由幹細胞產生神經細胞的方法及培養幹細胞的培養基的製作方法

2023-12-09 09:17:36 3

專利名稱：由幹細胞產生神經細胞的方法及培養幹細胞的培養基的製作方法
技術領域：
本發明是關於由幹細胞產生神經細胞的方法及培養幹細胞的培養基。
背景技術：
許多臨床上常見的慢性神經退化疾病，如帕金森氏症、阿茲海默症、亨丁頓氏症及肌萎縮性脊髓側索硬化症，都是由於中樞神經系統(CNS)中的神經細胞退化及死亡造成的結果。神經細胞不像表皮及肝臟細胞，無法快速地再生。雖然CNS中的幹細胞在正常及神經細胞受損的情況下都可複製及分化，但其複製速度相當慢，且分化成神經細胞的比例非常低。CNS中大部分的幹細胞會分化成神經膠質細胞，因而無法挽救神經退化疾病。
神經細胞移植已提供一個治療神經退化疾病的方向，研究人員已試著在活體外及活體內從不同的幹細胞產生神經細胞。一般相信幹細胞具有某些特性，包括自我更新、多能性、增殖、長壽及分化。在臨床的應用上，胚胎、臍帶血及骨髓是最普遍的人類幹細胞來源。在胚胎中可治療中樞神經系統病變的幹細胞主要是神經幹細胞及囊胚的胚胎幹細胞(R.L.Rietze et al.，2001，Nature 412；736-739)。研究也指出為了修還脊髓創傷，以胚胎幹細胞(J.W.McDonald et al.，1999，NatureMedicine 51410-1412)或神經幹細胞(Q.L.Cao et al.，2001，Experimental Neurology 16748-58)移植後，這些細胞主要分化成星細胞及寡樹突細胞，極少數轉變為神經細胞。除了取得困難、移植後的生存率不高及轉變為神經細胞的比例極低外，胚胎組織的移植也因為宗教、法律及道德爭議而受到阻礙。
藉由直接植入臍帶血中的造血幹細胞以治療受損神經細胞仍有待研究。然而，活體外模式顯示，臍帶血中的造血幹細胞培養在含有0.001％的β-巰基乙醇(BME)培養基中可轉型成神經細胞的前趨物，其中10％的細胞可進一步被誘導而分化成神經細胞及神經膠質細胞(J.R.Sanchez-Ramos et al.，2001，Experimental Neurology 171109-115；及Y.Ha et al.，2001，Neuroreport 12(16)3523-3527)。由於臍帶血幹細胞轉變成神經細胞的比例相對地較低，因此臍帶血的應用及研究主要集中在血液疾病。
骨髓中含有造血幹細胞，其提供紅血球、血小板、單核細胞、顆粒細胞及淋巴細胞前趨物的持續來源。此外，骨髓也含有達到非血液組織幹細胞標準的細胞。已有報告老鼠成熟骨髓中的造血幹細胞可分化成腦中的微神經膠質細胞及大神經膠質細胞(M.A.Eglitis et al.，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.944080-4085)。骨髓基質中的非造血幹細胞被稱為骨髓基質細胞(BMSC)或骨髓間葉細胞。BMSC在活體外可分化成骨生成細胞、軟骨生成細胞、脂肪生成細胞、肌纖維生成細胞及其它系統(M.F.Pittenger et al.，1999，Science 284143-147及B.E.Petersenet al.，1999，Science 2841168-1170)。最近，BMSC已被報告可在活體內分化成神經細胞(S.A.Azizi et al.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.953908-3913；及G.C.Kopen et al.，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.9610711-10716)。
以上所有利用多效性細胞產生神經細胞的方法都有一個共通的問題這些細胞大部分都分化成神經膠質細胞(星狀細胞、寡樹突細胞等)而非神經細胞。只有在BMSC的活體外培養發現BME在神經分化上有顯著的效果，其可誘導80％的培養BMSC分化成神經細胞(D.Woodbury et al.，2000，Journal of Neuroscience Research 61364-370)。然而，BME對蛋白質具有毒性而不適用於人體(K.White et al.，1973，Journal of pharmaceutical Sciences 62237-241)。因此仍需要開發更有效率的方法將幹細胞轉型成神經細胞。

發明內容
本發明是提供由幹細胞產生神經細胞的方法，其包括在培養基中培養神經細胞及在所產生的混合物中培養幹細胞。
本發明也提供培養幹細胞的培養基，其是藉由將神經細胞培養於基礎培養基而製備。


圖1表示臍帶間葉細胞在(A)FBS-DMEM培養基(控制組)及(B)培養過神經細胞的培養基中培養6天後的型態。
圖2表示臍帶間葉細胞在培養過神經細胞的培養基中培養6天後，(A)NF及(B)NeuN的免疫染色結果。
圖3表示臍帶間葉細胞以培養過神經細胞的培養基處理不同時間後，其表現NF的比例。
圖4表示臍帶間葉細胞以培養過神經細胞的培養基處理後，GluR5、GluR6、GluR7及KA2的西方墨點法結果。
圖5表示臍帶間葉細胞以培養過神經細胞的培養基培養9天後，其(A)parvalbumin(PV)及(B)calbindin-D28K(CB)的免疫染色結果。
圖6表示臍帶間葉細胞以培養過神經細胞的培養基培養6天後，其GAD的(A)免疫染色及(B)西方墨點法結果。
圖7(A)表示經培養過神經細胞的培養基誘導的臍帶間葉細胞在處理後第0、3、6及9天時，其細胞密度的改變(比例尺100μm)；(B)表示臍帶間葉細胞以培養過神經細胞的培養基處理後，以DAPI染色定量細胞密度。
圖8表示臍帶間葉細胞以培養過神經細胞的培養基培養3天(3D)及9天(9D)後，以DAPI+BrdU雙重染色及NF+BrdU雙重染色的結果。
具體實施例方式
為克服上術現有技術的缺點，本發明主要目的是藉由將神經細胞培養於基礎培養基6至9天而製備的培養基培養的臍帶間葉細胞，可高度(87％)分化成功能性後分裂神經細胞。
不欲受限於理論，吾人相信培養的神經細胞可釋放出某種物質組合，其提供理想狀況使幹細胞分化成神經細胞。
在此使用的″幹細胞″乙詞是指任何未分化、多能性(pluripotent)或多效性(multipotent)的哺乳動物細胞，包括但不限於胚胎幹(ES)細胞，胚胎生殖(EG)細胞，胚胎癌(EC)細胞，骨髓基質細胞，骨髓造血細胞，臍帶血細胞及臍帶間葉細胞。以上所有幹細胞除了臍帶間葉細胞外，都已被報告可分化成神經細胞及/或膠質細胞。然而，經由本發明的培養方法，即使是臍帶間葉細胞也可高比例地分化成功能性神經細胞。
因此，任何哺乳動物幹細胞皆適用於本發明的方法。較佳是使用間葉細胞如BMSC或臍帶間葉細胞。
本發明中用於製備培養基的神經細胞可得自哺乳動物之外圍神經系統及中樞神經系統(CNS)。較佳是得自中樞神經系統的神經細胞，更佳是得自腦部，最佳是得自海馬回。
本發明的培養基可藉由將神經細胞培養於任何現有的培養基而得。本發明適用的基礎培養基包括但不限於添加胎牛血清的達爾克必須基本培養基(FBS-DMEM)。
應了解本發明所用的基礎培養基可添加一般用於細胞培養的其它添加物。
根據本發明，神經細胞以現有方法在基礎培養基中培養3至6天，較佳是5天。所產生的混合物可直接用於培養幹細胞。
根據本發明，在成熟神經細胞收成的前，幹細胞以現有方法培養於本發明培養基6至12天。較佳是在培養的第九天收成。
培養的神經細胞被移走後，本發明的培養基可分裝為小份保存以作為將來使用。
以下分析是用以定性根據本發明的方法所產生的神經細胞。
NF的免疫細胞化學神經纖維(NF)是神經細胞中的主要細胞骨骼，其負責調整神經細胞樹突的大小、外觀及直徑。只有在發育晚期及成熟期的神經細胞才會表現NF。對NF的免疫染色可用以確定神經細胞處於晚期。
NeuN的免疫細胞化學神經細胞特定核蛋白(NeuN)是脊椎動物中樞神經系統神經細胞細胞核中的特殊蛋白。在活體外NeuN可和DNA結合。已知在神經細胞發育中，NeuN的出現較NF早。因此對NeuN的免疫染色可用以確定神經細胞處於轉型早期。
GluR5、GluR6、GluR7及KA2的西方墨點法在哺乳動物的CNS中，谷胺酸是主要的刺激神經傳導物質。大部分的神經細胞都有谷胺酸受體來接收刺激信息。其中主要有二類谷胺酸受體離子型及代謝型。離子型受體可依照其不同的選擇性激動劑，進一步再分為NMDA(N-甲基-D-天門冬胺酸)受體、AMPA(α-胺基-3-羥基-5-甲基-4-異唑基丙酸)受體及KA(海人草酸)受體。KA受體是由GluR5、GluR6、GluR7、KA1及KA2等次單元形成。因此，利用西方墨點法檢測GluR5、GluR6、GluR7及KA2可確定神經細胞具有合成功能性蛋白質的能力。
Ca2+結合蛋白的免疫細胞化學Ca2+在細胞的信息傳遞途徑中扮演重要的角色。然而，在細胞中大部分的Ca2+並不是單獨作用，而是和Ca2+結合蛋白相結合。Ca2+結合蛋白可以緩衝細胞內的Ca2+濃度，進而調節Ca2+的活性。在中樞神經系統中存在著許多種類的Ca2+結合蛋白，分布最廣的是parvalbumin(PV)、calbindin-D28K(CB)及calretinin。PV及CB皆屬於EF-hand型Ca2+結合蛋白家族。在胚胎神經系統發育期間，PV及CB被認為是神經細胞特定表現的Ca2+結合蛋白。因此，對PV及CB的免疫染色可用以確定神經細胞具有合成功能性蛋白質的能力。
BrdU及DAPI的雙重標記DAPI(4′，6-二基-2-苯基 二鹽酸鹽)是一種螢光染料，可自由地通過細胞膜和核膜，並和細胞核中的DNA結合，通常用以計算細胞的數目。此外，在細胞複製過程中，細胞須合成另一組染色體，並將外加的BrdU(溴化去氧尿核，其為胸腺嘧啶核 酸的相似物)納入所合成的染色體中。因此，觀察BrdU的納入可用以確定細胞的複製。BrdU及DAPI的雙重標記可確定神經細胞的複製。
BrdU及NF的雙重標記如上所述，NF的免疫染色用以確定是否為神經細胞，BrdU則用以確定細胞的複製。因此，NF及BrdU的雙重標記可確定神經細胞的複製能力。
GAD的免疫細胞化學GABA是神經傳導物質的一，其是由谷胺酸經谷胺酸去羧基(GAD)催化而合成。因此，利用對GAD的免疫染色可確定神經細胞具有合成神經傳導物質GABA的能力。
根據本發明的方法所產生的神經細胞可用於治療神經退化疾病，如帕金森氏症、阿茲海默症、亨丁頓氏症，及肌萎縮性脊髓側索硬化症或因中風及外傷造成的神經細胞死亡。
由以下的實施例對本發明做進一步說明，但不應以此限定本發明的範圍。
實施例1人類臍帶間葉細胞的製備人類臍帶間葉細胞是從一提供接生服務的診所(蔡氏婦產科診所，臺北市北投區石牌路一段72號)取得。臍帶以無菌操作方式收集並在4℃下儲存於HBSS(Biochrom L201-10)不超過24小時。
臍帶先泡在75％的乙醇中30秒以消毒。在無菌操作臺中將消毒過的臍帶置於無鈣及無鎂離子的緩衝溶液(CMF，Gibco 14185-052)，以消毒過的器具將臍帶縱切，並將其中的血管及間葉組織(瓦頓氏凝膠)去除。將間葉組織切成0.5立方公分的小塊，以250×g離心5分鐘。去除上清液，並以適量的無血清DMEM(Gibco 12100-046)清洗沉澱物二次，再以250×g離心5分鐘。間葉組織在37℃下以膠原 處理14至18小時，清洗後，再以2.5％的胰蛋白於37℃及震蕩下處理30分鐘。加入FBS(Hyclone SH30071.03)至間葉組織以終止胰蛋白 反應。此時間葉組織已變成間葉細胞。
間葉細胞以10％FBS-DMEM使其分散並計算其數量後，便可直接用於培養。
實施例2培養過神經細胞的FBS-DMEM的製備用以製備培養過神經細胞的FBS-DMEM的神經細胞是取自七天大的史泊格多利(Sprague-Dawley)大鼠的腦部(中華民國臺灣省臺北市國立陽明大學動物中心)。
在以下的操作的前，先將含有24ml 10％FBS-DMEM的50ml離心管置於37℃培養箱內。
大鼠以i.p.注射給予0.3ml的10％水合氯化物。3至4分鐘後，完全麻醉的大鼠以75％乙醇全身消毒。在無菌操作臺中將大鼠腦取出並置於CMF中。將腦以900rpm離心5分鐘。去除上清液，添加10％FBS-DMEM至沉澱物(腦組織)。以移液器吸放15次將腦組織打散成單細胞。將打散的細胞加至的前準備的50ml離心管，與其中的FBS-DMEM充分混合。將此混合物加至24孔盤的塗覆有聚-L-離胺酸的孔中，在37℃培養箱中培養。第二天加入最終濃度為2μM的阿糖胞(Arac)。
培養的第五天，此培養基即可取出用來培養臍帶間葉細胞。
實施例3臍帶間葉細胞轉型為神經細胞將由實施例1得到的臍帶間葉細胞，培養於由實施例2得到的培養過神經細胞的FBS-DMEM培養基中，或培養於FBS-DMEM(控制組)中，置於37℃培養箱。在第3、6、9及12天收集細胞。
如圖1(A)所示，培養於FBS-DMEM 6天的臍帶間葉細胞(控制組)的形態為紡錘型，且因細胞增殖而互相緊密地貼附。培養於培養過神經細胞的FBS-DMEM培養基6天的臍帶間葉細胞顯現神經的表型，包括細胞體收縮、精緻化歷程(process elaboration)及細胞集簇(圖1B)。
實施例4分析在實施例3中收集的細胞用以做以下的分析，其結果描述如下(1)NF的免疫染色以0.1M磷酸緩衝液(0.1M PBS，pH 7.4)清洗生長在蓋玻片上6天的細胞5分鐘二次；再以固定液(4％多聚甲醛溶於0.1M PBS中)固定20分鐘；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以阻斷液(0.05％ TritonX-100、5％正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)處理30分鐘以避免非專一性抗體-抗原結合。
處理後的細胞與初級抗體(兔子抗神經纖維200多株IgG，1∶250稀釋，Chemicon AB1982)在4℃下反應至少12至18小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再與二級抗體(生物素共軛的的山羊抗兔子IgG，1∶1000稀釋，Sigma b-8895)在室溫下反應1小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；接著與親和素-生物素化-辣根過氧化 還合物(ABC KIT，Vectorlabs PK-4000)在室溫下反應1小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以3，3′-二胺基聯苯胺(5mg DAB，3.5μl的30％H2O2溶於10ml的50mM Tris緩衝溶液中)顯影。
以上得到的樣品以濃度漸增(50％、70％、80％、90％、95％及100％)的乙醇及二甲苯進行脫水反應，每一濃度5分鐘。蓋玻片以封片膠(permount)封在載玻片上並在光學顯微鏡(Olympus BH-2)下觀察。
如圖2(A)所示，培養於培養過神經細胞的FBS-DMEM培養基6天的臍帶間葉細胞表現NF，顯示其已轉型成神經細胞。
本實驗也測定以培養過神經細胞的FBS-DMEM培養基處理不同時間的臍帶間葉細胞表現NF的比例。如圖3所示，處理後第3天有59.4％的臍帶間葉細胞表現NF，處理後第6天NF的表現量達到最大，87.4％。處理時間延長NF表現量既不升高也不降低(n＝3，單因子變異數分析，續以LSD分析，P＜0.01)。
(II)NeuN的免疫染色以0.1M磷酸緩衝液(0.1M PBS，pH7.4)清洗生長在蓋玻片上6天的細胞5分鐘二次；再以固定液(4％多聚甲醛溶於0.1M PBS中)固定20分鐘；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以阻斷液(0.05％ TritonX-100、5％正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)處理30分鐘以避免非專一性抗體-抗原結合。
處理後的細胞與初級抗體(小鼠抗神經核單株IgG，1∶100稀釋，Chemicon MAB377)在4℃下反應至少36至42小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再與二級抗體(生物素共軛的山羊抗老鼠IgG，1∶250稀釋，Chemicon AP124B)在室溫下反應1小時；再以0.1M PBS清洗5分鐘三次；接著與親和素-生物素化-辣根過氧化 還合物(ABC KIT，Vectorlabs PK-4000)在室溫下反應1小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以3，3′-二胺基聯苯胺(5mg DAB，3.5μl的30％H2O2溶於10ml的50mM Tris緩衝溶液中)顯影。
以上得到的樣品以濃度漸增(50％、70％、80％、90％、95％及100％)的乙醇及二甲苯進行脫水反應，每一濃度5分鐘。蓋玻片以封片膠封在載玻片上並在光學顯微鏡(Olympus BH-2)下觀察。
如圖2(B)所示，培養於培養過神經細胞的FBS-DMEM培養基6天的臍帶間葉細胞表現NeuN，顯示其已轉型成神經細胞。
(III)GluR5、GluR6、GluR7及KA2的西方墨點法(a)細胞膜的製備細胞膜的製備是由以培養過神經細胞的FBS-DMEM處理不同時間的臍帶間葉細胞及七天齡大鼠的腦而得。以0.1M磷酸緩衝液清洗培養的細胞3分鐘二次。在4℃下添加Tris-HCl緩衝液(50mM，pH7.4)至細胞，以刮刀將細胞從培養皿上刮除。將刮除的細胞置於一15ml的鐵氟龍-玻璃均質機中磨20次以使其均質化，接著在4℃下以30000g離心30分鐘。所得到的沉澱物大部分為細胞膜，再磨沉澱物並溶解於適量的Tris-HCl緩衝溶液中，儲存於-20℃冰箱中以備將來使用。
(b)蛋白質濃度的測定為了用於西方墨點法，由以上方法得到的樣品中的蛋白質以595nm吸光值測定蛋白質濃度，此蛋白質濃度的測定是依據Bradford法實施(MM.Bradford，1976，Analytical Biochemistry 72248-254)。
(c)電泳樣品中的蛋白質以20％SDS-PAGE分離。將凝膠中分離的蛋白質轉印至PVDF膜(NEW，NEF1002)以用於西方墨點法(d)西方墨點法以TBS溶液(0.9％NaCl溶於50mM Tris-HCl中，pH7.4)清洗含有蛋白質的PVDF膜30分鐘二次。以溶有5％脫脂奶粉的TBS緩衝液進行阻斷反應60分鐘。接著將PVDF膜浸泡於阻斷液(0.05％Triton-X100、5％正常山羊血清及3％BSA)60分鐘後，以TBS緩衝液清洗，再與初級抗體(兔子抗KA2多株IgG，1∶1800稀釋，UPSTATE06-315；山羊抗GluR5多株IgG，1∶30稀釋，Santa Cruz sc-7617；山羊抗GluR6多株IgG，1∶30稀釋，Santa Cruz sc-7618；山羊抗GluR7多株IgG，1∶30稀釋，Santa Cruz sc-7620；及兔子抗谷胺酸去羧基 多株IgG，1∶1500稀釋，Chemicon AB108)在4℃下反應12至18小時。
反應完成之後，以TTBS(0.05％Tween-20溶於TBS中)清洗PVDF膜30分鐘二次後，將此膜浸泡於阻斷液中60分鐘，再與二級抗體(抗Glu5/6/7的生物素-抗山羊/綿羊IgG，1∶200稀釋，Sigma B-3148；及抗KAR2/GAD的生物素-抗兔子IgG，1∶250稀釋，Chemicon AP187B)在室溫下反應1小時。以TTBS清洗反應過後的PVDF膜30分鐘二次，再與親和素-生物素化-辣根過氧化 還合物(ABC KIT，VectorlabsPK-4000)在室溫下反應1小時，以0.1M PBS清洗5分鐘三次，再以DAB(5mg DAB，3.5μl的30％H2O2溶於10ml的50mM Tris緩衝溶液中，pH7.4)顯影。
如圖4所示，臍帶間葉細胞在以培養過神經細胞的FBS-DMEM培養基處理前並無表現海人草酸(Kainate)受體次單元。以培養過神經細胞的FBS-DMEM培養基處理後第6天，海人草酸受體次單元，包括GluR6、GluR7及KA2，有少量地表現，處理後第12天，GluR5、GluR6、GluR7及KA2有顯著地表現。
(IV)Parvalbumin(PV)及Calbindin-D28K(CB)的免疫染色以0.1M磷酸緩衝液(0.1M PBS，pH7.4)清洗生長在蓋玻片上6天的細胞5分鐘二次；再以固定液(2％多聚甲醛及7.5％piric酸溶於0.1M的PBS中)固定20分鐘；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以阻斷液(0.05％Triton X-100、正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)處理30分鐘以避免非專一性抗體-抗原結合。
處理後的細胞與初級抗體(山羊抗parvalbumin的多株IgG，1∶40稀釋，Santa Cruz sc-7449及山羊抗calbindin多株IgG，1∶40稀釋，Santa Cruz sc-7691)在4℃下反應至少12至18小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再與二級抗體(生物素共軛的小鼠抗山羊/綿羊單株IgG，1∶250稀釋，Sigma B3148)在室溫下反應1小時；再以0.1M PBS清洗5分鐘三次；接著與親和素-生物素化-辣根過氧化 還合物(ABC KIT，Vectorlabs PK-4000)在室溫下反應1小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以3，3′-二胺基聯苯胺(5mg DAB，3.5μl的30％H2O2溶於10ml的50mM Tris緩衝溶液中)顯影。
以上得到的樣品以濃度漸增(50％、70％、80％、90％、95％及100％)的乙醇及二甲苯進行脫水反應，每一濃度5分鐘。蓋玻片以封片膠封在載玻片上並在光學顯微鏡(Olympus BH-2)下觀察。
如圖5所示，培養於培養過神經細胞的FBS-DMEM培養基9天的臍帶間葉細胞表現parvalbumin(圖5A)及calbindin-D28K(圖5B)，顯示其已轉型成神經細胞並具有合成Ca2+結合蛋白的能力。
(V)GAD的免疫染色及西方墨點法以0.1M磷酸緩衝液(0.1M PBS，pH7.4)清洗生長在蓋玻片上6天的細胞5分鐘二次；再以固定液(2％多聚甲醛及7.5％piric酸溶於0.1M的PBS中)固定20分鐘；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以阻斷液(0.05％Triton X-100、正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)處理30分鐘以避免非專一性抗體-抗原結合。
處理後的細胞與初級抗體(兔子抗谷胺酸鹽去羧基 多株IgG，1∶1500稀釋，Chemicon AB108)在4℃下反應至少12至18小時；以0.1MPBS清洗5分鐘三次；再與二級抗體(生物素共軛的山羊抗兔子IgG，1∶300稀釋，Sigma b8895)在室溫下反應1小時，以0.1M PBS清洗5分鐘三次。接著與親和素-生物素化-辣根過氧化還合物(ABC KIT，Vectorlabs PK-4000)在室溫下反應1小時，以0.1M PBS清洗5分鐘三次，再以3，3′-二胺基聯苯胺(5mg DAB，3.5μl的30％H2O2溶於10ml50mM的Tris緩衝溶液中)顯影。
以上得到的樣品以濃度漸增(50％、70％、80％、90％、95％及100％)的乙醇及二甲苯進行脫水反應，每一濃度5分鐘。蓋玻片以封片膠封在載玻片上並在光學顯微鏡(Olympus BH-2)下觀察。
如圖6(A)所示，培養於培養過神經細胞的FBS-DMEM培養基6天後的臍帶間葉細胞表現GAD，顯示其已轉型成神經細胞並具有合成神經傳導物質GABA的能力。如圖6(B)所示，臍帶間葉細胞可在處理後第6天被誘導出表現GAD的能力，且在第12天GAD的表現量有顯著地增加。
(III)、(IV)及(V)的結果證明根據本發明的方法得到的神經細胞具功能性且可合成具有神經細胞特徵的蛋白質及神經傳導物質。
(VI)DAPI染色以0.1M磷酸緩衝液清洗處理後的細胞5分鐘二次，然後以50μg/ml的DAPI染色30分鐘。細胞以Tris緩衝液(Tris-HCl 50mM，pH7.3)完全清洗並以包埋劑(Tris∶甘油＝1∶1)包埋，在螢光顯微鏡下觀察及計算細胞數目。
圖7(A)顯示細胞密度的顯微影像。利用DAPI標記(藍色)測定處理後第0、3、6及9天的細胞數目。圖7(B)顯示臍帶間葉細胞以培養過神經細胞的FBS-DMEM培養基處理不同時間後的細胞密度。在不同的處理後時間點，利用DAPI染色測定細胞密度的改變。結果指出處理後第9天的細胞密度顯著高於第3天的細胞密度(n＝3，單因子變異數分析，續以LSD分析，P＜0.01)。
(VII)BrdU及DAPI的雙重染色給予生長在蓋玻片上的細胞最終濃度為50μM的BrdU(SigmaB5002，配製為50mM庫存溶液)，並使其繼續生長24小時。以0.1M磷酸緩衝液(0.1M PBS，pH7.4)清洗細胞5分鐘二次；再以固定液(70％乙醇於50mM甘胺酸緩衝液中，pH2.0)在-20℃下固定30分鐘；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以阻斷液(0.05％Triton X-100、5％正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)處理30分鐘以避免非專一性抗體-抗原結合。
處理後的細胞接著與初級抗體(小鼠抗BrdU單株IgG，ChemiconMAB3222，以0.66mM CaCl2及1mM β-巰基乙醇於66mM的Tris緩衝液中1∶100稀釋)在4℃下反應至少36至42小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再與二級抗體(螢光素共軛的山羊抗小鼠IgG，1∶50稀釋，Chemicon AP124F)及1mg/ml DAPI(Sigma D9542)在室溫下反應1小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次。蓋玻片以包埋劑(Vector H-1000)固定於在載玻片上，以指甲油密封，在螢光顯微鏡(Olympus BX50)下觀察。並計算單位面積內被BrdU標記的細胞數目。
(VIII)BrdU及NF的雙重染色給予生長在蓋玻片上的細胞最終濃度為50μM的BrdU(SigmaB5002，配置為50mM庫存溶液)，並使其繼續生長超過24小時。以0.1M磷酸緩衝液(0.1M PB，pH7.4)清洗細胞5分鐘二次；再以固定液(70％乙醇於50mM胺基乙酸緩衝液中，pH2.0)在-20℃下固定30分鐘；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以阻斷液(0.05％Triton X-100、5％正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)處理30分鐘以避免非專一性抗體-抗原結合。
處理後的細胞與初級抗體(小鼠抗BrdU單株IgG，ChemiconMAB3222，以0.66mM CaCl2、1mM β-巰基乙醇於66mM的Tris緩衝溶液1∶100稀釋)在4℃下反應至少12至18小時後；再與另一初級抗體(兔子抗神經纖維多株IgG，1∶250稀釋，Chemicon AB1982)在4℃下反應至少12至18小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再與二級抗體(螢光素共軛的山羊抗老鼠IgG，1∶50稀釋，Chemicon AP124F及若丹明(Rhodamine)共軛的山羊抗兔子IgG，1∶50稀釋，ChemiconAP132R)在室溫下反應1小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次。蓋玻片以包埋劑(Vector H-1000)固定於在載玻片上，以指甲油密封，在螢光顯微鏡(Olympus BX50)下觀察。並計算單位面積內被BrdU標記的細胞數目。
圖8顯示臍帶間葉細胞以培養過神經細胞的FBS-DMEM培養基處理3天後的增殖分析結果(A-F)。大部分被DAPI標記的細胞(A中的藍色)為BrdU-陽性(B中的綠色)。(C)是結果(A)及(B)的合併。處理後第3天的細胞已分化成可表現NF的細胞(D中的紅色)，郄仍被BrdU標記(E中的綠色)。(F)是結果(D)及(E)的合併。以培養過神經細胞的FBS-DMEM處理後第9天的細胞失去增殖能力(G-L)。所有被DAPI標記的細胞(G中的藍色)為BrdU-陰性(H中的綠色)。(I)是結果(G)及(H)的合併。處理後第9天的細胞已分化成可表現NF的細胞(J中的紅色)，但大部分無法被BrdU標記(K中的綠色)。(L)是結果(J)及(K)的合併。總結來說，大部分的細胞在第9天已轉型成神經細胞並停止增殖，由此得知此神經細胞在第9天已進入後分裂階段。
(VII)及(VIII)的結果顯示，以培養過神經細胞的含血清的DMEM培養基培養的臍帶間質細胞可增殖並分化成神經細胞。
權利要求
1.一種由幹細胞產生神經細胞的方法，其特徵在於，該方法包括在培養基中培養神經細胞及在所產生的混合物中培養幹細胞。
2.根據專利申請範圍第1所述的方法，其特徵在於，該神經細胞是取自腦部。
3.根據專利申請範圍第2所述的方法，其特徵在於，該神經細胞是取自海馬回。
4.根據專利申請範圍第1所述的方法，其特徵在於，在加入該幹細胞的前，該神經細胞在該培養基中培養3至6天。
5.根據專利申請範圍第4所述的方法，其特徵在於，該神經細胞培養5天。
6.根據專利申請範圍第1所述的方法，其特徵在於，該幹細胞是選自由胚胎幹細胞、胚胎生殖細胞、胚胎癌細胞、骨髓基質細胞、骨髓造血細胞、臍帶血細胞及臍帶間葉細胞所組成的群。
7.根據專利申請範圍第6所述的方法，其特徵在於，該幹細胞是骨髓基質細胞或臍帶間葉細胞。
8.根據專利申請範圍第1所述的方法，其特徵在於，用於培養神經細胞的培養基是含血清的DMEM。
9.根據專利申請範圍第1所述的方法，其特徵在於，該幹細胞在該混合物中培養6至12天。
10.根據專利申請範圍第1所述的方法，其特徵在於，進一步包括從培養過幹細胞的混合物中收集神經細胞的步驟。
11.根據專利申請範圍第10所述的方法，其特徵在於，在培養第6至12天的期間收集該神經細胞。
12.根據專利申請範圍第10所述的方法，其特徵在於，在培養第6至9天的期間收集該神經細胞。
13.一種培養幹細胞的培養基，其特徵在於，該培養基是由於基礎培養基中培養神經細胞而製備。
14.根據專利申請範圍第13所述的培養基，其特徵在於，該基礎培養基是含血清的DMEM。
15.根據專利申請範圍第13所述的培養基，其特徵在於，該神經細胞已從該基礎培養基移除。
16.根據專利申請範圍第13所述的培養基，其特徵在於，該神經細胞是取自腦部。
17.根據專利申請範圍第16所述的培養基，其特徵在於，該神經細胞是取自海馬回。
18.根據專利申請範圍第13所述的培養基，其特徵在於，該神經細胞在該基礎培養基中培養3至6天。
19.根據專利申請範圍第18所述的培養基，其特徵在於，該神經細胞在該基礎培養基中培養5天。
全文摘要
本發明是關於由幹細胞產生神經細胞的方法，其包括在培養基中培養神經細胞及在所產生的混合物中培養幹細胞。本發明也關於培養幹細胞的培養基，其是藉由將神經細胞培養於基礎培養基而製備。
文檔編號C12N5/0793GK1532280SQ200310123358
公開日2004年9月29日 申請日期2003年12月15日 優先權日2002年12月13日
發明者傅毓秀 申請人:傅毓秀