一種重組人鹼性成纖維細胞生長因子的高效表達的製作方法

2024-01-28 09:11:15

專利名稱：一種重組人鹼性成纖維細胞生長因子的高效表達的製作方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，涉及一種重組人鹼性成纖維細胞生長因子(recombinant human basic fibroblast growth factor，簡稱rh-bFGF)高效表達菌株的構建背景技術：
bFGF是一種鹼性多肽，1974年由Gospodarowicz首次從牛腦垂體和腦組織中分離得到，由於具有促成纖維細胞(Balb/c3T3)增殖的特性，且具有較強的鹼性(等電點為9.6)，因此命名為鹼性成纖維細胞生長因子(A.Gopodarowicz，Nature，249，123，1974)。1984年Bohlen等進一步純化bFGF並測定其胺基酸序列，確定了由牛腦垂體分離純化得到的bFGF的N端15個胺基酸序列。1985年Esch等人報導了由牛腦垂體提取的bFGF的胺基酸全序列。1986年，Abraham等人報導了牛bFGF基因的克隆，隨後他們又克隆了人bFGF(hbFGF)分子(EMBO Joumal，5，2523-2528 1986)。人與牛的bFGF分子相比，僅有兩個胺基酸不同。全長hbFGF分子由155個胺基酸組成，分子量大約為17kD。bFGF在體內分布十分廣泛，腦、心、肝、骨、眼、腎上腺、胎盤等處均有表達。bFGF是重要的促有絲分裂的因子，也是形態發生和分化的誘導因子，其生物學功能主要有促進新血管生成、促進創傷癒合與組織修復、促進組織再生、參與神經再生等。近年研究發現，bFGF還具有在動脈粥樣硬化和血管損傷過程中介導血管平滑肌增生的作用。由於bFGF具有上述多種重要的生物學功能，因此國內外許多公司一直非常關注bFGF的開發，目前bFGF作為治療創傷和潰瘍方面的外用藥物已經上市，治療神經系統和心血管系統的注射用bFGF正在開發。總之，bFGF在醫藥應用方面有很大的潛力。
目前，仍主要採用大腸桿菌表達bFGF，但這一表達系統存在的主要問題是表達量太低(PCT專利，申請號WO86/07595)，近年有人利用PCR的方法在bFGF缺失體的N端引入鹼基突變，使bFGF的表達量有所提高(公開專利CN 1188151)。但bFGF的表達量仍然僅佔大腸桿菌總蛋白的15％左右，與某些細胞因子在大腸桿菌中的表達水平相比，還有很大差距。

發明內容
本發明的目的在於構建一種hbFGF的高效表達菌株。利用全基因合成技術，在不改變胺基酸序列的情況下將編碼hbFGF基因密碼子改為大腸桿菌偏性密碼子，主要做以下突變編碼精氨酸的密碼子突變為CGT(共突變8個密碼子，位點分別為31、48、69、90、106、116、118、129)，編碼脯氨酸的密碼子突變為CCG(共突變6個密碼子，位點分別為10、29、45、58、141、150)，編碼亮氨酸的密碼子突變為CTG(共突變9個密碼子，位點分別為62、64、83、91、92、107、134、147、149)。然後將之分別插入帶有T7啟動子的原核表達載體pET-23b和帶有Tac啟動子的原核表達載體pKK223-3中，構建成高效重組表達質粒pET-hbFGF和pKK223-hbFGF，然後轉化大腸桿菌，獲得陽性重組子。該重組子經培養及誘導表達，bFGF的表達量均佔菌體蛋白總量的25％以上，明顯高於相關文獻報導的水平。
具體實施例方式
本發明利用全基因合成技術，合成了hbFGF的全長DNA，再將之克隆進pGEM-T載體，獲得重組質粒pGEM-hbFGF。對重組質粒的序列分析表明，所獲得的DNA序列與實驗設計完全一致。
將hbFGF DNA由pGEM-hbFGF重組質粒亞克隆入帶有T7啟動子的高效表達載體pET-23b，和帶有Tac啟動子的高效表達載體pKK223-3中，獲得了可編碼hbFGF成熟蛋白的重組質粒pET-hbFGF和pKK223-hbFGF。將重組質粒轉化大腸桿菌E.coli BL21(DE3)和E.coli JM109(DE3)受體細胞，構建成BL21(DE3)/pET-hbFGF和JM109(DE3)/PKK-hbFGF工程菌株。以上菌株均可高效穩定地表達目的蛋白，表達量佔菌體總蛋白量的25％以上。
本發明運用重組DNA技術，在天然hbFGF的基因序列基礎上將編碼hbFGF的密碼子突變為大腸桿菌偏性密碼子，主要編碼將精氨酸的8個密碼子突變為CGT，編碼脯氨酸的6個密碼子突變為CCG，編碼亮氨酸的9個密碼子突變為CTG，從而使hbFGF在大腸桿菌中的表達水平明顯提高，為進一步提高生產效率奠定了堅實的基礎。
本發明用下述實例進行說明實施例1重組表達載體的構建根據文獻報導的hbFGF全長基因序列，利用全基因合成技術，將密碼子突變為大腸桿菌偏性密碼子，主要將編碼精氨酸的密碼子突變為CGT(分別為31、48、69、90、106、116、118、129位密碼子)編碼脯氨酸的密碼子突變為CCG，(分別為10、29、45、58、141、150位密碼子)，編碼亮氨酸的密碼子突變為CTG(分別為62、64、83、91、92、107、134、147、149位密碼子)。並為方便與表達載體連接，在hbFGF全基因序列的兩端分別加入NdeI和BamHI的酶切位點。
(1)hbFGF基因克隆進pGEM-T載體全基因合成的hbFGF序列與美國Promega公司的pGEM-T載體連接，連接反應參照產品說明書進行。具體如下反應混合物 (單位μl)全基因合成產物 32×T4連接酶反應緩衝液(美國Promega公司生產) 5PGEM-T載體(美國Promega公司生產) 1T4連接酶(美國Promega公司生產)1總體積 10μl4℃連接過夜。
將連接反應混合物轉化DH5α感受態細胞，經37℃培養過夜後，從瓊脂板上挑取轉化子，接種含氨苄青黴素的LB培養基，培養過夜後，用美國Promega公司質粒提取試劑盒小量製備質粒。質粒用NdeI和BamH I進行酶切，分別在3kb左右和486bp左右出現特異DNA條帶，與預計情況相符，說明重組質粒構建成功，將獲得的陽性重組子命名為pGEM-hbFGF(2)pET-rhbFGF重組表達載體的構建及轉化大腸桿菌表達載體pET-23b質粒先經Nde I酶切，再用BamH I進行酶切。然後用1％瓊脂糖凝膠電泳分離酶切後的樣品，再用美國Clontech公司生產的凝膠純化試劑盒從膠中純化出pET23b 3.7kb大小的酶切片段。
與此同時將pGEM-hbFGF質粒進行Nde I和BamH I雙酶切，經1.2％瓊脂糖凝膠電泳分離後，用美國Clontech凝膠純化試劑盒回收486bp的rhbFGF的片段。再將上述兩種回收產物在T4 DNA連接酶催化下連接成重組質粒，然後將連接產物轉化BL21(DE3)感受態細胞，塗LB-Amp瓊脂平板，置37℃培養過夜。
用美國Promega公司質粒提取試劑盒小量製備轉化子質粒。質粒用Nde I和BamH I進行酶切可產生兩條DNA片段，分別為3.7kb大小的pET-23b載體片段和486bp的rhbFGF DNA片段，與預計情況相符。將獲得的陽性重組子命名為pET-hbFGF。陽性重組子由博亞公司進行序列測定，測序結果顯示，所獲得的陽性重組子序列與設計完全一致。
(3)pKK223-rhbFGF重組表達載體的構建與轉化大腸桿菌表達載體pKK223-3質粒先經Smal酶切。然後將酶切產物經酚、氯仿抽提後乙醇沉澱，重懸於無菌純淨水中。
與此同時將pGEM-hbFGF質粒進行Nde I和BamH I雙酶切，然後用DNA聚合酶I(Klenow大片段)補平酶切後的3』凹端，乙醇沉澱，並將沉澱重懸於無菌純淨水中。在T4 DNA連接酶催化下與酶切後的pKK223-3載體連接成重組質粒，將連接產物轉化JM109(DE3)感受態細胞，塗LB-Amp瓊脂平板，置37℃培養過夜。
用美國Promega公司質粒提取試劑盒小量製備轉化子質粒。質粒用兩端特異性引物進行PCR擴增，擴增出486bp的rhbFGF DNA片段，與預計情況相符。將獲得的陽性重組子命名為pKK223-hbFGF。陽性重組子由博亞公司進行序列測定，測序結果顯示，所獲得的陽性重組子序列與設計完全一致。實施例2rh-bFGF的表達工程菌株BL21(DE3)/pET-hbFGF，JM109(DE3)/PKK223-hbFGF，分別經LB液體培養基(含氨苄青黴素100ug/ml)過夜活化，100倍放大培養，37℃培養至對數生長期，加入IPTG至終濃度為0.1mM，誘導表達4小時。收集菌體，SDS-PAGE電泳檢定hbFGF表達量都佔菌體總蛋白的25％以上。
附錄一種重組人鹼性成纖維細胞生長因子核苷酸序列和胺基酸序列110北京三元基因工程有限公司120一種重組人鹼性成纖維細胞生長因子的高效表達16022101211465212DNA213人工序列220223在天然hbFGF基因序列的基礎上，將密碼子突變為大腸桿菌偏性密碼子220221misc-feature222(93，144，207，270，318，349，355，387)223y＝t或c4001atggctgctg gttctatcac tactctgccg gctctgccgg aagacggtgg ttctggtgct 60ttccggccgg gtcacttcaa agacccgaaa cgyctgtact gcaaaaacgg tggtttcttc 120ctgcgyatcc acccggacgg tcgygttgac ggtgttcgyg aaaaatctga cccgcacatc 180aaactgcagc tgcaggctga agaacgyggt gttgtttcta tcaaaggtgt ttgtgctaac 240cgttacctgg ctatgaaaga agacggtcgt ctgctggctt ctaaatgtgt tactgacgaa 300tgtttcttct tcgaacgyct ggaatctaac aactacaaca cttaccgytc tcgyaaatac 360acttcttggt acgttgctct gaaacgyact ggtcagtaca aactgggttc caaaactggt 420ccgggtcaga aagctatcct gttcctgccg atgtctgcta aatct 4652102211155212PRT213人類(homo sapiens)4002Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp510 15Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys
20 25 30Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro35 40 45Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile50 55 60Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys65 70 75Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg80 85 90Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu95 100 105Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr110 115 120Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu125 130 135Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro140 145 150Met Ser Ala Lys Ser15權利要求
1.一種人工合成的人鹼性成纖維細胞生長因子(rhbFGF)的基因序列，其特徵在於在天然人全長鹼性成纖維細胞生長因子基因序列的基礎上，將密碼子改為大腸桿菌偏性密碼子。
2.根據權利要求1合成的基因序列，至少要引入下述突變將編碼精氨酸的密碼子突變為CGT或突變為CGC(有同樣效果)，編碼脯氨酸的密碼子突變為CCG，編碼亮氨酸的密碼子突變為CTG。
3.將根據權利要求1和2構建的hbFGF DNA，與原核表達載體連接，轉化大腸桿菌，構建成高效表達hbFGF的工程菌株，其特徵在於(1)hbFGF DNA與具有T7或Tac啟動子的原核表達載體連接，組裝成高效重組表達質粒；(2)上述重組表達質粒分別轉化大腸桿菌BL21(DE3)和大腸桿菌JM109(DE3)，構建成高效表達hbFGF的工程菌株，經IPTG誘導表達。
全文摘要
本發明涉及一種重組人鹼性成纖維細胞生長因子的高效表達。本發明利用全基因合成技術，在不改變胺基酸序列的情況下，將編碼人全長bFGF的密碼子改為大腸桿菌偏性密碼子，並將其構建入分別帶有T7啟動子的原核表達載體pET23b和帶有Tac啟動子的原核表達載體pKK223－3中，組成高效表達重組質粒pET－hbFGF，pKK223－hbFGF然後轉化大腸桿菌，經IPTG誘導，hbFGF表達量佔菌體總蛋白的25％以上，明顯高於相關文獻報導的表達水平。
文檔編號C07H21/00GK1448510SQ0210385
公開日2003年10月15日 申請日期2002年4月4日 優先權日2002年4月4日
發明者劉爽, 劉金毅, 侯芳, 孫儉波, 程永慶 申請人:北京三元基因工程有限公司, 北京畢艾歐科技發展有限責任公司