基因rcs21的製作方法

2024-02-03 11:50:15

專利名稱：：基因rcs21的製作方法基因RCS215本發明涉及新鑑定出的基因，其編碼L-抗壞血酸(下文中也稱為維生素C)合成中涉及的蛋白質。本發明還涉及包含該新穎基因的全長多核苷酸序列的多核苷酸及其片段，所述多核苷酸編碼的新穎的多肽及其片段，以及它們的功能等同物。本發明還涉及所述多核苷酸和多肽作為生物技術工具在從微生物生產維生素C中的用途，其中對所述多核苷酸和/或被10編碼的多肽的修飾對在所述微生物中生產所述發酵產物的產率、產量和/或效率有著直接或間接的影響。本發明還包括使用所述多核苷酸和經修飾的多核苷酸序列轉化宿主微生物的方法/工藝。本發明還涉及經過遺傳工程改造的微生物及其用於直接生產維生素C的用途。維生素c是對人類來說非常重要且必不可少的營養因子。維生素c還15用於動物飼料，儘管一些畜牧動物可自身體內合成維生素C。在過去的70年中，己通過公知的Reichstein方法從D-葡萄糖對維生素C進行了工業生產。該工藝中的所有步驟都是通過化學方式進行的，只除了其中一個步驟(從D-山梨糖醇到L-山梨糖的轉化)，其通過微生物轉化來進行。從對維生素C的工業生產的最初實踐開始，就已使用了多種化20學改良和技術改良，來提高Reichstein方法的效率。近來對維生素C生產的發展被概括於Ullmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry,5thEdition,Vol.A27(1996),pp.547ff中。維生素C生產的不同中間步驟已在微生物或從中分離出的酶的協助下進行。因此，可通過發酵工藝，通過屬於例如i:etogw/om'cz'gem'wm屬或25G/wco"o&"w屬的菌株從L-山梨糖或D-山梨糖醇起始來生產2-酮基-L-古洛酸(2-KGA，這是可通過鹼性重排反應化學轉化為維生素C的中間產物)，或者通過屬於G/wco"oZ)acter屬或屍cwtoea屬的重組菌株，從D-葡萄糖起始進行另一種發酵工藝來生產2-酮基-L-古洛酸。目前用於對維生素進行化學生產的方法具有一些人們不想要的特徵，例如高能耗以及要使用大量的有機及無機溶劑。因此，在過去數十年中，人們已在研究更加經濟且環保的用微生物轉化來製造維生素C的其它方法。從大量底物(包括D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮)來直接生產維生素C已在多種微生物中被報導過，所述微生物例如藻類、酵母和乙酸細菌，其中使用了不同的培養方法。己知能直接生產維生素c的細菌的例子包括，例如，來自G/wcowotecfe/-、G7wco"ace/o^ac/er、」ceto6acter、A^togw/函'a'gem'iwz、屍awtoea、屍化W(io,was1或j&cAen'c/n.a屬的菌株。已知酵母或藻類的例子包括，例如Om^cto、5Vzcc/^ram少c"、Zygc^accAaramyces、5bA/mracc/^o，ces、i^yvmmjc&y或C7z/ore〃a。能吸收D-山梨糖醇用於生長的微生物通常具有能將該化合物氧化為普遍性的同化吸收底物(例如D-果糖)的酶。能在L-山梨糖上生長的微生物還擁有一種酶——NAD(P)H-依賴性L-山梨糖還原酶，該酶可將該化合物還原為D-山梨糖醇，D-山梨糖醇再被進一步氧化為D-果糖。被D-果糖激酶磷酸化之後，D-果糖成為很多微生物生長的優秀底物。例如，在乙酸細菌(其是專性需氧的革蘭氏陰性微生物，屬於Jceto^z"er、G7wcowo6a"er禾口G7wco打aceto6a"er屬)的'瞎況下，這些微生物能將D-山梨糖醇轉運進胞質溶膠(cytosol),並通過胞質溶膠中的NAD-依賴性D-山梨糖醇脫氫酶將其轉化為D-果糖。一些個體菌株，例如G/wco"o^"eroxy&似IFQ3292和IFO3293還能將L-山梨糖轉運進胞質溶膠，並通過胞質溶膠中的NAD(P)H-依賴性L-山梨糖還原酶將其還原為D-山梨糖醇，D-山梨糖醇再被進一步氧化為D-果糖。在這些細菌中，Embden-Meyerhof-Parnas途徑以及三羧酸循環並不具有完全活性，將糖導向中央代謝的主要途徑是磷酸戊糖途徑。通過磷酸化反應從D-果糖獲得的D-果糖-6-磷酸進入磷酸戊糖途徑，其被進一步代謝，產生以NAD(P)H形式存在的還原能量和生長及維持所必需的三羧基化合物。乙酸細菌因其能不完全氧化不同底物(例如醇、糖、糖醇和醛)的能力而為人們公知。這些過程為人們所己知並通常被稱為氧化發酵或不完全氧化，它們已被長時間應用於食品和化學工業中，尤其是對醋和L-山梨糖的生產中。已知能用屬於G/wcow^acter屬的菌株從D-山梨糖醇或L-山梨糖進行不完全氧化獲得的有用產物是2-KGA。乙酸細菌通過位於周質空間中、周質膜上以及胞質中的不同脫氫酶來完成這些不完全氧化反應。不同的脫氫酶使用不同的輔助因子，最常見的5是用於膜結合酶或周質酶的PQQ和FAD，以及用於胞質酶的NAD/NADP。雖然這些氧化反應的所有產物都通過外層膜分散回到外界水環境，但是它們中的一些可被主動或被動轉運進細胞，並進一步用於與生長和能量形成有關的代謝途徑。細胞中，氧化產物可被還原酶多次還原回它們的最10初底物，然後被導向回到中央代謝。在電子轉移中具有活性的蛋白質，尤其是酶和轉運蛋白，在本文中被稱為涉及呼吸鏈系統(區espiratory￡hainSystem)。此類蛋白質在本文中被縮寫為RCS蛋白，其在生物的公知呼吸鏈(也稱作電子轉移系統)中發揮作用。15已知RCS蛋白在下述機制中很重要，通過該機制，細胞中通過氧化還原反應產生的電子被進一步轉移，這通常通過涉及輔助因子和氧化酶以及最終電子受體的一系列氧化還原反應來進行。活的生物體用於生產必要活動所需的能量的主要機制是呼吸。在高等生物中，碳水化合物、蛋白質、脂肪酸在胞質中通過糖酵解異化途徑以及20氧化過程被代謝為乙醯-CoA。乙醯-CoA再通過被稱為檸檬酸循環的一系列反應(發生於線粒體中)被進一步代謝。從這些反應獲得的能量用於產生以例如FADH2和NADH的形式貯存的還原能量。然後這些化合物用於所謂的電子轉移鏈，電子轉移鏈是一系列氧化還原鏈式反應，其中涉及位於線粒體內膜中的不同組分。最終電子受體是氧，其再與從反應鏈獲得的25質子反應，形成水。從該過程獲得的質子濃度梯度是ATP合成的驅動力。在細菌中，該基礎呼吸過程遵循同樣的生理原理，但可能以不同方式進行，並且涉及不同組分、中間產物、酶複合體以及終產物。細菌呼吸過程的效率變化可以很大，這取決於每個物種所表達的功能性生物組分，這進而取決於可獲得的遺傳機制以及取決於給定的生長條件。舉例而言，乙酸細菌(其是專性需氧的革蘭氏陰性微生物，屬於Jceto6acte/-、G7wco"o6acter禾口G/wcowacetoZacter屬)在能量產生過禾呈的方面呈現出特殊的性質。這些細菌因其能不完全氧化不同的底物(例如醇、糖、糖醇以及醛)而為人們所公知。這些過程為人們所已知並通常被稱為5氧化發酵，它們已被長時間應用於食品和化學工業中，尤其是對醋和L-山梨糖的生產中。已知使用屬於G/"co朋6acter屬的菌株從不完全氧化獲得的有用產物是對從D-山梨糖醇和L-山梨糖起始而言，2-酮基-L-古洛酸(2-KGA);對從D-葡萄糖起始而言，5-酮基-D-古洛酸(這是用於對D-酒石酸進行生物合成的前體)。對乙酸細菌來說，不完全氧化是產生能量10的主要機制。它們通過位於周質空間中、周質膜上以及胞質中的不同的脫氫酶完成這些反應。不同的脫氫酶使用不同的輔助因子，最常見的是用於膜結合酶或周質酶的PQQ和FAD，以及用於胞質酶的NAD/NADP。G7wcowo6acter/G7wcowaceto6a"er禾口^ceto6acter菌牛朱的電子轉移鏈已矢口分別包括輔酶Q10(CoQ10)和CoQ9作為用於所有過程的通用電子轉移化15合物，在一些情況下，所述電子轉移鏈包括某些種類的細胞色素c元件(element)。據報導，G7wco"o6acter菌株不含細胞色素c氧化酶，但其具有其它類型的末端氧化酶，例如Z^類型的。本發明的一個目的是提高維生素C生產的產率和/或生產能力。令人吃驚地，我們發現，RCS蛋白或此類蛋白的涉及電子轉移的亞基20在對維生素C的生物技術生產中具有重要作用。在一種實施方式中，本發明的RCS蛋白選自氧化還原酶[ECl]，優選選自在作為供體的聯苯酚以及相關物質上發揮作用的氧化還原酶[EC1.10],更優選選自用氧作為受體的氧化還原酶[EC1.10.3]以及具有其它受體的氧化還原酶[EC1丄99〗，最優選是醇脫氫酶(受體)[EC1丄99.8]。25此外，本發明的RCS蛋白可選自呼吸鏈蛋白，更優選選自載體蛋白或在輔助因子和/或輔基(prostheticgroup)的生物合成中發揮作用的蛋白，特別是涉及輔助因子和/或它們的前體(例如FAD、NAD、NADP、PQQ、泛醌(包括CoQ8、CoQ9或CoQ10)、細胞色素a/ZVc/c/以及亞鐵血紅素、對氰化物不敏感的型末端氧化酶亞基I(CydA)和II(CydB)、對氰化物敏感的60型末端氧化酶亞基(特別是亞基I、II、III和IV)、細胞色素c氧化酶亞基(特別是與膜結合的醇脫氫酶g3-ADH細胞色素c亞基))的生物合成或成熟的蛋白。最優選地，它們選自PQQ生物合成蛋白(例如PQQ生物合成蛋白A、B、C、D、E)或亞鐵血紅素輸5出蛋白(例如CcmA或CycW亞鐵血紅素輸出蛋白)。特別地，現已發現，具有下述核苷酸序列的多核苷酸編碼的RCS蛋白在對維生素C的生物技術生產中具有重要作用，該核苷酸序列能在優選高度嚴謹條件下與SEQIDNO:l所示的序列雜交。現還已發現，通過在能直接生產維生素C的微生物(例如G/"cwzoZ^cte"中對根據本發明的核苷10酸的表達水平進行遺傳改變，可很大程度地提高所述微生物對維生素C的直接發酵。隨後，本發明涉及選自下述組的多核苷酸或此類多核苷酸的互補鏈，所述組由(a)編碼包含根據SEQIDNO:2的胺基酸序列的多肽的多核苷酸；15(b)包含根據SEQIDNO:1的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用來自微生物的基因組DNA作為模板，並使用根據SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的引物組，通過核酸擴增(例如聚合酶鏈式反應)來獲得；(d)多核苷酸，其包含編碼被(a)至(c)中任一項的多核苷酸編碼20的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一個或多個胺基酸殘基較之所述多肽被保守取代，並且，所述片段或衍生物具有PQQ生物合成蛋白(RCS21)的活性；(e)編碼PQQ生物合成蛋白(RCS21)的多核苷酸，其互補鏈能在嚴謹條件下與(a)至(d)中任一項所定義的多核苷酸互補；以及25(f)編碼PQQ生物合成蛋白(RCS21)的多核苷酸，其與(a)至(d)中任一項所定義的多核苷酸至少70%相同，例如85%、90%或95%相同；構成。我們發現，本文中描述的SEQIDNO:2示出的從G/wco"okzcterojcj;&wDSM17078分離的RCS蛋白是特別有用的RCS蛋白，因為看起來其在微生物(特別是細菌，例如乙酸細菌，例如G7wco朋&cter，爿ceto^cter和G/wco"ac"okzcter)中的直接維生素C生產中發揮關鍵作用。因此，本發明涉及編碼根據SEQIDNO:2的多肽的多核苷酸。該蛋5白可由SEQIDNO:1示出的核苷酸序列編碼。本發明因此還涉及包含根據SEQIDNO:1的核苷酸序列的多核苷酸。上文確定的核苷酸序列和胺基酸序列被用作為"查詢序列"，以便用來自NationalCenterforBiotechnology[NCBI]的BLAST或Blast2程序(版本2)針對資料庫PROSW-SwissProt(完全發布版本加上增加的更新)進10行搜索。根據這些搜索結果，將根據SEQIDNO:1的RCS21多核苷酸標註為編碼輔酶PQQ生物合成蛋白A。可使用cDNA、mRNA或基因組DNA作為模板，使用合適的寡核苷酸引物(例如根據SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的核苷酸引物)，按照標準PCR擴增技術，通過核酸擴增來獲得根據本發明的核酸。由此擴增15出的核酸可被克隆進合適的載體，並通過DNA序列分析對其進行表徵。用於反應的模板可以是通過對從已知包含或懷疑包含根據本發明的多核苷酸的菌株製備的mRNA進行逆轉錄獲得的cDNA。PCR產物可被亞克隆和測序，以確保擴增出的序列代表本文所述的新的核酸序列或其功能等同物的序列。20然後可通過多種己知方法，用PCR片段分離全長cDNA克隆。例如，可標記擴增出的片段，用其篩選噬菌體或粘粒(cosmid)cDNA文庫。或者，經標記的片段可用於篩選基因組文庫。因此，本發明涉及包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用來自微生物的基因組DNA作為模板，並使用根據SEQIDNO:325和SEQIDNO:4的引物組，通過核酸擴增(例如聚合酶鏈式反應)來獲得。本發明還涉及下述多核苷酸，其包含編碼本文所述的多核苷酸編碼的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一個或多個胺基酸殘基較之所述多肽被保守取代，並且，所述片段或衍生物具有RCS多肽(優選地，RCS21多肽)的活性。本發明還涉及下述多核苷酸，其編碼RCS多肽(優選地，RCS21多肽)，其互補鏈能在嚴謹條件下與本文定義的多核苷酸互補。本發明還涉及下述多核苷酸，其與本文定義的多核苷酸至少70%相5同，並且其編碼RCS多肽；本發明還涉及是上文定義的多核苷酸的互補鏈的多核苷酸。本發明還涉及下述微生物，其中，RCS多肽(優選地，RCS21多肽)的活性增強和/或提高，使得從D-山梨糖醇或L-山梨糖直接生產的維生素C的產率增加。這可例如通過將根據本發明的多核苷酸轉入重組或非重組10微生物來完成，所述為生物可以含有RCS21基因的內源等同物，或者可以不含。技術人員將知道如何增強和/或提高RCS蛋白(優選地，RCS21蛋白)的活性。這些可以例如增加RCS蛋白(優選地，RCS21蛋白)的比活性，或者通過對宿主生物進行遺傳修飾來完成，所述遺傳修飾以較之野15生型生物產生更多或更穩定的RCS蛋白(優選地，RCS21蛋白)的拷貝的方式來進行。在下述說明書中，將對達到此目的(即，通過增加RCS21蛋白的活性，增加從D-山梨糖醇或L-山梨糖直接生產的維生素C的產率和/或產量)的方案進行詳細描述。在進行必要修正後，這些方案可應用於其它20RCS蛋白。為獲得產生更多拷貝的RCS21基因(即，過量表達該基因)和/或蛋白的生物進行的修飾包括使用強啟動子，或者對RCS21基因(的部分)或其調控元件加以突變(例如，插入、缺失或點突變)。這還可包括將多個拷貝的基因插入到合適的微生物中。RCS21蛋白比活性的增加也可25通過本領域已知的方法來完成。此類方法可包括對RCS21基因(的部分)的突變(例如，插入、缺失或點突變)。如果基因的轉錄水平較之野生型基因有所增強，那麼認為該基因被"過量表達"。這可通過例如對mRNA的量加以定量的Northern印跡分析來測量，mRNA的量被用作為對基因表達的指示。在本文中，如果產生的mRNA的量較之野生型基因產生說明書第8/41頁的mRNA的量增加至少1%、2%、5%、10%、25%、50%、75%、100%、200%或者甚至超過500%，那麼基因就是過量表達的。本領域中還已知可以通過將RCS21蛋白與特定增強子相接觸或與能與RCS21蛋白發生特異性相互作用的其它物質相接觸，來增強給定蛋白5質活性。為鑑定出此類特定增強子，可表達RCS21蛋白，並對存在懷疑能增強RCS21蛋白活性的化合物時的活性加以測試。還可通過對編碼RCS21的信使RNA進行穩定化來增加RCS21蛋白的活性。此類方法也是本領域已知的，見，例如Sambrooketal.,1989，MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.禾口Ausubeletal.(eds.),101995,CurrentProtocolsinMolecularBiology,(JohnWiley&Sons,N.Y.)。本發明可以在攜帶有RCS21基因或其同源體的任何微生物中進行。合適的微生物可選自酵母、藻類和細菌構成的組，它們可以是野生型菌株或通過標準的誘變方法和選擇方法獲得的突變體菌株以及重組菌株。此類酵母的例子可以是，例如，QmA^、5^ccAaram少CM、15Z少goracc/zaram少CM、5"c/n'zo犯cc/wram;;ces或A7w_yveram_yc&s。此類藻類的例子可以是，例如，CWwe/fe。此類細菌的例子可以是，例如，G7wcowoZac^、Jceto6a"er、G7wcowac柳6a"er、i^etogw/om'c/gem'wm、屍awtoea、屍sewc/omowoy(例如，i^ew^/<ms、G.cen'"ws、(.yh3tew/77、爿.ace/"w6取；c少/z力薩或ylac""wfep.or/eam^，優選地，G.ox;^araDSM17078。已按照《布達佩斯條約》，於2005年1月26日將G/wco"o6acterow^raDSM17078(以前稱作G7wcowZ)a"ero:n^msN44-l)保藏至DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen(DSMZ)，MascheroderWegIB,D-3812425Braunschweig,Germany。可用於本發明的微生物可被公眾從不同來源獲得，例如，DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen(DSMZ)，MascheroderWegIB,D-38124Braunschweig,Germany、AmericanTypeCultureCollection(ATCC),P.O.Box1549，Manassas,VA20108USA或CultureCollectionDivision,NITEBiologicalResourceCenter,2-5-8,Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba,292-0818，Japan(以前是InstitueforFermentation,Osaka(IFO),17-85,Juso-honmachi2-chome,Yodogawa-ku,Osaka532-8686,Japan)。保存到IFO的優選的細菌的例子例如是G&ccwo6actero^qyc/aw(以前被稱為5G.me/flwogewus)IF03293、G7wc。wo6a"erax^aw51(以前被稱為G.me/a"oge肌s)IF03292、G7wcowo6ac,ero;qyt/a/is(以前被禾爾為G.n^g7'woms)IF03244、G7wcc"o^c/e^/h3fewn7(以前被禾爾為G.zWw血'ws)IFO3260、G7Mcowo6a"ercer/wwsIF03266、G7wcowo6actera)qydawIFO3287和^ceto^cterace"犯fo/.cWeawt^IFO3259，上述這些都於1954年4月510日被保藏；1975年10月22日保藏的爿ceto6acferac幼'x_y/z>2wmIFO13693禾n1977年12月8日保藏的爿ceto^/z力iw2IFO13773。菌株A^tokcter平ATCC15164也是優選細菌的例子，其被保藏於ATCC。菌株G/wcowote"erax_y<i<ms(以前被稱為G.me/awogem^s)N44-l是優選細菌的另一個例子，其是菌株IFO3293的衍生物，在15Sugisawaetal.，Agric,Biol.Chem.54:1201-1209,1990中對其有所描述。本發明的微生物可在DNA水平或蛋白質水平上攜帶其它修飾(見上文所述)，只要此類修飾對從底物(例如D-山梨糖醇或L-山梨糖)直接生產維生素C的產率、產量和/或效率具有直接影響即可。此類其它修飾可以例如影響編碼上文所述的RCS蛋白的其它基因，特別是，編碼與膜結合20的L-山梨糖酮脫氫酶(例如，L-山梨糖酮脫氫酶SNDHai)或與膜結合的PQQ結合D-山梨糖醇脫氫酶的基因。進行此類修飾的方法是本領域已知的，一些例子在本文中有進一步描述。關於用於對維生素C進行直接生產的SNDHai及其核苷酸和胺基酸序列，參見WO2005/017159，其通過引用併入本文。25根據本發明的另一目的，提供了本文定義的多核苷酸或者已用此類多核苷酸進行過遺傳工程改造的微生物在生產維生素C中的用途。本發明還涉及在微生物中表達內源基因的工藝，涉及在微生物中生產上文定義的多肽的工藝，以及生產能產生維生素C的微生物的工藝。所有這些工藝都可包含改變微生物的步驟，其中，本文中使用的"改變"包括下述工藝，該工藝以使得發酵產物的產率和/或生產能力較之野生型生物有所提高的方式來進行"遺傳改變"或"改變細胞培養基的組成和/或改變用於培養的方法"。本文中使用的"維生素C的提高的產率"表示較之野生型微生物(即，沒有被遺傳改變的微生物)而言增加至少5%、10%、525%、30%、40%、50%、75%、100%、200%或者甚至超過500%。術語"遺傳工程改造"或"遺傳改變"表示對活的生物體中遺傳物質結構的科學改變。這包括生產和使用重組DNA。更特別地，這用於描述來自天然存在的生物而經遺傳工程改造或修飾的生物。遺傳工程改造可通過本領域已知的多種方法來進行，例如，基因替換，基因擴增，基因打10斷，使用質粒、病毒或其它載體進行的轉化、轉染。經遺傳修飾的生物，例如，經遺傳修飾的微生物通常還被稱作重組生物，例如重組微生物。根據本發明的另一方面，提供了用於通過直接發酵生產維生素C的工藝。特別地，本發明提供了用於直接生產維生素C的工藝，所述工藝包括15將底物轉化為維生素C。這可例如在包含微生物的培養基中進行，所述微生物可以是靜止微生物或生長中的微生物，優選地，靜止微生物。若干種底物可在本發明的工藝(即，用於將給定的底物直接轉化為維生素C的工藝，例如上文提到的)中用作為碳源。特別適用的碳源是可以容易地從D-葡萄糖或D-山梨糖醇代謝途徑獲得的那些，例如，D-葡萄20糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖、L-山梨糖酮、2-酮基-L-古洛糖酸鹽/酯、D-葡萄糖酸鹽/酯、2-酮基-D-葡萄糖酸鹽/酯，或2,5-二酮基-葡萄糖酸鹽/酯。優選地，底物選自，例如，D-葡萄糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮，更優選地，選自D-葡萄糖、D-山梨糖醇或L-山梨糖，以及最優選地，選自D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮。在涉及使用微生物進行25上述工藝時，術語"底物"和"生產底物"在本文中可互換使用。在本文中用於使用微生物進行的上述工藝的培養基可以是用於生產維生素C的任何合適的培養基。典型地，該培養基是包含例如鹽和(多種)底物，並具有一定pH的水性培養基。其中底物被轉化為維生素C的培養基也被稱為生產培養基。本文中使用的"發酵"或"生產"或"發酵工藝"可以是利用技術人員己知的培養基、條件和方案，使用生長中的細胞或非生長中的所謂靜止細胞，這在適合於將合適的底物轉化為想要的產物(例如維生素C)的條件下，使用技術人員已知的培養基、條件和方案對所述靜止細胞進行培5養之後進行。優選地，用靜止細胞來生產維生素C。術語"直接發酵"、"直接生產"、"直接轉化"等意指微生物能通過一個或多個生物轉化步驟將某底物轉化為特定的產物，而無需任何額外的化學轉化步驟。例如，術語"將D-山梨糖醇直接轉化為維生素C"意在描述下述過程，其中，微生物生產維生素C，並且，其中，D-山梨糖醇作10為碳源提供，而無需中間產物化學轉化步驟。能直接發酵維生素c的單種微生物是優選的。在允許本文定義的從底物開始的此類轉化進行的條件下培養所述微生物。在關於使用微生物進行上述工藝的方面，應當理解，上述微生物還包括此類菌株的具有同樣生理屬性的異名(synonym)或基原異名15(basonym)，其女口InternationalCodeofNomenclatureofProkaryotes所定義。本文中使用的對微生物的命名是InternationalCommitteeonSystematicsofProkaryotesandtheBacteriologyandAppliedMicrobiologyDivisionoftheInternationalUnionofMicrobiologicalSocieties官方接受的(在優先權申請的提交日期時)，並被其官方出版物InternationalJournalofSystematicand20EvolutionaryMicrobiology(IJSEM)所公開。具體的參考文獻是Urbanceetal.,IJSEM(2001)vol51:1059-1070，以及IJSEM(2001)vol51:1231-1233上的修訂通矢口，其中描述了對作為Ke^gw/om'dgem'wmvw/gare的o砂JawsDSM4025的分類學上的重新歸類。本文中使用的靜止細胞指下述微生物的細胞，所述微生物例如是存活25但不能活躍生長的，或者是以低的比生長速率生長的，例如，低於0.02h'1的生長速率，優選地，低於0.01h"。顯示出上述生長速率的細胞被稱為"靜止細胞模式"。如上所述使用微生物來進行的本發明的工藝可以以不同的步驟或階段來進行優選地，在第一個步驟(也被稱為步驟(a)或生長階段)中，於能夠生長的條件下對微生物進行培養。通過改變條件來終止該階段，其中，所述條件改變使得微生物的生長速率降低，導致靜止細胞產生，這也被稱為步驟(b)，接著是用(b)的靜止細胞從底物來生產維生素C，這也被稱為生產階段。5使用微生物的上述工藝中進行的生長階段和生產階段可在同樣的容器中進行，即，僅有一種容器，或在兩種或更多的不同容器中進行，在兩個階段之間具有可選的分離步驟。可通過任何合適的手段從細胞中回收得到產生的維生素C。"回收"指，例如，可將維生素C從生產培養基中分離出來。可選地，可對由此產生的維生素C進行進一步加工。10就關於使用微生物進行上述工藝的本發明的目的而言，術語"生長階段"、"生長步驟"和"生長時期"在本文中可互換使用。這同樣適用於"生產階段"、"生產步驟"、"生產時期"。進行本發明的使用微生物的上述工藝的一種途徑可以是下述工藝，其中微生物生長於第一容器(所謂的生長容器)中，它們作為靜止細胞的15來源，細胞中的至少一部分被轉移到第二容器(所謂的生產容器)中。生產容器中的條件可以是使得從生長容器中轉移出的細胞變為上文定義的靜止細胞的條件。維生素C在第二容器中產生，並從其中被回收。在關於使用微生物進行上述工藝的方面，在一個方面，生長步驟可在水性培養基中進行，即，補充有用於在需氧條件下生長的合適營養物的生20長培養基。培養可以以，例如，分批、補料分批、半連續或連續模式來進行。培養時間可以例如隨所用的宿主、pH、溫度和營養培養基而變化，其可以為例如以分批或補料分批模式進行時，大約10小時至大約10天之間，優選為大約l天至大約IO天之間，更優選地，大約1至大約5天，這取決於所述微生物。如果細胞以連續模式被培養，駐留時間可以例如為大25約2至大約100小時，優選地，大約2至大約50小時，這取決於所述微生物。如果微生物選自細菌，培養可進行於大約3.0至大約9.0的pH下，優選為大約4.0至大約9.0，更優選地，大約4.0至大約8.0，進一步更優選地，大約5.0至大約8.0。如果使用了藻類或酵母，培養可進行於低於大約7.0的pH下，優選低於大約6.0，更優選低於大約5.5，最優選地，低於大約5.0。用於使用細菌進行培養的合適的溫度範圍可以為，例如，大約13°C至大約40°C，優選地，大約18°C至大約37°C，更優選地，大約13°C至大約36°C，最優選地，大約18°C至大約33°C。如果使用藻類或酵母，用於進行培養的合適的溫度範圍可以例如為，大約15°C至大約540°C，優選地，大約20°C至大約45°C，更優選地，大約25°C至大約40°C，進一步更優選地，大約25°C至大約38°C，最優選地，大約30。C至大約38°C。用於進行培養的培養基通常可以含有下述營養物作為可被吸收的碳源，例如，甘油、D-甘露醇、D-山梨糖醇、L-山梨糖、赤藻糖醇、核糖醇、木糖醇、阿糖醇、肌糖、半乳糖醇、D-核糖、D-果糖、D-葡萄10糖、蔗糖和乙醇，優選地，L-山梨糖、D-葡萄糖、D-山梨糖醇、D-甘露醇、甘油和乙醇；以及含有可消化的氮源，例如，有機物質，例如，蛋白腖、酵母提取物和胺基酸。所述培養基可以含有或不含有尿素和/或玉米浸出液和/或麵包酵母。多種無機物質也可被用作為氮源，例如，硝酸鹽和銨鹽。此外，生長培養基通常含有無機鹽，例如，硫酸鎂、硫酸錳、磷酸鉀15和碳酸鈣。然後可在與上文所述大致相同的模式、溫度和pH條件下，存在例如D-山梨糖醇、L-山梨糖或D-葡萄糖等底物時，進一步溫育使用上述方案獲得的細胞，以使得所述細胞將底物直接轉化為維生素C。溫育可在富含氮的培養基中進行，培養基中含有，例如，有機氮源，例如，蛋白腖、酵母提取物、麵包酵母、尿素、胺基酸和玉米浸出液，或無機氮源，20例如硝酸鹽和銨鹽，這種情況下，細胞將能夠在產生維生素C的同時進一步生長。或者，溫育可在氮貧乏的培養基中進行，在這種情況下，細胞將基本不生長，其將處於靜止細胞模式，或生物轉化模式。在所有情況下，溫育培養基還可含有無機鹽，例如硫酸鎂、硫酸錳、磷酸鉀和氯化鈣。在關於使用微生物進行上述工藝的方面，在生長階段中，比生長速率25例如為至少0.02h—、對於以分批、補料分批或半連續模式生長的細胞而言，生長速率取決於，例如，生長培養基的組成、pH、溫度等。通常，生長速率可以例如在大約0.05至大約0.2h"的範圍內，優選地，在大約0.06至大約0.15h—1的範圍內，最優選地，在大約0.07至大約0.13h—1的範圍內。在使用微生物進行的上述方法的另一個方面，可通過在瓊脂平板(作為生長容器)上對個別微生物進行培養來提供靜止細胞，其中使用了基本上相同的條件，例如，如上所述的培養時間、pH、溫度、營養培養基，並添加有瓊脂。5在使用微生物進行上述工藝的方面，如果生長和生產階段進行於兩種不同的容器中，那麼來自生長階段的細胞可被收穫或濃縮，並轉移至第二容器(所謂的生產容器)中。該容器可以含有補充有任何適用的生產底物(可通過細胞被轉化為維生素C)的水性培養基。可通過任何合適的操作來收穫或濃縮來自生長容器的細胞，所述操作例如，離心、膜橫流10(membranecrossflow)超濾或微濾、過濾、傾析、絮凝。由此獲得的細胞還可以以原始培養液的形式從生長容器轉移至生產容器中，而不用被收穫、濃縮或洗滌，即，以細胞懸浮液的形式被轉移。在一種優選的實施方式中，細胞以細胞懸浮液的形式從生長容器被轉移至生產容器，在它們之間沒有任何洗滌或分離步驟。15因此，在使用微生物進行的上述工藝的一種優選的實施方式中，上文所述的本發明方法的步驟(a)和(c)不被任何洗滌和/或分離步驟分開。在使用微生物進行上述工藝的方面，如果生長和生產階段進行於同樣的容器中，細胞可以生長於適當的條件下，以達到理想的細胞密度，接著用含有生產底物的生產培養基來替換生長培養基。此類替換可以例如是，20在從容器中收回或收穫上清液的同時，並以與之相同的速度，將生產培養基補入到容器中。為將靜止細胞保留於容器中，可以使用用於細胞回收或駐留的操作，例如，細胞回收步驟。此類回收步驟，例如包括但不限於如下的方法使用離心機、過濾器、超濾步驟的膜橫流微濾、膜反應器、絮凝或在合適的多孔、非多孔或聚合物基質上的細胞固定。在轉移階段之25後，對容器應用下述工藝條件在此條件下，細胞以如上文定義的靜止細胞模式存在，並且，生產底物能有效地轉化為維生素C。在使用微生物進行上述工藝的方面，用於生產步驟中的生產容器中的水性培養基在下文中被稱為生產培養基，其可以僅含有將被轉化為維生素c的生產底物，或可以含有額外的無機鹽，例如，氯化鈉、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸錳、磷酸鉀、磷酸鈣和碳酸l丐。生產培養基還可以含有可消化的氮源，例如有機物質，例如，蛋白腖、酵母提取物、尿素、胺基酸和玉米浸出液；以及無機物質，例如，氨、硫酸銨和硝酸鈉，其濃度為使得細胞被保持為上文定義的靜止細胞模式的濃度。培養基可以含有或不含有尿素5和/或玉米浸出液和/或烘焙酵母。生產步驟可以，例如，以分批、補料分批、半連續或連續模式進行。在補料分批、半連續或連續模式下，來自生長容器和生產培養基的兩種細胞都可以以合適的補料速率被連續或間歇地補入到生產容器中。或者，僅生產培養基可被連續或間歇補入到生產容器中，而來自生長容器的細胞被同時轉移至生產容器。來自生長容器的細胞10可在生產容器中用作為細胞懸浮液，或者可被用作為例如，在任何固相(例如，多孔或聚合物基質)上絮凝或固定的細胞。生長時期被定義為從底物進入到生產容器中開始，到收穫含有維生素C的上清液(即所謂的收穫流)之間的時期，該時期可根據，例如，使用的細胞的濃度和種類、pH、溫度和營養培養基而變動，其優選在大約2至大約100小時之間。pH15和溫度可與生長步驟中的pH和溫度不同，但應與生長步驟中的基本上相同。在使用微生物進行上述工藝的一種優選的實施方式中，生產步驟可以以連續模式進行，這意味著，含有來自生長容器的細胞的第一種補料流和含有底物的第二種補料流被連續或間歇補入到生產容器中。第一種流可以20僅含有從生長培養基中分離/分開的細胞，或可以含有直接來自生長步驟的細胞懸浮液，即，懸浮於生長培養基中的細胞，而沒有任何中間的細胞分離、洗滌和/或分離步驟。在本文中定義的第二種補料流可以包括生產步驟的操作所需要的所有其它補料流，例如，以一種或多種不同的流的形式存在的包含底物的生產培養基、用於稀釋的水以及用於控制pH的鹼。25在關於使用微生物進行上述工藝的方面，當兩種流都連續補料時，第一種流的補料速率與第二種流的補料速率之比可在大約0.01至大約10之間變動，優選地，在大約0.01至大約5之間變動，最優選地，在大約0.02至大約2之間變動。該比例取決於第一種和第二種流中各自的細胞和底物的濃度。進行本發明的使用微生物的上述工藝的另一種途徑可以是在生長容器中使用一定細胞密度的靜止細胞的工藝。通過技術人員已知的方法，於600nm處，細胞密度作為吸收單位(光學密度)被測得。在一種優選的實施方式中，生產步驟中的細胞密度為至少大約10，更優選地，大約10至5大約200之間，進一步更優選地，大約15至大約200之間，進一步更優選地，大約15至大約120之間，最優選地，大約20至大約120之間。在關於使用微生物進行上述工藝的方面，為在生產階段期間(例如，以連續或半連續模式進行的)，以想要的細胞密度將細胞保持於生產容器中，本領域內已知的任何手段都可以使用，例如，通過離心、過濾、微濾10的膜橫流超濾、傾析、絮凝進行的細胞再利用，通過膜設備進行的細胞駐留，或細胞固定。此外，在生產步驟以連續或半連續模式進行的情況下，從生長容器中連續或間歇補入細胞，生產容器中的細胞密度可被保持於恆定的水平，這例如，通過從生產容器中收穫一定量的細胞來進行，所述的量對應於從生長容器中補入的細胞的量。15在關於使用微生物進行上述工藝的方面，從生產容器中回收/收穫在所謂的收穫流中含有的產生出的維生素C。收穫流可以包括，例如，來自生產容器的不含細胞的水溶液或含有細胞的水溶液，其中含有通過生產容器中的靜止細胞從生產底物轉化得到的維生素C。可通過本領域內己知的任何操作，將仍處於收穫流中的細胞與維生素C分開，例如，過濾、離心、20傾析、膜橫流超濾或微濾、切線流超濾或微濾或死端(deadend)過濾。在該細胞分離操作之後，收穫流中基本不含細胞。在另一個方面，本發明的工藝可組合有將產生的維生素C與收穫流中含有的其它組分分離和/或純化的額外步驟，即，所謂的下遊加工步驟。這些步驟可包括技術人員己知的任何手段，例如，濃縮、結晶、沉澱、吸25附、離子交換、電滲析、兩極膜電滲析和/或反滲透。維生素C可作為游離酸形式或其已知的任何鹽的形式被進一步純化，這是通過下述操作手段來進行的，例如，用活性炭進行處理、離子交換、吸附和洗脫、濃縮、結晶、過濾和乾燥。特別地，將維生素C與收穫流中其它組分的第一次分離可通過例如下述方法的任何合適的組合或重複來進行，所述方法例如兩區室或三區室電滲析、兩極膜電滲析、反滲透或吸附(其進行於，例如，離子交換樹脂上或非離子樹脂上)。如果獲得的維生素C的形式為L-抗壞血酸的鹽，將該鹽形式轉化為游離酸形式可通過例如，兩極膜電滲析、離子交換、模擬移動床色譜技術等來進行。上述步驟的組合也可使用，例5如，將電滲析和兩極膜電滲析組合為一個步驟，以及使用模擬移動床色譜方法的多個離子交換步驟的組合。上述任何方案單獨或組合就構成了用於分離和純化產物(即維生素C)的方便的手段。由此獲得的產物還可被進一步分離(例如，通過濃縮、結晶、沉澱、對晶體的洗滌和乾燥的方式來進行)和/或進一步純化(用活性炭處理、離子交換和/或重結晶)。10在一種優選的實施方式中，通過一系列上述下遊加工步驟來從收穫流中純化維生素C，而不必在該加工中的任何時刻將其轉移到非水性溶液中，即，所有步驟都在水性環境中進行。此類優選的下遊加工方案可以包括，例如，通過兩區室或三區室電滲析對來自生產容器的收穫流進行濃縮，通過兩極膜電滲析和/或離子交換將濃縮溶液中以其鹽的形式存在的維15生素C轉化為其酸的形式，通過例如用活性炭、離子交換或非離子樹脂進行處理等方法來進行純化，接著進行進一步的濃縮步驟和結晶。這些晶體可被分離、洗滌和乾燥。如果必要的話，晶體還可被重新溶解於水中，用活性炭和/或離子交換樹脂對其進行處理，並重結晶。然後可對上述晶體進行分離、洗滌和乾燥。20本發明的有利的實施方式通過從屬權利要求而顯而易見。根據本發明的教導，本領域技術人員將明白本發明的上述和其它方面以及上述和其它實施方式。通過對從G/wco"o6ac&rojc_y&raDSM17078獲得的基因組克隆進行測序，來測定包含編碼RCS21蛋白的SEQIDNO:1的核苷酸序列的基因25的序列。本發明還涉及編碼SEQIDNO:2所示的RCS21多肽的至少一個生物活性片段或衍生物的多核苷酸。本文中使用的"生物活性片段或衍生物"表示保留有與SEQIDNO:2所示的多肽基本相同的生物功能或活性的多肽。生物活性的例子可以例如是酶活、信號傳遞活性或抗體反應活性。術語"相同的生物功能"或"功能等同物"在本文中使用時表示蛋白質與SEQIDNO:2所示的多肽具有基本相同的生物活性，例如，酶活性、信號傳遞活性或者抗體反應活性。5本發明的多肽和多核苷酸優選以經分離的形式提供，優選地，被純化至均質。術語"經分離的"表示物質被移出其原來的環境(例如，如果其天然存在的話，就是天然環境)。例如，活的微生物中存在的天然存在的多核苷酸或多肽不是經分離的，但與天然系統中的一些或全部共存物質分開10的同樣的多核苷酸或多肽就是經分離的。此類多核苷酸可以是載體的一部分和/或此類多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，但仍然是經分離的，因為此類載體或組合物並非其天然環境的一部分。本文中使用的經分離的多核苷酸或核酸可以是這樣的DNA或RNA，它們與從中獲得該多核苷酸或核酸的生物的天然存在的基因組中緊密相鄰15的兩條編碼序列(5'末端一條，3'末端一條)並非緊密相鄰。因此，在一種實施方式中，核酸包括與編碼序列緊密相鄰的5'非編碼(例如，啟動子)序列的一些或全部。術語"經分離的多核苷酸"因此包括，例如，加入到載體中、加入到自主複製質粒或病毒中，或者加入到原核生物或真核生物的基因組DNA中的重組DNA，或者作為獨立於其它序列的單獨分子20(例如，通過PCR或限制性內切酶處理產生的cDNA或基因組DNA片段)存在的重組DNA。其還包括是雜合體基因的一部分的重組DNA，所述基因編碼基本不含細胞物質、病毒物質或培養基(當通過重組DNA技術生產時)或化學前體或其它化學物質(當通過化學方式合成時)的額外多肽。此外，"經分離的核酸片段"是這樣的核酸片段其天然並不作為25片段存在，並且將不會在天然狀態被發現。本文中使用的術語"多核苷酸"、"基因"和"重組基因"指可與染色體DNA分離開的、包括編碼蛋白質(例如，G.o矽c/fl"sDSM17078RCS蛋白)的開放讀碼框的核酸分子。多核苷酸可包括，例如，SEQIDNO:l所示的多核苷酸序列或其片段以及基因序列上遊或下遊的區域，所述區域可包括，例如，對於由其獲得的多肽的適當表達和穩定來說重要的啟動子區域、調控子區域和終止子區域。基因可包括編碼序列、非編碼序列(例如，位於基因編碼區域3'末端和5'末端的非翻譯序列)和調控序列。此外，基因指本文定義的經分離的5核酸分子。技術人員還將理解，導致RCS蛋白胺基酸序列的變化的DNA序列多態性可存在於禾中群(population)中，例如，G7wcowotecferox_y<i<ms種群中。RCS21基因中的此類遺傳多態性可由於天然變異存在於種群的個體間，或者存在於不同種群的細胞中。典型地，此類天然變異可導致RCS21基因核苷酸序列中1-5%的變化度。作為天然變異結果的、並且不會改10變RCS蛋白的功能活性的RCS21中的任何以及全部此類核苷酸變異和由此得到的胺基酸多態性也包括在本發明的範圍內。本文中使用的術語"多核苷酸"或"核酸分子"意欲包括DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA)禾口RNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸類似物產生的DNA或RNA的類似物。核酸分子可以是單鏈或雙鏈15的，但優選是雙鏈DNA。可使用寡核苷酸類似物或衍生物(例如，肌苷或磷硫醯核苷酸)來合成核酸。此類寡核苷酸可用於例如，製備具有改變的鹼基配對能力或增加的對核酸酶的抗性的核酸。本文中提供的序列信息不應被狹義理解為需要包括進被錯誤鑑定的鹼基。本文公開的特定序列可以很容易地用於從能將給定碳源直接轉化為維20生素C的重組或非重組微生物(特別是G/wcwzo^"woxj^a氾，優選地，G/wco加tecferoxWaMDSM17078)中分離出完整基因，隨後可容易地對該基因進行進一步的序列分析，由此鑑定出測序錯誤。除非特別指明，本文中通過對DNA分子進行測序來確定的所有核苷酸序列都是用自動DNA測序儀(測定的，並且，本文測定的DNA分子編25碼的多肽的所有胺基酸序列都是通過對按照上文所述測定的DNA序列進行翻譯來推測的。因此，如本領域所己知的，對由該自動方法所測定的任何DNA序列而言，本文所測定的任何核苷酸序列都可能含有一些錯誤。典型地，通過自動方法測出的核苷酸序列與被測序的DNA分子的實際核苷酸序列至少大約90%同源，更典型地，至少大約95%至至少大約99.9%相同。通過其它方法，包括本領域內公知的人工DNA測序方法，可對實際序列進行更為精確的測定。也如本領域所已知的，測得的核苷酸序列中較之實際序列的單個插入或缺失將會導致核苷酸序列翻譯中的讀碼框位移，使得從此類插入或缺失的點開始，測得的核苷酸序列編碼的預計氨5基酸序列完全不同於被測序的DNA分子實際編碼的胺基酸序列。本領域技術人員能鑑定出此類被錯誤鑑定的鹼基，並且知道如何改正此類錯誤。根據本發明的核酸分子可以僅包含本發明提供的核酸序列(例如，SEQIDNO:1示出的序列)的一部分或片段，例如，可用作為探針或引10物的片段(例如SEQIDNO:3或SEQIDNO:4)或編碼根據本發明的蛋白的一部分的片段。從對RCS21基因的克隆測定的核苷酸序列允許產生被設計來鑑定和/或克隆RCS21家族其它成員以及來自其它物種的RCS21同源體的探針和引物。典型地，該探針/引物包含基本純化的寡核苷酸，其典型地包含與SEQIDNO:1所示的核苷酸序列或其片段或衍生物的至少15大約12或15個、優選大約18或20個、更優選大約22或25個、進一步更優選大約30、35、40、45、50、55、60、65或75個或更多個連續核苷酸雜交(優選地，在高度嚴謹條件下雜交)的核苷酸序列區域。還可通過聚合酶鏈式反應(PCR)，使用基於本文含有的序列信息設計的合成寡核苷酸引物，分離出包含SEQIDNO:1的核苷酸序列的全部20或一部分的核酸分子。可按照標準PCR擴增技術，用cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板，使用合適的寡核苷酸引物，來擴增本發明的核酸。由此擴增的核酸可被克隆進合適的載體，並通過DNA序列分析加以表徵。根據本發明的多核苷酸的片段還可包含不編碼功能多肽的多核苷酸。25此類多核苷酸可作為探針或引物用於PCR反應。不管其編碼功能或非功能多肽，根據本發明的核酸都可用作為雜交探針或聚合酶鏈式反應(PCR)引物。不編碼具有RCS21活性的多肽的本發明核酸分子的用途包括(1)從cDNA文庫(例如來自除G/wco"o^ctero"&似外的其它生物)分離編碼本發明蛋白的基因或其等位變體，以及(2)用於探測特定細胞中所述蛋白的mRNA的表達的Northern印跡分析，或(3)用於增強和/或提高同源RCS21基因在所述其它生物中的功能或活性。基於本文提供的核苷酸序列的探針可用於檢測編碼同樣或同源蛋白5(例如，其它生物中的)的轉錄本或基因組序列。可基於其與本文公開的G.xoy&MRCS21核酸的同源性，使用G.0j9^awDNA或其一部分作為雜交探針，按照標準雜交技術，優選在高度嚴謹雜交條件下，分離出對應於本發明的G.;co;;^wRCS21DNA的天然變體或非G.o矽^似同源體的核酸分子，它們也包括在本發明內。10在優選的實施方式中，探針還包含與其附著的標記基團，例如，標記基團可以是放射性同位素、螢光化合物、酶或酶的輔助因子。例如，可使用基於本文教導的核苷酸序列設計的兩套簡併寡核苷酸引物庫，進行PCR來分離同源基因序列。用於反應的模板可以是通過對從已知能表達或懷疑能表達根據本發明15的多核苷酸的菌株製備的mRNA進行逆轉錄獲得的cDNA。PCR產物可被亞克隆及測序，以確保擴增出的序列代表本文所述的新的核酸序列或其功能等同物的序列。然後可通過多種已知方法，用PCR片段分離全長cDNA克隆。例如，可標記擴增出的片段，用其篩選噬菌體或粘粒cDNA文庫。或者，經20標記的片段可用於篩選基因組文庫。PCR技術還可用於從其它生物分離全長cDNA。例如，可按照標準方案，從合適的細胞或組織來源分離RNA。可在RNA上進行逆轉錄反應，其中使用與擴增片段的5'最末端具有特異性的寡核苷酸引物，以引導第一鏈合成。25然後可使用標準的末端轉移酶反應，對得到的RNA/DNA雜交體"加尾"(例如，用鳥嘌呤)，可用RNaseH消化雜交體，然後可(例如，用poly-C引物)引導第二鏈合成。由此，可容易地分離擴增的片段上遊的cDNA序列。關於有用的克隆策略的綜述，參見，例如上文所述的Sambrooketal.和上文所述的Ausubeletal.。此外，編碼RCS21家族其它成員、具有與根據SEQIDNO:1的核苷酸序列不同的核苷酸序列的核酸也在本發明的範圍內。此外，編碼來自其它物種的RCS21蛋白、具有與SEQIDNO:1示出的核苷酸序列不同的核苷酸序列的核酸也在本發明的範圍內。5本發明還涉及經分離的多核苷酸，其可在嚴謹條件下(優選地，高度嚴謹條件下)與本發明的多核苷酸(例如，SEQIDNO:1所示的多核苷酸)雜交。有利地，此類多核苷酸可從能將給定的碳源直接轉化為維生素C的微生物(特另lj是G/wcowo^;cfero;qyJara，優選地，G/wco"o6acferoxy&raDSM17078)中獲得。10本文中用到的術語"雜交"被用來描述雜交和洗滌，在所述雜交和洗漆條件下，典型地，互相之間同源性為至少約50%、至少約60%、至少約70%、更優選為至少約80%、進一步優選為至少約85%到90%、最優選為至少95%的核苷酸序列保持相互雜交的狀態。在一種實施方式中，本發明的核酸與SEQIDNO:1所示的核酸序列15或其互補序列至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85o/。、90%、91%、92o/q、93。/o、94o/o、95%、96%、97o/0、98o/o、99%同源或更同源。此類嚴謹雜交條件的一個優選的非限制的例子是在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中，大約45。C下雜交，隨後在lxSSC、0.P/oSDS中，50。C下20進行一次或多次洗滌，洗滌優選在55。C下，更優選在60。C下，進一步優選在65。C下進行。高度嚴謹條件包括使用經標記的DNA探針(例如，用地高辛(DIG)標記的DNA探針)在42。C溫育數天(例如2-4天)，接著在2xSSC和0.1%SDS中於室溫下洗一次或多次，以及在65-68°C，於0.5x25SSC和0.1%SDS或0.1xSSC和0.1%SDS中洗一次或多次。特別地，高度嚴謹條件包括，例如，在溶液中，例如含或不含100Mg/ml的鮭魚精DNA的DigEasyHyb溶液(RocheDiagnosticsGmbH)中，或包含50%甲醯胺、5xSSC(150mMNaCl、15mM檸檬酸三鈉)、0.02%十二垸基磺酸鈉、0.1%N-月桂醯肌氨酸和2%封閉試劑(RocheDiagnosticsGmbH)的溶液中，使用地高辛(DIG)標記的DNA探針(例如通過用RocheDiagnosticsGmbH，68298Mannheim，Germany的DIG標記系統來製備的)在42。C溫育2小時至4天，接著在2xSSC和0.1%SDS中，於室溫下，洗兩次膜，每次5至15分鐘，然後在65-68。C，於0.5xSSC和0.1。/qSDS5或0.1xSSC和0.1。/。SDS中洗兩次，每次15-30分鐘。優選地，與本發明的核苷酸序列雜交(優選在高度嚴謹條件下雜交)的本發明的經分離的核酸對應於天然存在的核酸分子。本文中使用的"天然存在的"核酸分子指具有天然存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如，編碼天然蛋白質)。在一種實施方式中，核酸編碼天然的G.10oj9^3^RCS21蛋白。技術人員知道何種條件適合用於嚴謹雜交條件及高度嚴謹雜交條件。本領域中易於獲得關於此類條件的其它指導，例如，在Sambrooketal.，1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.;禾口Ausubeletal.(eds.),1995,CurrentProtocolsinMolecularBiology,15(JohnWiley&Sons,N.Y.)中。當然，僅與poly(A)序列(例如mRNA的3，末端poly(A)區)或僅與T(或U)殘基的互補性延伸區段(stretch)雜交的多核苷酸將不會被包括在用於與本發明核酸的一部分特異性雜交的本發明多核苷酸中，因為此類多核苷酸將與任何含有poly(A)延伸區段的核酸分子或其互補序列(例如，實際上是任何雙鏈的cDNA克隆)雜交。20採用典型手段，可以對從其它生物，例如能將給定碳源直接轉化為維生素C的微生物(特別是其它G/wco"o&"er物種)構建的DNA文庫進行篩選。例如，可以通過Southern和/或Northern印跡分析來X寸G7wc卵o6acfer的菌株進行篩選。在探測到與本發明多核苷酸同源的轉錄本之後，可以利25用本領域技術人員公知的標準技術，由分離自合適菌株的RNA來構建cDNA文庫。或者，可以使用能與本發明多核苷酸雜交的探針來對全基因組DNA文庫進行篩選。可使用標準的分子生物學技術以及本文提供的序列信息，來分離本發明的核酸序列，例如SEQIDNO:1所示的核酸分子或其片段或衍生物。例如，可使用標準雜交和克隆技術(例如，Sambrook，J.，Fritsh,E.F.,和Maniatis,T.MolecularCloning:ALaboratoryManual.2nd,ed"ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989所述)，使用SEQIDNO:1所示的核酸分子的全部或一部分作5為雜交探針，分離根據本發明的核酸分子。此外，可通過標準合成技術(例如，使用自動DNA合成儀)來製備對應於本發明的核苷酸序列的寡核苷酸或可與本發明的核苷酸序列雜交的寡核苷酸。術語"同源性"或"相同性百分比"在本文中可互換使用。就本發明10的目的而言，在此定義為確定兩條胺基酸序列或兩條核酸序列的相同性百分比，本著最優比較的目的(例如，可以在第一條胺基酸序列或核苷酸序列上引入缺口，以與第二條胺基酸序列或核苷酸序列達到最佳的比對)，對序列進行比對。然後對相應胺基酸位置或核苷酸位置上的胺基酸殘基或核苷酸進行比較。如果第一條序列上某位置的胺基酸殘基或核苷酸15與第二條序列上相應位置的相同，那麼這些分子在此位置就是相同的。兩條序列間的相同性百分比是所述序列共有的相同位置的數量的函數(即，%相同性=相同位置的數量/位置(即重疊位置)總數x100)。優選地，這兩條序列長度相同。技術人員會知道有若干電腦程式可被用於確定兩條序列間的同源20性。例如，可以使用數學算法來完成對序列的比對和對兩條序列間相同性百分比的確定。在一種優選的實施方式中，使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法來確定兩條胺基酸序列間的相同性百分比，所述算法已被合併到GCG軟體包(可從http:〃www.accelrvs.com獲得)的GAP程序中，其中使用Blossom62矩陣或PAM250矩陣，缺口權25重為16、14、12、10、8、6或4，長度權重為1、2、3、4、5或6。技術人員會意識到上述的所有不同參數將導致有細微區別的結果，但是使用不同算法時兩條序列的總體％相同性不會有顯著改變。在又一種實施方式中，使用GCG軟體包(可從h加:〃www.accelrvs.com獲得)的GAP程序來確定兩條核苷酸序列間的相同性百分比，其中使用NWSgapdna.CMP矩陣，缺口權重為40、50、60、70或80,長度權重為1、2、3、4、5或6。在另一種實施方式中，使用E.Meyers禾PW.Miller(CABIOS,4:11-17(1989))的算法來確定兩條胺基酸序列或核苷酸序列的相同性百分比，所述算法己被合併到ALIGN程序5(2.0版)(可從http:〃vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi獲得)中，其中使用PAM120權重殘基表，缺口長度懲罰(penalty)為12，缺口懲罰為4。本發明的核酸和蛋白質序列可以進一步地被用作"査詢序列"來進行針對公眾資料庫的搜索，例如，去鑑定相關序列或家族中其它成員。可以10使用Altschul,etal.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的BLASTN和BLASTX程序(2.0版)來進行此類搜索。可以用BLASTN程序，以分數=100，字長(wordlength)=12來進行BLAST核苷酸搜索，以獲得與本發明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用BLASTX程序，以分數=50，字長=3來進行BLAST蛋白質搜索，以獲得與本發明的蛋白質分子同源的胺基酸15序列。本著比較的目的，為獲得有缺口的比對，可以利用Altschuletal.,(1997)NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402中描述的GappedBLAST。當利用BLAST禾QGappedBLAST程序時，可以使用各個程序(例如BLASTX禾口BLASTN)的預設參數。見http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov。在另一種優選的實施方式中，本發明的經分離的核酸分子包含是本發20明的核苷酸序列(例如，SEQIDNO:1所示的序列)的互補序列的核酸分子。與本文公幵的核苷酸序列互補的核酸分子是這樣的序列其與SEQIDNO:1所示的核苷酸序列足夠互補，從而其可與所述核苷酸序列雜交，由此形成穩定的雙鏈體(duplex)。在另一種優選的實施方式中，SEQIDNO:1所示的本發明的核酸或25其互補序列含有至少一處突變，所述突變導致基因產物具有經修飾的功能/活性。所述至少一處突變可通過本文所述的方法引入。在一個方面，所述至少一處突變導致產生這樣的RCS21蛋白其功能和/或活性較之野生型副本而言有所增強或提高。用於引入此類突變的方法是本領域公知的。本文中使用的術語——活性的"增加"包括增加生產生物中一種或多種多肽的活性，所述多肽是本文所述的相應的多核苷酸編碼的。本領域中可獲得用於增加給定蛋白(在本文的情況下是RCS21蛋白)活性的多種方法。通常，可增加蛋白質的比活性或者可以增加蛋白質的拷貝數。術語增加活性或者等同物表達還包括下述情形其中，RCS21蛋白活性被引5入以前不含該活性的細胞，這例如通過將編碼RCS21的基因引入以前不含該基因等同物的細胞或以前不能表達相應蛋白的活性形式的細胞來實現。為協助這種增加，對應於本文所述多核苷酸的基因的拷貝數可被增力口。或者，可使用強啟動子來指導多核苷酸的表達。在另一種實施方式10中，基因的啟動子、調控區域和/或核糖體結合位點可被改變，以增加表達。還可以通過增加信使RNA的相對半壽期來增強或強加表達。在另一種實施方式中，還可以通過在多肽胺基酸序列中利用能增加活性的一處或多處突變來增加多肽自身的活性。例如，改變多肽與其相應底物的親和性可導致活性提高。類似地，可增加肽的相對半壽期。在基因表達增強或者15比活性增加的情況下，可通過改變細胞培養基的組成和/或用於培養的方法來達成這種提高。本文中使用的"增強的表達"或"提高的活性"表示較之野生型蛋白、多核苷酸、基因、或多核苷酸或多肽被增強和/或提高之前存在的蛋白的活性和/或濃度而言，至少5%、10%、25%、50%、75%、100%、200%或者甚至超過500%的增加。還可通過將蛋白與其活性的特異20性或一般性增強劑相接觸來增加RCS21蛋白的活性。本發明的另一方面涉及載體，所述載體含有編碼本發明蛋白質的核酸或其功能等同物或一部分。在本文中使用的術語"載體"指能運送連接到其上的另一個核酸分子的核酸分子。一種載體類型是"質粒"，"質粒"指環狀的雙鏈DNA環，另外的DNA片斷可以連接到所述的環上。另一種25載體的類型是病毒載體，其中，另外的DNA片斷可以連接到病毒基因組中。某些載體能在其被引入的宿主細胞中進行自主複製(例如，具有細菌的複製起點的細菌載體)。其它載體在被引入宿主細胞之後就被整合進宿主細胞的基因組中，因此它們與宿主基因組一同複製。此外，某些載體能指導可操作地連接到其上的基因的表達。此類載體在本文中被稱為"表達載體"。一般而言，在重組DNA技術中用到的表達載體通常是質粒的形式。在本文中術語"質粒"和"載體"可以互換使用，因為質粒是最常用到的載體形式。然而，本發明也將包括其它形式的表達載體，例如病毒載體(例如，複製缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒和腺伴5隨病毒)，它們能提供等同的功能。本發明的重組表達載體包含本發明的核酸，所述核酸存在的形式適合於該核酸在宿主細胞中的表達，這意味著該重組表達載體包括一段或多段調控序列，所述調控序列是基於將用於表達的宿主細胞來選擇的，其被可操作地連接到將要表達的核酸序列上。在重組表達載體中，"可操作地連10接"被用來表示人們感興趣的核苷酸序列被連接到調控序列上，所述的連接以允許該核苷酸序列表達(例如，在體外轉錄/翻譯系統中表達，或者當載體被引入宿主細胞中時，在該宿主細胞中的表達)的方式進行。術語"調控序列"將包括啟動子、增強子和其它表達控制元件(例如，弱化子)。例如，在Goeddel;GeneExpressionTechnology:Methodsin15Enzymology185，AcademicPress,SanDiego,CA(1990)中對此類調控序列進行了描述。調控序列包括在很多種宿主細胞中指導核苷酸序列的組成型或誘導型表達的調控序列，也包括僅在某些宿主細胞中指導核苷酸序列表達的調控序列(例如，組織特異性調控序列)。本領域的技術人員將意識至U，對表達載體的設計可能取決於以下因素例如對將被轉化的宿主細20胞的選擇，期望獲得的蛋白質的表達水平等。本發明的表達載體可以被引入宿主細胞，由此生產本文所述的核酸編碼的蛋白質或肽，其包括但不限於本文所述的核酸編碼的突變體蛋白、其片段、其變體或功能等同物以及融合蛋白，例如，RCS21蛋白、RCS21蛋白的突變體形式、融合蛋白等。25為了在合適的微生物中表達RCS21蛋白，可對本發明的重組表達載體加以設計。例如，根據本發明的蛋白可在細菌細胞中表達，例如，在屬於G7wcowo6acter、G7wcowaceto6a"er或JcetoZacter屬的菌株中表達。在本發明中有用的表達載體包括源自染色體、游離體和病毒的載體，例如源自細菌質粒、噬菌體的載體和源自上述物質的組合的載體，例如源自質粒和噬菌體遺傳元件的載體，例如粘粒和噬菌粒(phagemid)。DNA插入應當被可操作地連接到合適的啟動子上，啟動子可以是組成型啟動子或可誘導的啟動子。技術人員知道如何選擇合適的啟動子。表達構建體可以含有用於轉錄起始、終止的位點，還可在轉錄區域含有核糖體5結合位點，以用於翻譯。由構建體表達的成熟轉錄本的編碼部分可優選包括處於起點的起始密碼子，以及恰當地定位於待翻譯的多肽末尾的終止密碼子。可通過傳統的轉化或轉染技術將載體DNA引入合適的宿主細胞。本文中使用的術語"轉化"、"轉橋聯(transconjugation)"和"轉染"意10指本領域內已知的、用於將外源核酸(例如DNA)引入到宿主細胞中的多種技術，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉澱、DEAE-葡聚糖介導的轉染、轉導、感染、脂質轉染、陽離子脂介導的轉染或電穿孔。用於對宿主細胞進行轉化和轉染的合適方法可在Sambrook,etal.(上文所述的)，Davisetal.，BasicMethodsinMolecularBiology(1986)及其它實驗手冊中找到。15為對已將外源DNA整合進它們基因組的細胞進行鑑定和選擇，通常，將編碼選擇標記(例如，對抗生素的抗性)的基因與感興趣的基因一起引入宿主細胞。優選的選擇標記包括賦予對藥物(例如卡納黴素、四環素、氨苄青黴素和鏈黴素)抗性的那些。編碼選擇標記的核酸優選在與編碼根據本發明的蛋白的載體相同的載體上引入宿主細胞，或者其可在單獨20的載體上引入，該載體例如是自殺性載體，其不能在宿主細胞中複製。可通過藥物選擇鑑定出經過引入的核酸穩定轉染的細胞(例如，已合併有選擇標記基因的細胞將存活，而其它細胞會死亡)。本發明還提供了經分離的多肽，其具有SEQIDNO:2所示的胺基酸序列或可通過在合適的宿主中表達本發明的多核苷酸(例如，SEQID25NO:l所示的多核苷酸序列)獲得的胺基酸序列。根據本發明的多肽可僅含對SEQIDNO:2所示的胺基酸序列中一個或多個胺基酸的保守取代，或對非關鍵胺基酸的取代、插入或缺失。因此，非關鍵胺基酸是SEQIDNO:2所示的胺基酸序列中可被改變、且不會對生物功能造成實質性影響的殘基。例如，在本發明的蛋白質之間保守的胺基酸殘基被預計為對改變特別不敏感。此外，在根據本發明的蛋白質和其它RCS21蛋白之間保守的胺基酸也對改變不太敏感。術語"保守取代"用於表示下述取代，其中，胺基酸殘基被具有相似側鏈的胺基酸殘基所取代。這些家族是本領域已知的，其包括具有鹼性側5鏈(例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸)、酸性側鏈(例如，天冬氨酸和穀氨酸)、不帶電荷的極性側鏈(例如，甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、帶beta支鏈側鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側鏈(例10如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的胺基酸。如上所述，本發明的多核苷酸可用於對合適的宿主細胞進行遺傳工程改造，使其在發酵中更好且更有效，例如，在對維生素C的直接發酵工藝中更好且更有效。根據本發明，提供了經遺傳工程改造/重組產生的宿主細胞(也被稱為15重組細胞或經轉化細胞)，其攜帶有此類經修飾的多核苷酸，其中，相連的蛋白的功能較之野生型細胞而言被顯著修飾，使得對一種或多種發酵產物(例如維生素C)的生產的產率、產量和/或效率被提高。宿主細胞可選自能從給定的碳源直接生產一種或多種發酵產物(例如維生素C)的微生物，特別是G7w園oteterojcW而，優選±也，G.oxj;fi顯DSM17078。20"經轉化細胞"或"重組細胞"是己通過重組DNA技術向其(或其祖先細胞)中引入了根據本發明的核酸的細胞，或者是其中RCS21蛋白的活性已被增加和/或增強的細胞。合適的宿主細胞包括能生產給定發酵產物(例如，能將給定碳源直接轉化為維生素C)的微生物的細胞。特別地，其包括來自i^eWomowos、P朋toea、Esc/e"'C、Co，e^acfen'ww、25《"ogw/om'dgem'wm屬的菌株，以及乙酸細菌，例如G/wcowo6acter、Jceto6acter或G7wcowacetoZacte廠，優選地，JcetoZacters/,、Jceto6ac妙^//a"g^CMS、G7wco"oZGCtero;qyc/a肌更優選地，G.oxjy^"s，最優選地，G.，d薩DSM17078。還可通過修飾RCS21基因獲得提高的基因表達，例如，通過將一處或多處突變引入RCS21基因來實現，其中，所述突變導致較之野生型蛋白而言功能顯著提高的RCS21蛋白。因此，在另一種實施方式中，從SEQIDNO:l所示的多核苷酸或其5等同物獲得攜帶至少一處突變的多核苷酸。本文中使用的突變可以是導致功能更強或更穩定的多肽(例如，功能更強或更穩定的RCS21基因產物)的任何突變。這可包括，例如，在微生物基因組中的下述改變其提高了RCS21的合成，或者導致RCS21蛋白以改變的胺基酸序列表達，該改變使得該蛋白的功能較之具有未被改變10的胺基酸序列的野生型副本而言被提高和/或增強。提高可在轉錄水平、翻譯水平或翻譯後水平上發生。微生物基因組中的改變可例如通過單交叉重組或多交叉重組用含有改變的DNA序列替換野生型DNA序列來進行。為了能方便地選擇出基因組被改變的微生物轉化子，該改變可以例如是編碼抗生素抗性基因的DNA15序列，或者編碼補足微生物可能的營養缺陷型的基因的DNA序列。突變可包括但不限於缺失-插入突變。還可通過下述方法獲得微生物基因組中導致功能更強的多肽的改變使用例如化學誘變劑、輻射或轉座子對微生物基因組進行隨機誘變，以及選擇或篩選出是一種或多種發酵產物的更好的或更有效的生產菌株的突變20體。用於篩選和選擇的標準方法是技術人員已知的。在一種特定實施方式中，人們需要敲除或遏制本發明RCS21基因的阻遏子，即，其中，當引入合適的宿主細胞時，其阻遏子基因的表達被人工遏制，以提高對發酵產物生產的產率、生產能力和/或效率。用於提供敲除的方法以及提供攜帶此類被遏制基因的微生物的方法是本領域公知的。25可通過缺失掉阻遏子基因或其調控區域的至少一部分，來誘導對阻遏子基因的遏制。本文中使用的"對基因表達的遏制"包括完全和部分遏制，以及在特定條件下的遏制，還包括對兩個等位基因中任何一個的表達的遏制。用於RCS21蛋白的上述誘變策略可導致想要的化合物(特別是維生素C)的產率增加。這些策略的列出並不意味著限制；對這些誘變策略的變化對於本領域普通技術人員來說將是顯而易見的。可通過這些機制，用本發明的核酸和蛋白質分子產生出微生物，例如表達經突變RCS21核酸和蛋白分子的G/wcoMokzc^o矽Am或細菌的相關菌株，使得對想要的化5合物(例如維生素C)的生產的產率、生產能力和/或產量被提高。在關於使用微生物進行上述工藝的一個方面，本發明的工藝導致維生素C的產率通常為至少約高於5.7g/1，例如，10g/1、20g/1、50g/1、100g/1、200g/1、300g/1、400g/1或者超過600g/1。在一種實施方式中，通過本發明的工藝生產的維生素C的產率在大約高於5.7g/l至大約600g/1的範10圍內。維生素C的產率指直接來自生產容器的收穫流(即包含維生素C的不含細胞上清液)中維生素C的濃度。在本發明的一個方面，提供了能從合適的碳源(例如D-山梨糖醇和/或L-山梨糖)直接生產維生素C的微生物(特別是G/wco朋^cter、G/wco加ce/o&c/er和jceto^c^r屬的)。當例如以靜止細胞方法在20小15時的溫育期之後測量時，發現這些生物能以分別高至280mg/l和670mg/1的水平從D-山梨糖醇或L-山梨糖直接生產維生素C。在本發明的另一個方面，提供了下述微生物，當從D-山梨糖醇起始時，其能以300mg/l或更多的量直接生產維生素C，或者當從L-山梨糖起始時，其能以800mg/l或更多的量直接生產維生素C，所述的量是例如以靜止細胞方法在20小時的20溫育期之後測量的。這可以通過增加RCS多肽(優選地，RCS21多肽)的活性來獲得。從D-山梨糖醇產生的維生素C的產率甚至可以高達400、600、1000mg/1，或者甚至超過1.5、2、4、10、20、50g/1。從L-山梨糖產生的維生素C的產率甚至可以高達1000mg/1，或者甚至超過1.5、2、4、10、20、50g/1。優選地，維生素C的這些量可以是例如以靜止細胞方25法在20小時的溫育期之後測量獲得的。本文中使用的以"靜止細胞方法"進行的測量包括(i)通過本領域技術人員公知的任何方法培養細胞，(ii)從生長培養基收穫細胞，以及(iii)在含有將被轉化為想要的產物(例如維生素C)的培養基中，於其中細胞不再生長的條件下，溫育收穫的細胞(即，在該所謂的轉化步驟期間，生物質沒有量上的增加)。攜帶有例如經修飾的RCS21基因並且能以顯著更高的產率、生產能力和/或效率生產發酵產物的重組微生物可在上文所述的需氧條件下被培養於補充有合適營養物的水性培養基中。5本文所述的核酸分子、多肽、載體、引物和重組微生物可用於下述方法中的一種或多種鑑定G/WC0"0/^"WOXJ^WS以及相關的生物；繪製與G/wco"o6flrfwox;;^氾相關的生物的基因組圖譜；對感興趣的G/wCO"C^flCterOX^to^序列進行鑑定和定位；進化研究；測定功能所需的RCS21蛋白區域；調節RCS21蛋白活性或功能；調節RCS途徑的活性；10以及調節對想要的化合物(例如，維生素c)的細胞內生產。本發明提供了篩選能調節RCS21蛋白活性的分子的方法，這種調節或者通過與蛋白本身或底物或RCS21蛋白的結合伴侶的相互作用或者通過調節本發明的RCS21核酸分子的轉錄或翻譯來實現。在此類方法中，將表達一種或多種本發明的RCS21蛋白的微生物與一種或多種測試化合15物接觸，並評估每種測試化合物對於RCS21蛋白表達水平或活性的影響。可通過技術人員公知的方法來測定RCS蛋白的生物活性、酶活性或其它活性，所述方法例如在存在輔酶Q2(CoQ2)——一種人工電子受體的情況下，溫育含有RCS蛋白的無細胞提取物或膜級分(membrane20fraction)，以及通過例如Clark型氧電極(RankBrothers,Cambridge,UnitedKingdom)等方來測量氧的消耗。因此，例如，可以在下述試驗中測量泛醌氧化酶bd(—種氰化物抗性末端氧化酶)的活性，該試驗中，在存在50mM磷酸鹽緩衝液(pH6.5)、0.02%去垢劑Tween20以及100//M氰化物(以使其它氰化物敏感性氧化酶失活)時，溫育含有該酶的無細胞25提取物或膜級分。然後可通過加入30mM被還原的人工電子受體一一CoQhd來來起始酶反應，接著測量275nm處吸光度的增加。可在Clark型電極協助下測量耗氧速率，其與膜級分或無細胞提取物中存在的泛醌氧化酶bd活性直接成正比。從上述描述中可顯而易見根據本發明的方法的發酵產物可不僅限於維生素C。本文中使用的"想要的化合物"或"發酵產物"可以是G/wco"okzcterox;^a^的任何天然產物，其包括生物合成途徑的終產物和中間產物，例如，L-山梨糖、L-山梨糖酮、D-葡萄糖酸鹽/酯、2-酮基-D-葡萄糖酸鹽/酯、5-酮基-D-葡萄糖酸鹽/酯、2，5-二酮基-葡萄糖酸鹽/酯和2-5酮基-L-古洛糖酸鹽/酯(2-KGA)，特別是對維生素C的生物合成生產。因此，本發明涉及本文所述的多核苷酸、多肽、載體、引物和重組微生物在生產維生素C(即將碳源直接轉化為維生素C)中的用途。在一種優選的實施方式中，本文所述的經修飾的多核苷酸、多肽、載體和重組微生物用於提高對維生素C生產的產率、生產能力和/或效率。10術語"產量"或"生產能力"是本領域已知的，其包括給定的時間和給定的發酵體積中形成的發酵產物(例如維生素C)的濃度(例如，每升每小時的kg產物)。術語"生產效率"包括獲得的特定水平的生產所需要的時間(例如，細胞達到發酵產物的特定速率輸出所需時間有多長)。術語"產率"是本領域已知的，其包括碳源向產物(例如，維生素15C)轉化的效率。這通常寫作，例如，kg產物/kg碳源。"增加"化合物的"產率和/或產量和/或生產能力"表示，給定的時間中給定量的培養物中回收的該化合物分子或回收的該化合物有用分子的量增加。術語"生物合成"或"生物合成途徑"是本領域已知的，其包括通過細胞，以可能是多步驟且被高度調控的過程，從中間產物化合物對化合物(優選地，有機20化合物)的合成。措辭"代謝"是本領域已知的，其包括對生物中發生的生化反應的總稱。然後，特定化合物的代謝(例如，胺基酸(例如甘氨酸)的代謝)包含細胞中與該化合物相關的總的生物合成、修飾和降解途徑。措辭"轉運"或"運入"是本領域已知的，其包括一種或多種分子在協助下移動經過該分子本來不能經過或不能高效經過的細胞膜。25本文中使用的維生素C可以是水溶液中發現的L-抗壞血酸的任何化學形式，例如未離解的、以其游離酸形式存在的或離解為陰離子的。L-抗壞血酸的溶解的鹽形式的特徵為在通常發現於發酵上清液中的任何種類的陽離子(例如，鉀、鈉、銨或鈣)存在時的陰離子。還包括在內的可以有L-抗壞血酸的游離酸形式的經過分離的晶體。另一方面，用其相應的鹽的名稱來命名L-抗壞血酸的鹽形式的經過分離的晶體，即抗壞血酸鈉、抗壞血酸鉀、抗壞血酸韓等。在一種優選的實施方式中，本發明涉及生產維生素C的方法，其中，將根據本發明的核苷酸或上文所述的經修飾多核苷酸序列引入合適的微生5物，在允許以高生產能力、產率和/或效率生產維生素C的條件下培養重組微生物，從培養基中分離產生的發酵產物，以及可選地，進一步純化。將通過下述實施例進一步闡述本發明，所述實施例不應被理解為起限制作用。本文提到的所有參考文獻、專利申請、專利和公開的專利申請的內容都通過引用併入本文。10實施例實施例1製備染色體DNA以及通過PCR擴增DNA片段在由25g/1甘露糖醇、5g/1酵母提取物(Difco)和3g/1細菌蛋白腖(Difco)構成的液體甘露糖醇培養基(MB)中，於30°C對15G/wco"o^c&ro"ctowDSM17078的細胞進行一天的培養，通過Sambrooketal(1989)"MolecularCloning:ALaboratoryManual/SecondEdition",ColdSpringHarborLaboratoryPress所述的方法，從培養的細胞製備G/wcowoZ^"er0j9;cfa似DSM17078的染色體DNA。使用按照上文所述製備的染色體DNA以及一組引物——Pf(SEQID20NO:3)禾QPr(SEQIDNO:4)，通過PCR來製備DNA片段。按照廠商說明書，用ExpandHighFidelityPCR試劑盒(RocheDiagnostics)禾口10ng染色體DNA以10Ad的總體積來進行反應，獲得了含有RCS21DNA序歹U(SEQIDNO:1)的PCR產物。從反應體系中回收PCR產物，並驗證了其正確序列。25實施例2在G.oxv&氾DSM17078中過量表達RCS21基因為對RCS21基因的表達進行上調，可以使用採用整合型構建體的過量表達系統。本文中，RCS21基因被融合到強組成型啟動子上，然後將構建體引入G.ax^/fl"sDSM17078。可以通過本領域技術人員已知的標準方法來測定RCS21基因的過量表達，所述方法例如使用Northern印跡雜交、RT-PCR或其它技術進行轉錄分析，使用Western印跡雜交、二維凝膠電泳來進行蛋白質表達測定，使用特異性酶試驗或者通過直接測量產物形成或底物轉化來進行酶活性測5定。啟動子可以是在G/wcow^flcba^fo;w中展示出強組成型活性的任何啟動子，例如，來自^foc/zen'c/^co/z'的^/B啟動子、來自G/wcwzoZ^cteraxjY/tms的^/B啟動子、來自G/wcowo6a"eroxj^ms的t/"a^啟動子、或者來白G7wcowo6"c/e廠ox;^/ais1的仍必啟動子。10為過量表達RCS21基因，可用強組成型的經修飾Psndh啟動子(SEQIDNO:5)替換RCS21的基因。為達到此目的，通過長側翼同源性(LFH)-PCR來構建由RCS21基因的500bp的上遊區域、卡納黴素抗性盒、與經修飾的核糖體結合位點融合的P犯dh啟動子以及RCS21基因的最開始500bp構成的DNA片段。為構建該DNA片段，首先使用GC-rich的15PCR試劑盒(RocheMolecularBiochemicals)通過PCR擴增出各個單獨的部分。使用引物對RCS21US+1(SEQIDNO:6)和KmRCS21US-1(SEQIDNO:7)(在5'末端含有互補性的卡納黴素抗性盒重疊序列)，擴增出RCS21DNA上遊區域。使用引物對KmPsndh+l(SEQIDNO:8)(在5'末端含有互補性的卡納黴素抗性盒重疊序列)和RCS2021Psndh-l(SEQIDNO:9)(在5'末端含有互補性的RCS21DNA重疊序列)，擴增出Psndh啟動子片段。使用引物對PsndhRCS21+1(SEQIDNO:10)(在5'末端含有互補性的Psndh啟動子重疊序列)和RCS21-1(SEQIDNO:11)，擴增出RCS21基因的最開始500個bp。在這些情況下，都用G/wco"o6ac&roxj^a似DSM17078基因組DNA作為模板。使25用質粒pUC4K(AmershamBioscience,accessionNo.X06404)作為模板，用引物對Km+l(SEQIDNO:12)和Km-1(SEQIDNO:13)，擴增出卡納黴素抗性盒。PCR條件由35個循環的94。C變性30秒、50°C退火30秒和72。C延伸1分鐘組成。對各條PCR片段進行凝膠純化、混合，用引物對RCS21US+1/RCS21-1再次擴增，擴增出全長產物，由此將Psn他啟動子插入到RCS21基因的上遊。用於第二輪反應的PCR反應條件是這樣的94°C2分鐘，然後10個循環的[94。C30秒，63°C30秒，68°C6分鐘]，接著是20個循環的[94。C30秒，63。C30秒，68。C6分鐘以及每個循環額外的20秒]以及在68。C最後延伸1Q分鐘。5將PCR產物直接轉化進感受態G.ox;^awDSM17078細胞，在含有終濃度為50/zgm1—1的卡納黴素的甘露糖醇培養基型瓊脂培養基上對轉化子加以選擇。觀察到若干個可能的轉化子，在使用引物對RCS21US+1/RCS21-1通過PCR對其中一些進行分析，以驗證DNA序列已通過雙交叉插入基因組。顯示出正確PCR產物大小的菌株的PCR產物被用10於測序。具有正確序列的菌株被命名為G.oxjt/awDSM17078-RCS21upl以及G.ox;^/a朋DSM17078-RCS21up2。實施例3使用靜止細胞從D-甘露糖醇生產維生素C在含有70g/1D-山梨糖醇、0.5g/1甘油、7.5g/1酵母提取物15(Difco)、2.5g/1MgS047H20、10g/L的CaC03禾卩18g/1瓊脂(Difco)的No.3BD瓊脂培養基上，於27。C對(.ox_yAzraDSM17078、G.oxy^/wDSM17078-RCS21upl以及G.ox;^a"sDSM17078-RCS21up2的細胞進行3天的培養。從瓊脂平板上刮下細胞，將其懸浮於蒸餾水中，用於在30°C，22020rpm振蕩下進行的靜止細胞反應。用處於反應混合物(還含有0.3%NaCl和1%CaC03)中的2%D-山梨糖醇來進行一系列反應(0.5ml反應混合物，處於5ml反應試管中)，用終濃度為OD6(K)=10的細胞進行溫育。20小時的溫育後，用具有與Aminex-HPX-78H(300x7.8mm)柱(Biorad，Rei腦h,Switzerland)相連的LiChrospher-100-RP18(125x4.6mm)柱25(Merck,Darmstadt,Germany)的Agilent1100HPLC系統(AgilentTechnologies,Wilmington,USA)，通過高效液相色譜(HPLC)來對反應混合物樣品進行分析。移動相為0.004M硫酸，流速為0.6ml/分鐘。用UV探測器(波長254nm)組合折射係數探測器，記錄下兩個信號。此夕卜，用具有UV探測的氨基柱(YMC-PackPolyamine-II，YMC，Inc.,Kyoto，Japan)在254nm處來進行對L-抗壞血酸的鑑定。移動相為50mMNH4H2P04和乙腈(40:60)。用AgilentSeries1100HPLC-質譜(MS)系統來鑑定L-抗壞血酸。用電噴霧界面在正離子模式下來操作MS。用LUNA0C8(2)柱(100x4.65mm)(Phenomenex,Torrance,USA)來進行分離。移動相為0.1%蟻酸和甲醇(96:4)的混合物。L-抗壞血酸以3.1分鐘的駐留時間被洗脫出來。通過駐留時間和該化合物的分子量來確認L-抗壞血酸的身份。用G.ojcWaraDSM17078-RCS21upl和G.ox;^/a/wDSM17078-RCS21up2的細胞溫育的反應混合物的上清液含有的維生素C比用G.oxj;^z^10DSM17078細胞溫育的反應混合物的上清液要多至少20%。實施例4RCS21基因和等同物在其它生物中的存在可通過簡單的DNA雜交實驗來測定其它生物(而非本文前面公開的那些，例如表l中提到的生物)中SEQIDNO:l和/或等同物的存在。15在含有5g/1細菌蛋白腖(Difco)、5g/1酵母提取物(Difco)、5g/1葡萄糖、5g/1甘露糖醇、1g/1MgS04'7H20、5ml/1乙醇和15g/1瓊脂的No.350培養基上，於27°C，對菌株Jc"okzcteraceriswfc/.x_y/z>zwmIFO13693和IFO13773進行3天的培養。在含有25g/l甘露糖醇、5g/l酵母提取物(Difco)、3g/1細菌蛋白腖(Difco)禾卩18g/1瓊脂(Difco)的甘露20糖醇培養基(MB)型瓊脂培養基上，於27°C，對所有其它G/wco朋ceto6a"w菌株和所有C/wco"o6acter菌株進行3天的培養。在LuriaBroth瓊脂培養基上培養W/ZK-12。在廠商推薦的培養基上或者按照本領域已知的方法培養其它菌株。按照例如Sambrooketal,1989,"MolecularCloning:ALaboratoryManual/SecondEdition",ColdSpring25HarborLaboratoryPress所述，從合適的生物(例如表1提到的)提取基因組DNA。用限制性酶(例如五wRI或消化基因組DNA製備物，通過瓊脂糖凝膠電泳(1%瓊脂糖)分離出1Atg的DNA片段。用0.25NHC1對凝膠進行15分鐘的處理，接著再用0.5NNaOH處理30分鐘，然後按照廠商說明書，用VacuumBlotterModel785(BIO-RADLaboratoriesAG,Switzerland)將凝膠印到硝酸纖維素或尼龍膜上。然後用得到的印跡與含有探針(例如具有SEQIDNO:1序列的DNA片段，或含有SEQIDNO:1序列的部分或全部的DNA片段)的溶液接觸或雜交，以從測試生5物中探測陽性DNA片段。可按照實施例1，用PCR-DIG標記試劑盒(RocheDiagnostics)和引物組SEQIDNO:3和SEQIDNO:4來製備DIG標記的探針，例如SEQIDNO:1。此印跡雜交結果示於表1中。雜交可在嚴謹條件或高度嚴謹條件下進行。此類條件的一個優選的非限制性的例子是在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中，大約45。C下雜交，隨10後在1xSSC、0.1%SDS中，50°C下進行一次或多次洗滌，洗滌優選在55。C下，更優選在60。C下，進一步優選在65。C下進行。高度嚴謹條件包括，例如，在溶液中，例如在含或不含100^g/rnl的鮭魚精DNA的DigEasyHyb溶液(RocheDiagnosticsGmbH)的溶液中，或包含50%甲醯胺、5xSSC(150mMNaCl、15mM檸檬酸三鈉)、0.02%十二烷基磺酸l5鈉、0.1%N-月桂醯肌氨酸和2%封閉試劑(RocheDiagnosticsGmbH)的溶液中，於42。C溫育2小時至4天，接著在2xSSC和0.1。/。SDS中，於室溫下，洗兩次膜，每次5至15分鐘，然後在65-68。C，於0.5xSSC和0.1。/。SDS或0.1xSSC和0.1。/。SDS中洗兩次，每次15-30分鐘。為檢測出與探針DNA具有較低相同性的DNA片段，最後的洗滌步驟可在較低溫度20(例如50-65。C)進行較短的洗滌時間(例如1-15分鐘)。可通過本領域公知的PCR方法，對表1所示各生物中陽性信號對應的基因加以克隆，這使用此生物的基因組DNA與合適的引物組(例如，SEQIDNO:3和SEQIDNO:4)在實施例1所述條件下進行，或者按照這樣進行每個反應使用5至100ng基因組DNA(總體積50。可用25ExpandHighFidelityPCR系統(RocheDiagnostics)，採用下述反應條件94°C2分鐘；30個循環的(i)94°C15秒的變性步驟，(ii)60°C30秒的退火步驟，(iii)72°C0.5至5分鐘(取決於目標DNA長度，1分鐘/1kb)的合成步驟；72°C延伸7分鐘。或者，可以用簡併引物來進行PCR，對簡併引物的設計可基於SEQIDNO:2或基於作為共有序列的胺基酸序列(通過對由序列搜索程序(例如BLASTP，或當核苷酸序列被用作"查詢序列"時，BLASTX)獲得的若干胺基酸序列進行比對選出的)，以找到與SEQIDNO:2的蛋白相似的蛋白。對使用簡併引物進行的PCR而言，第二個退火步驟的溫度(見上文)可被降低至55°C，或者5甚至50-45。C。此實驗的結果如表l所示。通過瓊脂糖凝膠電泳來分離PCR反應的樣品，在用例如溴化乙啶染色後，用透照器(transilluminator)來觀察條帶，從凝膠對條帶進行分離，驗證正確的序列。上文提到的共有序列可以是屬於若干蛋白質結構域/家族資料庫的某些10類的胺基酸序列，所述資料庫例如PROSITE(蛋白質家族和結構域的資料庫)、COGs(直向同源體組的簇)、CDD(保守結構域資料庫)、pfam(多重序列比對和隱Markov模型的大集合，覆蓋很多常見的蛋白質結構域和家族)。一旦可從含有此類資料庫的結構域或家族的蛋白中選出與本發明的蛋白具有相同/相近功能的某些蛋白，即可使用蛋白序列或其核苷酸15序列(當可從公眾資料庫獲得時)通過PCR來擴增編碼該蛋白的對應DNA。下述生物還可提供可用作為本發明的備選基因的基因JTa涵o/wowoscflmpastn、/v.caw/estnSATCC33913、Xa涵omowa5o"yzaeKACC10331、^gro^actehwmfwmey^c/e/wC58、_S-a<i}T/n'zoh.wm聲/om'cw附USDA110或S/woM/zo6z'讓,/z7o&1021。20實施例5來自其它生物的RCS21基因和等同物的過量表達，用於生產維生素C為在合適的微生物(能從給定碳源直接生產維生素C)中提高維生素C的生產，可在實施例2的過量表達系統中使用RCS21基因和等同物25(例如，實施例4中獲得的PCR產物，其在本文中被稱為基因X)，或者可將上述RCS21基因和等同物克隆進pCR2.1-TOPO(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA)，並用於轉化E.co/z'TG1，以獲得攜帶pCR2.1-TOPO-基因X的Apr轉化子，即攜帶有實施例4中獲得的PCR產物的Apr轉化子。用引物組--PfNdeI[SEQIDNO:3，但在5，末端具有CCCAT]禾口PrHindIII[SEQIDNO:4，但在5'末端具有CCAAGCTT]通過PCR來擴增該插入物。用和消化得到的PCR產物，將片段與用lol和A^/el消化過的PcrtE-SD(Shine-Dalgarno)片段(WO02/099095)—起插入進pVK100(ATCC37156)的oI和位點之間。用連接產物轉5化Eco/z'TG1，以獲得攜帶有質粒pVK-PcrtE-SD-基因X的1^轉化子，然後再通過電穿孔用其轉化合適的宿主(例如G.ox^fe^DSM17078)，獲得，例如，oxWaMDSM17078/pVK-PcrtE-SD-基因X。按照實施例3，使用重組細胞(例如G.ox;;^^菌株DSM17078的重組細胞)和對應的野生型菌株進行對維生素C的生產。10在用1%L-山梨糖酮作為底物的靜止細胞反應中，重組細胞生產的維生素c可比野生型菌株多至少2oy。。表l:其它生物中RCS21基因的等同物tableseeoriginaldocumentpage44tableseeoriginaldocumentpage45---信號1:在使用不同菌株的基因組DNA，用SEQIDNO:1作為經標記探針進行的印跡雜交試驗上對DNA的探測。信號2:使用引物對SEQIDNO:3和SEQIDNO:4在PCR反應中對不同菌株DNA的探測。信號3:使用簡併引物進行的PCR反應中對不同菌株DNA的探測。更多解釋5參見文本。權利要求1.選自下述組的多核苷酸或此類多核苷酸的互補鏈，所述組由(a)編碼包含根據SEQIDNO2的胺基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)包含根據SEQIDNO1的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用來自微生物的基因組DNA作為模板，並使用根據SEQIDNO3和SEQIDNO4的引物組，通過例如聚合酶鏈式反應的核酸擴增獲得；(d)多核苷酸，其包含編碼被(a)至(c)中任一項的多核苷酸編碼的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一個或多個胺基酸殘基較之所述多肽被保守取代，並且，所述片段或衍生物具有PQQ生物合成蛋白的活性；(e)編碼PQQ生物合成蛋白的多核苷酸，其互補鏈能在嚴謹條件下與(a)至(d)中任一項所定義的多核苷酸互補；以及(f)編碼PQQ生物合成蛋白的多核苷酸，其與(a)至(d)中任一項所定義的多核苷酸至少70％相同，例如85％、90％或95％相同；構成。2.含有權利要求1所述的多核苷酸的載體。3.如權利要求2所述的載體，其中，所述多核苷酸與允許在原核生物20宿主細胞或真核生物宿主細胞中表達的表達控制序列可操作地相連。4.用權利要求1所述的多核苷酸或用權利要求2或3所述的載體遺傳工程改造過的微生物。5.如權利要求4所述的微生物，其能以300mg/l或更多的量從D-山梨糖醇直接生產維生素C，所述的量是在20小時溫育之後以靜止細胞方法測25量的。6.如權利要求5所述的微生物，其能以800mg/l或更多的量從L-山梨糖直接生產維生素C。7.如權利要求1所述的多核苷酸編碼的多肽。8.用於生產能表達權利要求7所述的多肽的細胞的工藝，其包括下述步驟用權利要求2或3所述的載體或用權利要求1所述的多核苷酸對細胞進行遺傳工程改造。9.權利要求1所述的多核苷酸或用權利要求2或3所述的載體用於生產維生素C的用途。10.如權利要求9所述的用途，其中所述多核苷酸與表達控制序列可操作地連接，並被引入微生物。11.如權利要求io所述的用途，其中，所述表達控制序列包含調控序列和/或啟動子序列和/或終止子序列，並且，這些序列中的至少一種被改變，所述改變以使得所述微生物對維生素C的生產的產率和/或效率提高的10方式進行。12.如權利要求11所述的用途，其中，所述表達控制序列包含調控序列和/或啟動子序列和/或終止子序列，並且，這些序列中的至少一種被改變，所述改變以使得PQQ生物合成蛋白活性增加和/或提高的方式進行。13.如權利要求4所述的微生物或含有包含權利要求1所述的多核苷酸15的內源基因的微生物，所述微生物經過遺傳改變，所述改變以使得所述微生物對維生素C的生產的產率和/或效率提高的方式進行。14.如權利要求13所述的微生物，其生產出具有增加的和/或提高的PQQ生物合成蛋白活性的、權利要求7所述的多肽。15.如權利要求4-6、13或14中任意一項所述的微生物，其中，根據20權利要求1所述的多核苷酸被過量表達。16.如權利要求4-6、13-15中任意一項所述的微生物，其選自屍sewctomowas、、^Esc/zm'c/n'a、Co/"ywe&a"m'謂、《etogWom'c/gem'wm以及乙酸細菌，例如G7wcowo6acter、y4ceto6acfer或G/wcowacefc6a"er，優選地，^ceto^ac^5p.、^4ceto6ac^ace"'、25G7wcowo6a"eryh3&wWz'、G7wcowZac^ce"'wws、G/wcowo6acterf/m"tmci'cus、G7wcowo^"ercwqydaw構成的組，優選地，G7wcowotecteroxj(iam1，更優選地，G7wco"o^cte廠ox少(ia/is1DSM1707817.在微生物中生產增強的、編碼PQQ生物合成蛋白的內源基因的工藝，所述微生物包含權利要求1所述的多核苷酸，所述工藝包括如下步驟以使得所述微生物對維生素C的生產的產率和/或效率提高的方式來改變所述多核苷酸。18.用於生產能產生維生素C的微生物的工藝，所述工藝包括如下步驟改變所述微生物，使得所述微生物生產出具有增加的和/或提高的5PQQ生物合成蛋白活性的多肽，導致所述微生物對維生素C的生產產率和/或效率提高。19.用於生產含有下述內源基因的微生物的工藝，所述內源基因包含權利要求1的多核苷酸，所述工藝包括如下步驟改變所述微生物，使得所述內源基因被過量表達，導致所述微生物對維生素C的生產產率和/或效10率提高。20.如權利要求18或19所述的工藝，其用於生產根據權利要求13至16中任意一項所述的微生物。21.用根據權利要求13至16或權利要求4至6中任意一項所述的微生物生產維生素C的工藝，其中，在水性營養培養基中，在允許從D-山梨15糖醇或L-山梨糖對維生素C進行直接生產的條件下培養所述微生物，以及，可選地，維生素C作為發酵產物被分離。全文摘要本發明涉及新鑑定出的基因，其編碼L-抗壞血酸(下文中也稱為維生素C)合成中涉及的蛋白質。本發明還涉及包含該新穎基因的全長多核苷酸序列的多核苷酸及其片段，所述多核苷酸編碼的新穎的多肽及其片段，以及它們的功能等同物。本發明還涉及所述多核苷酸和多肽作為生物技術工具在從微生物生產維生素C中的用途，其中對所述多核苷酸和/或被編碼的多肽的修飾對所述微生物中生產所述發酵產物的產率、產量和/或效率有著直接或間接的影響。本發明還包括使用多核苷酸和經修飾的多核苷酸序列轉化宿主微生物的方法/工藝。本發明還涉及經過遺傳工程改造的微生物及其用於直接生產維生素C的用途。文檔編號C12P17/04GK101166829SQ200680004786公開日2008年4月23日申請日期2006年2月10日優先權日2005年2月11日發明者奈傑爾·約翰·芒希亞,安佳·穆利,安妮·弗朗索瓦·邁耶,巴斯蒂恩·施韋爾斯,新城雅子申請人:帝斯曼智慧財產權資產管理有限公司