循環系統的製作方法

2023-11-30 13:07:16

專利名稱：循環系統的製作方法
循環系統引言本發明涉及一種自含式循環系統，它支持在多個毛細管生長區段中形成毛細管並且允許形成多個微型類器官和/或多個微型組織區段，用於監測一種或多種測試化合物的效果並且確定療效、副作用、生物安全性、代謝產物、作用方式或器官再生；連同在所述自含式循環系統中建立這類微型類器官和/或微型組織的多種方法。
背景技術：
已經做出巨大的努力來開發用於體外培養的組織的生理營養供應和廢物去除的多種循環系統。這些開發的目的在於體外產生器官等價物(例如肝、淋巴結(Giese (基澤)等人，2010，生物技術雜誌(Journal of Biotechnology) 148，38-45)以及肺(Huh (許)等人，2010，科學(Science)，(328)5986，第 1662 - 1668 頁)或甚至多器官系統(Sonntag(索恩塔格)等人，2010，生物技術雜誌(Journal of Biotechnology) 148，70-75)),用於物質檢測、器官再生研究或用於移植物製造。為了這些目的，最初使用了基於膜、中空纖維(Catapano (卡塔帕諾)和Gerlach (格拉奇).用於肝組織工程化的生物反應器.2.組織工程化課題(Bioreactors for Liver Tissue Engineering.2.Topics in TissueEngineering)，第 3 卷，2007.1-42 編輯 N Asha.mma.khi (阿沙馬基),RReis (裡斯)&EChiellini (基耶利尼))或微通道網絡(Du (杜)等人，第7章:用於工程化血管化的組織構建體的微流體系統(Microfluidic Systems for Engineering Vascularized TissueConstructs) 〃.2008 (書本章節))的多種技術性的灌注系統。

在由Gerlach (格拉奇)與合作者開發的一個肝支持系統中，三束中空纖維被彼此地交織，形成用於血漿灌注和氧氣供應的多個相同微型培養空間。通過兩個微過濾中空纖維膜束來確保人血漿灌注，而通過一種不可滲透液體的氧氣運輸膜來進行充氧。基於這種原理的多個肝支持系統在若干周內具有良好的表現，這些肝支持系統被包括在患者的一個血漿流動迴路中。Du (杜)等人概述了用於基於水凝膠和微加工技術來產生微血管化組織構建體的流體平臺。該概述強調了在聚合材料內形成血管-毛細管網絡樣通道結構，用於通過組織培養進行有效液體灌注的技術能力。大多數所得微系統被用於高度有效的技術性灌注，但這些微系統不包括內皮細胞。這類系統局限於培養基或血漿的使用，但由於凝血現象而不能允許全血灌注。此外，它們不提供天然的血液組織屏障，該血液組織屏障在體內是由封閉的內皮細胞層組成。這允許穿過該細胞層的主動運輸，連同允許從該組織發信號到該毛細管網絡中。開發了不同的方法將技術性灌注系統(Song (宋)等人，2005，分析化學(Anal.Chem.)，2005，77，3993-3999)或合成的或生物的基質(Zhang (張)等人，2009，生物材料(Biomaterials)，30(19):3213-3223 ；ffalles (威爾斯)，2010，生物技術雜誌(Journal ofBiotechnology) 148, 56-63)與內皮細胞聯合。Song (宋)與合作者開發了一種微循環支持物以在確定的剪切應力下培養內皮細胞。可以在位於技術性運輸通道之間的多個單獨細胞培養隔區中建立內皮細胞的封閉單層。為了產生組織工程化血管移植物(tissue-engineeredvascular graft, TGVG),Zhang (張)等人開發了一種組織工程化構建體，該構建體使用了具有合適機械特性的管狀靜電紡絲的絲心蛋白支架來模仿血管結構。他們將人冠狀動脈平滑肌細胞(HCASMC)和人主動脈內皮細胞(HAEC)種在這些管狀支架的腔面上，並且在生理搏動流下培養，該生理搏動流是使用外部管材和泵在雙循環生物反應器內產生的。Walles (威爾斯)等人使用了一種完全生物的基質用於在體外建立一個內皮化的脈管系統，他們將聚合物管材和受控的泵送系統連接至一個去細胞的動物腸段上。在該系統中，由內皮細胞全部覆蓋的毛細管局限於該生物基質的功能上相關的區域。然而，現有技術循環系統中沒有一個適用於基於如在本申請中所提供的全血的長期組織培養。本發明涉及一種封閉的並且自含式的循環系統，該循環系統在組織水平上模仿了脊椎動物的天然血液灌注環境。該系統使用了一種微型化的生理血液循環以提供微升體積的循環，從而支持幾毫克的組織。這模仿了人的生理比例，其中在一種晶片兼容的微尺度(chip-compatible micro scale)下,幾升的血液體積支持了幾千克的組織。該自含式循環系統含有至少一個毛細管生長區段，該毛細管生長區段位於該系統的微型入口與微型出口之間。除了一個微型化的泵和多個運輸通道，將用於形成血液毛細管、支持營養物交換的一個毛細管生長區段整合到該循環中。發明簡述在第一方面，本發明涉及一種循環系統(1)，該系統是自含式的並且包括:a.至少一個毛 細管生長區段(2)，包括至少兩個微型入口(3)和兩個微型出口(4)，b.一個定向泵送裝置(5)，以及c.連接定向泵送裝置(5 )和這至少兩個入口( 3 )的一個小動脈運輸通道(6 )，和連接定向泵送裝置(5)和這至少兩個出口(4)的一個小靜脈運輸通道(7)。在第二方面，本發明涉及一種建立本發明的循環系統(I)的方法，包括以下步驟:a.將內皮細胞種到循環系統(I)中，並且b.孵育至少直至毛細管(14)已經在毛細管生長區段(2)中形成和/或直至一個內皮細胞層已經在這些運輸通道中形成和/或直至一個內皮細胞層已經覆蓋了泵送裝置(5)的所有內表面。在第三方面，本發明涉及通過本發明的方法可生產的一種循環系統(I)。在第四方面，本發明涉及根據本發明的或根據本發明可生產的循環系統(I)用於監測一種或多種測試化合物的效果和/或用於確定療效、副作用、生物安全性、代謝產物、作用方式或器官再生的用途。發明詳細說明在以下詳細描述本發明前，應當理解的是本發明不局限於在此描述的具體方法、實驗方案以及試劑，因為這些可以改變。還應當理解的是，在此使用的術語僅是出於描述具體實施方案的目的，並且不是旨在限制本發明的範圍，該範圍將僅由所附權利要求書來限制。除非另外定義，否則在此使用的所有技術性和科學性的術語具有與本領域普通技術人員所普遍理解的相同含義。優選地，在此使用的術語如在「生物技術術語的多種語言詞彙表:(IUPAC 推薦)(A multilingual glossary of biotechnological terms:(IUPACRecommendations) )」 Leuenberger (洛伊恩貝格爾)，H.G.W, Nagel (納格爾)，B.以及 Klbl(卡布)，H.編輯.(1995), Helvetica Chimica Acta 出版社，CH_4010Basel(巴塞爾)，瑞士)中所描述的，和如在由Axel (艾克塞爾)Kleemann (克林曼)&Jurgen (尤爾根)Engel (恩格爾)的「藥物物質:合成、專利、申請(Pharmaceutical Substances: Syntheses, Patents, Applications)」，Thieme Medical Publishing 出版社,1999 ;由 Susan (蘇珊)Budavari (布達瓦裡)等人編輯的「默克索引:化學品、藥物以及生物製品的百科全書(Merck IndexiAnEncyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals)」，CRC出版社，1996,以及由美國藥典委員會公司(United States Pharmcopeial Convention, Inc.) , Rockville (羅克維爾)Md.(馬裡蘭州)，2001出版的美國藥典-25/國家處方集-20中所描述的來定義。除非上下文另有要求，否則貫穿本說明書和其後的權利要求書，詞語「包括(comprise)」以及變體如「包括 了(comprises)」和「包括有(comprising)」將被理解為意指包括一種規定的特徵、整體或步驟，或多個特徵、整體或步驟的組，但不排除任何其他的特徵、整體或步驟，或多個整體或步驟的組。在以下的段落中，更詳細地定義了本發明的不同方面。除非清楚指出相反，否則這樣定義的各個方面可以與任何其他的一個方面或多個方面組合。具體來說，被指為是優選的或有利的任何特徵可以與被指為是優選的或有利的任何其他的一個特徵或多個特徵組合。貫穿本說明書的正文中引用了若干文件。在此引用的各文件(包括所有的專利、專利申請、科學出版物、製造商的說明書、指示等)，無論是在上文或是下文，均通過引用以其全文結合在此。在此絕不應解釋為許可本發明無權享有先於藉助現有發明的這類公開內容的權利。在下文，提供了在本說明書中頻繁使用的術語的一些定義。這些術語在其使用的每種情形下、在本說明書的其餘內容中具有相應定義的含義和優選的含義:「細胞」意指脊椎動物或無脊椎動物的細胞系或原代細胞。「類器官」意指體外不同類型細胞的人工的、重新產生的、功能性的細胞聚集體，這些細胞聚集體顯示出至少一種器官或組織功能，優選地顯示出大多數或基本上所有的器官或組織功能。「組織」代表從患者或動物中取得的活檢材料或外植體或體外產生的組織。「分化」意指培養的細胞的組織特異性功能的發展。「維持」描述了在給定的細胞培養過程內，保持給定的組織的所有功能恆定的能力，優選不具有細胞死亡和/或凋亡的明顯標誌。「培養基(Medium)」(複數:「培養基(media)」)意指具有用於培養細胞的營養物和物質的生長支持液體。合適的培養基的實例包括DMEM、漢姆氏(Ham』 s)F12以及RPMI。「基質」意指維持細胞的生活力、增強其增殖、分化以及功能、和/或類器官或器官形成的物質或物質的混合物。優選地，按可以符合存放毛細管生長區段(2)的空間的一種形式來提供基質材料。在本發明的背景中可使用的基質可以採用多種形狀，包括例如，水凝膠、泡沫、織物或無紡織物。該基質材料可以包括天然存在的基質物質，像胞外基質蛋白類，優選地膠原類、層粘連蛋白類、彈性蛋白、玻連蛋白、纖連蛋白、小分子基質細胞蛋白類(small matricellular proteins)、小分子整聯蛋白結合糖蛋白類、生長因子類或蛋白聚糖類，或可以包括人工的基質物質，像非可降解聚合物，例如聚醯胺纖維、甲基纖維素、瓊脂糖或藻酸鹽凝膠或可降解聚合物，例如聚丙交酯。「內表面」意指循環系統(I)的那些表面，這些表面是與循環的培養基、血漿和/或血液(例如全血)直接接觸的。為了克服與現有技術細胞培養系統相關的問題，本發明提供了一種循環系統(1)，它是自含式的並且包括:a.至少一個毛細管生長區段(2)，包括至少兩個微型入口(3)和兩個微型出口
(4)，b.一個定向泵送裝置(5)，以及 c.連接定向泵送裝置(5 )和這至少兩個入口( 3 )的一個小動脈運輸通道(6 )，和連接定向泵送裝置(5)和這至少兩個出口(4)的一個小靜脈運輸通道(7)。「自含式的」是指以下事實:在該系統中的流體是在該系統內，即在定向泵送裝置
(5)與這一個毛細管生長區段(2)或多個區段之間循環，並且優選不存在用於從一個外部的流體儲罐連續地提供流體(例如培養 基、血液)到循環系統(I)中的流體連接。在此背景下的「外部」意指該流體儲罐不是該循環系統的一個整體部分，例如，是經由管材連接至該循環系統上的。如果在孵育過程中必需對物質(例如營養物和/或流體)進行補充，優選的是通過一個注入口( 17)來間斷地供應這些營養物或流體，該注入口是優選位於一個小動脈或小靜脈運輸通道中或連接至該毛細管生長區段。在前一種情況下，這些物質(例如營養物和/或流體)被直接注入到這些毛細管內部。這種注入可能會導致內皮細胞的損傷，這些內皮細胞內襯於循環系統(I)內表面上的注入口(17)的開口。在後一種情況下，該注入增加了在該毛細管生長區段中形成的毛細管周圍的毛細管外空間中的流體壓力。流體和營養物將由於該毛細管外空間中的分壓增加而通過這些毛細管消散到該循環中。為了避免隨著時間推移並且隨著反覆注入有待補充的物質而使該系統中壓力增加，優選的是該循環系統進一步包括一個壓力補償儲罐。如果安排注入口(17)來允許注入到這些毛細管的內部，優選的是將該壓力補償儲罐連接至該毛細管外空間。相反地，如果安排注入口(17)來允許注入到該毛細管外空間中，優選的是將該壓力補償儲罐連接至該內部或這些毛細管。在一些優選實施方案中，該壓力補償儲罐具有一個開口，優選地一個小鑽孔或一個單向閥，以便將氣體從該壓力補償儲罐中釋放。這個開口優選地按以下方式配置:如果達到一個設定閾值壓力，僅將氣體釋放到環境中。合適的工具是，例如彈簧加載的單向閥或具有一個狹縫的矽膠塞。通過這種工具可能防止對該循環系統過度加壓，過度加壓會損壞所形成的毛細管。考慮到在該系統中包括較小的總液體體積，優選的是在任何給定時間下注入非常小的體積，例如小於(less then)該總體積的10%。將流體和/或細胞加載到該循環中的優選的方法是:將一個注入器、優選地一個注入針引入到該注入口中，並且通過適應於內皮細胞的移動速度的一個注入器移動速度，將流體和/或細胞注入到該循環中。一旦已經形成一個封閉的內皮細胞單層，這是特別優選的。優選的是該注入口是自封式的，即一旦注入裝置(例如注射器)已經取出，便封閉液體並且還優選是氣密的。這類自封的注入口的實例是本領域熟知的，並且包括單向閥和娃膠栓(si I icon pluck)。在多個優選實施方案中，通過以下方式使注入口(17)和/或該壓力補償儲罐從該循環或該毛細管外空間分開:一個細胞截留膜，即具有的平均孔徑大小是小於在本發明的循環系統(I)中生長的細胞的平均大小的一種膜；或多個細胞排除通道，這些細胞排除通道是被設定大小以排除在本發明的循環系統(I)中生長的細胞，以便防止細胞堵塞或逃逸。可能的是，在該系統的初始填充期間或在後來的注入期間，將氣體與流體共同注入。為了避免由捕集的氣泡而阻塞循環，優選的是在循環系統(I)中提供用於氣泡的一個或多個阱。這些阱可以具有在一個小動脈或小靜脈運輸通道的面向上的一側上的空腔或缺口的形式。額外地，優選的是以一種被動的方式為毛細管生長區段(2)提供氣體介質(例如02/C02)，例如通過穿過一種可氣體滲透的生物相容性基質(8)和/或穿過小動脈運輸通道(6)擴散到毛細管生長區段(2)中。循環系統(I)的一個優點是，可能在一個自含式系統內維持兩個或更多個不同的組織和/或類器官(15)，這些 組織和/或器官通過相同的循環液體來灌注，並且因此是處於如在天然環境中的流體連接。通常由待維持的分開組織和/或類器官(15)的數目來確定毛細管生長區段(2)的數目。因此，在本發明的循環系統(I)的一個優選實施方案中，循環系統(I)包括至少兩個毛細管生長區段(2);優選它包括3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個毛細管生長區段(2)。優選地，通過提供多個可氣體滲透的肺泡狀(alveolar)和小靜脈的運輸通道(7)來實現氣體(例如o2/co2)的交換，即這些肺泡狀和小靜脈的運輸通道包括一種可氣體滲透的材料或由其組成。取決於該系統中的總流體體積和運輸通道(5，6)的總表面積，穿過這些運輸通道的內表面的02/C02灌注可能不足以維持循環系統(I)中的細胞和/或類器官
(15)。在這些情況下，優選的是毛細管生長區段(2)之一的材料是至少部分可氣體滲透的，並且從而充當一個「微型肺」來為整個循環系統(I)供應02。相應地，優選的是該毛細管生長區段的一個或多個壁包括一種可氣體滲透的材料或由其組成。合適的可氣體滲透材料是本領域已知的。優選地，用來形成該毛細管生長區段的一個或多個壁的材料是聚二甲基矽氧烷(PDMS)。毛細管生長區段(2)是一個空間，提供該空間用於通過種到該系統中的內皮細胞以及任選的平滑肌細胞來組裝毛細管(14)。優選地，該毛細管生長區段充滿了一種基質
(8)，該基質用作為毛細管(14)提供一個生長支架的目的，一旦將內皮細胞種到該系統中並且使流體通過毛細管生長區段(2)來循環，這些毛細管就會自然形成。因此，優選的是生物相容性的基質(8)包括多個微型通道、結構和/或網絡，這些允許並且支持了通過內皮細胞來形成毛細管(14)。優選地，這些結構自身不具有後來毛細管的形狀，而只是為所形成的毛細管提供附著點和/或導向。優選的是毛細管生長區段(2)包括一種半固態、生物相容性的基質(8)或由其組成。一旦將內皮細胞種到該系統中，毛細管(14)將開始形成(典型地始於微型入口(3)處)並且將通過流體流動來定向生長，以便最後與這些微型出口(4)之一連接。替代地，單獨亦或被包埋在如上所述的一種生物相容性基質(8)中來提供生物相容性的中空纖維(9)。這些中空纖維優選在一側連接至該微型入口並且在另一側連接至微型出口(4)，從而導向這些內皮細胞的生長。為了維持所得到的毛細管(14)的彈性，優選的是生物相容性的中空纖維(9)的材料是可生物降解的；因為這允許該毛細管一旦已經形成，它隨著時間推移而去除。優選地，生物相容性的基質(8)包括基質膠、纖維蛋白凝膠、瓊脂糖凝膠、藻酸鹽凝膠、合成凝膠、可交聯聚合物或由其組成，並且生物相容性的中空纖維(9)優選地由選自下組的一種材料組成，該組由以下各項組成:聚乳酸(PLA)、聚丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)、聚己酸內酯(PCL)以及聚反丁烯二酸酐-癸二酸酐共聚物、聚乙烯醇、丙烯酸乙烯共聚物、聚丙烯酸、聚乙醇酸交酯、聚丙交酯、纖維素衍生物、甲酯基/乙基/羥丙基、透明質酸、葉酸連接的環糊精/葡聚糖、肌氨酸/胺基酸間隔的聚合物、角叉菜膠、果膠/殼聚糖、殼聚糖、葡聚糖、膠原或其混合物。優選的可交聯聚合物是具有化學式PEG-(DCR-CG)η的PEG衍生物，其中PEG是聚(乙二醇)，DCR是一個降解控制區，CG是一個交聯基團，並且η等於或大於3。用於生物相容性的中空纖維(9)的特別優選的材料是PLA和PLGA。該基質和/或中空纖維連同小動脈或小靜脈運輸通道的材料的選擇確定了本發明的循環系統的內表面是被內皮細胞快速並且完全覆蓋的。氧氣運輸的分析已經導致了離毛細管的向內流入端(inflow end)最遠的組織位點構建了一個致命的角落(lethal corner)的想法(Intaglietta (因塔列塔)等人，1996，心血管研究(CardiovascularResearch) 32，632-643)。由於在身體中(例如在腫瘤組織中)還存在具有低O2分壓的區域，本發明的一個目的在於在毛細管生長區段(2)內建立一個所謂的「新生血管形成(neovascularisation)」區(16),即一個區段,其中在本發明的循環系統(I)中初始建立毛細管(14)過程中，沒有形成毛細管(14)。這通過提供一個在毛細管生長區段(2)內的子區段(16)來實現，該子區段是沒有微型入口(3)和出口(4)的。如果將這個子區段(16)移開離相應的微型入口(3)和微型出口(4)足夠遠，那麼在這個子區段中的毛細管(14)形成會削弱。如果其中沒有毛細管形成，該子區段是被移開足夠遠的，優選地，它被移開至少ΙΟΟμπι和高達500 μ m,優選該子區段具有離微型入口(3)和/或微型出口在100 μ m至300 μ m的範圍內的距離。然後可能將選擇的任何組織或類器官放置在這個區域(例如腫瘤組織)中，以便研究用於構建毛細管(14)或再生過程的線索。如下所更詳細地概述，優選的是可以移開界定毛細管生長區段(2)的一部分材料，以便允許通向毛細管生長區段(2)。設想通過這個開口將細胞和/或類器官引入到毛細管生長區段(2)中。之後覆蓋這個開口以成為流體密封的。該蓋子的材料優選地是選自半透明的材料，例如玻璃或塑料，這些材料允許通過顯微法來進行毛細管生長區段(2)的顯微檢查。優選地，該材料不是可氣體滲透的。然而，在實施方案中，其中一個或多個毛細管生長區段具有「微型肺」的功能，用一種可氣體滲透的蓋子來覆蓋這樣的毛細管生長區段。優選地，將毛細管生長區段(2)模製或打磨成給定材料的固體嵌段，優選地是以長方體形式。在該實施方案中，優選的是該開口是在該嵌段的上偵牝並且在毛細管生長區段(2)的整個表面積上延伸。如果待血管化的區域沒有被供應氧氣，那麼促進了通過內皮細胞的毛細管(14)的形成。此外，毛細管(14)的最大長度應該不超過4mm，因為處於天然密度的周圍組織完全消耗了通過這種距離內的這類毛細管(14)而提供的營養物，尤其是氧氣。

因此，在一個優選實施方案中，有待通過新形成的毛細管(14)而連接的微型入口(3)與微型出口(4)之間的距離不應該超過這個最大距離，以便培養毛細管(14)的生長。因此，優選的是在一個微型入口(3)與最近的微型出口(4)之間的距離是在0.2_至4_、更優選地0.3至2mm、甚至更優選地0.4mm至Imm的範圍內，優選地約0.5mm。毛細管生長區段(2)的寬度是在0.5_與1.5_之間，優選地1.0mm和/或毛細管生長區段(2)的高度是在
0.3至0.7mm之間，優選地0.5mm。毛細管生長區段(2)的體積是在0.03 μ I至4.2 μ I之間，優選地在0.5μ I至1.0μ I之間。毛細管生長區段(2)、小動脈運輸通道(6)、小靜脈運輸通道(7)以及定向泵送裝置(5)的總體積是在Ι.Ομ I至100μ I之間，優選地在5.0μ I至15 μ I之間。為了促進線性毛細管連接的生長，優選的是將這些微型入口(3)和微型出口(4)各自安排在毛細管生長區段(2)的相反端。優選的是該毛細管生長區段具有一種基本上長方體的，優選地立方的形狀。優選地，將該微型入口和微型出口安排在該長方體的相反面上。該長方體的長度則由這些微型入口與微型出口之間的距離來確定。特別優選的是將各微型入口(3)與對應的微型出口(4)直接成一線。希望的是，通過這些毛細管對毛細管生長區段提供氧氣，因此，優選的是形成該毛細管生長區段的壁的材料具有一種低的或不具有氣體滲透性。然而，如果一個或多個毛細管生長區段具有微型肺的功能，則如上所概述來設計這些生長區段。優選地，該壁材料選自下組，該組由玻璃或塑料組成。如上所述，一旦被種有內皮細胞，在毛細管生長區段(2)內就會自發形成毛細管
(14)。這些內皮細胞的一個重要定向線索是流體穿過系統的流動。為了促進具有正確大小的毛細管(14)的生長，優選的是 微型入口(3)和/或微型出口(4)的直徑是在5 μ m至50μπκ更優選15μπι至30μπι之間。所形成的毛細管(14)具有在I至ΙΟμπκ優選地5至
6μ m範圍內的直徑。如下將更詳細描述，在該毛細管生長區段中的微型入口和微型出口的數目對應於這些小動脈和小靜脈運輸通道的表面積。為了向組織提供足夠的氧氣，將相應數目的微型入口和微型出口優選地分布在該毛細管生長室的相應側的表面上。出於相同的原因，所形成的兩個毛細管之間的距離應該不低於30 μ m。因此，優選的是微型入口(3)之間的距離是在30 μ m至500 μ m的範圍內，優選地在80 μ m至200 μ m的範圍內，和/或微型出口(4)之間的距離是在30μπι至500μπι的範圍內，優選地在80μπι至200μπι的範圍內。在一個優選實施方案中，將這些微型入口(3)和/或微型出口(4)安排成一排、兩排、三排或四排。設想將組織和/或類器官(15)放置在一個或多個毛細管生長區段(2)中，這將執行它們的天然功能。因此，在一個優選實施方案中，毛細管生長區段(2)進一步包括一種毛細管外流體和/或廢物收集器(10)。通過毛細管內壓力差來驅動毛細管外流體的排放。這用作從毛細管外分泌流體的組織和/或類器官(15)(例如胰腺、腎、腸)中排放掉流體的目的。優選地，以一種方式將廢物收集器(10)與生物相容性的基質(8)和/或生物相容性的中空纖維(9)分開，這防止了血細胞和/或組織或類器官細胞從毛細管生長區段(2)中流出。優選地，通過以下方式使該毛細管外的流體和/或廢物收集器(10)與剩餘的毛細管生長區段(2)分開:一個細胞截留膜(11)，即具有的平均孔徑大小是小於在本發明的循環系統(I)中生長的細胞的平均大小的一種膜；或多個細胞排除通道，這些細胞排除通道是被設定大小以排除在本發明的循環系統(I)中生長的細胞。
為了監測該系統的狀態，優選的是將一個或多個傳感器(12)安排在本發明的循環系統(I)中，優選地在一個肺泡狀的和/或小靜脈的運輸通道(7)中、在毛細管外流體和/或廢物收集器(10)、和/或該定向泵送裝置中。可以使用的傳感器(11)包括但不局限於:PH傳感器、p02傳感器；分析物捕獲傳感器、電導傳感器、等離子體共振傳感器、溫度傳感器、CO2傳感器；N0傳感器、趨化性傳感器、細胞因子傳感器、離子傳感器、壓力傳感器、電位傳感器、電流傳感器、流通傳感器、填充傳感器、阻抗傳感器、電導傳感器、電磁場傳感器、表面聲波傳感器、以及代謝傳感器。在本系統中使用的傳感器(12)可以是監測毛細管生長區段(2)和/或流出毛細管生長區段(2)的培養基的傳感器，或可以是被位於該廢物通道和/或儲罐(10)內的傳感器(12)。這些運輸通道模仿了血液系統中的更小動脈和靜脈，並且用作定向泵送裝置(5)與毛細管生長區段(2)之間的連接。因此，優選的是這些運輸通道是適合被塗布平滑肌細胞和內皮細胞的。具有希望的直徑和形態的運輸通道可以通過微機械加工在一個生物相容性基質(8)中的相應結構來提供，或可以是生物相容性的中空纖維(9)。然而，還可能使用去細胞化的生物小動脈和/或小靜脈。這些運輸通道(6，7)的表面積足以為大多數的系統提供所需要的O2，除非存在太多的毛細管生長區段(2)。因此，優選的是所述生物相容性的基質(8)或生物相容性的中空纖維 (9)是至少部分可氣體滲透的，優選地包括PDMS或由其組成。PDMS是一種基於矽的有機聚合物，是光學透明的、粘彈性的，並且可以例如通過表面電荷光刻來直接地圖案化。在本發明的一個優選實施方案中，小動脈運輸通道(6)和/或小靜脈運輸通道(7)在其與定向泵送裝置(5)相連接處的直徑是在300 μ m與2.0mm之間，優選500 μ m。希望的是，在循環系統(I)中的流體流動的速度在該流體循環期間，不會貫穿該系統中顯著變化。優選地，該系統中的流速是在0.02cm/s至0.lcm/s、更優選0.03至0.07cm/s的範圍內，最優選約0.05cm/s。然而，這些微型入口(3)和微型出口(4)通常具有分別小於小動脈微型入口(3)和小靜脈微型出口(4)的直徑和因此更小的表面積，這將導致當該流體進入這些微型入口(3)時該流速增加。因此，優選的是分別地，小動脈運輸通道(6)分支至少一次以與這至少兩個入口連接，並且小靜脈運輸通道(7)分支至少一次以與這至少兩個出口(4)連接。為了防止該流體流動的明顯改變，優選的是在分支點(13)後的這些小動脈通道的組合橫截面積是與在分支點(13)前的小動脈通道的橫截面積基本相同，和/或在分支點(13)後的這些小靜脈運輸通道(7)的組合橫截面積是與在分支點(13)前的小靜脈通道的橫截面積基本相同。通常，被連接至定向泵送裝置(5 )的小動脈通道(6 )或小靜脈通道(7 )分支成兩個或三個更小直徑的小動脈和小靜脈的通道(6，7)。為使小動脈的和小靜脈通道的直徑減小到相應微型入口(3)和微型出口(4)的直徑所要求的分支點(13)的數目和/或分支的數目，是由小動脈通道(6)和小靜脈通道(7)的相應橫截面積以及它們分別連接的微型入口(3)和微型出口(4)的直徑和橫截面積來確定的。例如，如果小動脈通道(6)具有Imm的直徑，並且微型入口(3)的直徑是50 μ m,則(than) 400個微型入口(3)具有與處於定向泵送裝置(5)處的小動脈通道(6)相同的表面積。因此，要求提供如所需要的一樣多的雙向、三向、四向或更多向的分支點(13)，以便將各單獨的微型入口與一個分支的小動脈通道
(6)相連接。在一個優選實施方案中，分支點(13)是雙向分支點(13)，並且因此，由公式2n來確定微型入口(3)的數目，其中η是在各流動路徑中的分支點(13)的數目。在循環系統(1)包括兩個或更多個毛細管生長區段(2)的情況下，使該流動路徑分支來分開連接這兩個毛細管生長區段(2)。並不要求兩個分支具有相同的橫截面積，只要分支點(13)後的組合橫截面積與分支點(13)前的橫截面積相同或基本上相同。例如，在一種「微型肺」已經在一個毛細管生長區段(2)中形成的情況下，可以不要求如同到另一個類器官(15)的毛細管生長區段(2)—樣，將類似量的流體引導至這個類器官(15)。因此，在分支點(13)處，連接該肺-類器官的小動脈分支將具有比連接另一個毛細管生長區段(2)的小動脈分支更小的表面積。所有入口(3)的組合橫截面積與所述一個小動脈通道和/或多個小動脈通道的橫截面積基本上相同，並且所有出口(4)的組合橫截面積與所述一個小靜脈通道和/或多個小靜脈通道的橫截面積，優選是多個小動脈通道(6)和多個小靜脈通道(7)的橫截面積基本上相同。優選地，定向泵送裝置(5 )是一種生物泵、液壓泵、壓電泵、蠕動泵、氣動泵、電磁泵或磁性泵。例如通過心肌細胞來形成一種生物泵，優選地將這些心肌細胞種在具有一種形狀的彈性聚合物上，該形狀支持了在心肌細胞收縮下的搏動性流動(Tanaka等人，2006，實驗室晶片(Lab Chip), 6，362-386)。這些心肌細胞的顫搐提供了泵送行為必需的收縮。該流動的方向性(即從泵送裝置(5)的這些小靜脈通道進入該泵送裝置的小動脈通道)可以通過泵(5)的致動模式來確立，這導致僅在泵送裝置(5)的一個側面上驅逐流體，或在多種情況下，其中泵送裝置(5)只是通過培養進入這些小動脈通道中的一種定向流動的另外的元件來搏動。因此，在一個優選實施方案中，定向泵送裝置(5)包括一個或多個定向流動元件，優選地選自下組，該組由一個噴嘴樣的元件和一個單向閥元件組成。可以將這些流動元件安排在定向泵送裝置(5)前的離開小靜脈運輸通道(7)的流動路徑中，和/或在定向泵送裝置(5)後的進入小動脈通道的流動路徑中。在噴嘴樣的元件的情況下，優選將它們安排在定向泵送裝置(5)的兩端。優選地，該泵送機制是基於通過泵送室而致動的優選彈性PDMS-基質/膜的搏動，以便產生培養基 的一種連續的蠕動流動。優選地，所述運輸通道和/或定向泵送裝置(5)的內表面塗覆有選自下組的一種物質，該組由以下各項組成:促進細胞粘附在生物相容性的聚合物上的肽類或蛋白類、或其混合物。適用維持這些細胞的粘附分子是選自下組，該組由以下各項組成:整聯蛋白類、白蛋白類、纖維蛋白類、粘附素類(adhesins)和/或膠原類、或其混合物。這種塗層培養了循環系統(I)的內表面被內皮細胞和/或平滑肌細胞所完全覆蓋。在本發明的循環系統(I)的一個優選實施方案中，進一步包括在毛細管生長區段
(2)中形成的毛細管(14)和/或類器官(15)。優選地，將毛細管生長區段(2)、該定向泵送裝置、這一個或多個小動脈運輸通道
(6)以及小靜脈運輸通道(7)製造為整體。該整體可以由彼此粘附的不同材料組成。例如，定向泵送裝置(5)、這一個或多個小動脈運輸通道(6)以及小靜脈運輸通道(7)例如通過微機械加工或鑄造，在可氣體滲透材料(例如PDMS)的一個嵌段中形成。包括該毛細管生長區段以及這些微型入口和微型出口的部分是在一種非可氣體滲透材料中形成，該部分粘附至其他部分的方式是:各微型入口和微型出口分別與一個小動脈運輸通道(6)和小靜脈運輸通道(7)對準。當還優選的是被安排在該毛細管生長區段中的基質(8)和/或中空纖維是由一種不同於該毛細管生長區段的材料製成的時，優選的是分開生產這個部分並且將其插入到該毛細管生長區段中。優選地，然後通過一個非可氣體滲透的蓋子來覆蓋該毛細管生長區段，除非它充當一種微型肺的功能。優選地，本發明的循環系統(I)的尺寸支持了 4_8μ I的全血穿過系統的連續循環，該系統的內表面完全覆蓋有內皮細胞、優選地是它們一個單層。優選地，配置這個循環系統以便在若干月的培養中，為各自具有微升規模的至少兩個不同的微型類器官提供營養物。血液(優選為全血)的使用確定了一個強緩衝系統、為這些組織提供了血漿的所有必需蛋白，支持了通過紅細胞的氧氣運輸，並且提供了一種通過白細胞的對抗汙染性微生物的免疫活性。本發明提供了一種建立一個循環系統(I)的方法，包括以下步驟:a.將內皮細胞種到循環系統(I)中，並且b.孵育至少直至毛細管(14)已經在毛細管生長區段(2)中形成和/或直至一個內皮細胞層已經在這些運輸通道中形成和/或直至一個內皮細胞層已經覆蓋了泵送裝置(5)的所有內表面。 如果放置在提供一個生長支架、營養物和氧氣以及任選的血管生成因子(angionic factor)(像FGF和/或血管內皮粘I丐蛋白(Cadherine) (VEC))的一種環境中，這些內皮細胞能夠形成毛細管(14)。因此，優先通過進入口將這些內皮細胞種到該系統中，並且孵育直至毛細管(14)形成，這通常需要2至10天、優選2至6天，取決於種的內皮細胞的數目、待連接的微型入口(3)與微型出口(4)之間的距離、以及有待被內皮細胞覆蓋的本發明的循環系統的總內表面。典型地，將在500至5，000個範圍內的細胞種到具有在I μ I至100 μ I範圍內、優選地在5μ1至50μ1範圍內的總流體體積的一個系統中。天然地小動脈和小靜脈不僅由內皮細胞構成，而且包括平滑肌細胞和生物相容性的基質。這些平滑肌細胞為這些小動脈和小靜脈提供了柔韌性，並且賦予它們流體不可滲透性。因此，在該方法的一個優選實施方案中，進一步包括在內皮細胞之前、同時亦或之後種平滑肌細胞。優選地，種的內皮細胞和平滑肌細胞的比率是在5比I與0.5比I之間，優選地2比I。優選地，本發明的方法進一步包括以下步驟:一旦一個內皮細胞單層已經覆蓋所有表面，就將全血注入到該微循環中。在該孵育期間，如果將這些內皮細胞不斷地暴露於機械力，它們更可能形成完整的毛細管(14)，因此優選地步驟b)是在剪切力下進行的。通過將培養基循環穿過本發明的循環系統(I)來產生這些剪切力。優選地，在微型入口(3)和微型出口(4)處的流動是在5至20達因/cm2的範圍內。為了允許這些細胞粘附至循環系統Cl)的內表面和/或遷移至毛細管生長室(2)，循環系統(I)充滿了一種流體。相應地，在一個優選實施方案中，在培養基、血漿或血液、優選地全血中包括種的細胞。還可以在導致毛細管(14)形成的孵育步驟期間使用的一種特別優選的「種培養基」包含:例如補充有氫化可的松、胎牛血清(FCS)、豬VEGF、人鹼性成纖維細胞生長因子(hbFGF)、人表皮生長因子(hEGF)、胰島素樣生長因子(R3IGF)、抗壞血酸、青黴素、鏈黴素的內皮細胞基礎培養基-2(EBM-2)，如果該培養基是血漿或血液，優選的是補充有以上指出的物質的一種或多種。為了確定毛細管(14)是否已經在步驟b)中形成，使用了微型傳感器(12)和/或視覺檢測。合適的微型傳感器(12)測量了跨內皮細胞電阻(TEER)。優選地，將一種或多種非內皮細胞類型種到循環系統(I)中，優選地種到毛細管生長區段(2)中，以便在毛細管生長區段(2)中建立組織和/或類器官(15)。可以在步驟a)之前、與步驟a)同時、在步驟a)之後或在步驟b)之後種這類另外的細胞。衍生出這些細胞的組織類型優選地是選自下組，該組由以下各項組成:肝、皮膚、肺、腎、腸、神經元、心肌和/或腫瘤類。本發明提供了一種通過所描述的方法可生產的循環系統(1)，例如具有建立的毛細管和/或類器官的一個循環系統。本發明提供了循環系統(I)用於監測一種或多種測試化合物的效果和/或用於確定療效、副作用、生物安全性、代謝產物、作用方式或器官再生的用途。優選地，通過經由該注入口注入一種或多種測試化合物來進行這種測試。項目I涉及一種循環系統(1)，它是自含式的並且包括:a.至少一個毛細管生長區段(2)，包括至少兩個微型入口(3)和兩個微型出口
(4)，b.一個定向泵送裝置(5)，以及

c.連接定向泵送裝置(5 )和這至少兩個入口( 3 )的一個小動脈運輸通道(6 )，和連接定向泵送裝置(5)和這至少兩個出口(4)的一個小靜脈運輸通道(7)。項目2涉及項目I所述的循環系統(I)，其中循環系統(I)包括至少兩個毛細管生長區段(2)。項目3涉及項目I或2中任一項所述的循環系統(1)，其中一個毛細管生長區段(2)是至少部分可氣體滲透的。項目4涉及項目I至3中任一項所述的循環系統(1)，其中毛細管生長區段(2)包括一種半固態、生物相容性的基質(8 )和/或半固態、生物相容性的中空纖維(9 )或由其組成。項目5涉及項目4所述的循環系統(I)，其中生物相容性的中空纖維(9)是可生物降解的。項目6涉及項目4或5所述的循環系統(1)，其中生物相容性的基質(8)包括選自下組的一種材料或由其組成，該組由以下各項組成:基質膠、纖維蛋白凝膠、瓊脂糖凝膠、藻酸鹽凝膠、合成凝膠、可交聯聚合物，並且生物相容性的中空纖維(9)由選自下組的一種材料組成，該組由以下各項組成:聚乳酸、聚丙交酯-乙交酯共聚物或其混合物。項目7涉及項目4至6中任一項所述的循環系統(I)，其中生物相容性的基質(8)包括多個微型通道、結構和/或網絡，它們允許通過內皮細胞來形成毛細管(14)。項目8涉及項目I至7中任一項所述的循環系統(1)，其中毛細管生長區段(2)的一個區段是沒有微型入口(3)和出口(4)的。項目9涉及項目I至8中任一項所述的循環系統(I)，其中這些微型入口(3)與微型出口(4)之間的距離是0.2mm至4臟，優選地0.5mm。項目10涉及項目I至9中任一項所述的循環系統(1)，其中毛細管生長區段(2)的寬度是在0.5_與1.5_之間，優選地1.0_，和/或毛細管生長區段(2)的高度是在0.3至0.7mm之間，優選地0.5mm。項目11涉及項目I至10中任一項所述的循環系統(1)，其中毛細管生長區段(2)的體積是在0.03 μ I至4.2 μ I之間。項目12涉及項目I至11中任一項所述的循環系統(1)，其中這些微型入口(3)和微型出口(4)被安排在毛細管生長區段(2)的相反端。項目13涉及項目I至12中任一項所述的循環系統(1)，其中這些微型入口(3)和/或微型出口(4)的直徑是在10至50 μ m之間。項目14涉及項目I至13中任一項所述的循環系統(1)，其中毛細管生長區段(2)進一步包括一種毛細管外流體和/或廢物收集器(10)。項目15涉及項目I至14中任一項所述的循環系統(I )，其中通過一個細胞截留膜或通過多個細胞排除通道(11)使該毛細管外流體和/或廢物收集器(10)與生物相容性的基質(8)和/或生物相容性的中空纖維(9)分開。項目16涉及項目14或15所述的循環系統(1)，其中至少一個傳感器(12)被安排在該毛細管外流體和/或廢物收集器(10)中。項目17涉及項目16所述的循環系統(1)，其中這至少一個傳感器(12)是選自下組，該組由以下各項組成:pH傳感器、p02傳感器；分析物捕獲傳感器、電導傳感器、等離子體共振傳感器、溫度傳感器、CO2傳感器；N0傳感器、趨化性傳感器、細胞因子傳感器、離子傳感器、壓力傳感器、電位傳感器、電流傳感器、流通傳感器、填充傳感器、阻抗傳感器、電導傳感器、電磁場傳感器、表面聲波傳感器、以及代謝傳感器。項目18涉及項目I至17中任一項所述的循環系統(1)，其中該運輸通道是已經被微機械加工到一種生物相容性的基質(8 )中的或是一種生物相容性的中空纖維(9 )，其中所述生物相容性的基質(8)或生物相容性的中空纖維(9)是至少部分可氣體滲透的，優選地包括PDMS或由其組成。項目19涉及項目I至18中任一項所述的循環系統(I)，其中小動脈運輸通道(6)和/或小靜脈運輸通道(7)在其與定向泵送裝置(5)相連接處的直徑是在300 μ m與2.0mm之間，優選地500 μ m。 項目20涉及項目I至19中任一項所述的循環系統(1)，其中分別地，小動脈運輸通道(6 )分支至少一次以與這至少兩個入口( 3 )連接，並且小靜脈運輸通道(7 )分支至少一次與這至少兩個出口(4)連接。項目21涉及項目20所述的循環系統(1)，其中在分支點(13)後面的這些小動脈通道的組合橫截面積與在分支點(13)前的小動脈通道的橫截面積基本上相同，和/或在分支點(13)後的這些小靜脈運輸通道(7)的組合橫截面積與在分支點(13)前的小靜脈通道的橫截面積基本上相同。項目22涉及項目20和21中任一項所述的循環系統(I )，其中所有入口(3)的組合橫截面積與所述一個小動脈通道和/或多個小動脈通道的橫截面積基本上相同，並且所有出口(4)的組合橫截面積與所述一個小靜脈通道和/或多個小靜脈通道的橫截面積基本上相同，優選地與多個小動脈通道和多個小靜脈通道的橫截面積相同。項目23涉及項目I至22中任一項所述的循環系統(1)，其中定向泵送裝置(5)是一種生物泵、液壓泵、壓電泵、蠕動泵、氣動泵、電磁泵或磁性泵。項目24涉及項目I至23中任一項所述的循環系統(1)，其中定向泵送裝置(5)包括一個或多個定向流動元件，優選地選自下組，該組由一個噴嘴樣的元件和一個單向閥元件組成。項目25涉及項目I至24中任一項所述的循環系統(I )，其中至少所述運輸通道和/或定向泵送裝置(5)的內表面塗覆有選自下組的一種物質，該組由以下各項組成:促進細胞粘附在生物相容性的聚合物上的肽類或蛋白類、或其混合物。
項目26涉及項目25所述的循環系統(1)，其中促進細胞粘附的肽類或蛋白類是選自下組，該組由以下各項組成:整聯蛋白類、白蛋白類、纖維蛋白類、粘附素類、膠原類。項目27涉及根據項目I至26中任一項所述的循環系統(I )，進一步包括在毛細管生長區段(2)中形成的毛細管(14)和/或類器官(15)。項目28涉及一種建立根據項目I至27中任一項所述的循環系統(I)的方法，包括以下步驟:a.將內皮細胞種到循環系統(I)中，並且b.孵育至少直至毛細管(14)已經在毛細管生長區段(2)中形成和/或直至一個內皮細胞層已經在這些運輸通 道中形成和/或直至一個內皮細胞層已經覆蓋了泵送裝置(5)的所有內表面。項目29涉及根據項目28所述的建立一個循環系統(I)的方法，其中在培養基和血漿中包括種的細胞。項目30涉及根據項目28或29所述的建立一個循環系統(I)的方法，其中該方法進一步包括以下步驟:在步驟a)之前、同時或之後種平滑肌細胞。項目31涉及根據項目28至30中任一項所述的建立一個循環系統(I)的方法，其中該方法進一步包括以下步驟:將全血注入到所述循環系統中。項目32涉及根據項目28至31中任一項所述的建立一個循環系統(I)的方法，其中在剪切力下進行步驟b)。項目33涉及根據項目29至32中任一項所述的建立一個循環系統(I)的方法，其中優選地在步驟b)後，將具有一種或多種細胞類型的細胞種到所述毛細管生長區段(2)中。項目34涉及根據項目33所述的建立一個循環系統(I)的方法，其中這些細胞是選自下組，該組由以下各項組成:肝細胞、皮膚細胞、肺細胞、腎細胞、腸細胞、神經元細胞、心肌細胞和/或腫瘤細胞。項目35涉及一種通過項目28至34中任一項所述的方法可生產的循環系統(I)。項目36涉及根據項目27或35所述的循環系統(I)用於監測一種或多種測試化合物的效果和/或用於確定療效、副作用、生物安全性、代謝產物、作用方式或器官再生的用途。兀件符號列表(I)自含式循環系統(2)毛細管生長區段(3)微型入口(4)微型出口(5)定向泵送裝置(6)小動脈運輸通道(7)小靜脈運輸通道(8)生物相容性的基質(9)生物相容性的中空纖維(10)外流體和/或廢物收集器
(11)截留膜或細胞排除通道(12)傳感器(13)分支點(14)毛細管(15)組織和/或類器官(16)新生血管形成區(17)注入口附圖簡要說明

圖1:一種自含式循環系統(I)的一個優選實施方案的自頂向下視圖，該循環系統包括兩個毛細管生長區段(2)、定向泵送裝置(5)以及小動脈運輸通道(6)和小靜脈運輸通道(7)。在一個優選實施方案中，泵送裝置(5)和這兩個毛細管生長區段(2)是平行安排的。運輸通道(6，7)用作定向泵送裝置(5)與毛細管生長區段(2)之間的連接。在一個優選實施方案中，將一個注入口(17)(即用於支持緩衝)緊接該微型泵而定位。通常，被連接至定向泵送裝置(5)的小動脈通道(6)或小靜脈通道(7)在分支點(13)處分支成兩個或三個更小直徑的小動脈和小靜脈的通道。優選地，由不同的組織和/或類器官(15)來定殖毛細管生長區段(2)，這些組織和/或類器官通過相同的循環`流體來灌注並且允許同時例如在多於一個類器官上進行一種化合物的效果的測試。圖2:自含式循環系統(I)的毛細管生長區段(2 )的一個優選實施方案的自頂向下視圖。毛細管生長區段(2)是多個空間，提供這些空間用於通過例如在微型入口(3)與出口(4)之間的內皮細胞來組裝毛細管(14)。為了給毛細管(14)生長提供一個適當的環境，優選的是毛細管生長區段(2)包括一種半固態、生物相容性的基質(8)或由其組成。可替代地，提供生物相容性的中空纖維(9)，這些中空纖維在一側連接至微型入口(3)並且在另一側連接至微型出口(4)。離毛細管(14)的向內流入端最遠的組織位點在毛細管生長區段
(2)內構建了一個新生血管形成區(16)，即一個區段，其中在循環中基本建立毛細管(14)期間，沒有形成毛細管(14)。優選地，毛細管生長區段(2)進一步包括一種毛細管外流體和/或廢物收集器(10)，通過一個細胞截留膜(11)使該毛細管外流體和/或廢物收集器與其餘的毛細管生長區段(2)分開。為了監測該系統的狀態，將一個或多個傳感器(12)安排在毛細管外流體和/或廢物收集器(10)中。圖3:在實例實驗中使用的自含式循環系統的一個優選實施方案的自頂向下視圖，該自含式循環系統裝備有一個蠕動泵(5)、用於液體置換的三個閥、一個插入件(15)以及支持填充和衝洗該系統的兩個收集器(10)。圖4:在灌注培養七天後，完全覆蓋有人內皮細胞的自含式微循環系統的通道的一個具體區段的鈣黃綠素AM生活力染色。圖5:在灌注七天後，完全覆蓋有人內皮細胞的自含式循環系統晶片的CellMask1:突光質膜染色。實例通過用無菌培養基中的活的人內皮細胞完全覆蓋如在圖3中所示的一個生物反應器原型晶片的所有通道和表面，在14天的時期內已經建立了一個自含式循環系統(I)。使用一個蠕動微型泵(5)來產生穿過組織培養空間(15)的液體循環。將用於外流體和廢物的收集器(10)與閥A、B以及C組合使用，以便管理該系統中的液面和交換。通過使用一個主片(master)和PDMS來鑄造該晶片。然後將該PDMS層轉移到一個載玻片上，並且插入到一個夾具中。通過在該PDMS載玻片頂部上的一個碳酸鹽板，將用於細胞和組織接種物(15)的金屬插件、和外流體或廢物收集器(10)固定到該生物反應器晶片上。一個完全組裝的自含式循環系統晶片在圖4中示出。在第4-7段之間使用了從Promoce 11公司獲得的人真皮微血管內皮細胞(HDMEC )。在使用前，使它們在37° C和5%C02 (潮溼的孵育器)下，在具有內皮細胞生長培養基MV-2((Promocell公司，5%FCS，1%青黴素-鏈黴素)的T-75燒瓶中生長，並且在80%鋪滿時傳代。對於該實驗，通過用PBS洗滌一次並且添加2ml的一種0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液來收集細胞。在37° C下孵育5min內發生這些細胞的脫離。在用DMEM中的10%FCS來中和該胰蛋白酶溶液後，在300x g下將細胞離心5min，並且使用一個血細胞計數器來計數。用80%的乙醇對一個無菌的自含式循環系統晶片衝洗10分鐘。然後使用一個注射器，將PBS注入到這些通道中，並且另外孵育10分鐘。在用HDMEC培養基衝洗這些通道來替換PBS之後，將該晶片在4° C下孵育過夜。為了將該HDMEC種到這些微通道中，將細胞團塊在HDMEC培養基中重新懸浮至2xl07細胞/毫升的最終濃度。將細胞懸浮液轉移至空的插入件(圖3，15)中。為了在該插入件空間與這些收集器(圖3，10)之間產生靜水壓力差，將培養基從這些收集器中去除。然後打開該蠕動泵，以便讓這些細胞填充這些通道。額外地，打開閥A以確保均勻填充整個晶片。為了允許這些內皮細胞附著和鋪散在這些通道表面上，將該自含式循環系統晶片在37° C和5%C02下孵育2h。之後，按如上所述的相同方式，將50 μ I的HDMEC-培養基添加到該插入件中，並且將細胞重新懸浮以填充這些通道。然後用培養基裝滿收集器、關緊，並且將該裝置倒置以便讓這些細胞也 附著至這些通道的頂部。在靜態孵育5h之後，將該晶片連接至氣動泵裝置，並且將閥B和C關閉以形成一個循環的流動。在0.16Hz的泵送頻率和0.3巴的壓力下，將該晶片孵育14天。每天替換該插入件和收集器空間的培養基。通過螢光顯微法來確定剪切對內皮細胞形狀和內皮細胞對所有通道表面的完全封閉覆蓋的影響(圖4和圖5)。
權利要求
1.一種循環系統(1)，該循環系統是自含式的並且包括: a.至少一個毛細管生長區段(2)，該毛細管生長區段包括至少兩個微型入口(3)和兩個微型出口(4)， b.一個定向泵送裝置(5)，以及 c.連接該定向泵送裝置(5)和這至少兩個入口( 3 )的一個小動脈運輸通道(6 )，和連接該定向泵送裝置(5)和這至少兩個出口(4)的一個小靜脈運輸通道(7)。
2.如權利要求1所述的循環系統(I)，其中該循環系統(I)包括至少兩個毛細管生長區段⑵。
3.如權利要求1或2中任一項所述的循環系統(I)，其中一個毛細管生長區段(2)是至少部分可氣體滲透的。
4.如權利要求1至3中任一項所述的循環系統(I)，其中該毛細管生長區段(2)包括一種半固態、生物相容性的基質(8)和/或半固態、生物相容性的中空纖維(9)或由其組成。
5.如權利要求4所述的循環系統(1)，其中該生物相容性的基質(8)包括多個微型通道、結構和/或網絡，它們允許通過內皮細胞來形成毛細管(14)。
6.如權利要求1至5中任一項所述的循環系統(1)，其中該毛細管生長區段(2)的一個區段是沒有微型入口(3)和出口(4)的。
7.如權利要求1至6中任一項所述的循環系統(1)，其中該毛細管生長區段(2)進一步包括一種毛細管外流體和/或廢物收集器(10)。
8.如權利要求 1至7中任一項所述的循環系統(I)，其中通過一個細胞截留膜或通過多個細胞排除通道(11)使該毛細管外流體和/或廢物收集器(10)與該生物相容性的基質(8)和/或生物相容性的中空纖維(9)分開。
9.如權利要求8所述的循環系統(1)，其中至少一個傳感器(12)被安排在該毛細管外流體和/或廢物收集器(10)中。
10.根據權利要求1至9中任一項所述的循環系統(I)，進一步包括在該毛細管生長區段(2)中形成的多個毛細管(14)和/或類器官(15)。
11.根據權利要求1至10中任一項所述的循環系統(1)，其中兩個或更多個不同的組織和/或類器官(15)被維持在一個自含式系統內，這些組織和/或類器官是通過相同的循環流體來灌注的。
12.根據權利要求1至11中任一項所述的循環系統(1)，其中提供了在該毛細管生長區段(2)內的一個子區段(16)，該子區段是沒有微型入口(3)和出口(4)的。
13.根據權利要求12所述的循環系統(1)，其中將該子區段(16)移開離對應的微型入口(3)和微型出口(4)足夠遠，使得在這個子區段中毛細管(14)的形成被削弱。
14.根據權利要求12或13所述的循環系統(I)，其中該子區段(16)具有離這些微型入口(3)和/或微型出口(4)至少100 μ m並且高達500 μ m、優選地100 μ m至300 μ m的距離。
15.根據權利要求1至14中任一項所述的循環系統(I)，其中分別地，該小動脈運輸通道(6 )分支至少一次以與這至少兩個入口( 3 )連接，並且該小靜脈運輸通道(7 )分支至少一次以與這至少兩個出口(4)連接。
16.如權利要求15所述的循環系統(1)，其中在該分支點(13)後的這些小動脈通道的組合橫截面積與在該分支點(13)前面的小動脈通道的橫截面積基本上相同，和/或在該分支點(13)後的這些小靜脈運輸通道(7)的組合橫截面積與在該分支點(13)前面的小靜脈通道的橫截面積基本上相同。
17.如權利要求15或16所述的循環系統(1)，其中所有入口(3)的組合橫截面積與所述一個小動脈通道和/或多個小動脈通道的橫截面積基本上相同，並且所有出口(4)的組合橫截面積與所述一個小靜脈通道和/或多個小靜脈通道的橫截面積基本上相同，優選地與多個小動脈通道和多個小靜脈通道的橫截面積相同。
18.一種建立根據 權利要求1至17中任一項所述的一個循環系統(I)的方法，該方法包括以下步驟: a.將內皮細胞種到該循環系統(I)中，並且 b.孵育至少直至毛細管(14)已經在該毛細管生長區段(2)中形成和/或直至一個內皮細胞層已經在這些運輸通道中形成和/或直至一個內皮細胞層已經覆蓋了該泵送裝置(5 )的所有內表面。
19.根據權利要求18所述的建立一個循環系統(I)的方法，其中該方法進一步包括以下步驟:將全血注入到所述循環系統中。
20.根據權利要求18或19中任一項所述的建立一個循環系統(I)的方法，其中在剪切力下進行步驟b)。
21.通過權利要求18至20中任一項所述的方法可生產的循環系統(I)。
22.根據權利要求1至17或權利要求21所述的循環系統(I)用於監測一種或多種測試化合物的效果和/或用於確定療效、副作用、生物安全性、代謝產物、作用方式或器官再生的用途。
全文摘要
本發明涉及一種自含式循環系統，該自含式循環系統支持在多個毛細管生長區段中形成毛細管並且允許形成多個微型類器官和/或多個微型組織區段，用於監測一種或多種測試化合物的效果並且確定療效、副作用、生物安全性、代謝產物、作用方式或器官再生；連同在所述自含式循環系統中建立這類微型類器官和/或微型組織的多種方法。
文檔編號C12M3/06GK103080296SQ201180038546
公開日2013年5月1日 申請日期2011年8月5日 優先權日2010年8月6日
發明者U·馬克思, G·林德勒, R·霍爾蘭德, S·霍夫曼, R·勞斯特爾 申請人:柏林工業大學