結腸特異性基因及蛋白質的製作方法

2023-11-09 10:21:32

專利名稱：結腸特異性基因及蛋白質的製作方法
技術領域：
本發明涉及最新鑑別的多核苷酸、由這些多核苷酸編碼的多肽、這些多核苷酸和多肽的用途。本發明還涉及抑制本發明的這些多核苷酸的功能和產生的方法。
胃腸道是每年在美國發生的新診斷的癌症和致命癌症(男人比女人的數量要高一些)兩者的最普通的位點。結腸癌在美國的發生率逐漸增加，而胃癌則減少，小腸癌稀有。胃腸癌的發生率隨地理位置變化。胃癌在日本普遍在美國不普遍。而結腸癌在日本不普遍在美國普通。環境病原學因子由統計數據(顯示移居至高-風險區的人承擔高的風險)強烈地表明。表明胃癌的一些病原學因子包括黃麴黴毒素、由在汙染食品中存在的黃麴黴形成的致癌因子、煙燻魚、酒精和維生素A和鎂缺陷。膳食高脂肪和低的大(和可能的)甾醇代謝降解產物可能是結腸癌的病因。一些疾病可以預示著癌症，例如，惡性貧血預示著胃癌，未治療非熱帶口炎性腹瀉和免疫缺陷預示著淋巴瘤和癌，潰爛和肉芽腫結腸炎、分離的息肉遺傳性家族息肉病預示著結腸癌。
結腸最普通的腫瘤是腺瘤息肉。在結腸原發性淋巴瘤很少，在小腸中常見。
腺瘤息肉是最普通的良性胃腸腫瘤。它們在整個GI道中發生，最一般地在結腸和胃部，在男性中比在女性中更常見。它們可以單一的或者更常見的是多重的，無蒂的或有蒂的。它們可以遺傳，如同在家族息肉病和Gardener’s綜合症中，這主要涉及結腸。結腸癌的發展在家族息肉病中普遍。息肉經常造成流血，可以隱藏或者是顯露，但是很少造成疼痛除非症狀複雜。一種不太常見的乳頭狀的腺瘤僅在結腸中發現，也可以引起電解質喪失和類粘蛋白流出。
惡性腫瘤包括結腸癌可以是滲透的或者是植外的，同時最一般地發生於直腸乙狀結腸之中。因為上行結腸的內含物為液態，在這個區域中的癌通常不造成阻礙，但是病人在病程後期易於出現貧血，腹腔疼痛，或者腹腔團塊或可觸知的團塊。
結腸腫瘤的預後取決於腸壁入侵的程度區域淋巴節介入和遠距離轉移的存在。直腸和下行結腸癌的預後意想不到地十分好。在結入侵發展之前，對早期切除，80至90％的治癒率是可能的。由於這一原因，當不能解釋的貧血、隱藏的胃腸流血或在腸道習慣方面改變在以前健康的病人中發展時，必須特別注意排除這種疾病。在其擴散到淋巴結之前完全除去病灶對結腸癌病人提供了生存的最好機會。通過潛隱性出血病人中的血篩選檢測導致最高5年的存活。
臨床懷疑的惡性損傷通常可以經放射線學檢測。不到1cm的息肉容易被錯過，尤其是在乙上面的狀結腸中在憩室病的存在中。在食道、胃部或結腸中的臨床懷疑和放射線學檢測的損傷可以由纖維光學內窺鏡檢查與直接活組織檢查和營養學進行的組織學組織診斷結合證實。結腸鏡檢查是檢測結腸疾病所利用的另一個方法。尚不能由X光預見的良性和惡性息肉經常用結腸鏡檢查檢測。此外，在X光上具有一種損傷的患者經常在結腸鏡檢查上有另外的損傷。然而，乙狀結腸鏡檢查發現大約50％的結腸腫瘤。
檢測結腸癌的上述方法有一些缺點，通過以上描述的所有方法，小的結腸腫瘤可以被錯過。檢測結腸癌的重要性對預防轉移也極端重要。
按照本發明的一個方面，本發明提供了核酸探針，這種核酸探針包含長度足以特異性地與從本發明的人類結腸特異性基因轉錄的RNA雜交或者與相應於這種RNA的DNA雜交的核酸分子。
按照本發明的另一方面，本發明提供了一種通過檢測來源於宿主的樣品中的從本發明的人類結腸特異性基因轉錄的RNA或者相應於這種RNA的DNA的存在，來診斷結腸癌轉移的方法和產品。
按照本發明的另一方面，本發明提供了一種通過檢測來源於宿主的樣品中的相應於本發明的結腸特異性基因的多肽的改變的水平來診斷結腸癌轉移的方法和產品。所述多肽提高的水平指示結腸癌診斷。
按照本發明的另一方面，本發明提供了編碼本發明的多肽的分離的多核苷酸，包括mRNA、DNA、cDNA、基因組DNA以及其反義類似物和其生物學活性的並且在診斷上或治療上有用的片段。
按照本發明的一個方面，本發明提供了由所說多核苷酸編碼的新的多肽以及其生物學活性的並且在診斷上或治療上有用的片段、類似物和衍生物。
按照本發明的另一方面，本發明提供了通過重組技術產生這些多肽的方法，該方法包括在促進所說的蛋白質表達的條件下培養含有編碼本發明多肽的核酸序列的重組原核和/或真核宿主細胞，隨後回收所說的蛋白質。
按照本發明的另一方面，本發明提供了對這些多肽特異性的抗體。
按照本發明的另一方面，本發明提供了使用本發明的多肽治療結腸癌的方法和使用所說的多肽篩選與該多肽相互作用的化合物的方法，所述化合物例如為抑制或激活本發明的多肽受體的化合物。
按照本發明的另一方面，本發明提供了篩選與所說的多肽相互作用的化合物的方法，所述化合物例如為抑制或激活本發明的多肽的化合物。
按照本發明的另一個方面，本發明提供了將這些多肽或編碼這些多肽的多核苷酸體外用於與科學研究、DNA合成及DNA載體的人工合成有關的目的的方法。
從本文的教導中，本領域技術人員會清楚本發明的這些和其它方面。
下列附圖用來說明本發明的實施方案，而無意於用它們來限制本發明權利要求所包括的範圍。


圖1顯示了相應於本申請中公開的人類結腸特異性基因的cDNA序列和相應的推導的胺基酸序列。使用了胺基酸標準單字母縮寫。
術語「結腸特異性基因」指這種基因首先在來源於結腸的組織中表達，並且這種基因可以在來源於非結腸組織的細胞中表達。然而這種基因在來源於結腸組織中的表達明顯高於非結腸組織中的表達。
按照本發明的一個方面，本發明提供了分離的核酸(多核苷酸)，這種核酸編碼具有圖1(SEQ ID NO2)的推導的胺基酸序列的成熟多肽或由1995年4月28日以保藏號ATCC 97129保藏的克隆的cDNA編碼的成熟多肽。
編碼本發明的結腸特異性基因的多核苷酸是從人結腸癌cDNA文庫中分離的。該多核苷酸包含一個編碼158個胺基酸殘基之蛋白質的開放讀框。該多核苷酸顯示出來源於菱形斑紋響尾蛇的半乳糖特異性凝集素的同源性(具有36％的相同性和54％的相似性)，與人類胰腺結石蛋白質前體具有30％的相同性和52％的相似性。
本發明的多核苷酸可以是RNA形式或是DNA形式，其中DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA。這種DNA可以是雙鏈或單鏈，如果是單鏈，其可以是編碼鏈或非編碼(反義)鏈。這種編碼成熟多肽的編碼序列可以和圖1(SEQ ID NO1)所示的編碼序列或保藏的克隆的編碼序列相同；由於遺傳密碼的豐餘性或簡併性，這種編碼序列也可以是一種不同的編碼序列，其可以和圖1(SEQ ID NO1)的DNA或保藏的cDNA編碼相同的成熟多肽。
編碼圖1(SEQ ID NO2)的成熟多肽或編碼由保藏的cDNA編碼的成熟多肽的多核苷酸可以包括僅僅是編碼成熟多肽的編碼序列；編碼成熟多肽的編碼序列和附加的編碼序列，如前導或分泌序列或蛋白原序列；編碼成熟多肽的編碼序列(和可有可無的附加的編碼序列)和非編碼序列，如內含子或成熟多肽編碼序列的5′和/或3′非編碼序列。
這樣，「編碼多肽的多核苷酸」這一術語包括只含有多肽編碼序列的多核苷酸以及還含有附加的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上文描述的多核苷酸變體，這種變體編碼具有圖1(SEQ ID NO2)的推導的胺基酸序列的多肽或由保藏的克隆的cDNA編碼的多肽的片段、類似物和衍生物。這種多核苷酸變體可以是天然產生的多核苷酸等位變體或是非天然產生的多核苷酸變體。
這樣，本發明包括編碼如圖1(SEQ ID NO2)所示的相同成熟多肽或由保藏的克隆的cDNA編碼的相同成熟多肽的多核苷酸，以及編碼如圖1(SEQ ID NO2)所示的成熟多肽或由保藏的克隆的cDNA編碼的成熟多肽的片段、衍生物和類似物的多核苷酸變體。這些核苷酸變體包括缺失變體、取代變體、添加或插入變體。
正如上文所表明的，所述多核苷酸可以具有一種編碼序列，該序列是圖1(SEQ ID NO1)中所示的編碼序列或保藏的克隆的編碼序列的天然產生的等位變體。本領域已知等位變體是多核苷酸序列的另一種形式，其可以具有一個或多個核苷酸的取代、缺失或添加，而實質上不改變所編碼的多肽的功能。
本發明也包括這樣的多核苷酸，其中所說的成熟多肽的編碼序列可以在相同的閱讀框架中與幫助從宿主細胞表達和分泌多肽的多核苷酸序列融合，所述的多核苷酸序列如作為分泌序列在控制多肽從細胞轉運中起作用的前導序列。具有前導序列的多肽是前蛋白(preprotein)，並且可以具有由宿主細胞切割形成成熟形式的多肽的前導序列。這種多核苷酸也編碼蛋白原(proprotein)，這種蛋白原是添加有附加的5』胺基酸殘基的成熟蛋白。具有原序列(prosequence)的成熟蛋白是蛋白原，是一種無活性的蛋白形式。一旦切除原序列，留下的就是有活性的成熟蛋白。這樣，本發明的多核苷酸例如可以編碼一種成熟蛋白或編碼具有原序列的蛋白質或編碼既有原序列又有前序列(presequence)(前導序列)的蛋白質。
本發明的多核苷酸也可以具有在讀框中與標記序列融合的編碼序列，所述的標記序列使得可以純化本發明的多核苷酸。在細菌宿主的情況下，所述的標記序列可以是由pQE-9載體提供的六組氨酸標記，其提供來純化融合進標記的成熟多肽，或例如當使用哺乳動物細胞(如COS-7細胞)時，標記序列可以是血細胞凝集素(HA)標記。所說的HA標記相應於來源於流感血細胞凝集素蛋白質的一種表位(Wilson，I.等，細胞，37767(1984))。
術語「基因」是指和產生多肽鏈有關的DNA區段；其包括在編碼區前面的和後面的區(前導區和尾隨序列)以及在各個編碼片段(外顯子)之間的間插序列(內含子)。
全長結腸特異性基因片段可以用作cDNA文庫的雜交探針，用來分離全長基因和與此基因有高度的序列類似性或類似生物活性的其它基因。這種類型的探針優選地是具有至少30個鹼基，並且可以含有，例如50個或更多的鹼基。所說的探針也可以用於鑑別相應於全長轉錄物的cDNA克隆和基因組克隆或含有包含調節和啟動子區、外顯子和內含子的完整的結腸特異性基因的克隆。篩選的實例包括通過利用已知DNA序列合成寡核苷酸探針來分離基因的編碼區。具有互補於本發明的基因序列之序列的標記可以用來篩選人類cDNA、基因組DNA或mRNA文庫，以確定探針和哪些文庫成員雜交。
本發明還涉及與以上所描述的序列雜交的多核苷酸(如果兩個序列之間具有至少70％，優選地具有至少90％，更優選地具有至少95％的等同性)。本發明特別涉及在嚴格條件下與以上所述的多核苷酸雜交的多核苷酸。如本文所使用的，術語「嚴格條件」指僅在序列間具有至少95％，優選地具有至少97％的同源性時雜交才可以發生。在一個優選的實施方案中，與以上所述的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼這樣一種多肽，其實質上保持與由圖1(SEQ ID NO1)的cDNA或保藏的cDNA(s)編碼的成熟多肽相同的生物學功能或活性。
此外，所述多核苷酸可以具有至少20個鹼基，優選地是至少30個鹼基，更優選地是至少50個鹼基，其與本發明的多核苷酸雜交，並且具有如上文所述的相同性，可以保留或不保留活性。例如，這種多核苷酸可以用作圖1(SEQ ID NO1)多核苷酸的探針，例如用於回收多核苷酸或作為診斷探針或作為PCR引物。
這樣，本發明涉及與編碼圖1(SEQ ID NO2)多肽之多核苷酸具有至少70％相同性，優選地至少90％相同性並且更優選地至少95％相同性的多核苷酸及其片段(這種片段具有至少30個鹼基，優選地至少50個鹼基)和這些多核苷酸編碼的多肽。
本文所提及的保藏物將按照用於專利程序的國際承認的微生物保藏布達佩斯條約的規定保持。這些保持物僅僅是為了給本領域技術人員提供方便，並不是35 U.S.C 112條所需的保藏。包含在所述的保藏材料中的多核苷酸序列和由其編碼的胺基酸序列本文一併參考，並且用於解決本文序列描述上的任何矛盾。對保藏材料的任何製造、使用或銷售需要經過許可，在此未給予任何這樣的許可。
按照本發明的另一方面，本發明提供了一種多核苷酸，該多核苷酸優選地具有與以下序列雜交並且與以下具有至少70％的相同性的至少10個鹼基對，所述序列是從人類基因轉錄的RNA(或相應的DNA)，所說的基因具有與圖1(SEQ ID NO1)的DNA序列的編碼序列至少90％相同的編碼序列。
這樣，如上所述的雜交的多核苷酸序列可以用來雜交到它們所相應的人類基因上，和用來檢測所述人類基因的表達，以用於此後描述的診斷測定中。
按照本發明的另一方面，本發明提供了用於在宿主中檢測結腸癌微轉移的診斷測定法。雖然申請人不希望將本發明的推論限制在任何特定的理論上，但可以相信在宿主細胞中本發明的結腸特異性基因(而不是來源於結腸的那些)的活性轉錄的存在是結腸癌轉移指示性的。這是真實的，因為儘管結腸特異性基因在身體的所有細胞中均有發現，但是在非有病的個體中其轉錄成mRNA，cDNA以及表達產物主要限制在結腸中。然而，如果存在結腸癌，結腸癌細胞從癌向其它細胞遷移，以使這些其它細胞以較高的水平活化轉錄和表達結腸特異性基因，所述水平高於通常在非有病個體中通常發現的，即轉錄高於在健康個體的非結腸組織中發現的。正是在不是來源於結腸的那些細胞中檢測到這種增強的轉錄或增強的蛋白質表達才是指示結腸癌轉移。
在這樣一種診斷測定的一個例子中，通過與探針雜交檢測在來源於不是結腸組織的樣品中的RNA序列。所說的樣品包含核酸或核酸混合物，其中至少之一懷疑包含從本發明的人類結腸特異性基因轉錄的RNA(或相應的cDNA)。這樣，例如，在確定細胞中特異性RNA的存在的測定形式中，最初的RNA是從細胞分離的。
樣品可以從來源於不是結腸的組織的細胞獲得，包括但不限於血液，尿，唾液，組織活組織檢查和屍體解剖材料。在從非結腸細胞獲得的樣品中使用這種方法檢測從本發明的人類結腸特異性基因轉錄成mRNA的增強在本文的教導下完全在本領域技術人員的知識範圍內。
mRNA的分離包括經裂解細胞和進行示差離心分離總細胞RNA。一旦分離總RNA，通過用本領域技術人員所知的腺苷酸殘基形成的幾乎在每一種真核mRNA分子3』末端發現的poly(A)尾分離mRNA。由脫氧胸苷組成的寡核苷酸[oligo(dT)]連接到纖維素上，並且oligo(dT)-纖維素被填充到小柱中。當總細胞RNA製備物流過這樣一個柱時，mRNA分子通過poly(A)尾結合到oligo(dT)上，而剩下的RNA流過柱。然後從柱洗脫mRNA並收集。
檢測從編碼本發明的多肽的本發明的結腸特異性基因或其片段轉錄的分離的mRNA的一個例子包括用設計用來與待檢測的mRNA雜交的特定的寡核苷酸探針篩選所收集的mRNA。所述寡核苷酸探針包含與至少一部分從一種或多種本發明的結腸特異性基因或其片段轉錄的分離的mRNA(或從這種RNA產生的cDNA)雜交的多核苷酸序列。所述的多核苷酸序列至少70％相同於從本發明的人類結腸特異性基因或其片段轉錄的分離的mRNA(或從這種RNA產生的cDNA)並與其雜交，所述的基因具有外顯子並包括與圖1的DNA序列(SEQID NO1)具有至少90％，優選地至少95％，最優選地至少97％的相同性的DNA。
也應認識到可以用分析上可檢測的試劑標記這些探針，並且優選地是如此。有用的試劑包括但不限於放射性，螢光染料或能夠催化形成可檢測產物的酶。
檢測互補於mRNA序列的多核苷酸(cDNA)的一個例子是採用聚合酶鏈反應(PCR)以及逆轉錄酶。PCR是用於特異性擴增DNA或者RNA的一種十分有力的方法(Saiki等，自然，234163-166(1986))。這種技術的一種應用是使以低拷貝數存在的核酸序列達到可檢測水平的核酸探針技術。H.A.Erlich編輯的《(PCR技術原理和在DNA擴增上的應用》(Stockton出版社，USA，1989)中，和M.A.Inis(編者)在PCR方案(學術出版社，San Diego，USA，1990)中描述了這一方法的許多診斷和科學應用。
RT-PCR是將PCR與逆轉錄酶的結合。逆轉錄酶是一種從相應mRNA分子產生cDNA分子的酶。這是重要的，因為PCR擴增核酸分子，特別是DNA，這一DNA可以從由來源於宿主的樣品中分離的mRNA產生。
RT-PCR診斷測定的一個特定的例子涉及從宿主組織移取樣品。這種樣品將來源於不是結腸的組織，例如血液。因此，這樣的診斷測定的例子包括全血梯度分離有核的細胞，總RNA抽提，總RNA的RT-PCR和PCR產物的凝膠電泳。PCR產物包含互補於從本發明的結腸特異性基因或其片段轉錄的RNA的cDNA。更具體地說，獲得血液樣品，將全血與磷酸緩衝鹽水合併，離心，以及小心抽吸淋巴細胞和粒細胞層，再次用磷酸緩衝液鹽水稀釋並再離心。棄去上清液，含有有核的細胞的沉澱用於用如製造者(Tel-Test Inc.，Friendswood，TX)所描述的RNazole B法提取RNA。
用對本發明的DNA序列高度特異性的DNA序列製備寡核苷酸引物和探針。所述探針長度至少為10個鹼基對，優選地至少30個鹼基對，可以是至少50個鹼基對或更多。逆轉錄酶反應和PCR擴增依次進行無須中斷。在PCR期間使用Taq聚合酶，濃縮PCR產物，使整個樣品在包含溴化乙錠的Tris-硼酸鹽-乙二胺四乙酸瓊脂糖凝膠上電泳。
按照本發明另一方面，本發明提供了一種通過檢測來源於不是結腸的組織的生物樣品中本發明的特異性多肽的改變的水平診斷結腸疾病(例如結腸癌)的方法。本發明的結腸特異性多肽的提高的水平指示相應的結腸特異性基因產物的活性轉錄和表達。用於檢測得自宿主的樣品中結腸特異性多肽的水平的分析方法對本領域的技術人員是公知的，所說的方法包括放射免疫測定、競爭結合測定、Western印跡分析、ELISA測定和「夾心」測定。生物樣品可以包括但不限於組織提取物、細胞樣品或生物體液，然而，按照本發明，生物樣品具體來說不包括結腸組織或細胞。
ELISA測定(Coligan等，免疫學當代方案，1(2)，第6章(1991))最初包括製備對本發明的結腸特異性多肽特異性的抗體，優選地是單克隆抗體。此外，製備單克隆抗體的報導抗體。將可檢測的試劑和報導抗體結合，所說的試劑如放射性、螢光或者在這一實例中是辣根過氧化物酶。由宿主獲得樣品，並將其在與樣品中蛋白質結合的固體支持物(如聚苯乙烯皿)中溫育。通過和非特異性蛋白質(如BSA)一起溫育，將覆蓋皿中任何游離的蛋白質結合位點。接下來，將單克隆抗體在皿中溫育，在此期間單克隆抗體和結合到聚苯乙烯皿上的本發明任何多肽結合。用緩衝液將所有未結合的單克隆抗體洗掉。此時，將和辣根過氧化物酶連接的報導抗體放入皿中，結果導致報導抗體和任何結合到結腸特異性基因多肽上的單克隆抗體結合。然後將未結合的報導抗體洗掉。接著向皿中加入過氧化物酶底物，和標準曲線比較，在給定時間內產生的顏色的量即是給定體積的患者樣品中存在的結腸特異性多肽的量。
也可以使用競爭測定，其中將對結腸特異性多肽特異性的抗體連接到固體支持物上，然後，標記結腸特異性多肽，使標記的多肽和來源於宿主的樣品通過固體支持物，經例如液體閃爍層析檢測的標記的量可以與樣品中結腸特異性多肽的量相關聯。
「夾心」測定類似於ELISA測定。在「夾心」測定中，將本發明的多肽通過固體支持物並連接到結合在固體支持物上的抗體上。然後將第二抗體連接到結腸特異性多肽上。使標記的並且對第二抗體特異性的第三抗體通過固體支持物並連接到第二抗體上，可以定量結合的量。
在可替性方法中，使用結腸特異性多肽的標記抗體。在一步測定中，將靶分子(如果其存在)固定化並且與標記的抗體一起溫育。標記的抗體結合到固定化的靶分子上。在洗滌除去未結合的分子後，檢測樣品中標記的存在。在兩步測定中，將固定化的靶分子與非螢光素標記抗體一起溫育。然後，使靶分子-標記抗體複合物(如果其存在)結合到對未標記的抗體是特異性的第二標記抗體上。洗滌樣品，檢測樣品中標記的存在。
對用於標記的標記物的選擇隨應用而變化，然而，標記物的選擇易於由本領域技術人員確定。這些標記的抗體可以用於免疫測定以及組織學應用中，以檢測蛋白質的存在。標記的抗體可以是多克隆的或者單克隆的。
非結腸細胞中結腸特異性基因的活性轉錄(其大於通常發現的)的存在(存在mRNA，cDNA或者表達產物的改變的水平)是存在已轉移的結腸癌的重要的指示，因為結腸癌細胞遷移到總的循環中。因此，這一現象可以具有重要的臨床暗示，因為治療局部腫瘤的方法完全不同於治療轉移的腫瘤的方法。
以上所描述的方法也可以用於檢測在化療前所保存的骨髓是否由結腸癌細胞的微轉移所汙染。在測定中，從骨髓分離血液細胞，並且按如上所述處理。這一方法使得人們可以測定所保存的骨髓是否在化療之後仍然適合於移植。
對結腸特異性多肽特異性的抗體(例如單克隆抗體)也可以用於導向結腸癌細胞，例如，在導向相互作用劑方法中，這些藥劑在接觸結腸癌細胞時消滅它們。這是真實的，因為所述抗體對首先在結腸中表達的結腸特異性多肽是特異性的，相互作用劑與抗體的連接會引起相互作用劑被直接攜帶到前列腺。
這種類型的抗體也可以用來進行體內造影，例如通過標記的抗體，以促進掃描骨盆區和結腸。一種造影方法包括將待造影的任何結腸腫瘤細胞與用可檢測的標記物標記的抗結腸特異性抗體接觸。所述方法在使標記抗體結合到任何接觸特異性多肽的條件下進行。在一個特定的例子中，抗體與結腸(例如結腸癌細胞)相互作用，使結腸造影和基於這種接觸的可見的螢光被增強，使得可以測定結腸的疾病或非疾病狀態。
本發明還涉及具有圖1的推導的胺基酸序列(SEQ ID NO2)的結腸特異性基因多肽或具有由保藏的cDNA編碼的胺基酸序列的多肽，以及這些多肽的片段、類似物和衍生物。
術語「片段」、「衍生物」和「類似物」，當有關圖1的多肽(SEQ ID NO2)或由保藏的cDNA編碼的多肽時，指基本上保持與這樣的多肽相同的生物功能或活性的多肽。這樣，類似物包括蛋白原，這種類似物可以由蛋白原部分切除進而產生活性的成熟多肽激活。
本發明的多肽可以是重組多肽，天然多肽或合成多肽，優選地是重組多肽。
所說的圖1(SEQ ID NO2)的多肽或由保藏的cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物可以是(i)這樣一種，其中一個或多個胺基酸殘基被保守或非保守胺基酸殘基取代(優選地是保守胺基酸殘基取代)並且取代的胺基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼子編碼的胺基酸殘基；或(ii)這樣一種，其中一個或多個胺基酸殘基包含取代基；或(iii)這樣一種，其中成熟多肽與另一種化合物融合，所述化合物如增加多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)；或(iv)這樣一種，其中附加胺基酸與成熟多肽融合，例如前導或分泌序列或用來純化成熟多肽的序列或原序列。通過本文的闡述，可以認為這樣的片段、衍生物以及類似物在本領域技術人員的知識範圍之內。
本發明優選地是提供分離形式的多肽和多核苷酸，並且優選地是將所述多肽和多核苷酸純化成同質性的。
術語「分離的」意指所述的物質脫離了其原始環境(例如，天然環境，如果其是天然產生的)。例如，一種存在於活的動物中的天然產生的多核苷酸或多肽不是分離的，但是與天然系統中某些或全部共存的物質分開的相同的多核苷酸或多肽是分離的。這樣的多核苷酸可以是載體的一部分，和/或這樣的多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，其仍然是分離的，這是因為這種載體或組合物不是其天然環境的一部分。
本發明的多肽包括圖1的多肽(SEQ ID NO2)特別是成熟多肽以及和圖1的多肽(SEQ ID NO2)具有至少70％的相似性(最好是70％的相同性)，更優選地是90％的相似性(最好是90％的相同性)，最優選地是95％的相似性(最好是90％相同性)的多肽，也包括這些多肽的部分，這些多肽的部分通常包含至少30個胺基酸，並且優選地是至少50個胺基酸。
如本領域所熟知的，兩個多肽之間的「相似性」是通過比較一個多肽和另一個多肽序列的胺基酸序列和其保守胺基酸取代來確定的。
本發明多肽的片段或部分通過肽合成可以用於產生相應的全長多肽；因此，此片段可以用作產生全長多肽的中間體。本發明多核苷酸的片段或部分可以用於合成本發明的全長多核苷酸。
本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體和用本發明的載體經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明的多肽的方法。
宿主細胞是用本發明的載體經基因工程(轉導、轉化或轉染)產生的，所說的載體可以是克隆載體或表達載體。該載體可以是例如，質粒、病毒顆粒和噬菌體等形式。工程宿主細胞可以在修飾得適於激活啟動子、選擇轉化體或擴增結腸特異性基因的常規營養培養基中培養。培養條件，例如溫度和pH值等，是以前用於表達選擇的宿主細胞的那些，對普通技術人員是顯而易見的。
本發明的多核苷酸可以用來經重組技術產生多肽。這樣，例如，多核苷酸可以包含在各種用於表達多肽的表達載體的任何一種中。這樣的載體包括染色體、非染色體和合成DNA序列，例如SV40衍生物；細菌質粒；噬菌體DNA；杆狀病毒；酵母質粒；從質粒和噬菌體DNA組合衍生的載體、病毒DNA如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、和假狂犬病病毒。然而，任何其它載體也可以使用，只要其在宿主中可複製和穩定。
可以用多種方法將合適的DNA序列插入到載體中。一般來說，用本領域已知的方法將DNA序列插入到適當的限制性核酸內切酶位點。這樣的方法和其它方法被認為在本領域技術人員的知識範圍內。
在表達載體中的所說的DNA序列是可操作地連接到適當的指導mRNA合成表達控制序列(啟動子)上的。這樣的啟動子的代表性例子可以提到的是LTR或SV40啟動子，大腸桿菌的lac或trp、噬菌體λPL啟動子，和已知在原核或真核細胞或它們的病毒中控制基因表達的其它啟動子。所說的表達載體也包含用於翻譯起始和轉錄終止的核糖體結合位點。該載體也可以包含供擴增表達的合適的序列。
此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用於選擇轉化的宿主細胞的表型特徵，例如真核細胞培養物的二氫葉酸還原酶或新黴素抗性，或例如大腸桿菌中的四環素和氨苄青黴素抗性。
包含以上所述的適當的DNA序列以及適當的啟動子或控制序列的載體可以用於轉化適當的宿主，以使其能夠表達蛋白質。
作為合適宿主的代表性例子，這裡可以提到的是細菌細胞，如大腸桿菌、鏈黴菌、鼠傷寒沙門氏菌；真菌細胞，如酵母；昆蟲細胞，如Drosorphila S2和Spodoptera Sf9；動物細胞，如CHO、COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物細胞等。通過本文的闡述，對適當的宿主的選擇在本領域技術人員的知識範圍之內。
更具體地說，本發明也包括重組構建體，該構建體包含以上廣泛描述的一種或多種序列。該構建體包含載體，如質粒或病毒的載體，該載體已正向或反向插入了本發明的序列。在這一實施方案的更為理想的情況下，構建體還包含可操作連接到所述序列上的調節序列，包括，例如，啟動子。大量適合的載體和啟動子是本領域技術人員已知的，並且是通過商業途徑可獲得的。以舉例的方式給出下列載體細菌pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD1O、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRITS(Pharmaca)；真核pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Parmacia)。然而，任何其它質粒或載體都可以使用，只要它們在宿主中可複製和穩定。
可以用CAT(氯黴素轉移酶)載體或其它帶有選擇性標記的載體從任何所需的基因選擇啟動子區。兩種合適的載體是pKK232-8和pCM7。特別提到的細菌啟動子包括lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL、和trp。真核生物啟動子包括CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、得自逆轉錄病毒的LTRs和小鼠金屬硫蛋白-I。對適當的載體與啟動子的選擇在本領域普通技術人員的水平之內。
在另一個實施方案中，本發明涉及包含以上所述構建體的宿主細胞。所說的宿主細胞可以是高等真核細胞(如哺乳動物細胞)，或低等真核細胞(如酵母細胞)，或宿主細胞可以是原核細胞(如細菌細胞)。可以由磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染，或電穿孔有效地將構建體引入到宿主細胞中(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，分子生物學中的基本方法(1986))。
宿主細胞中的構建體可以用來以常規方式產生由重組序列編碼的基因產物。此外，本發明的多肽可以由常規肽合成儀合成產生。
蛋白質可以在哺乳動物細胞、酵母、細菌或其它細胞中在適當的啟動子控制下表達。採用來源於本發明的DNA構建體的RNA，無細胞翻譯系統也可以用來產生這種蛋白質。Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，再版，冷泉港，N.Y.，(1989)(本文一併參考)描述了與原核和真核宿主一起使用的合適的克隆和表達載體。
高等真核生物編碼本發明的多肽的DNA的轉錄被插入到載體中的增強子序列增強。增強子是DNA的順式作用元件，通常約10至300bp，作用在啟動子上增加其轉錄。例子包括複製起點後側100至270bp上的SV40增強子、細胞肥大病毒早期啟動子增強子、複製起點後側上的多形瘤增強子以及腺病毒增強子。
一般來說，重組表達載體包括複製起點和允許宿主細胞轉化的選擇性標記(例如，大腸桿菌的氨苄青黴素抗性基因和啤酒糖酵母TRP1基因)以及源於高表達基因的指導下遊結構序列轉錄的啟動子。這樣的啟動子可以是來自編碼糖酵解酶(例如3-磷酸甘油酸激酶(PGK))、α-因子、酸性磷酸酶或熱休克蛋白質等的操縱子。異源結構序列以合適的方式(phase)與翻譯起始和終止序列裝配。異源序列可以也可以不編碼融合蛋白，這種蛋白質包括賦予所需特徵的N-末端鑑別肽，所需特徵例如，表達的重組產物穩定或簡化純化步驟。
通過將帶有合適的翻譯起始和終止信號的編碼所需蛋白質的結構DNA序列與功能性啟動子一起插入可操作讀框中來構建用於細菌的有用的表達載體。所說載體包含一個或多個表型選擇性標記和複製起點，以在宿主來保證保持載體和需要時提供擴增。適合轉化的原核宿主包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、假單胞菌屬、鏈黴菌屬和葡萄球菌屬的各種(雖然其它的也可以選擇來使用)。
作為一個代表性的但不是限制性的例子，用於細菌的有用的表達載體可以包含源於市售質粒(包含眾所周知的克隆載體pBR322(ATCC 37017)的遺傳元件)的選擇性標記和細菌複製起點。這樣的市售載體包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine化學品公司，Uppsala，瑞典)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，美國)。這些pBR322「骨架」片段與適當的啟動子和待表達的結構序列組合。
在合適的宿主菌株轉化和合適的宿主菌株生長至適當的細胞密度之後，用合適的方法(例如溫度變換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞培養另外一段時間。
典型地經離心收穫細胞，經物理或化學方法破碎細胞，保持所形成的粗產物用於進一步的純化。
可以經任何常規的方法破碎用於表達蛋白質的微生物細胞，所述方法包括凍-融循環、聲處理、機械破碎或使用細胞裂解劑，這些方法是本領域技術人員熟知的。
各種哺乳動物細胞培養系統也可以用於表達重組蛋白質。哺乳動物表達系統的例子包括由Gluzman(細胞，23175(1981))描述的猴腎成纖維細胞COS-7細胞系和其它能夠表達相容載體的細胞系，例如，C127、3T3、CHO、HeLa和BHK細胞系。哺乳動物表達載體包含複製起點、適合的啟動子和增強子，也可以包含任何必需的核糖體結合位點、聚腺苷酸化位點、剪接供體和受體位點、轉錄終止序列和5』側翼非轉錄序列。得自SV40剪接和聚腺苷酸化位點的DNA序列可以用來提供所需的非轉錄遺傳元件。
結腸特異性基因多肽可以用多種方法從重組細胞培養物回收和純化，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉澱、酸抽取、陰離子或陽離子交換層析、磷纖維素層析、疏水相互作用層析、親和性層析、羥基磷灰石層析和植物凝集素層析。需要時在完成成熟蛋白質的構型中可以使用蛋白質再摺疊步驟。最後，可以使用高效液相層析(HPLC)作為最後的純化步驟。
本發明的多核苷酸也可以具有在讀框中與標記序列融合的編碼序列，所述的標記序列使得可以純化本發明的多核苷酸。在細菌宿主的情況下，標記序列的一個例子是可以由載體(優選地是pQE-9載體)提供的六組氨酸標記，其提供來純化融合進標記的成熟多肽，或例如當使用哺乳動物細胞(如COS-7細胞)時，標記序列可以是血細胞凝集素(HA)標記。所說的HA標記相應於來源於流感血細胞凝集素蛋白質的一種表位(Wilson，I.等，細胞，37767(1984))。
本發明的多肽可以是天然純化的產物，或化學合成方法的產物，或經重組技術從原核或真核宿主(例如細菌、酵母、高等植物、培養的昆蟲和哺乳動物細胞)產生的。依據重組產生方法中使用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的或可以是非糖基化的。本發明的多肽也可以包括起始甲硫氨酸胺基酸殘基。
按照本發明的另一方面，本發明提供了可以用於篩選抑制本發明的結腸特異性基因或結腸特異性蛋白質的作用的治療劑的測定法。一種測定利用這些蛋白質的還原酶功能。本發明公開了用於選擇以足夠的親和性與結腸特異性基因蛋白質形成複合物以阻止它們的生物學功能的治療劑的方法。所述方法包括各種測定法，包括競爭測定法，其中蛋白質固定化在支持物上，並同時或先後與天然底物和標記的治療劑接觸，以確定治療劑是否以足以阻止所說的蛋白質與其底物結合的方式有效地與天然底物競爭。
在另一個實施方案中，將底物固定化在支持物上，與標記的結腸特異性多肽和治療劑(或非標記的蛋白質和標記的治療劑)兩者接觸，確定結合到底物上的結腸特異性多肽的量與沒有添加治療劑的測定比較是否降低。所述的結腸特異性多肽可以用抗體標記。
在另一個這樣的篩選測定的例子中，本發明提供了表達本發明的結腸特異性多肽的哺乳動物細胞或膜製劑，其是在待篩選的化合物存在下在有利於氧化還原反應的條件(其中氫和氧形成水)下與同時經歷氧化和還原的成分一起溫育的，所述成分例如一起形成水的氫和氧，其中的氫可以被放射活性物(例如氚)標記。然後可以測定化合物阻斷這一相互作用的能力。
本發明提供了鑑別本發明的多肽之受體的方法。可以用許多本領域技術人員已知的方法鑑別編碼所說受體的基因。所述方法如配體淘選和FACS分選(Coligan等，免疫學當代方案，1(2)，第5章，(1991))。優選地，使用表達克隆，其中從對所述多肽反應性的細胞製備多聚腺苷酸RNA，將從這一RNA產生的cDNA文庫分成小集合體，用於轉染COS細胞或對所述多肽非反應性的其它細胞。使生長在載波片上的標記後的轉染細胞暴露在本發明的多肽下，所述多肽可以由多種方法(包括碘化或引入位點特異性蛋白質激酶的位點)標記。在固定和溫育後，將載波片進行放射自顯影分析。鑑別陽性集合體，製備亞集合體，用交互式亞集合和再篩選方法再轉染，最終產生編碼推定的受體的單克隆。
受體鑑別的另一種方法是可以將標記的多肽與表達受體分子的細胞膜和抽提製劑光親和連接，經PAGE分離交聯材料，並對X-光膠片曝光。可以切下包含所述多肽受體的標記複合物，分離成肽片段進行蛋白質微測序。從微測序獲得的胺基酸序列用於設計一套篩選cDNA文庫簡併寡核苷酸探針，以鑑別編碼推定的受體的基因。
此外，因為本發明的結腸特異性基因和基因產物是生長調節物，所述多肽的興奮劑和拮抗劑可以通過這樣一種測定法來測定，其中包括將包含多肽受體的膜製劑與待篩選的化合物組合，並且測定從受體產生的信號。在測定拮抗劑的情況下，將本發明的多肽添加到測定中，然後可以測定化合物競爭結合位點(即，不從受體產生信號)的能力。
結腸特異性多肽的潛在的拮抗劑包括以上描述的抗體和抗獨特型抗體，或者在某些情況下包括結合到其上的寡核苷酸。
另一個潛在的拮抗劑化合物是採用反義技術製備的反義構建體，其針對結腸特異性多肽以阻止轉錄。反義技術可以通過三螺旋形成或反義DNA或RNA來控制基因的表達，這兩種方法都基於多核苷酸和DNA或RNA的結合。例如，編碼本發明的成熟多肽的多核苷酸序列的5』編碼部分可以用來設計長度約10至40個鹼基對的反義RNA寡核苷酸。一種DNA寡核苷酸被設計成與轉錄所涉及的基因區互補(三螺旋-參見Lee等，核酸研究，63073(1979)；Cooney等，科學，241456，(1988)；和Dervan等，科學，2511360(1991))，進而阻止結腸特異性多核苷酸的轉錄和產生。反義RNA寡核苷酸在體內和mRNA雜交，並阻斷mRNA分子翻譯成為結腸特異性基因多肽(反義-Okano，J.Neurochem.，56560(1991)；寡脫氧核苷酸作為基因表達的反義抑制劑(CRC出版社，Boca Raton，FL(1988))。以上描述的寡核苷酸可以傳送到細胞中，以便可以體內表達反義RNA和DNA，抑制結腸特異性多肽的產生。
潛在的拮抗劑也包括小分子，這些小分子結合併佔據結腸特異性多肽的活性位點，從而使活性位點不能接近底物，使正常的生物學活性被阻斷。小分子的例子包括但不限於小肽或類肽分子。
所述的拮抗劑可以用於治療結腸癌，因為它們以足以抑制結腸癌細胞存活所必需的天然功能的方式影響結腸特異性多肽的功能。拮抗劑可以用於與藥學上可接受的載體組合，例如如此後所描述的。
本發明的多肽和拮抗劑可以與合適的藥物載體組合使用。這樣的組合物包含治療有效量的所說多肽或拮抗劑以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這樣的載體包括但不限於鹽水、緩衝鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇和它們的組合物。其配方應該適宜於施用的方式。
本發明也提供了藥物包或試劑盒，它們包含一個或多個填裝有本發明的藥物組合物的一種或多種成份的容器。與這種容器相關聯的可以是管理藥物和生物製品製造、使用或銷售的政府機構規定形式的告示，這一告示反映了製造、使用或銷售人類使用品的政府機構的同意。此外，所述的藥物組合物可以與其它治療化合物結合使用。
所述藥物組合物可以以方便的方式施用，所述方式例如口頭、局部、靜脈內、腹膜內、肌內、皮下、鼻內、肛門內或真皮內途徑施用。所說的藥物組合物以治療和/或預防特定疾病的有效量施用。一般來說，它們以至少大約10微克/千克體重的量施用，在大多數情況下，它們以不超過每天大約8毫克/千克體重的量施用。在大多數情況之下，考慮用藥途徑和病症等因素，劑量從每日大約10微克/千克到1毫克/千克體重。
結腸特異性基因多肽和多肽形式的興奮劑和拮抗劑，可以依據本發明通過體內表達這樣的多肽來利用，這常被稱作「基因治療」。
這樣，例如，可以體外對患者細胞用編碼多肽的多核苷酸(DNA或RNA)進行基因工程操作，用工程細胞向被治療的患者提供所說的多肽。這樣的方法是本領域眾所周知的。例如，可以用包含編碼本發明的多肽的RNA的逆轉錄病毒顆粒對細胞進行基因工程操作。
同樣地，可以通過例如本領域已知的方法體內對細胞進行基因工程操作，以便體內表達多肽。如本領域已知的，可以將產生反轉錄病毒顆粒(含有編碼本發明多肽的RNA)的產生細胞施用於患者，以便體內將細胞基因工程化並體內表達所說的多肽。經本發明的描述，通過這種方式施用本發明多肽的這些或其它方法對本領域技術人員是清楚的。例如，工程化細胞的表達載體可以不是反轉錄病毒，如可以在與合適的運送載體組合後用於體內工程化細胞的腺病毒。
可以得自上文描述的反轉錄病毒質粒載體的反轉錄病毒包括但不限於莫洛尼氏鼠白血病病毒、脾壞死病毒、反轉錄病毒如勞氏肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽類白血病病毒、長臂猿猩猩白血病病毒、人類免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增值肉瘤病毒、和乳房腫瘤病毒。在一個實施方案中，反轉錄病毒質粒載體來自莫洛尼氏鼠白血病病毒。
所述載體包含一個或多個啟動子。可以使用的合適的啟動子包括但不限於反轉錄病毒LTR；SV40啟動子；和人類巨細胞病毒(CMV)啟動子(Miller，等，生物技術，Vol.7，No.9，980-990(1989)描述)；或其它任何啟動子(例如真核細胞啟動子，如包括但不限於組蛋白、pol III和β-肌動蛋白啟動子)。使用的其它病毒啟動子包括但不限於腺病毒啟動子、胸苷激酶(TK)啟動子和B19細小病毒啟動子。通過本文的描述，合適的啟動子的選擇在本領域技術人員的知識範圍內。
編碼本發明多肽的核酸序列在合適的啟動子控制下。可以使用的合適的啟動子包括但不限於腺病毒啟動子(如腺病毒主要晚期啟動子)；或異源啟動子(如巨細胞病毒(CMV)啟動子)；呼吸合胞體病毒(RSV)啟動子；可誘導的啟動子(如MMT啟動子、金屬硫蛋白啟動子)；熱休克啟動子；清蛋白啟動子；ApoAI啟動子；人類珠蛋白啟動子；病毒胸苷激酶啟動子(如單純皰疹胸苷激酶啟動子)；反轉錄病毒LTRs(包括上文描述的修飾的反轉錄病毒LTRs)；β-肌動蛋白啟動子；和人類生長激素啟動子。所說的啟動子也可以是控制編碼所述多肽之基因的天然啟動子。
使用反轉錄病毒質粒載體轉導包裝細胞系以便形成生產細胞系。可以被轉染的包裝細胞的例子包括但不限於PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAm12和DAN細胞系(Miller、人類基因治療，Vol.1，pgs.5-14(1990)描述的，其全部內容本文一併參考)。可以通過本領域任何已知的方法用所述載體轉導包裝細胞。這些方法包括但不限於電穿孔、使用脂質體和CaPO4沉澱。另外，反轉錄病毒質粒載體可以包囊在脂質體中，或和脂類偶合，然後施用到宿主中。
生產細胞系產生感染性的反轉錄病毒載體顆粒，這種顆粒包含編碼所述多肽的核酸序列。然後可以使用這些反轉錄病毒載體顆粒體內或體外轉導真核細胞。轉導的真核細胞將表達編碼所述多肽的核酸序列。可被轉導的真核細胞包括但不限於胚胎幹細胞、胚胎癌細胞、以及造血幹細胞、肝細胞、成纖維細胞、成肌細胞、角質化細胞、內皮細胞和支氣管上皮細胞。
本發明也涉及用本發明的結腸特異性基因作為診斷劑。例如，某些疾病產生遺傳缺陷基因。本發明的結腸特異性基因在結腸癌中超量表達。本發明的結腸特異性基因中的突變可以用各種技術在DNA水平上檢測。可以從患者的不是結腸的細胞(如血液，尿，唾液，組織活組織檢查和屍體解剖材料)獲得用於診斷的核酸(基因組DNA，mRNA等)。基因組DNA可以直接用於檢測，或在分析前用PCR酶促擴增(Saiki等，自然，324163-166(1986))。RNA或cDNA也可以用於相同的目的。作為一個例子，可以用與本發明的核酸互補的PCR引物鑑別和分析本發明的結腸特異性多肽中的突變。例如，可以通過與正常遺傳型比較的擴增產物大小上的改變來檢測缺失或插入。點突變可以經擴增的DNA與放射性標記的結腸特異性RNA或放射性標記的反義DNA序列雜交鑑別。
另一個用於篩選在PCR擴增後DNA特定區段中的突變的成熟方法是單鏈形成多態性(SSCP)分析。經再擴增10個循環摻入32P-dCTP製備用於SSCP的PCR產物，以適當的限制性內切酶消化產生200-300bp片段，由加熱至85℃5分鐘變性。然後投入至冰中。接著在非變性凝膠(5％甘油，5％丙烯醯胺)中進行電泳(Glavac，D.和Dean，M.，人類突變，2404-414(1993))。
通過直接的DNA測序方法揭示參照基因和「突變體」間的序列差異。此外，克隆的DNA區段(segment)可以用作探針以檢測特異性DNA區段。當和PCR結合時，這種方法的敏感性大大提高。例如，將測序引物和雙鏈的PCR產物或由改良的PCR方法產生的單鏈模板分子一起使用。通過常規的放射標記核苷酸方法或具有螢光標記的自動測序方法確定序列。
基於DNA序列差異的遺傳試驗可以通過檢測在有或沒有變性劑時凝膠上DNA片段電泳遷移率的改變完成。小的序列缺失和插入可以由高解析度凝膠電泳顯示出。不同序列的DNA片段可以在變性甲醯胺梯度凝膠上的區別，其中不同的DNA片段的遷移按照其特定的熔點或部分融化溫度而停滯在凝膠的不同位置(參見，例如，Myers等，科學，2301242(1985))。此外，可以按DNA遷移模式的變化測定序列改變，特別是小的缺失。
也可以由核酸酶保護測定法揭示特定位置上的序列變化，所述測定法如核糖核酸酶保護和S1保護以及化學裂解方法(例如，Cotton等，PNAS，美國，854397-4401(1985))。
這樣，可以由以下方法檢測特定DNA序列，所述方法例如雜交、核糖核酸酶保護、化學裂解、直接DNA測序、或使用限制酶(例如，限制片段長度多形性(RFLP))和基因組DNA的Southern印跡法。
本發明的序列對染色體鑑別也有價值。所說的序列特異性地導向單個人染色體的特定位置，並與之雜交。此外，也需要鑑別染色體上的特定位點。極少的基於實際序列數據(重複多形性)的染色體標識試劑現在可用來標記染色體位置。在關聯與疾病有關基因的那些序列中，按照本發明的染色體的DNA作圖是重要的第一步。
簡言之，可以通過從cDNA製備PCR引物(優選地15-25bp)對染色體序列作圖。3』未翻譯區的計算機分析用來迅速選擇引物，該引物不跨越一個以上的基因組DNA中的外顯子，否則使擴增方法複雜化。然後，這些引物用於經PCR篩選包含單獨的人染色體的體細胞雜合子。僅包含相應於引物的人基因的那些雜種產生擴增片段。
體細胞雜合子的PCR作圖是指定特定DNA到特定染色體的快速方法。利用本發明及相同的寡核苷酸引物，可以由一組特定染色體的片段或一組大的基因組克隆以類似的方式獲得亞定位。可以類似地用於對其染色體作圖的其它作圖策略包括原位雜交、用標記的流式分選染色體預篩選和經雜交預選擇以構建染色體特異性-cDNA文庫。
在一個步驟中，中期染色體塗片的cDNA克隆的螢光原位雜交(FISH)可以用來提供精確的染色體位置。這一技術可以與短至50或60鹼基的cDNA一起使用。這種技術的綜述，參見Verma等，人染色體基本技術手冊，Pergamon出版社，紐約(1988)。
一旦序列定位至精確的染色體位置上，染色體上的序列的物理位置就可以與遺傳圖數據關聯。這樣的數據可以在例如V.McKusick，在人中的孟德爾式遺傳中找到(可聯機到Johns Hopkins大學Welch醫學文庫上使用)。然後，基因和已定位到相同的染色體區的疾病之間的相互關係經連鎖分析(物理鄰近基因的共遺傳)鑑別。
接著，有必要確定感染和未感染個體之間cDNA或基因組序列中的不同。如果在某些或全部感染個體中觀察到突變，但在任何正常個體中觀察不到，則所述的突變很可能是疾病的病因。
採用現有解析度的物理作圖和遺傳作圖技術，精確定位到與疾病相關的染色體區上的cDNA可能是50和500之間的潛在致病基因的一個(這假定1兆鹼基作圖解析度，每20kb一個基因)。
所說的多肽，其片段或衍生物或類似物，或表達它們的細胞可以用作免疫原由此產生抗體。這些抗體可以是例如，多克隆或單克隆抗體。本發明也包括嵌合的、單鏈和人化的抗體以及Fab片段，或Fab表達文庫的產物。本領域中已知的各種方法可以用於產生這樣的抗體和片段。
可以通過對動物直接注射多肽或對動物(優選地是非人動物)施用多肽獲得抗相應於本發明的序列的多肽產生的抗體。然後如此獲得的抗體結合多肽本身。按這種方式，即使是編碼多肽的一個片段的序列也可以用於產生結合全部天然多肽的抗體。用這種抗體從表達多肽的組織中分離多肽。
對於單克隆抗體的製備，可以使用任何提供由傳代細胞系培養物產生的抗體的技術。例子包括產生人單克隆抗體的雜交瘤技術(Kohler和Milstein，1975，自然，256495-497)、三瘤技術、人B-細胞雜交瘤技術(Kozbor等，1983，當今免疫學，472)和EB病毒-雜交瘤技術(Cole等，1985，單克隆抗體和癌療法，Alan R.Liss，公司，pp.77-96)。
所描述的有關單鏈抗體產生的技術(美國專利4,946,778)可以用來產生抗本發明的免疫原性多肽產物的單鏈抗體。也可以利用轉基因小鼠產生抗體。
所述的抗體也可以用於導向結腸癌細胞，例如，在導向相互作用劑這些藥劑在接觸結腸癌細胞時消滅它們方法中。這是真實的，因為所述抗體對本發明的結腸特異性多肽是特異性的，相互作用劑與抗體的連接會引起相互作用劑被直接攜帶到結腸。
這種類型的抗體也可以用來進行體內造影，例如通過標記的抗體，以促進掃描骨盆區和結腸。一種造影方法包括將待造影的任何結腸腫瘤細胞與用可檢測的標記物標記的抗結腸特異性抗體接觸。所述方法在使標記抗體結合到任何接觸特異性多肽的條件下進行。在一個特定的例子中，抗體與結腸(例如結腸癌細胞)相互作用，使結腸造影和基於這種接觸的可見的螢光被增強，使得可以測定結腸的疾病或非疾病狀態。
將參照以下實施例進一步描述本發明。然而應該清楚本發明不限於這些實施例。除非特別指明，所有分數或數量均指重量。
為了有利於理解下列實施例，以下描述一些經常出現的方法和/或術語。
「質粒」由前面的小寫p和/或後續的大寫字母和/或數字指定。本文的起始質粒是市售的、公眾可無限制獲得的或是可以按已出版的方法從可獲得的質粒構建的。此外，所描述的質粒的等同質粒在本領域中是已知的，對普通技術人員是顯而易見的。
DNA的「消化」指以限制性內切酶催化切割DNA，這種限制性內切酶僅作用在DNA一定的序列上。本發明所有的各種限制酶是市售的，如普通技術人員所知採用它們的反應條件，輔因子和其它需要。為了分析的目的，一般地是在約20微升緩衝液中使用1微克質粒或DNA片段以及約2單位的酶。為了分離用於質粒構建體之DNA片段的目的，一般是在較大體積中用20至250單位的酶消化5至50微克DNA。特定限制酶所採用的緩衝液和底物的量由製造者規定。通常使用37℃約1小時的培養時間，但可以按照供應者的說明變化。在消化之後，反應物直接在聚丙烯醯胺凝膠上電泳以分離所需的片段。
用Goeddel等，核酸研究，84057(1980)描述的8％聚丙烯醯胺凝膠進行切割片段的大小分離。
「寡核苷酸」指單鏈多脫氧核苷酸鏈或兩條互補的多脫氧核苷酸鏈，其可以是化學合成的。這樣合成的寡核苷酸沒有5』磷酸，因此若不在激酶存在下用ATP添加磷酸時，其不連接另一個寡核苷酸。合成的寡核苷酸將連接沒有去磷酸化的片段。
「連接」指在兩個雙鏈核酸片段間形成磷酸二酯鍵的過程(Maniatis，T.等，Id.，p.146)。除非提供其它方式，可以採用已知緩衝液和條件用每0.5微克大約等摩爾量的待連接的DNA片段10單位T4DNA連接酶(「連接酶」)進行連接。除非有其它說明，按Graham，F.和van der Eb，A.，病毒學，52456-457(1973)的描述進行轉化。
實施例1測定結腸特異性基因的轉錄為了評估結腸特異性基因RNA的活性轉錄存在或不存在，以標準的靜脈穿刺術用肝素化管獲得大約6ml靜脈血液。將全血與相等體積的磷酸緩衝鹽水混合，然後在15ml聚苯乙烯試管中的8mlFicoll(Pharmacia，Uppsala，瑞典)上分層。於5℃在1800Xg下梯度離心20分鐘。小心吸取淋巴細胞和粒細胞層(約5ml)，在50ml試管中用磷酸鹽緩衝鹽水再稀釋至50ml，再一次於5℃在1800Xg下離心20分鐘。棄去上清液，含有有核的細胞的沉澱用於用如製造者(Tel-Test Inc.，Friendswood，TX)所描述的RNazole B法提取RNA。
為了測定來源於感興趣基因的mRNA的量，設計與從人類基因(其編碼部分包括圖1的DNA序列)轉錄的mRNA序列具有相同性的探針。將這一探針與抽提的RNA混合，混合的DNA與RNA於-70℃下用乙醇沉澱15分鐘。將沉澱重懸於雜交緩衝液中並溶解。在72℃的水浴中將包含混合物的試管溫育10-15分鐘，以使DNA變性。將試管迅速轉移至所需雜交溫度的水浴中。雜交溫度取決於DNA的G+C含量。進行雜交3小時。添加0.3ml核酸酶-S1緩衝液，並且充分混合。加入50μl4.0M醋酸銨和0.1M乙二胺四乙酸停止反應。用苯酚/三氯甲烷抽提混合物，加入20μg載體tRNA，用等體積的異丙醇進行沉澱。將沉澱溶解在40μl的TE(pH7.4)中，在鹼性瓊脂糖凝膠上電泳。電泳後，對RNA微測序，以證實核苷酸序列(更詳細的描述參見Favaloro，J.等，酶學方法，65718(1980))。
將兩個寡核苷酸引物用於擴增從以上方法分離的序列。5』引物20個核苷酸長，3』引物是分離的mRNA的3』末端的互補序列。按分離mRNA常規設計引物，在Perkin Elmer 9600 PCR儀(Emeryville，CA)中不間斷地進行逆轉錄酶反應和PCR擴增。將在20μl焦碳酸二乙酯處理過的水中的400ng總RNA置於65℃的水浴中5分鐘。在添加PCR試劑之前在冰上迅速冷卻。50μl總PCR體積由以下成分組成2.5單位Taq聚合酶(Perkin-Elmer)；2單位禽類成髓細胞瘤病毒逆轉錄酶(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)；dCTP，dATP，dGTP和dTTP(Perkin Elmer)各200μM；引物各18pM；10mMTris-HCl；50mM KCl和2mM MgCl2(PerkinElmer)。PCR如下循環1為42℃15分鐘，然後97℃15秒鐘(1個循環)；循環2為95℃1分鐘，60℃1分鐘，72℃30秒鐘(15個循環)；循環3為95℃1分鐘，60℃1分鐘，72℃1分鐘(10個循環)；循環4為95℃1分鐘，60℃1分鐘，72℃2分鐘(8個循環)；循環5為72℃15分鐘(1個循環)；最後的循環是在4℃下保持直到樣品從儀器中取出。經真空離心將50μl樣品濃縮成10μl，然後將樣品在含溴化乙錠的薄的1.2％Tris-硼酸鹽-乙二胺四乙酸瓊脂糖凝膠上電泳。預期大小的條帶表明這一基因存在於組織中。在沉澱中的RNA的量可以用多種方法定量，例如，可以稱量。
經微測序證實PCR產物核苷酸序列。按照製造者的描述用QiagenPCR產物純化試劑盒(Qiagen，Chatsworth，CA)純化PCR產物。按照應用生物系統(Foster CA)的描述在Perkin-Elmer 9600 PCR儀中用Taq DyeDeoxy Terminator Cycle測序試劑盒對1μgPCR產物進行PCR測序。按照廠商的描述用Centri-Sep柱(Princeton Separations，Adelphia，NJ)純化測序產物。然後用ABI型373A DNA測序系統(應用生物系統)以及Macintosh IIci計算機分析這一產物。
實施例2細菌表達和純化結腸特異性基因蛋白質以及用於製備單克隆抗體利用PCR寡核苷酸引物起始擴增編碼本發明的多肽的DNA序列ATCC#97129，所說的引物相當於加工過的蛋白質的5』序列(減去信號肽序列)和所述基因的3』的載體序列。將相應於DNA序列的附加核苷酸分別加入到5』和3』序列中。所說的5』寡核苷酸引物GCAGGATCCTGGCTTCCAGAAGCATG(BAMHI)(SEQ ID NO3)可以含有例如限制性內切酶位點，接著由加工過的蛋白質的假定的末端胺基酸開始的編碼序列的核苷酸。3』序列TACGGGTACCTTGCTCTATGGTCGGTAC(ASP718)(SEQ ID NO4)可以包含例如與限制酶位點互補的序列，並且也接著編碼感興趣蛋白質的核酸序列的核苷酸。所說的限制性內切酶位點相應於在細菌表達載體例如pQE-32(Qiagen，Chatsworth公司，CA，91311)上的限制性內切酶位點。pQE-32編碼抗生素抗性(Ampr)、細菌的複製起點(ori)、IPTG可調節的啟動子操縱子(P/O)、核糖體結合位點(RBS)、6-組氨酸標記和限制性內切酶位點。然後用相應於包含在引物序列中的限制酶位點的限制酶消化pQE-9。將擴增的序列連接到pQE-9中並將其插入到帶有編碼組氨酸標記和RBS之序列的框架中。然後通過Sambrook等(分子克隆實驗手冊，冷泉港實驗室出版社，(1989))描述的方法，用連接混合物轉化大腸桿菌菌株，例如M15/rep 4(Qiagen)。M15/rep4包含質粒pREP4的多拷貝，這種質粒表達lacI阻遏物，同時賦予卡那黴素抗性(Kanr)。通過轉化體在LB平板上的生長能力鑑定轉化體，並篩選出氨苄青黴素/卡那黴素抗性菌落。通過限制分析分離並確認質粒DNA。將含有所需構建體的菌落在補充了Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養基中過夜(O/N)生長。將O/N培養物以1∶100至1∶250的比率用於接種大體積培養物。細胞生長至光密度600(O.D.600)為0.4和0.6之間時，加入IPTG(異丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖糖苷)至最終濃度為1mM。IPTG通過失活lacI阻遏物，清除P/O，增加基因表達。將細胞再培養3至4小時。通過離心收穫細胞，將細胞沉澱溶解在6M鹽酸胍離液劑中。澄清後，在允許含有6-組氨酸標記的蛋白質緊密結合的條件下，在鎳-螯合物柱中通過層析從溶液中純化溶解的蛋白質(Hochuli，E.等，層析法雜誌411177-184(1984))。將蛋白質以6M鹽酸胍(pH值5.O)從柱中洗脫下來，為了復性，調至3M鹽酸胍、100mM磷酸鈉、10mM穀胱甘肽(還原型的)、2mM穀胱甘肽(氧化型的)。在溶液中溫育12小時後，將蛋白質對10mM磷酸鈉透析。
以這種方式純化的蛋白質可以用作表位產生對這種蛋白質特異性的單克隆抗體。針對多肽和分離的蛋白質的單克隆抗體可以經直接將多肽注射到動物中或者經向動物施用多肽獲得。如此獲得的抗體將結合蛋白質本身。然後，通過使用例如ELISA測定，這種抗體可以用於從表達該多肽的組織分離蛋白質。
實施例3經由基因治療的表達從患者中經皮膚活組織檢查獲得成纖維細胞。將得到的組織放置在組織培養基中並將其分成小塊。將小組織塊放置在溼組織培養瓶的表面，每瓶放置大約10塊。將瓶倒轉，蓋緊，在室溫下過夜。在室溫下放置24小時後，將瓶旋轉過來，組織塊仍然固著在燒瓶底部，加入新鮮培養基(如Ham’s F12培養基，其中含有10％FBS、青黴素和鏈黴素)。然後，在37℃下培養大約1周。此時，加入新鮮培養基，以後每隔幾天換一次培養基。又培養2周之後，出現單層的成纖維細胞。將單層細胞用胰蛋白酶消化，並放入在大瓶中。
將pMV-7(Kirschmeier，P.T.等，DNA，7219-25(1988))(其兩側是Moloney鼠肉瘤病毒的長末端重複區)用EcoRI和HindIII消化，之後用牛犢腸磷酸酶處理。在瓊脂糖凝膠上分級分離線性載體，並用玻璃珠純化。
利用PCR引物擴增編碼本發明的多肽的cDNA，所說的引物分別相應於5』和3』末端序列。5』引物包含EcoRI位點，3』引物包含HindIII位點。在T4DNA連接酶存在下，將等量的Moloney鼠肉瘤病毒線性骨架和EcoRI和HindIII片段一起加入。在適於這兩種片段連接的條件下，保持得到的反應混合物。用連接混合物轉化細菌HB101，然後將細菌HB101在含卡那黴素的瓊脂中平板上塗布，以確認載體中是否含有正確插入的感興趣基因。
將兼嗜性pA317或GP+aml2包裝細胞在Dulbecco改進的Eagles培養基(DMEM)(含有10％小牛血清(CS)、青黴素和鏈黴素)中組織培養至其鋪滿。然後將含有所說的基因的MSV載體加入到培養基中，並用載體轉導包裝細胞。此時，包裝細胞產生含有所說的基因的感染性病毒顆粒(此時，包裝細胞稱為生產細胞)。
將新鮮培養基加入到轉導的生產細胞中，隨後，在鋪滿生產細胞的10cm平板上收穫培養基。通過微孔濾膜過濾含有感染性病毒顆粒的用過的培養基，以除去脫附的(detached)生產細胞，然後用這種培養基感染成纖維細胞。從亞鋪滿成纖維細胞的平板中除去培養基，並迅速地用來源於生產細胞的培養基替換。將此培養基除去，以新鮮培養基代替。如果病毒的滴度很高，事實上所有的成纖維細胞都將被轉染，而不需要選擇。如果病毒的滴度很低，有必要利用具有選擇性標記如neo或his的反轉錄病毒載體。
然後將工程化的成纖維細胞注射到宿主中，或單獨或在cytodex 3微載體珠上生長至鋪滿再注射。此時，成纖維細胞產生蛋白質產物。
實施例4利用杆狀病毒表達系統克隆和表達結腸特異性基因多肽利用PCR寡核苷酸引物擴增編碼全長蛋白質的DNA序列，ATCC#97129，所說引物相應於所說基因的5』和3』序列5』引物具有序列5′ATCGGGATCCGCCATCATGGCTTCCAGAAGCATGCG(SEQ ID NO5)，包含BamHI限制位點(粗體)，接著為代表在真核細胞中起始轉錄的有效信號的6個核苷酸(Kozak，M.，分子生物學雜誌，196947-950(1987))，其後為結腸特異性基因的頭20個核苷酸(轉錄起始密碼子「ATG」有下劃線)。
3』引物具有序列5′TACGGGTACCTTGCTCTATGGTCGGTAC3』(SEQ ID NO6)，包含限制性內切酶Asp718的切割位點和互補於結腸特異性基因3』-非翻譯序列的5個核苷酸。用市售試劑盒(「Geneclean」BIO 101公司，La Jolla，Ca.)從1％瓊脂糖凝膠分離擴增的序列。然後將所說的片段用核酸內切酶BamHI和Asp718消化，並在1％瓊脂糖凝膠上再次純化。此片段指定為F2。
使用載體pA2(由pVL941載體修飾而成，見下文討論)由杆狀病毒表達系統表達結腸特異性蛋白質(綜述參見Summer，M.D.和Smith，G.E.1987，杆狀病毒載體和昆蟲細胞培養過程的方法手冊，德克薩斯農業的試驗站公報1555)。這種表達載體包含苜蓿銀紋夜蛾核型多角病毒(AcMNPV)強多角體蛋白啟動子，其後面是限制性核酸內切酶BamHI和Asp718的識別位點。猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位點用於有效的聚腺苷酸化。為了容易地選擇重組病毒，把大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因以與多角體蛋白啟動子同樣的方向插入，其後是多角體蛋白基因的聚腺苷酸化信號。多角體蛋白序列的兩側是用於細胞介導的共轉染的野生型病毒DNA的同源重組的病毒序列。可以用很多其它的杆狀病毒載體代替pRG1，所說的載體如pAc373、pVL941和pAcIM1(Luckow，V.A.和Summer，M.D.，病毒學，17031-39)。
用限制酶消化所說的質粒，然後由本領域已知的方法利用牛犢腸磷酸酶使質粒去磷酸化。然後用市售試劑盒(「Geneclean」，BIO 101公司，La Jolla，Ca.)從1％瓊脂糖凝膠分離DNA。這種載體DNA命名為V2。
用T4DNA連接酶連接F2片段和所說的去磷酸化質粒V2。然後轉化大腸桿菌DH5c細胞(Stratagene克隆系統，11011 North TorreyPines Road La Jolla，Ca.92037)並利用酶BamHI和Asp718鑑別含有帶結腸特異性基因的所說質粒(pBac-結腸特異性多肽)的細菌。通過DNA測序確認所克隆的片段的序列。
用脂轉染法(Felgner等，美國科學院學報，847413-7417(1987))將5μg質粒pBac-結腸特異性多肽與1.0μg市售的線性杆狀病毒(「BaculoGoldTM杆狀病毒DNA」，Pharmingen，San Diego，CA.)共轉染。
將1μg BaculoGoldTM病毒DNA和5μg質粒pBac結腸特異性基因在含有50微升無血清Grace’s培養基(Life Technologies公司，Gaithersburg，MD)的微滴板的無菌孔中混合。在添加10微升脂轉染試劑和90微升Grace’s的培養基後，混合併於室溫下培養15分鐘。然後將轉染混合物逐滴添加到Sf9昆蟲細胞(ATCC CRL1711)中，所說細胞接種在具有1ml無血清Grace’s培養基的35mm組織培養平板上。來回搖動平板以混合新添加的溶液。然後將平板在27℃下培養27小時。5小時後，從平板除去轉染溶液，添加1微升補充有10％胎牛血清的Grace’s昆蟲培養基。把平板放回到溫箱，在27℃下連續培養4天。
4天後，收集上清液，用類似Summers和Smith(同上)所述的方法進行噬斑測定。一點改變是使用具有「Blue Gal」的瓊脂糖凝膠(LifeTechnologies公司，Gaithersburg)，其使得易於分離染藍的噬斑。(「噬斑測定」的詳盡的描述也可以在Life Technologies公司(Gaithersburg)發布的昆蟲細胞培養和杆狀病毒學用戶指南9-1O頁中找到)。
四天後，將系列稀釋的病毒添加到細胞中，用Eppendorf吸管尖端挑取染藍的噬斑。然後將包含重組病毒的瓊脂懸浮於包含200微升Grace’s培養基的Eppendcrf管中。經簡短離心除去瓊脂，將包含重組杆狀病毒的上清液用於感染接種到35毫米培養皿中的Sf9細胞。4天後，收穫這些培養皿中的上清液，於4℃貯存。
使Sf9細胞在補充有10％熱滅活FBS的Grace』培養基中生長。在感染複數(MOI)2下用重組杆狀病毒V-結腸特異性基因感染細胞。6小時後，除去培養基，用SF900II培養基(減甲硫氨酸和半胱氨酸)(LifeTechnologies公司，Gaithersburg)替代。42小時後，添加5μCi35S甲硫氨酸和5μCi35S半胱氨酸(Amersham)。感染72小時後在低滲磷酸鹽緩衝液中進行細胞裂解，從感染細胞純化結腸特異性蛋白質，並進一步經離子交換層析、篩選層析和反相層析純化。
在以上所述的教導下，本發明的許多改良和變化是可能的，因此，在附屬權利要求的範圍內，可以以不同於以上特定描述的方式實施本發明。
序列表(1)一般信息(i)申請人LI，ET AL.(ii)發明名稱人類結腸特異性基因(iii)序列數6個(iv)通訊地址(A)收信人CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCHI，STEWART和OLSTEIN(B)街道6 BECKER FARM ROAD(C)城市ROSELAND(D)州新澤西州(E)國家美國(F)ZIP07068(v)計算機可讀形式(A)介質類型3.5英寸磁碟(B)計算機IBM PS/2(c)作業系統MS-DOS(D)軟體WORD PERFECT 5.1(Vi)當前申請的數據(A)申請號(B)申請日(C)分類號(Vii)在先申請的數據(A)申請號(B)申請日(viii)律師/代理人信息(A)姓名FERRARO，GREGORYD.
(B)登記號36,134(c)卷號/文檔號325800-(ix)電信信息(A)電話201-994-1700(B)傳真201-994-1744(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特徵(A)長度1114個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1GCACGAGGCC AAACAGATTT GCAGATCAAG GAGAACCCAG GAGTTTCAAA GAAGCGCTAG 60TAAGGTCTCT GAGATCCTTG CACTAGCTAC ATCCTCAGGG TAGGAGGAAG ATGGCTTCCA 120GAAGCATGCG GCTGCTCCTA TTGCTGAGCT GCCTGGCCAA AACAGGAGTC CTGGGTGATA 180TCATCATGAG ACCCAGCTGT GCTCCTGGAT GGTTTTACCA CAAGTCCAAT TGCTATGGTT 240ACTTCAGGAA GCTGAGGAAC TGGTCTGATG CCGAGCTCGA GTGTCAGTCT TACGGAAACG 300GAGCCCACCT GGCATCTATC CTGAGTTTAA AGGAAGCCAG CACCATAGCA GAGTACATAA 360GTGGCTATCA GAGAAGCCAG CCGATATGGA TTGGCCTGCA CGACCCACAG AAGAGGCAGC 420AGTGGCAGTG GATTGATGGG GCCATGTATC TGTACAGATC CTGGTCTGGC AAGTCCATGG 480GTGGGAACAA GCACTGTGCT GAGATGAGCT CCAATAACAA CTTTTTAACT TGGAGCAGCA 540ACGAATGCAA CAAGCGCCAA CACTTCCTGT GCAAGTACCG ACCATAGAGC AAGAATCAAG 600ATTCTGCTAA CTCCTGCACA GCCCCGTCCT CTTCCTTTCT GCTAGCCTGG CTAAATCTGC 660TCATTATTTC AGAGGGGAAA CCTAGCAAAC TAAGAGTGAT AAGGGCCCTA CTACACTGGC 720TTTTTTAGGC TTAGAGACAG AAACTTTAGC ATTGGCCCAG TAGTGGCTTC TAGCTCTAAA 780TGTTTGCCCC GCCATCCCTT TCCACAGTAT CCTTCTTCCC TCCTCCCCTG TCTCTGGCTG 840TCTCGAGCAG TCTAGAAGAG TGCATCTCCA GCCTATGAAA CAGCTGGGTC TTTGGCCATA 900AGAAGTAAAG ATTTGAAGAC AGAAGGAAGA AACTCAGGAG TAAGCTTCTA GACCCCTTCA 960GCTTCTACAC CCTTCTGCCC TCTCTCCATT GCCTGCACCC CACCCCAGCC ACTCAACTCC 1020TGCTTGTTTT TCCTTTGGCC ATAGGAAGGT TTACCAGTAG AATCCTTGCT AGGTTGATGT 1080GGGCCATACA TTCCTTTAAT AAACCATTGT GTAC 1114(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特徵(A)長度158個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Ala Ser Arg Ser Met Arg Leu Leu Leu Leu Leu Ser Cys Leu5 10 15Ala Lys Thr Gly Val Leu Gly Asp Ile Ile Met Arg Pro Ser Cys20 25 30Ala Pro Gly Trp Phe Tyr His Lys Ser Asn Cys Tyr Gly Tyr Phe35 40 45Arg Lys Leu Arg Asn Trp Ser Asp Ala Glu Leu Glu Cys Gln Ser50 55 60Tyr Gly Asn Gly Ala His Leu Ala Ser Ile Leu Ser Leu Lys Glu65 70 75Ala Ser Thr Ile Ala Glu Tyr Ile Ser Gly Tyr Gln Arg Ser Gln80 85 90Pro Ile Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Gln Lys Arg Gln Gln Trp95 100 105Gln Trp Ile Asp Gly Ala Met Tyr Leu Tyr Arg Ser Trp Ser Gly110 115 120Lys Ser Met Gly Gly Asn Lys His Cys Ala Glu Met Ser Ser Asn125 130 135Asn Asn Phe Leu Thr Trp Ser Ser Asn Glu Cys Asn Lys Arg Gln140 145 150His Phe Leu Cys Lys Tyr Arg Pro15權利要求
1.一種分離的多核苷酸，該多核苷酸包括選自下組的成員(a)一種編碼包含SEQ ID NO2所示的1至158位胺基酸的多肽的多核苷酸；(b)一種編碼由包含在ATCC 97129號保藏物中的DNA編碼的成熟多肽的多核苷酸；(c)一種能夠與(a)或(b)的多核苷酸雜交，並且與(a)或(b)的多核苷酸具有至少70％的相同性的多核苷酸；和(d)一種(a)、(b)或(c)的多核苷酸的多核苷酸片段。
2.權利要求1的多核苷酸，其中所說的多核苷酸是DNA。
3.權利要求2的多核苷酸，該多核苷酸編碼包含SEQ ID NO2所示的1至158位胺基酸的多肽。
4.一種分離的多核苷酸，該多核苷酸具有與選自下組的成員雜交並且與選自下組的成員具有至少70％的相同性的至少10個鹼基對(a)從人類基因轉錄的RNA，所說的基因包括與選自由SEQ IDNO1組成的組的DNA具有至少90％的相同性的DNA；以及(b)相應於(a)的RNA的DNA。
5.一種包含權利要求2的DNA的載體。
6.一種用權利要求5的載體經基因工程操作的宿主細胞。
7.一種產生多肽的方法，該方法包括從權利要求6的宿主細胞表達由所說的DNA編碼的多肽。
8.一種產生能夠表達多肽的細胞的方法，該方法包括用權利要求5的載體對細胞進行基因工程操作。
9.一種由權利要求1的多核苷酸編碼的多肽，其包括選自下組的成員(i)一種具有SEQ ID NO2的推導的胺基酸序列的多肽和其片段、類似物及衍生物；(ii)一種由ATCC 97129號保藏物之cDNA編碼的多肽和其片段、類似物及衍生物。
10.一種權利要求9的多肽的興奮劑。
11.一種權利要求9的多肽的拮抗劑。
12.一種治療需要抑制結腸特異性基因蛋白質之患者的方法，該方法包括對患者施用治療有效量的權利要求11的拮抗劑。
13.權利要求12的方法，其中所說的拮抗劑是一種多肽，並且其中所說的治療有效量的拮抗劑是通過對患者提供編碼所說多肽的DNA並在體內表達所說的多肽來施用的。
14.一種治療需要結腸特異性基因蛋白質之患者的方法，該方法包括對患者施用治療有效量的權利要求9的多肽。
15.權利要求14的方法，其中所說的治療有效量的多肽是通過對患者提供編碼所說多肽的DNA並在體內表達所說的多肽來施用的。
16.一種篩選化合物以鑑別權利要求9的多肽的拮抗劑的方法，該方法包括在有利於氧化還原反應的條件下，在待篩選的化合物存在下將所說的多肽與同時進行氧化和還原的組分組合；和測定所說化合物抑制所說反應的能力。
17.一種診斷宿主中結腸疾病的方法，該方法包括測定來源於宿主非結腸組織樣品中人類基因的轉錄，所說的基因具有這樣的編碼部分，其包括與選自由SEQ ID NO1的DNA組成的組的DNA具有至少90％的相同性的DNA，其中所說的轉錄指示宿主中的結腸疾病。
18.權利要求17的方法，其中所說的轉錄通過檢測從所說的人類基因轉錄的RNA的改變的水平的存在來測定。
19.權利要求17的方法，其中所說的轉錄通過檢測互補於從所說的人類基因轉錄的RNA的DNA的改變的水平的存在來測定。
20.權利要求17的方法，其中所說的轉錄通過檢測所說的人類基因之表達產物的改變的水平的存在來測定。
全文摘要
本發明公開了人類結腸特異性基因多肽和編碼這些多肽的DNA(RNA)以及通過重組技術產生這些多肽的方法。本發明也公開了將這種多核苷酸和多肽用作結腸癌診斷標記和用作確定結腸癌是否已轉移之藥劑的方法。本發明也公開了對結腸特異性基因多肽特異性的抗體,其可以用於導向腫瘤細胞和用作結腸癌疫苗的一部分。本發明還公開了篩選所述多肽的興奮劑和拮抗劑的方法以及所述拮抗劑的治療用途。
文檔編號C12R1/19GK1194009SQ95197931
公開日1998年9月23日 申請日期1995年6月6日 優先權日1995年6月6日
發明者丹尼爾·R·索佩特, 李毅, 派屈克·J·迪龍 申請人:人體基因組科學有限公司