一種新型草坪草種質的創製方法及產品的製作方法

2023-12-05 08:11:11 3

專利名稱：一種新型草坪草種質的創製方法及產品的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新型草坪草種質的創製方法及產品，屬於生物技術領域。
背景技術：
葉片衰老不是葉片細胞的簡單死亡，而是一種動態的細胞程序性死亡過程(programmed cell death, PCD)。葉片衰老外觀上表現為葉色由綠變黃、最後枯死；在生理水平上表現為 蛋白含量及葉綠素含量下降、葉片光合能力降低、膜脂過氧化加劇、游離胺基酸積累、腐胺 含量上升而精胺含量下降、細胞分裂素(CTK)含量下降、脫落酸(ABA)含量上升、膜系統保護 酶活性降低等。
目前，採用基因工程技術抑制植物葉片衰老主要有兩條途徑 一是抑制乙烯合成，二是 促進細胞分裂素合成。異戊烯基轉移酶基因(ipt)是細胞分裂素合成步驟中的一個關鍵酶 ，它在脅迫條件下被激活而引起細胞分裂素(CTK)的大量合成，從而打破細胞中CTK與生長 素的平衡。付強等研究發現，在活體條件下，這種改變不僅能使寄生植物芽大量生長，而且 還會使植物產生對脅迫因子的抗性，推遲葉片衰老的時間。
抗除草劑bar基因不僅在遺傳轉化上作為標記基因，在草坪草育種上也可做功能基因使 用。多年生黑麥草作為草坪草種，在國外已經有許多通過常規育種方法育成的品種，在生態 環境改善、水土保持、城市綠化、運動場地建設等方面發揮了重要的作用。但現有技術中還 沒有關於同時轉有異戊烯基轉移酶基因和抗除草劑基因的草坪草植株的報導。

發明內容
本發明的目的在於，提供一種新型草坪草種質的創製方法及產品。本發明利用異戊烯基 轉移酶基因(ipt)的抗逆特性，將其與抗除草劑基因(bar)構建融合基因，轉入黑麥草植 株中，獲得既抗衰老又抗除草劑的一種新型草坪草種質資源。
本發明的技術方案 一種新型草坪草種質的創製方法，包括下列步驟
A. 愈傷誘導黑麥草系列草坪草成熟種子切去部分胚乳，用75%酒精浸泡40-503，再用 0. P/。HgCl2浸泡2-5min，用無菌水清洗4-6次，吸乾水分接於誘導培養基上，每18-23天繼代 一次；
B. 浸染及篩選挑取含有表達載體pBinAipt-bar的農桿菌EHA105菌落，在含50mg/L卡那 黴素和20mg/L利福平的YEP培養基中26-3(TC震蕩培養至菌液0D6(K)值為0. 5-0. 7時收集菌體，用MS重懸培養基重懸菌體；挑選鮮嫩的愈傷於菌體重懸液中浸泡12-18min，用無菌濾紙吸乾 菌液接於共培養基上，48-72小時後轉入含除草劑Basta 4. 5-5. 5mg/L的篩選培養基上，保持 選擇壓繼代l-3次；
C.分化、生根、移栽將在篩選培養基上存活下來的愈傷組織接於分化培養基上，分化 的幼苗長至2-3cm時轉移至生根培養基中培養，待苗長至5-10cm時打開瓶蓋，煉苗3-5d後移 植到土壤中。
A步驟中所述愈傷組織誘導培養基中含有l. 8-2. 2mg/L 2， 4-二氯苯氧乙酸。 B步驟中所述的MS重懸培養基中含有95-105mg/L乙醯丁香酮和18-22g/L蔗糖。 B步驟中所述的共培養基中含有1.8-2.2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、95-105mg/L乙醯丁香 酮及18-22g/L蔗糖。
B步驟中所述篩選培養基中含有1.8-2.2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、除草劑Basta 4. 5-5. 5mg/L、 240-260mg/L T頭孢黴素及28-32g/L蔗糖。
C步驟中所述分化培養基中含有1.8-2.2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、0. 08-0. 12mg/L 6-苄 氨基嘌呤、240-260mg/L T頭孢黴素及28-32g/L蔗糖。
C步驟中所述生根培養基中含有240-260mg/L頭孢黴素和18-22g/L蔗糖。 植物組織培養各個階段的培養條件為誘導、繼代、篩選均為暗培養；分化、芽增殖和 生根為光照培養，光強為3800-42001ux、 12-16h/d。
如上所述新型草坪草種質的創製方法製得的草坪草種質。 本發明所用生根培養基為1/2MS培養基，其餘培養基均為MS常規培養基。 本發明以農桿菌介導法用雙價表達載體pBinAipt-bar轉化黑麥草，使其獲得既抗衰老又 抗除草劑的能力。發明人利用黑麥草成熟胚為材料進行遺傳轉化並得到轉基因植株，並對該 轉基因植株和非轉基因植株進行了對比1.與非轉基因植株比較轉基因植株表現出分櫱增加 ，葉綠素含量提高等特性；2.PCR檢測結果如圖2所示，轉基因植株出現325bp目標條帶，非 轉基因植株沒有目標帶出現；3.抗除草劑鑑定轉基因植株與非轉基因植株比較表現出對除 草劑抗性增強；4.延緩衰老鑑定轉基因植株離體葉片在光照培養8天後仍然保持綠色，非 轉基因植株離體葉片在培養5天後開始出現黃化，8天後2/3以上葉片黃化。
與現有技術相比，本發明將異戊烯基轉移酶基因(ipt)與抗除草劑基因(bar)構建融 合基因轉入黑麥草中，獲得了同時抗除草劑又延緩衰老的轉基因植株，該植株表現出葉綠素 含量及分櫱數增加，提供了一種更優良的草坪草種質資源。


圖l是黑麥草轉基因植株與非轉基因植株的對照圖，其中A為轉基因植株，B為非轉基因 植株。
圖2是黑麥草轉基因植株和非轉基因植株的PCR檢測結果，其中M: 100bp DNA ladder P: pBinAipt-bar 質粒l、 9、 10、 15、 24:轉基因植株 CK:非轉基因植株
圖3是黑麥草植株抗除草劑的鑑定結果，其中l、 2為轉基因植株，CK為非轉基因植株。 圖4是黑麥草植株延緩衰老鑑定結果，其中l、 2為轉基因植株，CK1、 CK2為非轉基因植株。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步的詳細說明。
具體實施例方式
培養基及培養條件共培養基中含有2. 0mg/ L 2，4-二氯苯氧乙酸、100mg/L乙醯丁香 酮及20g/L蔗糖，MS重懸培養基中含有100mg/L乙醯丁香酮及20g/L蔗糖，篩選培養基中含有 2. Omg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、5mg/L除草劑Basta、 250mg/L T頭孢黴素及30g/L蔗糖，愈傷 組織誘導培養基中含有2. Omg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，生根培養基中含有250mg/L頭孢黴素及 20g/L蔗糖，分化培養基中含有2. Omg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、0. lmg/L 6-苄氨基嘌呤、 250mg/L T頭孢黴素及30g/L蔗糖。實驗中生根培養基為1/2MS培養基，其餘培養基均為MS常 規培養基。植物組織培養各個階段培養條件為誘導、繼代、篩選均為暗培養；分化、芽增 殖和生根為光照培養，光強為40001ux、 14h/d。其中1L MS培養基中包含硝酸鉀(KN03) 1900毫克，硝酸銨(NH4N03) 1650毫克，氯化鈣(CaCl2 2H20) 440毫克，硫酸鎂(MgS04. 7H20) 370毫克，磷酸二氫鉀(腿2P04) 170毫克，硫酸錳(MnS04 4H20) 22. 3毫克，硫酸鋅 (ZnS04*7H20) 8. 6毫克，硼酸(112803) 6. 2毫克，碘化鉀(KI) 0. 83毫克，鉬酸鈉(Na2Mo04 2H20) 0.25毫克，乙二胺四乙酸二鈉(Na2-EDTA.2H20) 37. 25毫克，硫酸亞鐵(FeS04 7H20) 27.8毫克，硫酸銅(CuS04 5H20) 0. 025毫克，氯化鈷(C0C12 6H20) 0. 025毫克，肌醇100毫 克，煙酸0.5毫克，鹽酸硫胺素(維B1) 0. l毫克，鹽酸吡哆素(維B6)0.5毫克，甘氨酸2毫克 ，PH值5. 80。 1L YEP培養集中包含:5. Og蛋白腖，5. Og酵母提取物，2. 5gNaCl， PH值7. 20。
1、黑麥草遺傳轉化
將黑麥草卓越系列草坪草成熟種子切去部分胚乳，用75。/。酒精浸泡45s，再用O. l%HgCl2 浸泡3min，用無菌水清洗5次，吸乾水分接於誘導培養基上，每20天繼代一次。
黑麥草的遺傳轉化採用農桿菌介導法，將製備表達載體pBinAipt-bar的農桿菌EHA105在 含50mg/L卡那黴素和20mg/L利福平的YEP培養基中28。C震蕩培養至菌液OD6oo值為0. 5-0. 7時集菌，用MS重懸培養基重懸菌體。挑選鮮嫩的愈傷於菌體重懸液(OD6oo為0.5-0.7)中浸泡，其間不斷搖動，15min後取出用無菌濾紙吸乾菌液接於鋪有無菌濾紙的共培養基上培養3天。經共培養後的愈傷組織轉入篩選培養基(含除草劑Basta 5.0mg/L)，約40天後大部分愈傷組織褐化死亡，但部分褐化的愈傷組織會長出部分顆粒狀的新鮮愈傷。將在篩選培養基上存活下來的愈傷組織接於分化培養基(2. O)上，分化的幼苗長至2-3cm時轉移至生根培養基中培養，待苗長至5-10cm時打開瓶蓋，煉苗3-5d後移植到土壤中。
按上述方法得到的轉基因植株即為本發明的新型草坪草種質。
2、轉基因植株PCR檢測
用ipt基因特異引物進行PC財廣增，目的片段為325bp。引物序列為Foward: 5'-ATCGGGTCCAATGCTGTCCTC-3;Reverse: 5'-TGCTTAACTCTGGCCTTGGC-3'。
反應體系(20 y 1 volume)
10XPCR buffer (with Mg2+)2. 0 y 1
dNTPs (0. 2 mM each) 1. 6 y 1
Primerl (20 y M) 0.3 y 1
Primer2 (20 y M) 0.3 y 1
Template DNA 0.2 y 1
T叫酶 0. 1 y 1
ddH20至總體積 20 y 1
擴增反應程序為①94。C5min，②94。C30s， 55。C30s， 72。C30s進行35個循環，③72。C10min。
擴增產物在1%瓊脂糖凝膠電泳上檢測並拍照。
隨機選取5株移栽成活的抗性植株提取總DNA進行PC財廣增，發現第1和第24號植株出現325bp目標帶，對照植株沒有目標帶，初步證明目的基因整合到早熟禾植物基因組中(見圖l)c
3、 抗除草劑鑑定
剪取轉基因植株與對照葉位相同完全展開新鮮葉片，插入含有200mg/L的除草劑Basta的培養瓶中培養，對照植株7d即黃化，10d時死亡，轉基因植株葉片7d仍健康，轉基因植株在培養15d後出現黃化。
4、 抗衰老鑑定
7分別取轉基因植株和對照葉位相同，剛展開的完全葉，放在鋪有溼濾紙的培養皿中，保溼離體培養，25'C下光照8h/d。觀察離體葉片的滯綠效果。轉基因植株離體葉片在光照培養8天後仍然保持綠色，非轉基因植株離體葉片在培養5天後開始出現黃化，8天後葉片完全黃化。
權利要求
權利要求1一種新型草坪草種質的創製方法，其特徵在於包括下列步驟
2.根據權利要求l所述的新型草坪草種質的創製方法，其特徵在於 A步驟中所述誘導培養基中含有l. 8-2. 2mg/L 2， 4-二氯苯氧乙酸。
3.根據權利要求l所述的新型草坪草種質的創製方法，其特徵在於 B步驟中所述的MS重懸培養基中含有95-105mg/L乙醯丁香酮和18-22g/L蔗糖。
4.根據權利要求l所述的新型草坪草種質的創製方法，其特徵在於 B步驟中所述的共培養基中含有1.8-2.2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、95-105mg/L乙醯丁香酮及 18-22g/L蔗糖。
5.根據權利要求l所述的新型草坪草種質的創製方法，其特徵在於 B步驟中所述篩選培養基中含有1.8-2.2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、除草劑4. 5-5. 5mg/L、 240-260mg/L T頭孢黴素及28-32g/L蔗糖。
6.根據權利要求l所述的新型草坪草種質的創製方法，其特徵在於 C步驟中所述分化培養基中含有1.8-2.2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、0. 08-0. 12mg/L 6-苄氨基嘌呤、240-260mg/L T頭孢黴素及28-32g/L蔗糖。
7.根據權利要求l所述的新型草坪草種質的創製方法，其特徵在於 C步驟中所述生根培養基中含有240-260mg/L頭孢黴素和18-22g/L蔗糖。
8.根據權利要求l所述的新型草坪草種質的創製方法，其特徵在於 植物組織培養各個階段的培養條件為誘導、繼代、篩選均為暗培養；分化、芽增殖和生根 為光照培養，光強為3800-42001ux、 12-16h/d。
9.如權利要求l-8中任一項所述新型草坪草種質的創製方法製得的草坪草種質。
全文摘要
本發明提供了一種新型草坪草種質的創製方法及產品。本發明採用農桿菌介導法，經過愈傷誘導、浸染及篩選、分化、生根、移栽等步驟，用雙價表達載體pBinAipt-bar對黑麥草進行遺傳轉化，得到既抗衰老又抗除草劑的黑麥草轉基因植株。與現有技術相比，本發明將異戊烯基轉移酶基因(ipt)與抗除草劑基因(bar)構建融合基因轉入黑麥草中，獲得了同時抗除草劑又延緩衰老的轉基因植株，該植株表現出葉綠素含量及分櫱數增加，提供了一種更優良的草坪草種質資源。
文檔編號A01H4/00GK101461326SQ20071020317
公開日2009年6月24日 申請日期2007年12月18日 優先權日2007年12月18日
發明者曾曉芳, 趙德剛, 黃傲楠 申請人:貴州大學