一種支持cho細胞大規模高密度懸浮培養的無血清培養基的製作方法

2023-12-09 04:17:31 1

專利名稱：：一種支持cho細胞大規模高密度懸浮培養的無血清培養基的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種支持哺乳動物細胞培養的無血清培養基，具體地說是支持CHO細胞大規模高密度懸浮培養的無血清培養基，屬於細胞工程
技術領域：
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背景技術：
：CHO(Chinesehamsterovary)細胞與其它動物細胞相比，具有外源蛋白易在細胞中合成並分泌到培養基中；能正確組裝多亞基蛋白；重組蛋白的摺疊與修飾、理化性質、生物學性質幾乎與天然蛋白相同；能大規模無血清高密度培養等優點。因此，CHO細胞在生物製藥中得到了廣泛的應用，在已經上市和處於不同臨床試驗研究階段的基因工程藥物中，超過70%為哺乳動物細胞表達產品，而CHO細胞表達產品佔其中的絕大部分。CHO細胞系貼壁依賴性細胞，傳統的細胞貼壁培養由於受細胞貼附面積的限制，極大的限制了細胞的產能。隨著動物細胞懸浮培養技術的不斷發展，單個細胞懸浮培養技術的優勢日益顯現。相對於動物細胞貼壁培養而言，單個細胞懸浮培養具有細胞生長均一性好、傳質效率高、容易實現規模放大和過程控制的特點。哺乳動物細胞的懸浮培養已成為目前動物細胞培養的理想模式和動物細胞表達產品工業化生產的首要選擇，超過80%的哺乳動物細胞表達生物技術藥物採用動物細胞懸浮培養為其生產工藝。對於CHO細胞懸浮培養而言，要在規模化的培養中獲取好的培養結果，設計出適宜細胞懸浮生長的培養基是至關重要的。細胞培養基是動物細胞體外培養的最重要因素之一。細胞培養基的發展已經歷了天然培養基、合成培養基及無血清培養基三個階段。無血清培養基因其組成成份相對清楚、不存在動物源性病原微生物汙染、批次間重複性好、蛋白質含量低或不含蛋白質、便於細胞表達產品的分離純化等優點，在哺乳動物細胞表達產品的規模化生產中得到普遍的應用。目前，國內雖已針對CHO細胞開發了多種無血清培養基，但其細胞培養方式多為貼壁培養，難於適應目前動物細胞培養的應用現狀和發展趨勢。同時，其所支持的細胞最大生長密度往往較低，不能滿足CH0細胞大規模高密度培養的需求。Hyclone、Invitrogen等多家國外培養基供應商已開發出多種針對CHO細胞懸浮培養的商業化無血清培養基，其中包括CH0無血清培養基、CH0無蛋白培養基和化學成分明確的CH0無血清培養基，但商業化無血清培養基的組成配方一直是秘而不宣的核心商業機密，此外，昂貴的價格以及適用細胞系範圍較窄的不足，也在很大程度上限制商品化CHO細胞無血清培養基的應用。因此，本領域迫切需要開發新的適合CH0細胞大規模懸浮培養的無血清培養基。
發明內容本發明的目的是提供一種新的支持CH0細胞大規模高密度懸浮培養的無血清培養基，該培養基可以支持CH0細胞在懸浮培養條件下，呈單個懸浮細胞快速生長並達到較高的培養密度。本發明的發明思路為在現有的基礎培養基中，主要包括葡萄糖、胺基酸、維生素、無機鹽等其它多種成分。在進行動物細胞培養時，常常需要在基礎培養基中添加一定濃度的動物血清，才能使細胞較好的生長。在進行動物細胞無血清培養時，則必須在基礎培養基中添加血清替代成分，如結合蛋白、激素、生長因子、低分子量營養物質如微量元素、脂類等，從而使細胞的培養效果相當於或好於有血清的培養基。本發明所提供的一種適合CHO細胞大規模懸浮培養的無血清培養基，就是依據如上的構想，選用匿EM/F12(v/v，1:l)作為基礎培養基，並添加化學成分明確的血清替代成分和具有保護細胞受流體剪切力損傷及抑制細胞聚集成團的化合物組成。基於以上考慮，本發明的無血清培養基在DMEM/F12(v/v，1:1)基礎培養基中選擇了如下有效成分胰島素促進細胞對葡萄糖和胺基酸的攝取，並促進細胞生長。腐胺具有促進蛋白和核酸合成的作用及調節細胞內pH的作用。轉鐵蛋白結合鐵的糖蛋白、與細胞表面專一受體結合作用，傳遞鐵離子、協助鐵的吸收，可絡合有害離子，起解毒作用，同時還有生長因子的作用。穀胱甘肽具有保護細胞膜免受自由基損傷的作用。乙醇胺是無血清培養基的重要組成部分，與磷脂(磷脂醯乙醇胺)的合成有關。卵磷脂卵磷脂作為細胞膜的重要組成部分。羥丙基_|3_環狀糊精貯存及運送生物大分子，提高生物活性物質的穩定性和生物利用度。|3-巰基乙醇促進胱氨酸的吸收，還可使穀胱甘肽處於還原狀態，從而保護細胞免受過氧化氫的損傷。抗壞血酸在細胞生長代謝過程中，具有促進細胞生長和保護細胞免受氧自由基損傷的作用。微量元素主要起調節、傳遞和控制的作用，如Fe:酶和血紅素的輔基、是線粒體中呼吸鏈的組成部分。Cu:超氧化物歧化酶的輔基，是線粒體呼吸鏈的組成部分。Mn:超氧化物歧化酶、水解酶、激酶和轉移酶的輔基，參與細胞代謝。Zn:酶的輔基，參與細胞代謝。Mo:黃嘌呤氧化酶、醛氧化酶、亞硫酸氧化酶的輔基，它參與細胞內的電子傳遞、機體內鐵代謝和醛的氧化等。Se:穀胱甘肽還原酶的組成部分、具有抗氧化作用。V:調節細胞鈉/鉀ATP酶、磷醯轉移酶、腺苷酸環化酶、蛋白激酶類的輔因子，與細胞的蛋白質和脂類代謝關係密切。本發明培養基中還可添加嵌段式聚醚F-68(PluronicF-68):PluronicF-68作為一種表面活性劑，可有效的降低細胞懸浮培養過程中流體剪切力對細胞的損傷，同時對細胞也具有一定生物學活性。穀氨醯胺為細胞提供必需的氮源，促進細胞內蛋白質合成、細胞生長和分化。4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES):pH緩衝劑，維持培養基pH的相對恆定。硫酸葡聚糖硫酸葡聚糖作為高度磺化硫酸聚陰離子物質，可以通過改變細胞表4面的電荷，促使單個細胞的懸浮，進而達到抑制細胞聚集成團的目的。根據上述物質對細胞生長的不同作用，本發明在DMEM/F12(v/v，1:1)培養基的基礎上，將上述物質按以下濃度加入到DMEM/F12(v/v，1:1)培養基中，組成了一種新的CHO細胞無血清培養基。其中添加物中含有腐胺轉鐵蛋白穀胱甘肽乙醇胺卵磷脂羥丙基-e-環狀糊精P-巰基乙醇抗壞血酸20.550.511100105mg/L0.8mg/L7mg/Llmg/L3mg/L2mg/L-200mg/L20iiM510mg/L所述的添加物，還含有以下微量元素Na2Se03MnS04H20Na2Mo042H20NaV03CuS045H20ZnS047H20FeC6H507510nM0.5InM510nM510nM510nM13iiM35iiM。所述的添加物，還含有以下物質穀氨醯胺5mM硫酸葡聚糖25mg/LPluronicF-68lOOOmg/LHEPES15mM。本發明提供的無血清培養基與現有CHO細胞無血清培養基相比具有以下優點1.能夠支持CHO細胞在懸浮培養條件下呈單個懸浮細胞快速生長。2.添加成份明確、組成相對簡單、易於配製。3.細胞生長良好、細胞培養密度和細胞活力高於有血清培養基和同類商品化無血4.成本低廉。下面將結合附圖和實例對本發明做進一步說明,圖1A為倒置顯微境下觀察的在含5X(v/v)小牛血清DMEM/F12(v/v，1:1)培養基中生長的CHO細胞；圖IB為倒置顯微境下觀察的在本發明無血清培養基中生長的CHO細胞；圖2為CHO細胞在本發明無血清培養基中和含5%(v/v)小牛血清DMEM/F12(v/v，l:1)培養基中批次培養的活細胞密度變化。A、B分別表示CHO細胞在無血清培養基及含5%(v/v)小牛血清DMEM/F12(v/v，1:1)培養基中批次培養的活細胞密度；圖3為CHO細胞在本發明無血清培養基中與Hyclone公司的無血清培養基(SFM-CHO)中批次培養的活細胞密度變化。A、B分別表示CHO細胞在本發明無血清培養基及Hyclone公司SFM-CHO培養基中批次培養的活細胞密度；圖4為CHO細胞在5L攪拌罐式生物反應器中用本發明無血清培養基培養的活細胞密度。具體實施例方式實施例1:運用統計學方法Plackett-Burman及響應面法確定CHO細胞無血清培養基添加成分及其最適使用劑量將CHO細胞(CH0-K1，ATCCCat.No.CC1-61)按3-3.5X105cells/m接種於100ml三角瓶中，培養體積為35ml，培養時加入含有5mM穀氨醯胺、0.1%(v/v)PluronicF-68及25iig/ml硫酸葡聚糖的無血清培養基或含5X(v/v)血清的DMEM/F12(v/v，1:1)培養基，將三角瓶置於37。C溫箱中搖床上培養，搖床轉速90r/min。CH0細胞懸浮培養無血清培養基的設計以DMEM/F12(v/v，1:1)為基礎培養基，應用Plackett-Burman方法考察胰島素(X》、腐胺(X》、轉鐵蛋白(X》、微量元素(X4，表1)、抗壞血酸(X5)、卵磷脂(X6)、e-巰基乙醇(X7)、穀胱甘肽(X8)、乙醇胺(X9)、e-環狀糊精(X1Q)等IO種添加成分對細胞生長的影響(表2、3)。進而應用響應面方法(RSM)中的Box-behnken對胰島素(X》、腐胺(X》、轉鐵蛋白(X3)對的使用濃度進行優化(表4、5)。在此基礎上加入穀氨醯胺、硫酸葡聚糖、HEPES及PluronicF_68，組成了適用於CHO細胞懸浮培養的無血清培養基的組成配方(表6)。表1.微量元素的組成成分tableseeoriginaldocumentpage6表2.Plackett-Burman設計因素水平tableseeoriginaldocumentpage7表4.響應面設計tableseeoriginaldocumentpage8tableseeoriginaldocumentpage8表5.響應面設計及響應值tableseeoriginaldocumentpage8表6.無血清培養基的組成及用量tableseeoriginaldocumentpage9實施例2:培養基的配製和CHO細胞培養1.培養基配製:在以DMEM/F12(v/v，l:胰島素2mg/L腐胺0.5mg/L轉鐵蛋白5mg/L穀胱甘肽0.5mg/L乙醇胺lmg/L卵磷脂lmg/L羥丙基-P-環狀糊精lOOmg/LP-巰基乙醇10iiM1)為基礎培養基中添加以下物質:0090]抗壞血酸5mg/L:0091]所述的添加物還含有以下微量元素:0092]Na2Se035nM:0093]MnS04H200.5nM:0094]Na2Mo042H205nM:0095]NaV035nM:0096]CuS045H205nM:0097]ZnS047H201iiM:0098]FeC6H5073iiM:0099]所述的添加物還含有以下物質:0100]硫酸葡聚糖25mg/L:0101]穀氨醯胺5mM:0102]PluronicF-681000mg/L:0103]HEPES15mM上述培養基成分溶解於去離子水中，用0.2ym微孔膜濾器過濾除菌。2.細胞培養將預先準備好的CHO細胞(CH0-K1)在無菌操作下，離心去上清，用過濾除菌配製好的上述無血清培養基重新懸浮細胞，將細胞接入100ml三角瓶中，接種密度為3XlScells/ml，培養體積為35ml，將三角瓶置於37。C溫箱中搖床上培養，搖床轉速90r/min。每隔24h取樣計數。同時以添加5mM穀氨醯胺、0.1%(w/v)PluronicF_68、25yg/ml硫酸葡聚糖及5%(v/v)新生小牛血清的DMEM/F12(v/v，1:1)培養基作為對照。整個培養過程持續8d，每天取樣倒置顯微鏡下觀察細胞形態，用CedexA20測定CHO細胞的活細胞密度。在含5%(v/v)小牛血清DMEM/F12(v/v，1:1)培養基中懸浮培養的CHO細胞可見部分細胞集結成團現象(圖1A);CHO細胞在本發明無血清培養基中呈單個細胞懸浮生長(圖IB)。培養第4d，CHO細胞在本發明無血清培養基及含5%(v/v)小牛血清DMEM/F12培養基(v/v，1:1)中的活細胞密度分別達到4.3Xl6cells/ml和2.5Xl6cells/ml(圖2)。實施例3:與Hyclone公司的CHO細胞無血清培養基SFM-CH0比較在Hyclone公司SFM-CH0培養基中加入0.1%(v/v)PluronicF-68及25iig/ml硫酸葡聚糖，採用與實施例2相同的培養方法對CH0細胞(CH0-K1)進行培養。整個培養過程持續8d。培養第4d，CHO細胞在本發明無血清培養基及Hyclone公司SFM-CHO培養基中的活細胞密度分別達到4.2X106cells/ml和3.3X106cells/ml(圖3)。實施例4.在5升攪拌罐式生物反應器中批次懸浮培養1.培養基配方在DMEM/F12(1:1，v/v)基礎培養基中添加以下物質胰島素5mg/L腐胺0.8mg/L轉鐵蛋白7mg/L穀胱甘肽lmg/L乙醇胺3mg/L卵磷脂2mg/L羥丙基-13-環狀糊精200mg/LP-巰基乙醇20iiM抗i不血酸lOmg/L所述的添加物還含有以下微量元素Na2Se0310nMMnS04H20InMNa2Mo042H2010nMNaV0310nMCuS045H2010nMZnS047H203iiMFeC6H5075iiM所述的添加物還含有以下物質硫酸葡聚糖25iig/ml穀氨醯胺5mMPluronicF-68lOOOmg/LHEPEP15mM上述培養基成分溶解於去離子水中，用0.2ym微孔膜濾器過濾除菌。2.細胞培養將在250ml攪拌瓶中用本發明無血清培養基懸浮培養的CHO細胞(CHO-S，Invitrogen公司)按3X105cells/ml接種5L攪拌罐式生物反應器(B.BraunBiotecnlnternational公司)，加本發明無血清培養基至5L設定工作體積。溫度設置為37°C，溶解氧濃度控制在3050%，pH控制在7.17.2，攪拌速度設置為60_70r/min，每天取樣用CedexA20測定細胞密度和細胞活力。整個培養過程持續8d，培養第4d的活細胞密度達到4.6X106cells/ml(圖4)。以上實施例具體使用原料均可從市售途徑得到。本發明使用原料來源l、DMEM/F12(v/v，l:1)培養基、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)購自美國Hyclone公司。2、胰島素、轉鐵蛋白、腐胺、嵌段式聚醚F-68(PluronicF_68)、穀胱甘肽、穀氨醯胺、抗壞血酸、P-巰基乙醇、亞硒酸鈉、硫酸銅、硫酸鋅、乙醇胺均美國Sigma公司產品。3、硫酸葡聚糖購自日本Wako公司。4、卵磷脂德國Merck公司產品。5、羥丙基-13-環狀糊精購自山東恆臺新大精細化工有限公司。6、硫酸錳、鉬酸、偏釩酸鈉、檸檬酸鐵均購於北京化學試劑公司。1權利要求一種用於CHO細胞大規模高密度懸浮培養的無血清培養基，所述培養基包含有基礎培養基和添加物；其特徵在於，所述添加物的組分和用量為胰島素2～5mg/L腐胺0.5～0.8mg/L轉鐵蛋白5～7mg/L穀胱甘肽0.5～1mg/L乙醇胺1～3mg/L卵磷脂1～2mg/L羥丙基-β-環狀糊精100～200mg/Lβ-巰基乙醇10～20μM抗壞血酸5～10mg/L。2.根據權利要求1所述的用於CHO細胞大規模高密度懸浮培養的無血清培養基，其特徵在於，所述添加物中還含有以下組分和用量的微量元素Na2Se03510nMMnS04H200.5InMNa2Mo042H20510nMNaV03510nMCuS045H20510nMZnS047H2013iiMFeC6H50735iiM。3.根據權利要求1或2所述的用於CHO細胞大規模高密度懸浮培養的無血清培養基，其特徵在於，所述添加物中還含有以下用量的物質穀氨醯胺5mM硫酸葡聚糖25mg/L嵌段式聚醚F-68lOOOmg/L4-羥乙基哌嗪乙磺酸15mM。4.根據權利要求1或2所述的用於CHO細胞大規模高密度懸浮培養的無血清培養基，其特徵在於，所述基礎培養基為體積比為1:1的匿EM/F12。5.根據權利要求3所述的用於CHO細胞大規模高密度懸浮培養的無血清培養基，其特徵在於，所述基礎培養基為體積比為1:1的DMEM/F12。6.根據權利要求5所述的用於CHO細胞大規模高密度懸浮培養的無血清培養基，其特徵在於，所述培養基用於CHO細胞的高密度懸浮培養。全文摘要本發明公開了一種適於CHO細胞大規模高密度懸浮培養的無血清培養基。該培養基是以DMEM/F12(v/v，1∶1)為基礎培養基，並添加了胰島素、腐胺、轉鐵蛋白及微量元素等其它物質。本發明提供的無血清培養基具有以下優點能夠支持CHO細胞在懸浮培養條件下快速生長；蛋白含量很低且化學成分基本明確。細胞呈單個懸浮生長、活細胞密度和細胞活率高於有血清和同類商品化無血清培養培養；成本較低。文檔編號C12N5/075GK101724600SQ200910241670公開日2010年6月9日申請日期2009年11月30日優先權日2009年11月30日發明者劉興茂,劉紅,葉玲玲,吳本傳,李世崇,王啟偉,謝靖,陳昭烈申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所