一種神經細胞無血清培養基及其應用的製作方法

2023-12-01 09:00:16

本發明屬於生物技術領域，涉及一種細胞培養基，尤其是涉及一種神經細胞無血清培養基及其應用。

背景技術：

神經細胞是近代神經學科中研究重點之一，在體外特定環境中，通過培養可以連續地直接觀察神經細胞或神經膠質細胞的形態、生長、分化、遷移、突觸形成、理化改變以及對環境的反應。實驗中常用有血清培養基體外培養原代大鼠的海馬神經元細胞和皮層神經細胞進行相關的研究工作。由於神經細胞培養相對困難，存活率低，非神經細胞比例過高，不同細胞培養批次間可重複性差，由此影響了實驗結果的可靠性。

導致上述神經細胞培養問題的主要原因有動物血清中的一些成分抑制神經細胞的分化和生長、每批次培養液中的成分不一致、實驗人員培養細胞的熟練程度等。為了解決這些問題，開發高質量的各種成分確定的無血清培養基勢在必行。

技術實現要素：

本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種神經細胞無血清培養基及其應用，本發明提供的神經細胞無血清培養基尤其適用於培養原代大鼠神經元細胞，即作為培養原代大鼠神經元細胞的無血清培養基。

為了達到上述目的，本發明採用了以下技術方案：優化無血清培養基中的各種成分，並將優化後的無血清培養基用於培養大鼠海馬神經元細胞和大鼠皮層神經細胞。

本發明的技術方案具體包括以下內容：

技術方案一，提供一種神經細胞無血清培養基，包括以下成分：

基礎培養基d-mem；

生長因子：鹼性成纖維生長因子(bfgf)，終濃度：0.1-10μg/ml；表皮生長因子(egf)，終濃度：0.1-10μg/ml；血管內皮生長因子(vegf)，終濃度：0.1-10μg/ml；腦源性神經營養因子(bdnf)，終濃度：0.01-1μg/ml；

蛋白質：牛血清白蛋白，終濃度：0.001-0.1％；轉鐵蛋白，終濃度10-500μg/ml；

激素：胰島素，終濃度：1-100μg/ml；類胰島素生長因子1(igf-1)，終濃度：0.1-10μg/ml；皮質酮，終濃度：1-100μg/ml；黃體酮，終濃度：0.1-10μg/ml；

其它物質：大豆胰蛋白酶抑制劑，終濃度：0.1-20μg/ml；丁二胺，終濃度：1-100μg/ml；亞硒酸鈉，終濃度：1-1000μg/ml。

所述的基礎培養基d-mem為來自於thermo-fisher公司的產品，產品目錄號：11995065。

所述的神經細胞無血清培養基的ph值調節至7.4。

技術方案二，提供上述神經細胞無血清培養基的配製方法，每100ml神經細胞無血清培養基配製方法如下，其他體積的培養基按比例放大或縮小進行配製：

取90ml的dmem培養液，加到一個乾淨的200ml燒杯中；

按照優化的最適濃度依次加入上述血清替代物中的各成分；

用0.1n的氫氧化鈉調節ph值到7.4；

補加dmem至100ml；

用0.22μm的除菌過濾器將溶液過濾到無菌的200ml藍蓋瓶中，於4℃保存備用。

技術方案三，提供上述神經細胞無血清培養基的應用，所述的神經細胞無血清培養基配合神經細胞有血清培養基共同使用，進行神經細胞的培養。

每100ml神經細胞有血清培養基通過以下方式配製得到，其他體積的培養基按比例放大或縮小進行配製：

無菌取84mldmem培養基；

無菌加入10ml胎牛血清，加入5ml馬血清，1ml濃度為10mg/ml的穀氨醯胺；

保存於4℃環境下備用。

所述的神經細胞無血清培養基配合神經細胞有血清培養基共同使用，進行大鼠海馬神經元細胞貼壁培養，具體步驟如下：

取15-20天的sd大鼠，用常規方法無菌取出雙側海馬，剪碎，置於0.125％(質量分數)的胰蛋白酶/edta消化液中，於37℃，5％(體積分數)co2，消化20-30分鐘；

將上述消化組織無菌轉至15ml無菌離心管中，加入3ml神經細胞有血清培養基，然後輕輕吹打，以分散組織成單個細胞，得到細胞懸液；

用血球計數板計數上述細胞懸液，調整細胞濃度至4～6×105細胞/ml；

接種細胞至6孔培養板中，1.5ml/孔，於37℃，5％co2培養箱中培養24小時；

第二天，分別在不同的孔中更換神經細胞有血清培養基或神經細胞無血清培養基，繼續培養7天，其間分別換液2次；

第7天後，在神經細胞有血清培養基的孔中加入細胞分裂抑制劑，繼續培養，每周換液2次，細胞分裂抑制劑為含有20ug/ml的脫氧尿苷與40ug/ml的尿苷；

在神經細胞無血清培養基的孔中不加入細胞分裂抑制劑，繼續培養，每周換液2次。

所述大鼠海馬神經元細胞生長為典型的海馬神經元細胞形態，3周後神經細胞無血清培養基的細胞緻密度大於95％，細胞生長質量明顯好於有血清培養基培養的細胞。

所述的神經細胞無血清培養基配合神經細胞有血清培養基共同使用，進行大鼠皮層神經細胞貼壁培養，具體步驟如下：

取新生的sd大鼠，用常規方法無菌取出腦皮層，剝去腦膜，剪碎，置於0.125％的胰蛋白酶/edta消化液中，於37℃，5％co2，消化20-30分鐘；

將上述消化組織無菌轉至15ml無菌離心管中，加入3ml神經細胞有血清培養基，然後輕輕吹打，以分散組織成單個細胞，得到細胞懸液，然後用200目的無菌篩網過濾細胞懸液至另一個離心管中；

用血球計數板計數上述細胞懸液，調整細胞濃度至2～4×105細胞/ml；

接種細胞至6孔培養板中，1.5ml/孔，於37℃，5％co2培養箱中培養24小時；

第二天，分別在不同的孔中更換神經細胞有血清培養基或神經細胞無血清培養基，繼續培養4天，其間分別換液2次；

第4天後，在神經細胞有血清培養基的孔中加入細胞分裂抑制劑，繼續培養，每周換液2次，細胞分裂抑制劑為含有20ug/ml的脫氧尿苷與40ug/ml的尿苷；

在神經細胞無血清培養基的孔中不加入細胞分裂抑制劑，繼續培養，每周換液2次。

所述大鼠皮層神經細胞生長為典型的皮層神經細胞形態，2周後神經細胞無血清培養基培養的細胞緻密度大於95％，細胞生長質量明顯好於有血清培養基培養的細胞。

儘管有血清培養基能適用於大多數細胞的生長，但是由於血清中複雜的成分，導致其中的某些雜質可能抑制原代細胞，特別是神經細胞的生長。因此本發明根據文獻報導的一些信息，在基礎培養基中補充了一般細胞生長的必要成分如鹼性成纖維生長因子、表皮生長因子、血管內皮生長因子、牛血清白蛋白、轉鐵蛋白、胰島素、類胰島素生長因子1、皮質酮、大豆胰蛋白酶抑制劑外，本發明根據自己積累的經驗，還在該培養基配方中添加了一定比例的腦源性神經營養因子、黃體酮、丁二胺、亞硒酸鈉，這些成分充分保證了大鼠神經細胞的良好生長。

與現有技術相比，本發明為大鼠神經細胞培養提供了更為高效和可靠的無血清培養基。

附圖說明

圖1：實施例2中大鼠海馬神經元細胞在無血清和有血清培養基中培養1周的生長狀況。

圖2：實施例3中大鼠海馬神經元細胞在無血清和有血清培養基中培養5天的生長狀況。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施例對本發明進行詳細說明。

實施例1

一種培養原代大鼠神經元細胞的無血清培養基及其應用，包括以下步驟：

一、無血清培養基研製

1、基礎培養基d-mem：來自於thermo-fisher公司的產品，產品目錄號：11995065；

2、血清替代物：

2.1生長因子：鹼性成纖維生長因子(bfgf)，終濃度：0.1-10μg/ml；表皮生長因子(egf),終濃度：0.1-10μg/ml；血管內皮生長因子(vegf)，終濃度：0.1-10μg/ml；腦源性神經營養因子(bdnf)，終濃度：0.01-1μg/ml。

2.2蛋白質：牛血清白蛋白，終濃度：0.001-0.1％；轉鐵蛋白，終濃度10-500μg/ml。

2.3激素：胰島素，終濃度：1-100μg/ml；類胰島素生長因子1(igf-1)，終濃度：0.1-10μg/ml；皮質酮，終濃度：1-100μg/ml；黃體酮，終濃度：0.1-10μg/ml。

2.4其它：大豆胰蛋白酶抑制劑，終濃度：0.1-20μg/ml；丁二胺，終濃度：1-100μg/ml；亞硒酸鈉，終濃度：1-1000μg/ml。

3、無血清培養基的配製(100ml，新鮮配製)

3.1、取90ml的dmem培養液，加到一個乾淨的200ml燒杯中；

3.2、按照優化的最適濃度依次加入上述血清替代物中的各成分；

3.3、用0.1n的氫氧化鈉調節ph值到7.4；

3.4、補加dmem至100ml；

3.5、用0.22μm的除菌過濾器將溶液過濾到無菌的200ml藍蓋瓶中，於4℃冰箱保存備用。

4、無血清培養基各種成分最適濃度的優化

4.1根據上述血清替代物中的各成分的濃度範圍和配製方法，配製105種無血清培養基；

4.2用實施例2中「大鼠海馬神經元細胞貼壁培養」的方法測試各種無血清培養基的培養效果；

4.3培養效果的指標為：海馬神經元細胞的細胞形態，細胞存活率，神經元細胞佔總細胞的比例；

4.4經測試，第65號無血清培養基(sfm-65)所培養的海馬神經元細胞具有典型的海馬神經元細胞形態，細胞存活率為97％，神經元細胞佔總細胞的比例為89％。

105種無血清培養基的組成為以下添加劑的不同成分和比例的組合：

1)基礎培養基d-mem；

2)生長因子：鹼性成纖維生長因子，終濃度：0.1-10μg/ml；表皮生長因子，終濃度：0.1-10μg/ml；血管內皮生長因子，終濃度：0.1-10μg/ml；腦源性神經營養因子，終濃度：0.01-1μg/ml；

3)蛋白質：牛血清白蛋白，終濃度：0.001-0.1％；轉鐵蛋白，終濃度10-500μg/ml；

4)激素：胰島素，終濃度：1-100μg/ml；類胰島素生長因子1，終濃度：0.1-10μg/ml；皮質酮，終濃度：1-100μg/ml；黃體酮，終濃度：0.1-10μg/ml；

5)其它物質：大豆胰蛋白酶抑制劑，終濃度：0.1-20μg/ml；丁二胺，終濃度：1-100μg/ml；亞硒酸鈉，終濃度：1-1000μg/ml。

實施例2、大鼠海馬神經元細胞貼壁培養

1、取15-20天的sd大鼠，用常規方法無菌取出雙側海馬，剪碎，置於0.125％的胰蛋白酶/edta消化液中，於37℃，5％co2,消化20-30分鐘；

2、將上述消化組織無菌轉至15ml無菌離心管中，加入3ml有血清培養基，然後輕輕吹打，以分散組織成單個細胞；

3、用血球計數板計數上述細胞懸液，調整細胞濃度至～5x105細胞/ml；

4、接種細胞至6孔培養板中，1.5ml/孔，於37℃，5％co2培養箱中培養24小時；

5、第二天，分別在不同的孔中更換有血清培養基或無血清培養基，繼續培養7天，其間分別換液2次；

6、第7天後，在有血清培養基的孔中加入細胞分裂抑制劑(20ug/ml的脫氧尿苷，40ug/ml的尿苷)，繼續培養，每周換液2次；

7、在無血清培養基的空中不加入細胞分裂抑制劑，繼續培養，每周換液2次。

本實施例中大鼠海馬神經元細胞在無血清和有血清培養基中培養1周的生長狀況如圖1所示。可以看出，大鼠海馬神經元細胞生長為典型的海馬神經元細胞形態，3周後神經細胞無血清培養基的細胞緻密度大於95％，細胞生長質量明顯好於有血清培養基培養的細胞。

實施例3、大鼠皮層神經細胞貼壁培養

1、取新生的sd大鼠，用常規方法無菌取出腦皮層，剝去腦膜，剪碎，置於0.125％的胰蛋白酶/edta消化液中，於37℃，5％co2，消化20-30分鐘；

2、將上述消化組織無菌轉至15ml無菌離心管中，加入5ml有血清培養基，然後輕輕吹打，以分散組織成單個細胞，然後用200目的無菌篩網過濾細胞懸液至另一個離心管中；

3、用血球計數板計數上述細胞懸液，調整細胞濃度至～3x105細胞/ml；

4、接種細胞至6孔培養板中，1.5ml/孔，於37℃，5％co2培養箱中培養24小時；

5、第二天，分別在不同的孔中更換有血清培養基或無血清培養基，繼續培養4天，其間分別換液2次；

6、第4天後，在有血清培養基的孔中加入細胞分裂抑制劑(20ug/ml的脫氧尿苷，40ug/ml的尿苷)，繼續培養，每周換液2次；

7、在無血清培養基的空中不加入細胞分裂抑制劑，繼續培養，每周換液2次。

本實施例中，大鼠皮層神經元細胞在無血清和有血清培養基中培養5天的生長狀況退2所示，大鼠皮層神經細胞生長為典型的皮層神經細胞形態，2周後神經細胞無血清培養基培養的細胞緻密度大於95％，細胞生長質量明顯好於有血清培養基培養的細胞。

上述的對實施例的描述是為便於該技術領域的普通技術人員能理解和使用發明。熟悉本領域技術的人員顯然可以容易地對這些實施例做出各種修改，並把在此說明的一般原理應用到其他實施例中而不必經過創造性的勞動。因此，本發明不限於上述實施例，本領域技術人員根據本發明的揭示，不脫離本發明範疇所做出的改進和修改都應該在本發明的保護範圍之內。