一種抑制肺癌細胞生長的峨參提取物及其藥用用途的製作方法
2023-12-10 03:54:26
專利名稱：一種抑制肺癌細胞生長的峨參提取物及其藥用用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥領域，具體說是對肺癌細胞具有明顯抑制作用的石油醚峨參部位 提取物，及其製備方法和對肺癌防治方面的用途。
背景技術：
肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，按病理類型可分為小細胞肺癌(small cell 1 μ ng cancer SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell 1 μ ng cancer NSCLC)，其中 NSCLC佔80%，它嚴重影響人類生命健康，目前已成為世界上發病率和死亡率最高的惡性腫 瘤之一。肺癌常規治療方法包括外科治療、放射治療、化學治療、中醫藥治療、中西醫結合治 療、靶向治療等。在我國，傳統的中醫療法在肺癌的綜合治療中發揮獨特的作用。中醫認為 肺癌的病因多為虛、瘀、痰、毒四個方面，其中以虛為本，痰瘀毒邪為標。病位在肺，常累及脾 腎。中醫治療肺癌在緩解臨床症狀、提高生活質量、延長生存期等方面具有優勢，中藥配合 現代治療如放化療可以發揮減毒增效作用。採用辨證與辨病相結合，從藥用植物和中藥中提取分離抗癌活性成分或活性部 位，從而研製中藥新藥、新劑型，是近年來肺癌治療研究的熱點之一。經國家批准的中藥新 藥、中藥複方成藥製劑有金復康口服液、肺瘤平膏等國家中藥三類新藥。從單味中藥中提取 有效成分製成可供靜脈使用的中藥抗癌藥有康萊特注射液(從薏苡仁中提取)、欖香烯注 射液(從莪朮中提取)、鴉膽子乳劑、嗎特靈注射液(從苦參中提取)、威麥寧膠囊(從野蕎 麥根中提取)等，臨床用於肺癌治療均顯示了一定的療效。峨參nthriscy s sylvestris(L. )Hoffm.，傘形科峨參屬植物，與峨蕊、雪磨芋，歷 來被人們認為是峨眉山的三大特產而聞名遠近，中醫認為峨參有補中益氣，祛瘀消腫，補肺 平喘的作用。藥理作用研究提示峨參具有增強機體免疫、抗癌、抗病毒、抗炎、抗過敏以及健 脾益氣、活血化瘀等作用。有文獻報導從峨參根中提取出一種具有抗腫瘤活性的有效成分， 結構研究表明是去氧鬼臼毒素(峨參內酯)，對人體子宮頸腺癌傳代細胞系的作用具有生物 活性，而對肺癌的作用尚無文獻報導。
發明內容
本發明的目的是提供一種峨參部位提取物，要求方法簡便合理。本發明的目的還 在於，研究上述提取物的藥用活性，為抑制肺癌細胞A549和H460藥物提供新的藥用來源。本發明的目的是通過如下措施來實現的
峨參提取物通過以下方法製備，將峨參切斷，粉碎成細小顆粒，過20目篩，烘乾，用8倍 體積量的80%乙醇浸泡M h，利用閃式提取器，對(1)步驟的浸泡體系間斷提取間斷提取 共3分鐘，抽濾，得到濾液，旋轉蒸發儀回收溶劑，得到浸膏。再用石油醚萃取，得到石油醚 部位提取物，用旋轉蒸發儀回收溶劑。本發明提取物的製備工藝簡便合理，可得到一種峨參 部位提取物。本發明的實驗中應用MTT比色法觀察到峨參石油醚提取物對肺癌細胞A549和H460的生長具有明顯抑制作用，且抑制率與濃度呈明顯的效應關係，隨著藥物濃度的增加， 細胞存活率不斷下降。用倒置顯微鏡觀察到，經峨參石油醚提取物處理肺癌細胞A549和 H460後，癌細胞生長受到明顯抑制。不同濃度的峨參石油醚提取物作用於A549和H460細 胞，24h後用DAPI染色，螢光下可見細胞核發生明顯皺縮和斷裂。國內關於峨參化學成分和抗腫瘤作用方面的研究，文獻報導較少，尤其是對肺癌 的作用未見報導。本發明所獲峨參提取物對肺癌的防治方面的用途。本發明提取物的製備 工藝簡便合理，可得到石油醚部位提取物，並可對肺癌細胞A549和H460的生長有明顯抑制 作用，通過進一步研究石油醚提取物對肺癌細胞A549和H460的作用機理，發現其對以上兩 種癌細胞凋亡有明顯誘導作用。以下的實驗和實施方式也表明本發明所述提取物對肺癌細 胞A549和H460癌細胞凋亡有明顯誘導作用，該提取物可作為藥用活性成分製備對肺癌具 有防治作用的藥物。
圖1不同濃度峨參石油醚提取物對肺癌細胞A549和H460生長的抑制作用效果圖。圖2不同濃度石油醚提取物處理後細胞形態(X400)圖。
具體實施例方式
一、峨參提取物的製備
將峨參切斷，粉碎成細小顆粒，過20目篩，烘乾，用8倍體積量的80%乙醇浸泡Mh， 利用閃式提取器(河南金鼎科技有限公司JHBE-50，額定功率1. 8KW)，在15000r/min轉數 下間斷提取達3分鐘，抽濾，得到濾液，旋轉蒸發儀回收溶劑，得到浸膏。再用石油醚萃取， 得到石油醚部位提取物，用旋轉蒸發儀回收溶劑，得到部位提取物浸膏，使用前用RPMI1640 調整至實驗所需濃度，DMSO (濃度<0. 05%)助溶備用。二、醫學觀察 1實驗材料
1.1細胞人肺癌細胞株A549和H460購置於四川大學華西國家重點實驗室。1.2藥品與試劑RPMI 1640和胰蛋白酶均採用Gibco進口分裝；MTT購自寶信生 物有限公司。峨參飲片購自於四川省峨眉山市仙山中藥飲片公司，經本院宋良科副教授鑑 定為四川峨眉山產傘形科峨參屬植物峨參Anthrisc μ s sylvestris (L.)Hoffm的乾燥塊 根；其餘試劑均採用分析純。1.3主要儀器CO2恆溫孵箱(3110型，美國Thermo公司)、細胞培養板、培養瓶(美 國Coster公司)、酶標儀(Elx-800型，美國Bio-Tek公司)、離心機(L420型，長沙湘儀離心 機有限公司)、倒置相差顯微鏡(日本索尼公司)、螢光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)、超淨工作 臺(BSW-880，江蘇蘇淨集團有限公司)、閃式提取器(河南金鼎科技有限公司)、旋轉蒸發儀 (上海亞榮生化儀器廠)。2實驗方法
2. 1 細胞株培養將肺癌細胞A549和H460接種於含10%新生牛血清的RPMI1640培 養基的培養瓶中，37°C、5%C02、飽和溼度條件下常規培養，每2 d換液傳代培養，取對數生長 期細胞用於實驗。2. 2石油醚提取物對肺癌細胞AM9、H460增殖抑制作用的檢測取
對數生長期細胞接種於對孔培養板內，2X104 / mL個細胞/孔。細胞貼壁後加入不同濃度的峨參石油醚提取物，共設7個藥物濃度梯度，分別為1. 25,2. 5、5、10、20、40、80μ g / μ L。每個濃度3個復孔，每孔體積500 μ L，培養48 h後，每孔加入lmg/mL MTT工作液 500 yL，37°C放置4 h，棄上清，每孔加入500 μ L 0. 4%酸化異丙醇，220 r / min搖床震 蕩5min溶解結晶，經充分震蕩後，吸取200 μ L至96孔酶標板於全自動酶標儀檢測570 nm 波長處的各孔吸光度(0D值)，0. P/oDMSO作為陰性對照，根據0. 1% DMSO值繪製曲線，比較 不同濃度峨參石油醚提取物對2個細胞株增殖的影響。細胞增殖抑制率(%) = (I"藥物組平均OD值/對照組平均OD值)X 100%
2.3 DAPI染色將潔淨無菌蓋玻片置於6孔板內，種入細胞培養過夜，使為60% 80%。設對照組、2. 5yg / yL,5yg / μ L峨參石油醚提取物組(AM9)和對照組、1. 25 Ug / yL,2.5yg / μ L峨參石油醚提取物組(H460)，分別繼續培養M h，吸棄廢液，然後 用4%多聚甲醛固定細胞爬片35min，IxPBS衝洗3次，每次2min，加入2 mL DAPI染色液，染 色15min，IxPBS衝洗兩次，取出爬片用封片液封片，螢光顯微鏡可檢測到呈藍色的細胞核。 激發波長在350 nm左右，發射波長在460 nm左右。2. 4統計學分析採用SPSS13. 0軟體進行數據分析，各組數據以 7 士s表示，實驗組及對照組比較用單因素方差分析。實驗結果
3. 1峨參石油醚提取物對肺癌細胞A549和H460生長的抑制作用 採用MTT比色法 檢測峨參石油醚提取物對肺癌細胞A549和H460
生長的抑制作用，結果表明，(1.25 80) yg / μ L的峨參石油醚提取 物對體外培養的人肺癌細胞Α549和Η460的增殖呈明顯抑制作用，並 且隨著藥物濃度的升高，細胞存活率不斷下降，峨參石油醚提取物對 肺癌細胞Η460的抑制作用比對細胞Α549明顯。經計算得出，峨參石 油醚部位提取物對肺癌細胞Α549和Η460的IC5tl分別為6. 13 Ug / μ L和 0. 97 μ g/ μ L。見圖 1。3.2峨參石油醚提取物對肺癌細胞A549和H460凋亡的影響倒置顯微鏡 觀察到，經峨參不同部位提取物處理4 後，肺癌細
胞A549和H460的生長明顯受到抑制，細胞體積縮小，連接消失，與 周圍的細胞脫離，細胞由梭形變成圓形細胞脫落，浮懸於培養液中。螢光顯微鏡觀察到，經峨參石油醚提取物處理24h後，肺癌細胞A549 和H460生長明顯受到抑制，螢光增加，有明顯的細胞核斷裂和皺縮， 隨劑量增加，細胞凋亡現象越明顯，見圖2。
本實驗應用MTT比色法觀察到1. 25-80 μ g / μ L的峨參石油醚部位提取物對肺癌 細胞Α549和Η460的生長具有明顯抑制作用，結果提示峨參石油醚提取物對肺癌細胞Α549 和Η460的抑制作用的IC5tl值分別為6. 13 Ug / μ L和0. 97 Ug / μ L,且抑制率與濃度 呈明顯的效應關係，隨著藥物濃度的增加，細胞存活率不斷下降。用倒置顯微鏡觀察到，經 峨參石油醚部位提取物處理肺癌細胞Α549和Η460後，癌細胞生長明顯受到抑制，細胞體積 縮小，連接消失，與周圍的細胞脫離，細胞由梭形變成圓形細胞脫落，浮懸於培養液中。不同 濃度的峨參石油醚提取物作用於Α549和Η460細胞，24 h後用DAPI染色，螢光下可見細胞核發生明顯皺縮和斷裂。 綜上所述，峨參石油醚提取物對肺癌細胞A549和H460的生長確有明顯抑制作用， 通過進一步研究石油醚提取物對肺癌細胞A549和H460的作用機理，發現其對以上兩種癌 細胞凋亡有明顯誘導作用。這為峨參抗肺癌的研究提供了實驗依據。
權利要求
1.一種抑制肺癌細胞生長的峨參提取物，其特徵在於所述的提取物通過以下方法制 備(1)將峨參切斷，粉碎成細小顆粒，過20目篩，烘乾，用8倍體積量的80%乙醇浸泡24h ； (2)利用閃式提取器，對(1)步驟的浸泡體系間斷提取，抽濾，得濾液；旋轉蒸發儀回收溶 劑，得峨參浸膏；C3)用石油醚萃取浸膏，濃縮後，得到石油醚部位提取物。
2.權利要求1所述之抑制肺癌細胞生長的峨參提取物的用途，其特徵在於以峨參石 油醚提取物為藥用活性成分製備對肺癌細胞A549和H460產生抑制作用的藥物。
全文摘要
本發明公開了一種對肺癌細胞具有明顯抑制作用的峨參石油醚部位提取物及其藥用用途，所述的提取物通過以下方法製備將峨參切斷，粉碎成細小顆粒，過20目篩，烘乾，用8倍體積量的80%乙醇浸泡24h，利用閃式提取器，對(1)步驟的浸泡體系間斷提取，抽濾，得到濾液，旋轉蒸發儀回收溶劑，得到浸膏。再用石油醚萃取，得到石油醚部位提取物，用旋轉蒸發儀回收溶劑。本發明提取物的製備工藝簡便合理。本發明還公開了以峨參石油醚提取物為藥用活性成分製備對肺癌防治藥物的用途，所述活性提取物對肺癌細胞A549和H460癌細胞凋亡有明顯誘導作用，可作為藥用活性成分製備藥物。
文檔編號A61K36/23GK102125588SQ201110058789
公開日2011年7月20日 申請日期2011年5月4日 優先權日2011年5月4日
發明者萬軍, 吳曉青, 唐靜, 李娜, 塗顯琴, 耿耘, 蔣合眾, 馬超英, 高雅蓉, 魏屹 申請人:西南交通大學