一種可調節膚色的組織工程化皮膚的構建方法與應用的製作方法
2023-09-21 04:47:20 2
專利名稱：一種可調節膚色的組織工程化皮膚的構建方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學領域，具體地說是涉及將來自不同組織的幹細胞在體外分別向表皮和向真皮細胞定向誘導分化，並將誘導分化的細胞群和分離培養的黑色素細胞以一定的比例與生物材料相結合，共同構建可調節膚色的組織工程化皮膚的方法，利用此方法可製備用於臨床燒傷、潰瘍、創傷、畸形、術後缺損、疤痕等皮膚組織修復和癒合的具有特定形狀、厚度、可調節膚色的皮膚組織替代物。
背景技術：
皮膚作為人體的最大器官，具有屏障、保護、調節體溫和感覺的功能。由於炎症、潰瘍、燙傷、燒傷等因素造成的皮膚缺損，嚴重的可危及生命。目前臨床通常採用自體皮瓣或皮膚移植的方法治療缺損創面，但面臨供皮區新的創傷缺陷，以及供皮區來源的不足。此外移植物與移植部位臨近的皮膚存在顏色、質地、功能上的差異。
組織工程學是應用工程學和生命科學的原理和方法，構建生物性替代物，以恢復、維持或增進受損器官或組織功能的一門科學(Nerem RM.Tissue engineeringin the USA.Med Biol Eng Comput，1992，30(4)CE8)。組織工程學的建立和發展為皮膚缺損治療開創了嶄新的途徑。
目前應用於臨床的組織工程產品主要有合成性敷料、人工皮片、人工真皮替代物和人工複合全層皮膚。IntegraTM是由美國Integra Life Sciences公司生產的雙層基質的人工真皮。其真皮是由牛肌腱的膠原蛋白及硫酸軟骨素製成具有一定孔洞大小的支架，利於血管內皮細胞通過和纖維細胞長入，表皮是由矽膠膜組成，可在真皮層癒合後除去，再進行人工表皮的移植。美國FDA於1996年核准IntegraTM用於燒燙傷的治療。然而，IntegraTM由於缺乏活的細胞成分，可能延緩真皮的重建。
還有一類是含有單一細胞的皮膚，如人工表皮和人工真皮。
EpicelTM是由美國Genzyme組織修復公司生產的人工表皮，主要用於治療大面積燒燙傷病人。它是將病人自體的角質細胞在體外放大培養，移植到潰瘍、痔、大皰性表皮鬆懈症部位。雖然它們在殘留的真皮部位黏附得很好，但它們不黏附脂肪、慢性創面或感染性創面；而且移植部位容易剝離，或者形成水皰，對機械損傷高度敏感；缺乏真皮成分；移植成功率主要與創面細菌汙染程度有關；費用昂貴。DermagraftTM是由Advanced Tissue Sciences公司生產的人工真皮。是將新生兒包皮中獲取的成纖維細胞接種於生物可降解的聚乳酸纖維網上，移植後14天，成纖維細胞大量增殖並分泌膠原等細胞外基質以及細胞因子，3～4周聚乳酸纖維網因生物降解而消失，用於治療糖尿病引起的足部潰瘍。但生產這種合成網膜真皮替代物需要大量成纖維細胞；難以改變網膜的厚度；市售產品只達到真皮重建。
ApligraftTM是第一種商業化的既含有表皮層又含有真皮層的組織工程化皮膚，由美國Organogenesis公司生產。它是將新生兒包皮中獲取的成纖維細胞接種於牛的I膠原蛋白中，6天後細胞分泌細胞外基質，形成類似真皮層的組織，再種植上新生兒包皮的角質細胞。角質細胞附著在真皮上開始分裂分化形成表皮層。再將整個複合物置於氣-液界面繼續培養，促使角質細胞成熟。雖然ApligraftTM實現了一次外科手術同時重建真皮和表皮的目的，但由於採用同種異體細胞作為種子細胞來源，因而存在著不可避免的免疫排斥反應，以及潛在的病源微生物感染的風險；而且所用的種子細胞均為終末分化的成熟細胞，沒有自我增殖分化的能力。
成體幹細胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細胞，國內外已有大量關於成體幹細胞向骨、軟骨、脂肪、肝臟和神經等誘導分化的離體實驗研究報導，並且當其移植到體內，具有向病變部位遷移並分化成機體所需要的相應細胞的能力(Mackenzie TC，Flake AW.Blood Cells Mol Dis，2001，27(3)601.)，利用成體幹細胞作為種子細胞，將為皮膚缺損的治療開闢新的途徑。
目前應用於臨床的組織工程化皮膚尚不能根據患者膚色的不同進行相應的皮膚移植修復。
發明內容
本發明提供了一種幹細胞體外定向誘導分化為表皮和真皮細胞，再與分離培養的黑色素細胞及生物材料一起構建可調節膚色的組織工程化皮膚的方法。其特徵是將體外誘導成皮膚的表皮細胞群、真皮細胞群和分離培養的黑色素細胞用組織工程方法按比例混合，通過調節黑色素細胞的加入比例構建含有黑色素細胞的人工皮膚。通過這種方法可製備用於臨床燒傷、潰瘍、創傷、畸形、術後缺損、疤痕等皮膚組織修復和癒合的具有特定形狀、厚度的、可調節膚色的皮膚組織替代物。
本發明是通過以下技術方案實現的(1)體外誘導幹細胞向表皮細胞分化將骨髓、脂肪、胚胎、臍帶血、外周血等組織來源的MSC或其它成體幹細胞種植於在預先鋪有明膠(Sigma公司，貨號G-1890)、膠原、纖維蛋白凝膠、Matrigel膠(BD公司，貨號354240)或其它生物活性膠的孔板上，加入含10％胎牛血清(Biochrom公司，貨號S0115)的低糖DMEM培養基(Sigma公司，貨號D-5523)或者其它成體幹細胞相應的基本培養基，於37℃，5％CO2培養箱中進行培養至細胞達到30％～50％的融合，遂改用表皮誘導條件培養液低糖DMEM/DF12(1∶1)培養基(DF12培養基，Sigma公司，貨號D-0547)中含有下列成分10～20ng/ml EGF(RD公司，貨號236-EG)，10～20ng/ml bFGF(RD公司，貨號234-FSE)，5～20ng/ml PDGF(RD公司，貨號222-AB)，1％ITS(Sigma公司，貨號I-3146)，5～15mmol/L地塞米松(Sigma公司，貨號D-1756)，100IU/ml青黴素，100IU/ml鏈黴素中的兩種或兩種以上的組合物進行誘導培養，10～14天後即可得到表皮細胞。
(2)體外誘導幹細胞向真皮細胞分化將骨髓、脂肪、胚胎、臍帶血、外周血等組織來源的MSC或其它成體幹細胞培養在含10％胎牛血清(Biochrom公司，貨號S0115)的低糖DMEM培養基(Sigma公司，貨號D-5523)或者其它成體幹細胞相應的基本培養基中，在37℃，5％CO2培養箱中培養至細胞達到30％～50％的融合，遂改用真皮誘導條件培養液高糖DMEM(Sigma公司，貨號D-5648)中含有下列成分2～10％胎牛血清(Biochrom公司，貨號S0115)，5～15ng/mlTGF-β1(RD公司，貨號240-B)，10～20ng/ml bFGF(RD公司，貨號234-FSE)，1％ITS(Sigma公司，貨號I-3146)，5～15mmol/L地塞米松(Sigma公司，貨號D-1756)，100IU/ml青黴素，100IU/ml鏈黴素中的兩種或兩種以上的組合物進行誘導培養，10～14天後即可得到真皮細胞。
(3)黑色素細胞的分離培養取部分皮膚組織，去除皮下組織及肉膜，然後置於75％乙醇中消毒1min，生理鹽水漂洗數遍，轉入培養皿中，用眼科剪將組織切為2mm×10mm細條狀，2.5g/L的Dispase酶(Gibco公司，貨號17105-041)消化過夜。用小鑷子輕輕將表皮與真皮分離，收集表皮，用0.25％胰酶消化10min，反覆吹打獲得單細胞懸液，加入適量血清終止消化，400目篩網過濾，細胞懸液於離心管中1000轉/min離心5min，棄上清，沉澱中加入含有100μg/ml遺傳黴素(Gibco公司，貨號11811-023)的黑色素細胞培養液(melanocyte growth medium M2，c-24110，PromoCell公司)於37℃，5％CO2孵箱中培養。36h後換液，去除未貼壁的細胞，隔日換一次液。原代細胞70％～80％融合時，常規胰酶消化傳代。
(4)膠原溶液製備和支持材料的準備新鮮牛尾浸於75％酒精中，無菌條件下剝離牛肌腱，生理鹽水洗滌，剪碎，加入0.03～0.05M冰醋酸4℃反覆振搖溶解，製備膠原溶液。加入1/10體積的10×低糖DMEM(Sigma公司，貨號D-5523)，適量的胎牛血清(Biochrom公司，貨號S0115)，用1N的NaOH調節pH值至7.2～7.4。使用前將所需的膠原溶液注入培養皿中，置於冰上，紫外燈下照射30min～60min。
將豬、牛、羊等各種哺乳動物或其它來源的皮膚脫細胞基質或其它商業脫細胞基質或者諸如膠原海綿、蠶絲蛋白、PLA、PGA、PLGA等可降解、疏鬆多孔的生物或者聚合物材料進行鈷60照射滅菌，用低糖DMEM培養基洗3次，之後置於4℃存放，待用。
(5)組織工程全層皮膚的製備將脫細胞基質或其它生物支架材料或聚合物材料(如家蠶絲或柞蠶絲溶解提純得到的絲膠、絲素及甲殼素、纖維素、聚胺基酸、PLGA、PGA、PLA、聚醯胺、聚酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚氯乙稀、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、硝化纖維等)放在矽化處理過的培養板(或其它培養皿)中。將向真皮細胞誘導10～14天的細胞群消化，用含10％胎牛血清(Biochrom公司，貨號S0115)的低糖DMEM培養基(Sigma公司，貨號D-5523)重懸，計數，和膠原溶液混合均勻，按1×103～5×104個/cm2的密度種進支持材料中。加入適量含10％胎牛血清的低糖DMEM培養基，靜置10分鐘，隨後放入37℃，5％CO2培養箱中培養，4h後將培養基吸去，換成真皮細胞培養液培養。4天後將向表皮細胞和黑色素細胞誘導10～14天的細胞群分別消化，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培養基重懸，計數，按3～30∶1的比例，以2×103～2×105個/cm2的密度均勻種植於含有真皮細胞的材料表面。2h後將培養基吸去，換成表皮細胞培養液進行培養，3天後換成氣-液界面培養，繼續培養7天後組織工程化皮膚即可用於移植。
本發明是將不同組織來源的幹細胞在體外分別向表皮和向真皮細胞定向誘導分化，然後與分離培養的黑色素細胞以一定比例混合，再與豬、牛、羊等各種哺乳動物或其它來源的皮膚脫細胞基質或其它商業脫細胞基質或者諸如膠原海綿、蠶絲蛋白、PLA、PGA、PLGA等可降解、疏鬆多孔的生物或者聚合物材料結合起來，共同構成可調節膚色的組織工程化皮膚，可製備用於臨床燒傷、潰瘍、創傷、畸形、術後缺損、疤痕等皮膚組織修復和癒合的具有特定形狀、厚度、可調節膚色的皮膚組織替代物。由於幹細胞具有多向分化潛能，能夠在誘導條件下分化為表皮細胞和真皮細胞，通過誘導分化的細胞及其分泌的可溶性細胞因子及細胞外基質等活性成分的共同作用，能夠加速缺損創面的癒合，同時根據加入黑色素細胞比例的不同還能夠滿足不同個體膚色的需要，因此，市場價值潛力巨大，具有廣闊的應用前景。
圖1幹細胞向表皮細胞誘導分化a誘導分化後5天，細胞呈表皮細胞典型的「鋪路石狀」(×200)b誘導分化後10天透射電鏡觀察，胞漿中出現大量張力細絲和黑色素小體(×60000)c免疫螢光鑑定，誘導分化的細胞表達CK19(×100)d免疫組織化學鑑定，誘導分化的部分細胞表達CK10(×200)圖2幹細胞向真皮細胞誘導分化a誘導分化後10天透射電鏡觀察，細胞外出現少量膠原微纖維(×60000)b免疫組織化學鑑定，誘導分化部分細胞表達I型膠原圖3組織工程化皮膚裸鼠移植試驗及體內免疫螢光檢測a覆蓋組織工程化皮膚的裸鼠移植試驗模型b免疫螢光鑑定，組織工程化皮膚移植後3天，裸鼠皮膚缺損創面細胞表達CK10c免疫螢光鑑定，組織工程化皮膚移植後7天，細胞向皮膚缺損創面遷移d組織工程化皮膚移植後7天，組織工程化皮膚創面癒合率達到50％e組織工程化皮膚裸鼠移植試驗21天後，缺損創面完全癒合具體實施方式
實施例1、以骨髓MSC為例，體外分離不同組織來源的幹細胞無菌條件下直接抽取患者骨髓，加等量生理鹽水稀釋，200目篩網過濾，加入6％HES(B.Braun公司)沉降紅細胞，吸取上層細胞懸液，離心去上清，加生理鹽水製成細胞懸液，用比重1.073g/ml的Percoll分離液(AmershamBiosciences公司，貨號17-0891-01)分離(1000g×20min)，小心吸出中間層細胞，用含10％胎牛血清(Biochrom公司，貨號S0115)的低糖DMEM培養基(Sigma公司，貨號D-5523)重懸，接種於T-25培養瓶中。置CO2培養箱(溫度設定為37℃，CO2濃度為5％)內培養；培養72h後換液，此後依細胞生長速度對培養體系進行換液，待培養瓶內細胞長至80％以上融合時，用0.25％的胰蛋白酶37℃消化細胞，分別按5.5～7.0×103個/cm2接種於培養瓶中，置CO2培養箱培養。
實施例2、體外誘導MSC向表皮細胞分化將骨髓來源的MSC種植於預先鋪有Matrigel膠(BD公司，貨號354240)的孔板上，加入含10％胎牛血清(Biochrom公司，貨號S0115)的低糖DMEM培養基(Sigma公司，貨號D-5523)，於37℃，5％CO2培養箱中進行培養至細胞達到50％的融合，遂改用表皮誘導條件培養液低糖DMEM/DF12(1∶1)培養基(Sigma公司，貨號D-0547)，15ng/ml EGF(RD公司，貨號236-EG)，15ng/ml bFGF(RD公司，貨號234-FSE)，5ng/ml PDGF(RD公司，貨號222-AB)，1％ITS(Sigma公司，貨號I-3146)，10mmol/L地塞米松(Sigma公司，貨號D-1756)，100IU/ml青黴素，100IU/ml鏈黴素進行誘導培養，10～14天後即可得到表皮細胞。結果顯示，幹細胞向表皮細胞誘導分化後5天，細胞呈表皮細胞典型的「鋪路石狀」。誘導分化後10天，胞漿中出現大量張力細絲和黑色素小體，免疫螢光檢測細胞表達CK19，免疫組化檢測部分細胞表達CK10(圖1)。
實施例3、體外誘導MSC向真皮細胞分化將骨髓來源的MSC種植於預先鋪有Matrigel膠的孔板上，加入含10％胎牛血清(Biochrom公司，貨號S0115)的低糖DMEM培養基(Sigma公司，貨號D-5523)，於37℃，5％CO2培養箱中進行培養至細胞達到50％的融合，遂改用真皮誘導條件培養液高糖DMEM(Sigma公司，貨號D-5648)，5％胎牛血清(Biochrom公司，貨號S0115)，15ng/mlTGF-β1(RD公司，貨號240-B)，15g/ml bFGF(RD公司，貨號234-FSE)，1％ITS(Sigma公司，貨號I-3146)，10mmol/L地塞米松(Sigma公司，貨號D-1756)，100IU/ml青黴素，100IU/ml鏈黴素進行誘導培養，10～14天後即可得到真皮細胞。結果顯示，幹細胞向真皮細胞誘導分化後10天，細胞外出現少量膠原微纖維，免疫組化檢測，部分細胞表達I型膠原(圖2)。
實施例4、黑色素細胞的分離及體外培養取部分皮膚組織，去除皮下組織及肉膜，然後置於75％乙醇中消毒1min，生理鹽水漂洗數遍，轉入培養皿中，用眼科剪將組織切為2mm×10mm細條狀，2.5g/L的Dispase酶(Gibco公司，貨號17105-041)消化過夜。用小鑷子輕輕將表皮與真皮分離，收集表皮，用0.25％胰酶消化10min，反覆吹打獲得單細胞懸液，加入適量血清終止消化，400目篩網過濾，細胞懸液於離心管中1000轉/min離心5min，棄上清，沉澱中加入含有100μg/ml遺傳黴素(Gibco公司，貨號11811-023)的黑色素細胞培養液(melanocyte growth medium M2，c-24110，PromoCell公司)於37℃，5％CO2孵箱中培養。36h後換液，去除未貼壁的細胞，隔日換一次液。原代細胞70％～80％融合時，常規胰酶消化傳代。
實施例5、膠原溶液準備新鮮牛尾浸於75％酒精中，無菌條件下剝離牛肌腱，生理鹽水洗滌，剪碎，加入0.05M冰醋酸4℃反覆振搖溶解，製備膠原溶液。加入1/10體積的10×低糖DMEM，適量的胎牛血清，用1N的NaOH調節pH值至7.2～7.4。使用前將所需的膠原溶液注入培養皿中，置於冰上，紫外燈下照射40min。
實施例6、以皮膚脫細胞基質為例，製備可調節膚色的組織工程化皮膚將牛來源的皮膚脫細胞基質進行鈷60照射滅菌，用低糖DMEM培養基洗3次，之後置於矽化處理過的培養板(或其它培養皿)中。將向真皮細胞誘導10～14天的細胞群消化，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培養基重懸，計數，和膠原溶液混合均勻，按5×104個/cm2的密度種進支持材料中。加入適量含10％胎牛血清的低糖DMEM培養基，靜置10分鐘，隨後放入37℃，5％CO2培養箱中培養，4h後將培養基吸去，換成真皮細胞培養液培養。4天後將向表皮細胞和黑色素細胞誘導10～14天的細胞群分別消化，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培養基重懸，計數，按30∶1的比例，以2×105個/cm2的密度均勻種植於含有真皮細胞的材料表面。2h後將培養基吸去，換成表皮細胞培養液進行培養，3天後換成氣-液界面培養，繼續培養7天後組織工程化皮膚即可用於移植。
實施例7、組織工程皮膚修復裸鼠創面實驗用3.5％水合氯醛麻醉裸鼠後，於背部尾側切取全層皮膚作直徑1.5cm的圓形缺損創面，移植組織工程皮膚替代物；術後3天去除包紮敷料，皮膚與創面貼合較緊，成活，第7天，創面癒合率達到50％，第21天創面已完全癒合，創面修復良好(圖3)。
權利要求
1.一種能夠調節膚色的組織工程化皮膚的構建方法，其特徵在於由向表皮細胞和向真皮細胞誘導分化的細胞群、分離培養的黑色素細胞與生物材料共同構建而成。
2.根據權利要求1所述的能夠調節膚色的組織工程化皮膚的構建方法，其特徵在於所述的向表皮細胞或向真皮細胞誘導分化的細胞包括從臍帶血、外周血、骨髓、脂肪、胎盤、臍帶等組織分離的幹細胞經體外誘導分化而獲得。
3.根據權利要求1所述的能夠調節膚色的組織工程化皮膚的構建方法，其特徵在於所述的生物材料包括可降解生物材料包括家蠶絲或柞蠶絲溶解提純得到的絲膠、絲素及膠原、甲殼素、纖維素、聚胺基酸、PLGA、PGA、PLA；還包括脫細胞真皮基質；非降解型生物材料如聚醯胺、聚酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚氯乙稀、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、硝化纖維。
4.根據權利要求1所述的能夠調節膚色的組織工程化皮膚的構建方法，其特徵在於所述的黑色素細胞分離自皮膚，經體外培養擴增獲得。
5.根據權利要求1所述的能夠調節膚色的組織工程化皮膚的構建方法，包括有幹細胞的分離、幹細胞的體外誘導分化、誘導分化的細胞和分離培養的黑色素細胞與生物材料的共培養，其特徵在於，本發明方法包括以下步驟(1)不同組織來源幹細胞的分離培養；(2)黑色素細胞的分離培養；(3)不同組織來源幹細胞向表皮細胞誘導分化；(4)不同組織來源幹細胞向真皮細胞誘導分化；(5)膠原溶液製備和支持材料的準備；(6)含有誘導分化的表皮細胞和真皮細胞以及黑色素細胞的可調節膚色的組織工程化皮膚的構建1)將脫細胞基質或者其它生物或者聚合物材料放在矽化處理過的培養板(或其它培養皿)中，將向真皮細胞誘導10～14天的細胞群消化，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培養基重懸，計數，和膠原溶液混合均勻，按1×103～5×104個/cm2的密度種進支持材料中，加入適量含10％胎牛血清的低糖DMEM培養基，靜置10分鐘，隨後放入37℃，5％CO2培養箱中培養，4h後將培養基吸去，換成真皮細胞培養液培養；2)4天後將向表皮細胞誘導10～14天的細胞群和培養的黑色素細胞分別消化，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培養基重懸，計數，按3～30∶1的比例，以2×103～2×105個/cm2的密度均勻種植於含有真皮細胞的材料表面；3)2h後將培養基吸去，換成表皮細胞培養液進行培養，3天後換成氣-液界面培養，繼續培養7天後組織工程化皮膚即可用於移植。
6.根據權利要求1所述的可調節膚色的組織工程化皮膚的構建方法，其特徵在於用於誘導不同組織來源幹細胞向表皮細胞分化的培養基是在低糖DMEM/DF12(1∶1)培養基中含有下列成分EGF、bFGF、PDGF，ITS，地塞米松，青黴素，鏈黴素中的兩種或兩種以上的組合物。
7.根據權利要求1所述的可調節膚色的組織工程化皮膚的構建方法，其特徵在於用於誘導幹細胞向真皮細胞分化的培養基是在高糖DMEM培養基中含有下列成分胎牛血清，TGF-β1，bFGF，ITS，地塞米松，青黴素，鏈黴素中的兩種或兩種以上的組合物。
8.根據權利要求1所述的可調節膚色的組織工程化皮膚的構建方法，其特徵在於用於幹細胞向表皮細胞分化的一種誘導方案可以是低糖DMEM/DF12(1∶1)培養基，15ng/ml EGF，15ng/ml bFGF，5ng/ml PDGF，1％ITS，10mmol/L地塞米松，100IU/ml青黴素，100IU/ml鏈黴素。
9.根據權利要求1所述的可調節膚色的組織工程化皮膚的構建方法，其特徵在於用於幹細胞向真皮細胞分化的一種誘導方案可以是高糖DMEM，5％胎牛血清，15ng/mlTGF-β1，15g/ml bFGF，1％ITS，10mmol/L地塞米松，100IU/ml青黴素，100IU/ml鏈黴素。
10.可調節膚色的組織工程化皮膚的應用，其特徵在於根據權利要求1所述方法構建的可調節膚色的組織工程化皮膚可製備應用於臨床燒傷、潰瘍、創傷、畸形、術後缺損、疤痕等皮膚組織修復和癒合的皮膚組織替代物。
全文摘要
本發明涉及生物醫學領域，是將不同組織的幹細胞體外分別向表皮和真皮細胞定向誘導分化，並將誘導分化的細胞群和培養的黑色素細胞以一定比例與生物材料相結合，共同構建可調節膚色的組織工程化皮膚的方法。利用此方法可在支架材料上製備用於臨床燒傷、潰瘍、創傷、畸形、術後缺損、疤痕等皮膚組織修復和癒合的具有特定形狀、厚度、可調節膚色的皮膚組織替代物。由於幹細胞具有多向分化潛能，能夠在誘導條件下分化為表皮細胞和真皮細胞，通過誘導分化的細胞及其分泌的可溶性細胞因子及細胞外基質等活性成分的共同作用，能夠加速缺損創面的癒合，根據加入黑色素細胞比例的不同能夠滿足不同個體膚色的需要，市場價值潛力巨大，具有廣闊的應用前景。
文檔編號A61F2/10GK101063109SQ20061007636
公開日2007年10月31日 申請日期2006年4月24日 優先權日2006年4月24日
發明者裴雪濤, 何麗娟, 陳琳, 南雪, 王韞芳, 管利東, 劉大慶, 白慈賢 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所