重組多聚流感蛋白的製作方法

2023-10-07 21:23:34 2

專利名稱：重組多聚流感蛋白的製作方法
重組多聚流感蛋白
本發明涉及病毒學領域，具體地，本發明涉及流感病毒疫苗領域。
流感是由屬於正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的三種類型的流感病毒甲型、乙型和丙型流感病毒引起的感染性疾病。流感病毒為由編碼9種蛋白質的7個負單鏈RNA區段(丙型流感)或編碼11種蛋白質的8個負單鏈RNA區段(甲型和乙型流感)組成的RNA 病毒(Chen和Deng，2009)。鳥類被認為是所有甲型流感病毒的天然宿主，但許多亞型也可感染哺乳動物包括人。流感症狀包括發熱、頭痛、惡寒、肌內疼痛和咽喉疼痛，與普通感冒相當的症狀。然而，流感可導致威脅生命的併發症例如肺炎，和在高危人群例如幼兒、老年人以及免疫力下降的或患慢性疾病的個體中導致死亡。在過去，流感大流行例如1918/1919 西班牙流感大流行(H1N1亞型)和1968/1969香港流感大流行(H 3N2亞型)已造成數百萬人死亡(Khanna等人，2008)。
流感病毒表面蛋白血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)為血清學上不同的流感亞型的基礎。目前已鑑定了 16種HA(H1-H16)和9種NA(N1_N9)血清型，其用於分類流感病毒(例如H3N2)。抗原漂移(由引起胺基酸置換的一個或多個突變導致)，可引起HA和NA的小的抗原改變，從而導致逃脫宿主的免疫。此外，稱為抗原轉變的過程通過來自不同流感病毒亞型的HA和NA的組合導致形成新的病毒亞型(重排列)。HA和/或NA的這些改變部分可以為選擇壓力的結果(Chen和Deng, 2009)。
HA存在於病毒膜中。其必須被宿主蛋白酶切割，產生兩條多肽HAl和HA2，才能具有感染性。在切割後，HA2多肽的新暴露的N末端隨後用於介導病毒與宿主細胞膜的融合， 這使得病毒能夠起始對宿主細胞的感染(Skehel和Wiley，2000)。HA為由3個結構上不同的區域(由包含受體結合位點和和HA1/HA2切割位點的反向平行β-摺疊組成的球狀頭部、三鏈捲曲螺旋(coiled-coil) α螺旋莖、和由反向平行β -摺疊組成的球狀腳)組成的同三聚體。圖I中展示了流感病毒的示意圖。每一個單體由具有通過二硫鍵連接的HAl和 ΗΑ2 區域的 HA 多肽組成(Skehel 和 Wiley, 2000; Stevens 等人，2006)。
NA催化宿主細胞的糖蛋白的末端唾液酸殘基的水解，從而阻止HA與此類蛋白質的結合。因此NA促進病毒從細胞釋放,從而促進病毒的擴散。NA為通過N端錨定至病毒膜的同四聚體。在圖I中，顯示了流感病毒的示意圖。每一個單體包含以螺旋漿形式排列的6個拓撲學上一致的β_摺疊，這形成了連接至莖區域的四聚體蛋白的頭部。酶活性位於每一個單體中(Colman 1994)。
流感病毒感染在冬天最盛行，每年都開發季節性流感疫苗。此類疫苗包含兩種甲型流感病毒(Η1Ν1和Η3Ν2)和一種乙型流感病毒(Khanna等人，2008)。每年都需要開發新型組合物來保護免受預測的循環株(circulating strain)的侵害。儘管它們可具有高同源性，特定疫苗可能不能保護免受相同甲型流感亞型的不同株的侵害。除了季節性人流感疫苗外，存在幾種用於治療動物的流感疫苗，例如抗家禽的禽H5N1和H9N2流感感染的疫苗和抗豬的HlNl和H3N2流感感染的疫苗。目前可獲得的流感疫苗為活減毒流感病毒或滅活的流感病毒，其通常通過在含胚雞卵(embryonized chicken egg)中生長病毒來產生。該生產方法存在幾個不利方面，包括操作流感病毒所需的高水平生物安全防範設施，不能在含胚雞卵中獲得高產率的流感病毒，對於非常有限數目的甲型流感亞型的高度特異性以及不能在蛋類過敏的個體(主要是兒童)中使用疫苗(Lipatov等人，2004)。
已作出許多努力來開發基於來源於HA或NA的重組蛋白質的疫苗。然而，所有此類疫苗在治療效率和功效方面具有局限性。Wei等人(JVirol. 2008)描述了利用重組H5N1 HA蛋白接種小鼠。用於表達重組H5N1 HA蛋白的質粒包含編碼三聚結構域和His-標籤的核酸序列，所述三聚結構域和His-標籤在蛋白質純化後都被去除。為了有效，必須用相對高的量(20 μ g)的蛋白質免疫小鼠超過I次(第O和3周)。在Song等人(PLoS One. 2008) 和TO 2007/103322中，描述了利用2個劑量的包含融合至TLR5配體鞭毛蛋白的HA球狀頭部的組合物進行的小鼠免疫。此外，在Song等人(PLoS One. 2008)中，利用2個劑量的5 或15 μ g融合至鞭毛蛋白的HA免疫兔子。在Saelens等人(Eur JBiochem. 1999)中，使用 3個劑量的包含畢赤酵母(P.pastoris)中表達的重組HA和Ribi佐劑(水包油乳劑)的組合物來免疫小鼠，W095/18861描述了使用3個劑量的包含神經氨酸酶的組合物免疫小鼠。 Kong等人(Proc Natl Acad Sci USA. 2006)需要利用3個劑量的表達流感病毒血凝素的質粒 DNA 來免疫小鼠，這也描述於 WO 2007/100584、WO 2008/112017 和 WO 2009/092038 中。
本發明的目的是，提供用於引發抗流感病毒的保護性免疫應答的改進的免疫原性組合物。因此本發明提供了免疫原性組合物，其包含至少一種融合至鏈黴抗生物素蛋白親和標籤的流感病毒蛋白的重組多聚胞外結構域或其部分，以及藥學上可接受的稀釋劑。
「免疫原性組合物」在本文中被定義為，當給個體施用時能夠引發免疫應答的組合物。引發的免疫應答可以是體液免疫應答、細胞免疫應答或其組合，包括但不限於抗體、B細胞和T細胞的產生。本文中使用的免疫應答優選特異性針對根據本發明的組合物中的一種或多種免疫原。
可通過本領域已知的任何技術給個體施用本發明的免疫原性組合物，所述技術包括但不限於肌內(IM)、真皮內(ID)、皮下(SC)、顱內(1C)、腹膜內(IP)或靜脈內(IV)注射、 經皮膚、口服、鼻內或直腸施用，及其組合。此外，可以例如通過注射或口服或經鼻施用單個地,或例如通過補充入飲用水或通過對動物噴霧或噴霧至動物例如農場動物上方的空氣中集體地進行根據本發明的免疫原性組合物的施用。在優選實施方案中，根據本發明的免疫原性組合物用於引發免疫應答。優選將免疫原性組合物用作疫苗。
「個體」在本文中定義為人或動物，優選可被流感病毒感染的動物，例如鳥類，包括但不限於家禽。個體包括但不限於雞、鴨、鵝、火雞、天鵝、鴯鶓、珠雞(guinea fowl)和雉、 人、豬、白鼬、海豹、兔、貓、狗和馬。在本發明的優選實施方案中，個體為哺乳動物例如人、豬或馬，或鳥類。在本發明的一個實施方案中，所述哺乳動物為人。
「多聚胞外結構域」在本文中定義為，表面蛋白質的細胞外部分，所述表面蛋白包含至少兩個(非共價鍵合的)亞基。所述表面蛋白可以為流感病毒的任何表面蛋白。通過使用流感病毒表面蛋白的多聚胞外結構域或其部分，獲得和/保持所述流感病毒表面蛋白的正確二級、三級和四級結構。「流感蛋白質」在本文中定義為由流感病毒基因組編碼的任何蛋白質。
本文中使用的「藥學上可接受的稀釋劑」定義為，不具有生物學或另外的不想要的活性的任何溶液、物質或其組合，意味著可將其與免疫組合物的其它組分一起給個體施用而不引起明顯的不利反應。
在整個本申請中，融合至鏈黴抗生物素蛋白親和標籤的流感蛋白質的重組多聚胞外結構域或其部分還進一步稱為根據本發明的重組多聚胞外結構域或其部分。
如本文中所用，「流感病毒」包括甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒以及所有流感病毒亞型。如本文中所用，「流感類型」是指甲型、乙型或丙型流感。如本文中所用，「流感株」是指不同的甲型流感病毒例如H1N1、H1N2、H1N7、H2N2、H3N2、H3N8、H4N8、 H5N1、H5N2、H5N9、H6N2、H6N5、H7N2、H7N3、H7N7、H8N4、H9N2、H10N7、H11N6、H12N5、H13N6。 如本文中所用，「血凝素」或「HA」是指流感病毒的血凝素蛋白，並且可以是任何流感類型， 甲型、乙型或丙型，以及任何血清型例H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、 H14、H15或H16，包括屬於相同血清型但因例如抗原漂移而具有小差異的亞型。如本文中所用，「神經氨酸酶」或「NA」是指流感病毒的神經氨酸酶蛋白，並且可以為任何流感類型，甲型、乙型或丙型，和任何血清型例如NI、N2、N 3、財、陽、郵、町、_或_，包括屬於相同血清型但因例如抗原漂移而具有小的差異的亞型。如本文中所用，「其部分」被定義為比流感病毒蛋白質的完整多聚胞外結構域小但具有相似免疫原性的流感病毒蛋白質的重組多聚胞外結構域的任何部分。
例如，根據本發明的重組多聚HA的一部分包括HA2，或包含緊鄰HA的HAl亞基的高度保守的表位的HA2的一部分(Ekiert等人，2009)或缺乏球狀頭部結構域的HA胞外結構域。優選所述HA2的表位、HA2的部分或缺乏球狀頭部結構域的HA胞外結構域包含融合至HA的胺基酸293-524 (根據流感株X31的HA的編號的胺基酸編號，EMBL-EBI登錄號 P03438)的HA的胺基酸1-68。因為所述HA的表位在不同流感病毒類型、亞型和株中高度保守，因此如果所述部分用於根據本發明的免疫原性組合物，則可提供抗不同流感病毒類型、 亞型或株的廣泛保護作用。
在優選實施方案中，提供了根據本發明的免疫原性組合物用於製備引發抗流感病毒的免疫應答的預防劑的用途。還提供了用作疫苗的根據本發明的免疫原性組合物。
「鏈黴抗生物素蛋白未和標籤」或「 strep-標籤」在本文中被定乂為，結合鏈黴抗生物素蛋白或其衍生物例如Strep-Tactin的標籤，其包含至少一個由9個胺基酸組成的肽:Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly,或至少一個由8個胺基酸組成的肽(也稱為 Strep-標籤 II) :Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys,其中 Trp 為色氨酸，Ser 為絲氨酸， His為組氨酸，Pro為脯氨酸，Gln為穀氨醯胺，Phe為苯丙氨酸，Glu為穀氨醯胺，Lys為賴氨酸，Ala為丙氨酸，Arg為精氨酸以及Gly為甘氨酸。在優選實施方案中，鏈黴抗生物素蛋白親和標籤包括兩個或更多個所述多肽(每一個由8或9個胺基酸組成)，更優選3個所述肽。在一個實施方案中，鏈黴抗生物素蛋白親和標籤包含超過3個的所述肽。strep-標籤例如用於分離和/或純化目的。該標籤結合鏈黴抗生物素蛋白或其衍生物(例如固定在柱子上的)。可使用生物素或其衍生物或類似物例如脫硫生物素從柱子洗脫融合至strep-標籤的蛋白質。可將鏈黴抗生物素蛋白親和標籤置於目標蛋白質的C或N端。如本文中所用， 『衍生物』被定義為具有被鏈黴抗生物素蛋白親和標籤結合的能力，從而可用於分離或純化包含鏈黴抗生物素蛋白親和標籤的蛋白質的鏈黴抗生物素蛋白的任何變體。鏈黴抗生物素蛋白的優選衍生物為Strep-Tactin。
可通過與生物素或適當的衍生物競爭，在溫和條件下洗脫結合的重組蛋白質。溫和條件意指，可在生理條件例如水溶液、室溫、中性或微鹼性pH和常壓下進行純化。
在本發明的優選實施方案中，流感蛋白質的重組多聚胞外結構域或其部分選自重組三聚流感血凝素胞外結構域或其部分和重組四聚流感神經氨酸酶胞外結構域或其部分。
在一些實施方案中，根據本發明的重組多聚胞外結構域或其部分的胺基酸序列例如通過胺基酸置換、缺失和/或添加來改變，所述改變提供了功能上與根據本發明的重組多聚胞外結構域或其部分等同的蛋白質。功能上等同的蛋白質可通過本領域已知的任何方法，例如通過它們誘導個體的抗流感病毒的免疫應答的能力，或在其中測定對抗體的結合的體外測定中來進行鑑定。在根據本發明的免疫原性組合物中提供改變的重組多聚胞外結構域，例如因為其可以以與未改變的親代多聚胞外結構域相比較更高的水平產生。
根據本發明的重組多聚胞外結構域或其部分優於流感病毒蛋白質的單體胞外結構域或其部分，因為此類多聚胞外結構域將導致免疫應答的更有效的引發。因此，根據本發明的包含這樣的重組多聚胞外結構域的免疫原性組合物，與包含流感病毒蛋白質的單體胞外結構域的免疫原性組合物相比較，需要更低的施用劑量和減少的施用次數來引發充足的免疫應答。
根據本發明的免疫原性組合物可包含一種重組三聚流感血凝素胞外結構域或其部分或一種重組四聚流感神經氨酸酶胞外結構域或其部分。此類免疫原性組合物特別適合於引發個體的抗流感病毒亞型或株或超過一種相關流感病毒亞型或株的免疫應答。然而， 在一些實施方案中，根據本發明的免疫原性組合物包含一種或多種三聚血凝素胞外結構域或其部分，和/或一種或多種四聚神經氨酸酶胞外結構域或其部分的組合。
因此，例如，可組合2、3、4、5、6、7、8、9或10種三聚血凝素胞外結構域或其部分，例如 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 和 / 或 H16，或可組合 2、3、4、5、6、7、8或9種四聚神經氨酸酶胞外結構域或其部分，例如NI、N2、N3、N4、N5、N6、N7、 NS和/或_。此外，根據本發明的免疫原性組合物可包含不同流感病毒亞型的一種或多種三聚血凝素胞外結構域或其部分和一種或多種四聚神經氨酸酶胞外結構域或其部分的組合。例如，可組合1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種三聚血凝素胞外結構域或其部分和1、2、3、4、5、6、7、8或9種四聚神經氨酸酶胞外結構域或其部分，例如HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、 H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16、NI、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8 和 / 或 N9。本領域技術人員將清楚，術語「一個或多個胞外結構域」包括來自一種或多種流感病毒亞型例如甲型流感病毒和乙型流感病毒的一個或多個胞外結構域。因此，根據本發明的免疫原性組合物可以是多價組合物，其與包含一種重組三聚流感血凝素胞外結構域或其部分或一種重組四聚流感神經氨酸酶胞外結構域或其部分的免疫原性組合物相比較，可用於獲得增強的抗流感病毒感染的保護作用。此外，或可選擇地，通過利用多價組合物，可獲得抗超過一種流感病毒類型或流感病毒亞型或株的更廣泛的保護作用。此外，與常規滅活的流感病毒疫苗或活的減毒的流感病毒疫苗相比，根據本發明的免疫原性組合物對抗原的改變較不敏感。
根據本發明的免疫原性組合物的其它有利方面為，例如以相對低的成本在細胞培養物中大量產生重組多聚胞外結構域或其部分的可能性，因為高水平生物安全防範設施不是產生根據本發明的免疫原性組合物所必需的。
與先前產生基於重組流感病毒蛋白質的疫苗的努力不同，引發個體的免疫應答僅需極低量的根據本發明的融合至鏈黴抗生物素蛋白親和標籤的流感病毒蛋白質或其部分的重組多聚胞外結構域或其部分。如在實施例中更詳細地顯示的，在白鼬中低至3. 75yg的重組蛋白質的量，在豬中低至5μ g的重組蛋白質的量和在雞中低至O. 4μ g的重組蛋白質的量足以在用流感病毒攻擊後在各自這些動物中弓I發保護性免疫應答。
可以以單個劑量或以多個劑量施用根據本發明的免疫原性組合物。然而，與基於重組流感蛋白質的其它疫苗不同，在施用根據本發明的免疫原性組合物一次後，獲得抗流感病毒感染的保護作用。因此，根據本發明的免疫原性組合物比本領域已知的基於重組流感蛋白質的其它免疫原性組合物更有效。
Str印-標籤不可能影響蛋白質融合、結構、摺疊、分泌並且具有低免疫原性。此外， 在溫和條件下可實現含strep-標籤的蛋白質的洗脫。不受理論束縛，據信可能由於可在蛋白質純化過程中使用的溫和條件和從而蛋白質的抗原性的良好保存和免疫應答的更有效的引發，至少一個根據本發明的重組多聚胞外結構域與鏈黴抗生物素蛋白親和標籤的使用的組合導致本發明優於本領域已知的包含流感蛋白質的免疫原性組合物的有利方面。
在本發明的一些實施方案中，三聚化結構域(trimerizationdomain)用於提供三聚重組流感血凝素胞外結構域或其部分。如本文中所用，術語「三聚化結構域」被定義為，介導從3個單體蛋白質或其部分形成三聚體的結構域。適當的三聚化結構域包括但不限於， 來自卩遼菌體T4次要纖維蛋白(fibritin)的三聚化序列和基於酵母GCN4捲曲螺旋蛋白質的人造三聚化結構域(GCM-pII)。在優選實施方案中，由基於GNC4的三聚化結構域提供了重組流感血凝素胞外結構域或其部分的三聚化。所述基於GCN4的三聚化結構域優選包含胺基酸序列MKQIEDKIEEIESKQKKIENEIARIKK。
在本發明的一些實施方案中，將四聚化結構域(tetramerizationdomain)用於提供四聚重組流感神經氨酸酶胞外結構域或其部分。如本文中所用，術語「四聚化結構域」被定義為，介導從4個單體蛋白質或其部分形成四聚體的結構域。適當的四聚化結構域包括但不限於，仙臺病毒磷蛋白四聚化結構域和通過突變從酵母GCN4 二聚化結構域衍生的四聚化結構域(GCM-pLI)。在優選實施方案中，由基於GCN4的四聚化結構域提供重組流感神經氨酸酶胞外結構域或其部分的四聚化。基於GCN4的四聚化結構域優選包含胺基酸序列 MKQIEDKLEEILSKLYHIENELARIKKLLGE。
在一些實施方案中，根據本發明的免疫原性組合物包含佐劑和/或載體或本領域已知的其它賦形劑。「佐劑」在本文中定義為被添加至免疫組合物以增強個體在細胞或體液水平上對特定抗原的免疫應答的物質。適當的佐劑包括但不限於，鋁和鈣鹽例如磷酸鋁、氫氧化鋁、硫酸鋁鉀(明礬)和磷酸鈣、有機佐劑例如角鯊烯、油基佐劑例如完全和不完全弗氏佐劑、RIBI 佐劑系統@(11人3 )、Stimune (Specol) 、Ti terMax 、 Montanides、MF-59、AS 03、QS21、佐劑 65、皂苷、MDP 和 Syntex 佐劑製劑(SAF) 、單磷醯脂質A、Gerbu 佐劑、免疫刺激複合物(ISCOMs)、細胞因子例如幹擾素-、、免疫刺激性核酸序列例如CpG寡核苷酸、脂質體、病毒樣顆粒、表面活性劑例如十六烷基胺、多聚陰離子例如批喃和硫酸葡聚糖。優選佐劑為Stimune(Specol)。用於人的其它優選佐劑為磷酸招或氫氧化鋁、磷酸鈣、ISCOMs、AS03或MF59。
優選佐劑為ISCOMs。ISCOM技術具有優於其它佐劑的幾個有利方面。ISCOMs刺激體液和細胞介導的免疫應答。ISCOMs為高效佐劑，其使得根據本發明的重組多聚胞外結構域或其部分的量能夠進一步減少。優選的ISCOMs為ISCOM Matrix-M0不受理論束縛，在根據本發明的方法或免疫原性組合物中使用ISCOMs，甚至能夠增強本發明的優於本領域已知的包含流感蛋白質的免疫原性組合物的有利方面，例如根據本發明的免疫原性組合物的更低的施用劑量和減少的施用次數。
如本文中所用，「載體」或「支架」被定義為，能夠與本文中定義的免疫原性組合物的任何組分締合(用於所述組分的運輸、至免疫系統的呈遞和/或增強所述免疫原性組合物的免疫原性)的分子例如肽、多肽、蛋白質、蛋白質複合物或化合物。適當的載體或支架包括但不限於，生物學支架例如病毒、細菌、病毒樣顆粒和細菌殘留部分例如細菌壁骨架、 化學支架例如化學連接的鏈黴抗生物素蛋白單位或其衍生物的陣列、生物化學多價接頭、 白喉或破傷風類毒素、鑰孔血藍蛋白(KLH)、血清白蛋白(例如BSA)、血藍蛋白、白蛋白、無毒突變型白喉毒素CRM197、來自腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)的外膜蛋白質複合物(OMPC)、不耐熱的大腸桿菌(Escherichia coli)的B亞基、從曬菌體Qb的重組衣殼蛋白質裝配的病毒樣顆粒和纖維素珠粒。
本發明還提供了包含含有編碼信號序列的核酸序列、編碼流感病毒蛋白質的重組胞外結構域或其部分的核酸序列、編碼三聚化或四聚化序列的核酸序列以及編碼鏈黴抗生物素蛋白親和標籤的核酸序列的表達盒的載體。
根據本發明的載體特別適用於根據本發明的重組多聚胞外結構域或其部分的表達和產生。因此，在優選實施方案中，提供了根據本發明的載體用於製備根據本發明的免疫原性組合物的用途，所述免疫原性組合物用於引發抗流感病毒的免疫應答。還提供了用作疫苗的根據本發明的載體。
如本文中所用，術語「載體」被定義為，能夠將異源核酸序列引入宿主細胞的核酸分子，例如質粒、噬菌體或動物病毒。根據本發明的載體允許由異源核酸序列編碼的蛋白質或其部分在宿主細胞中表達或產生。適合於根據本發明的方法的載體包括但不限於 pCD5 (Pouyani和Seed, 1995)和pCAGGS (Niwa等人，1991)。「宿主細胞」為已被或能夠被核酸分子例如載體轉化的細胞。術語「轉化」在本文中被定義為，外來核酸至受體細胞的引入。受體細胞的轉化可導致所述細胞瞬時表達重組蛋白質，意味著重組蛋白質僅表達一段確定的時期。或者，受體細胞的轉化可導致穩定的表達，意味著核酸被引入細胞的基因組， 從而被傳遞至細胞的下一代。此外，可獲得重組蛋白質的誘導型表達。誘導型表達系統需要允許目標核酸序列的表達的分子的存在或不存在。誘導型表達系統的實例包括但不限於Tet-On和Tet-Off表達系統、激素誘導型基因表達系統例如蛻皮激素誘導型基因表達系統、阿拉伯糖誘導型基因表達系統以及使用包含誘導型金屬硫蛋白啟動子的pMT/BiP載體 (Invitrogen)的果蠅誘導型表達系統。
「信號序列」在本文中被定義為，指導蛋白質或其部分運輸至真核細胞的內質網 (分泌途徑的進入位點)的信號肽。信號序列可位於蛋白質或其部分的N末端或C末端。 信號肽可在蛋白質插入內質網後被切掉。例如，在一個實施方案中，用於在果蜆細胞中表達重組蛋白質的pMT/BiP載體包含BiP信號序列。在另一個實施方案中，用於在哺乳動物細胞中表達重組蛋白的PCD5載體包含信號序列MPMGSLQPLATLYLLGMLVA。
表達盒優選包含允許起始包含在表達盒內的核酸序列的轉錄的啟動子/增強子。 啟動子的實例包括但不限於，用於在植物細胞中表達的RAmy3D和CaMV啟動子、用於在昆蟲細胞中表達的多角體蛋白、plO、IE-0, PCNA, 0plE2、OplEl和肌動蛋白5c啟動子和用於在哺乳動物細胞中表達的肌動蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子、5S RNA啟動子或病毒來源的啟動子例如巨細胞病毒(CMV)、勞斯肉瘤病毒(RSV)和猿猴病毒40 (SV40)啟動子。優選的載體由用於在哺乳動物細胞中表達重組蛋白質的包含CMV啟動子的pCD5表達載體提供。更優選的載體由用於在哺乳動物細胞中表達重組蛋白質的包含CMV增強子/雞β-肌動蛋白(CAG)啟動子的pCAGGS表達載體提供。
意欲用於表達三聚流感血凝素胞外結構域或其部分的根據本發明的表達盒優選從5』至3』包含編碼信號序列的核酸序列；編碼流感血凝素的重組胞外結構域或其部分的核酸序列；編碼三聚化序列，優選基於GCN4的三聚化序列的核酸序列和編碼鏈黴抗生物素蛋白親和標籤的核酸序列。意欲用於表達四聚流感神經氨酸酶胞外結構域或其部分的根據本發明的載體優選從5』至3』包含編碼信號序列的核酸序列；編碼鏈黴抗生物素蛋白親和標籤的核酸序列；編碼四聚化序列，優選基於GCN4的四聚化序列的核酸序列和編碼流感血凝素的重組胞外結構域或其部分的核酸序列。
根據本發明的重組多聚胞外結構域或其部分例如在原核細胞或在真核細胞例如植物細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞或昆蟲細胞中表達。此外，根據本發明的重組多聚胞外結構域或其部分可在植物中表達。原核和真核細胞在本領域是公知的。原核細胞為例如大腸桿菌。植物和/或植物細胞的實例包括但不限於，玉米(細胞)、水稻(細胞)、浮萍(細胞)、菸草(細胞，例如BY-2或NT-I細胞)和馬鈴薯(細胞)。酵母細胞的實例為酵母菌屬(Saccharomyces)酵母和畢赤酵母屬(Pichia)酵母。昆蟲細胞的實例包括但不限於，草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)細胞例如Tn5、SF-9和SF-21細胞，以及果蠅細胞例如果蠅Schne ider 2(S2)細胞。適用於表達根據本發明的重組多聚胞外結構域或其部分的哺乳動物細胞的實例包括但不限於，非洲綠猴腎(Vero)細胞、幼倉鼠腎(例如BHK-21)細胞、人視網膜細胞(例如PerC6細胞)、人胚胎腎細胞(例如HEK293細胞)、Madin Darby Canine腎(MDCK)細胞、雞胚胎成纖維細胞(CEF)、雞胚胎腎細胞(CEK細胞)、胚盤來源的胚胎幹細胞(例如EB14)、小鼠胚胎成纖維細胞(例如3T3細胞)、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、 小鼠骨髓瘤(例如NSO和SP2/0)、鵪鶉肌細胞(QM5)以及此類細胞類型的衍生物。在優選實施方案中，哺乳動物HEK293T細胞或S2昆蟲細胞用於產生根據本發明的重組多聚胞外結構域或其部分。
本發明還提供了用於製備根據本發明的免疫原性組合物的方法，包括提供根據本發明的載體，用所述載體轉化宿主細胞，在培養基中培養所述宿主細胞，從而允許表達融合至鏈黴抗生物素蛋白親和標籤的流感病毒蛋白質的重組多聚胞外結構域或其部分，以及分離所述融合至鏈黴抗生物素蛋白親和標籤的流感病毒蛋白的重組多聚胞外結構域或其部分。
當使用用於在宿主細胞中表達根據本發明的重組多聚胞外結構域或其部分的根據本發明的方法時，優選將所述多聚胞外結構域或其部分分泌入培養基，以及可從所述培養基分離所述多聚胞外結構域或其部分。所述多聚胞外結構域或其部分的分離例如通過離心或過濾培養基以除去細胞和細胞殘留部分來進行，並且純化可使用本領域已知的任何方法例如凝膠電泳或色譜法，例如親和色譜法或高效液相色譜法來進行。在優選實施方案中， 使用融合的鏈黴抗生物素蛋白親和標籤，例如使用具有鏈黴抗生物素蛋白或Strep-Tactin Sepharose (IBAGermany)的純化柱和用於從柱子置換Strep-標籤蛋白的包含生物素或其衍生物或類似物的洗脫緩衝液來純化根據本發明的重組多聚胞外結構域或其部分。
在一些實施方案中，根據本發明的載體來源於動物病毒例如但不限於痘苗病毒 (包括減毒衍生物，例如改良痘苗病毒Ankara，MVA)、新城疫病毒(NDV)、腺病毒或逆轉錄病毒。優選，用作根據本發明的載體的動物病毒是減毒的。此類載體的任一種特別適用於在其中意欲引發免疫原性應答的宿主中表達根據本發明的重組多聚胞外結構域或其部分。動物病毒例如NDV的使用的有利方面為，其可以以低成本和足夠高的量在含胚雞卵中有效生長。在優選實施方案中，在含胚雞卵中繁殖動物病毒後，隨後將分離的病毒用於感染真核細胞。隨後將感染的細胞用於產生根據本發明的重組多聚胞外結構域或其部分。適用於表達根據本發明的重組多聚胞外結構域或其部分的細胞的實例為上述哺乳動物細胞。在另一個優選實施方案中，在例如在含胚雞卵中繁殖動物病毒後，將分離的病毒用於直接感染其中待引發免疫原性應答的宿主的細胞。利用根據本發明的載體感染其中待引發免疫原性應答的宿主的一個有利方面是，施用可以例如通過噴霧至動物上或噴霧至動物上方的空氣中來非常高效地進行。因此本發明還包括包含根據本發明的載體和藥學上可接受的稀釋劑的免疫原性組合物。
用於根據本發明的免疫原性組合物的根據本發明的載體包含表達盒,所述表達盒含有適用於在期望的宿主細胞中起始轉錄的啟動子。用於在禽類宿主中表達至少一個根據本發明的重組多聚胞外結構域或其部分的適當的啟動子的實例包括但不限於，禽類β_肌動蛋白啟動子或雞RNA pol I啟動子。用於在哺乳動物宿主中表達至少一個根據本發明的重組多聚胞外結構域或其部分的適當的啟動子的實例包括但不限於，用於哺乳動物宿主的 β -肌動蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子、5S RNA啟動子或病毒來源的啟動子例如巨細胞病毒(CMV)、勞斯肉瘤病毒(RSV)和猿猴病毒40 (SV40)啟動子。
在一些實施方案中，編碼根據本發明的重組胞外結構域或其部分的核酸序列可以例如通過核酸置換、缺失和/或添加來改變，所述改變使得能夠表達功能上等同於根據本發明的重組多聚胞外結構域或其部分的蛋白質。功能上等同的蛋白質可通過本領域已知的任何方法，例如通過它們誘導個體的抗流感病毒的免疫應答的能力，或在其中測定對抗體的結合的體外測定中來進行鑑定。
在一些實施方案中，將編碼三聚流感血凝素胞外結構域或其部分的核酸序列和/ 或編碼四聚流感神經氨酸酶或其部分的核酸序列插入載體。在另一個實施方案中，將編碼超過一個的三聚流感血凝素胞外結構域或其部分和/或四聚流感神經氨酸酶或其部分或其組合的核酸序列插入載體。在另一個實施方案中，根據本發明的免疫原性組合物包含分離的載體，在每一個所述載體中插入了編碼三聚流感血凝素胞外結構域或其部分，和/或四聚流感神經氨酸酶或其部分的核酸序列。
因此，可將例如2、3、4、5、6、7、8、9或10種編碼三聚血凝素胞外結構域或其部分的核酸序列組合入一個載體，例如編碼 Η1、Η2、Η3、Η4、Η5、Η6、Η7、Η8、Η9、Η10、Hll、Η12、Η13、 Η14、Η15和/或Η16的核酸序列。或者，可將2、3、4、5、6、7、8或9種編碼四聚神經氨酸酶胞外結構域或其部分的核酸序列組合入一個載體，例如編碼NI、Ν2、Ν3、Ν4、Ν5、Ν6、Ν7、Ν8和 /或Ν9的核酸序列。此外，根據本發明的免疫原性組合物可包含一種或多種編碼不同流感亞型的三聚血凝素胞外結構域或其部分的核酸序列和一種或多種編碼不同流感亞型的四聚神經氨酸酶胞外結構域或其部分的核酸序列的組合。例如，可組合1、2、3、4、5、6、7、8、9 或10種編碼三聚血凝素胞外結構域或其部分的核酸序列和1、2、3、4、5、6、7、8或9種編碼四聚神經氨酸酶胞外結構域或其部分的核酸序列，例如Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、 H10、Hll、H12、H13、H14、H15、H16、NI、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8 和 / 或 N9。本領域技術人員清楚，術語「一個或多個胞外結構域」包括來自一種或多種流感病毒亞型例如甲型流感病毒和乙型流感病毒的一個或多個胞外結構域。這樣，根據本發明的免疫原性組合物可包括多價組合物，利用其可獲得抗超過一個流感病毒類型或流感病毒亞型或株的更廣泛的保護作用。此外，與常規滅活的流感病毒疫苗或活的減毒的流感病毒疫苗相比，此類免疫原性組合物對抗原改變較不敏感。
本發明還提供了用於引發個體的抗流感病毒的免疫應答的方法，包括給所述個體施用根據本發明的免疫原性組合物。
在下列實施例中進一步解釋本發明。這些實施例不限制本發明的範圍，而僅用於闡明本發明。


圖I.流感病毒的示意圖。
圖2.重組可溶性三聚H5蛋白的表達、純化和生物學活性。(A)使用的H5表達盒的圖示。符合讀框地克隆在CMV啟動子的控制下的H5胞外結構域編碼序列(H5)與編碼信號肽(SP)、GCN4異亮氨酸拉鏈三聚化基序(GCN4)和Str印-標籤II (ST)的DNA序列。(B)通過SDS-PAGE和蛋白質印跡來分析H5的表達和至培養基中的分泌。使用小鼠抗-Strep-標籤抗體檢測重組蛋白。(C)利用凝膠過濾的純化的重組H5蛋白的分析。顯示了使用Superdex200GL 10-300柱產生的H5蛋白的洗脫圖。232kDa過氧化氫酶對照的洗脫由虛線顯示。(D)在其用於胎球蛋白結合測定之前，用綴合有HRP的針對strep-標籤的小鼠抗體複合重組可溶性H5三聚體。還在用霍亂弧菌(Vibrio Cholera)來源的神經氨酸酶處理胎球蛋白(胎球蛋白+VCNA)之後評估HA結合。
圖3.雞的可溶性血凝素(sHA)接種。利用IOug sHA免疫一組10隻SPF雞2次 (在第O天和第21天)。作為攻擊對照，對一組雞進行模擬處理(PBS)。第2次接種後3周， 利用IO5 TCID5tl的H5NlA/Vietnam/1203/04攻擊所有雞，每天監測其臨床體徵直至p. i.第 14天。A)Kaplan-Meier存活曲線,顯示每一個組的每一天的百分比死亡率。B)在第一次免疫後3周(第21天)，第二次接種後3周(第42天)和攻擊後2周(第56天)收集血液樣品。對每一隻雞的血清中的HI抗體滴度作圖。條塊表示每一組的幾何平均值。虛線顯示與該實驗中的保護作用相關的最低抗體水平。
圖4.雞的s HA接種。以3周的間隔利用10、2或O. 4 μ g sHAi. m.免疫7組WHL 雞(每組10隻)1或2次。作為攻擊對照，對一組進行模擬處理(PBS)。接種後4周，利用IO5TCID5tl的A/Vietnam/1203/04攻擊所有雞，在14天的過程中每天監測其臨床體徵。 Kaplan-Meier存活曲線顯示被接種一次(A)或二次(B)的每一個組的每一天的百分比死亡率。
圖5. 2009A(HlNl)流感病毒的純化的可溶性多聚HA(sHA)和NA(sNA)蛋白的表達和分析。A)重組表達的sHA和sNA亞基的圖示。sHA:HA胞外結構域(a. a. 17-522)與 N末端⑶5信號序列和C末端三聚(GCN4-pII)GCN4結構域和strep-標籤(ST) —起表達。 sNA:NA頭部結構域(a. a. 75-469)與N末端CD5信號序列、OneSTrEP(OS)和四聚(GCN4-pLI)GCN4結構域一起表達。⑶親和純化的sHA和sNA蛋白的考馬斯藍染色的還原性SDS-PAGE。 (C)純化的 sHA 和 sNA 蛋白分別在 Superdex 200 16/600 和 Superdex 200 10/300 柱上的凝膠過濾層析。虛線顯示校準標準(calibration standard)(鐵蛋白，440kDa;過氧化氫酶，232kDa)的偏移。主峰的表觀分子量為288kDa (對於sHA)和291kDa (對於sNA)，分別與sHA和sNA的三聚和四聚寡聚狀態相關。
圖6.接種後白鼬的針對2009A(H1N1)流感病毒的抗體的誘導。在第O天和第 21 天接受使用 3.75yg HA+3. 75 μ g NA,3. 75 μ g HA 和佐劑(Iscoms Matrix M;[IMM])、3.75 μ g NA+IMM、3. 75 μ g HA+3. 75 μ g NA+IMM、PBS 或 IMM 的免疫的白鼬的血清的(A)血細胞凝集抑制滴度(HI)、(B)神經氨酸酶抑制滴度(NI)和(C)病毒中和滴度(VN)，如所指示的。顯示了幾何平均滴度；誤差棒表示SD。顯示了統計上顯著的差異*，P〈0.05。
圖7.用2009A (HlNl)流感病毒接種的白鼬的動物體重和肺病理學。利用3. 75 μ g HA+3. 75 μ g NA,3. 75 μ g HA 和佐劑(Iscoms MatrixM; [IMM])、3· 75 μ g ΝΑ+ΙΜΜ、3· 75 μ g ΗΑ+3. 75 μ g NA+IMM、PBS或I麗(如所指示的)免疫6組白鼬(每組6隻)兩次。在第56 天用IO6TCID5tl的病毒鼻內接種動物。(A)接種的動物的體重減輕顯示為感染前體重(100%) 的百分比。(B)肺重量顯示為體重的百分比，作為肺實變的指標。(C)肉眼觀察肺，給顯示壞死性損傷的肺面積百分比評分。顯示了幾何平均滴度；誤差棒表示SD。顯示了統計上顯著的差異*，Ρ〈0· 05;**，Ρ〈0· 01。
圖8.接種的白鼬的肺、鼻和咽喉中2009Α(Η1Ν1)流感病毒的脫落。⑷在用 2009Α(HlNl)流感病毒感染後4天，在用3.75 μ g HA+3. 75 μ g NA,3. 75 μ g HA和佐劑 (Iscoms Matrix M; [IMM]) ,3. 75 μ g ΝΑ+ΙΜΜ、3· 75 μ g HA+3. 75 μ g NA+IMM、PBS 或 IMM(如所指示的)免疫的白鼬中的肺病毒滴度。(B和C)病毒從接種的動物的鼻和咽喉脫落。在接種後第4天收集拭子。通過MDCK細胞的終點滴定測定病毒滴度。給出了幾何平均滴度； 誤差棒顯示標準差。顯示了統計上顯著的差異***，P〈0. 001。
圖9.在用2009A (HlNl)流感病毒的sHA和sNA接種後白鼬的交叉中和抗體的誘導。㈧在血凝素抑制(HI)測定中測試接受sHA或sHA+sNA和佐劑(Iscorns Matrix Μ; [IMM])的雙免疫的白鼬的血清的針對不同流感病毒分離株(包括A/ Swi ne/shope/1/56、A/Italy/1443/76、A/NL/386/86、A/Iowa/15/30、A/NL/25/80、A/ NewYersey/8/76、A/PR/8/34和IVR/148流感HlNl病毒)的HI抗體。顯示了幾何平均滴度；誤差棒表示SD。(B)匯集接受sNA或sHA+sNA和佐劑的單或雙免疫的白鼬的血清，在神經氨酸酶抑制(NI)測定中測試所述血清的針對A/Kentucky/UR06-0258/2007 (HlNl)和A/ turkey/Turkey/1/2005 (H5N1)流感病毒的 NA 的 NI 抗體。將 A/California/04/2009 (HlNl) 的 NA 用作陽性對照。特異於 A/NL/602/09 (HlNl)或 A/turkey/Turkey/1/2005 (H5N1)流感病毒的陽性對照血清獲自用此類病毒感染的白鼬。顯示了兩次重複的平均滴度；誤差棒表示SD0
圖10. A.流感病毒A/California/04/2009 (HlNl)的血凝素(HA)胞外結構域 (a. a. 17-522)。B.流感病毒A/California/04/2009 (HlNl)的神經氨酸酶(NA)頭部結構域 (a. a. 75-469)。
圖ll.rNDV-HA載體病毒的產生和HA和sH53的表達。A)編碼流感HA蛋白的 PFL-HertsAPBC構建體的圖示。通過定點誘變引入XbaI和PmeI限制性位點以使得能夠插入含有NDV末端-起始轉錄信號的接頭。將編碼未修飾的H5 HA基因或可溶性sH53蛋白(後者由融合至三聚化序列GCN4的H5HA胞外結構域組成)的基因各自插入接頭序列的下遊。B) HA在QM5細胞單層中的表達。模擬感染或用wt NDV Herts (顯示為wt NDV)、 rNDV-H5HA或rNDV_sH53 (分別顯示為NDV-H5和NDV_sH53)感染細胞，並使用特異性抗體針對HA和F蛋白對細胞進行染色。C)由rNDV-sH53-感染的細胞產生和分泌sH53。在胰蛋白酶不存在的情況下以3的MOI用rNDV-sH53感染QM5細胞，在接種後2天收穫上清液。使用 Strep-tactin瓊脂糖珠粒從上清液純化sH53蛋白。將純化產物經歷SDS-PAGE電泳，利用 Blue染色劑對蛋白質進行染色。平行地運行在HEK 293S細胞中表達的sH53蛋白和一系列 BSA稀釋物。D)從rNDV-sH53-感染的QM5細胞回收的sH53表達產物的Blue非變性PAGE 分析。顯示了在電泳之前加熱樣品之後觀察到的HA蛋白的三聚體和單體形式在凝膠中的位置。
圖12.用NDV-H53接種雞後的保護。A. Kaplan-Meier存活曲線顯示肌內(i. m.) 接種的雞的存活率(%)。B.攻擊後觀察到的基於臨床體徵計算的臨床指數(如材料和方法中描述的)。
圖13.用NDV-H53接種雞後的血清學應答。在通過i. m.途徑接種後第21天收集的血清樣品中測量的抗流感(A)和NDV Herts (B)的血細胞凝集抑制(HI)抗體滴度。滴度表示為，顯示HI的最高血清稀釋度的倒數。虛線表示檢測的下限。低於檢測限的滴度被賦予2或4的值。每一個圓圈代表，每一隻雞的一次HI測量(對於抗禽流感(Al)的HI抗體的檢測)和每一隻雞的2次測量(在NDV HI抗體檢測的情況下)。水平線表示每組的幾何平均滴度。實施例
實施例I
材料和方法
基因和表達載體
基於H3編號，由GenScript USA Inc.使用人優選密碼子合成編碼相應於來自A/ Viet Nam/1203/2004 (H5N1)的 HA (Genbank 登錄號 ABW90137. I)的殘基 18 至 523 的胺基酸殘基的cDNA克隆。將編碼HA胞外結構域的cDNA克隆入pCD5表達載體以在哺乳動物細胞中高效表達(Zeng等人，2008)。已修飾了 p⑶5載體，以便符合讀框地克隆編碼HA的cDNA 與編碼信號序列、GCN4異亮氨酸拉鏈三聚化基序(ELIKRMKQIEDKIEEIESKQKKIENEIARIKKIK LVPRGSLE ； (Pancera 等人，2005)和 Str印-標籤 II (WSHPQFEK; IBA, Germany)的 DNA 序列。
蛋白質表達和純化。以1:5的比率(μ g PEI: μ g DNA)使用聚乙烯亞胺(PEI)將包含編碼HA胞外結構域的序列的P⑶5表達載體轉染入HEK293S GnTI (-)細胞(Reeve s等人，1999)。在轉染後6小時,用補充有碳酸氫鈉(3. 7g/升)、葡萄糖(2. Og/升)>Primatone RL-UF (3. Og/ 升,Kerry Bio-Science, Zwi jndrecht, The Netherlands)、青黴素(100 單位 /ml)、鏈黴素(100 μ g/ml)、glutaMAX(Gibco)和 I, 5%DMS0 的 293SFM II 表達培養基 (Invitrogen)替代轉染混合物。在轉染後5_6天收穫組織培養上清液。通過十二燒基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE),然後使用小鼠抗-Strep-標籤抗體(IBA, Germany) 的蛋白質印跡來確認HA蛋白質的表達和分泌。按照製造商的說明書(IBA, Germany)使用Strep-tactin瓊脂糖珠粒純化分泌的HA蛋白質。按照製造商的說明書，使用Nanodrop 1000分光光度計(IsogenLife Sciences)測定純化的蛋白質的濃度。
重組HA的生物學表徵。使用 Superdex200GL 10-300 柱(U-ProteinExpress),通過分析洗脫圖測定HA蛋白的寡聚狀態。使用胎球蛋白固相測定(Lambre等人，1991)評估可溶性HA三聚體(sHA3)的功能性。將I μ g/ml胎球蛋白/孔用於包被96孔nunc maxisorp 板。如圖例中顯示的，用霍亂弧菌來源的神經氨酸酶(VCNA)處理胎球蛋白，然後進行充分的洗滌步驟。在於胎球蛋白包被的板上溫育有限稀釋物(60分鐘，室溫[RT])之前，sHA3用辣根過氧化物酶(HRP)連接的抗-Str印-標籤抗體(2:1的摩爾比)在0°C下預複合30分鐘。隨後使用四甲基聯苯胺底物(BioFX)在ELISA讀數器(EL-808 [BioTEK])中檢測HA-結合，讀取450nm處的0D。
在雞中講行的梓種_攻擊實齡
使用6周齡的SPF白色來亨雞(Lohmann)。將雞在Bsl_3條件下關養在空調室中。在第一個實驗中，通過肌內注射(O. 5mL)以Stimune (ID-Lelystad, Lelystad, The Netherlands)為佐劑的10 μ g sHA3來免疫一組10隻雞2次(在第O天和第21天)。作為攻擊對照，一組10隻雞接受等體積的在Stimune中的PBS(模擬接種)。接種後3周，通過用 IO5 TCID50 的 A/Vietnam/1194/04 病毒(O. Iml，鼻內(i. η.)和 O. Iml，氣管內(i. t.), UniProt Taxonomy ID:284217)感染來攻擊雞，並在14天的時期中監測雞的疾病徵兆。在每一次免疫後3周(第21天和第42天)和在感染後(p. i.) 14天收集血液樣品。在感染後第2、4和7天從每一隻雞獲取氣管和洩殖腔拭子。
在下一個實驗中，使用購自當地育種者的總共70隻一天齡蛋雞(白色來亨雞)。 按照農場慣例在I天齡時針對NDV (新城疫病毒)和IBV (感染性支氣管炎病毒)接種雞。 在6周齡時，將雞運至生物安全水平(Bsl-) 3設施，然後分配至7個實驗組，每組10隻雞。 通過在第21天單次肌內注射10、2或O. 4μ g sHA3抗原或以相同劑量肌內注射2次(在第 O天和第21天)而免疫6個組。作為攻擊對照，利用在Stimune中的PBS模擬接種(在第 O天和第21天)一組10隻雞。接種後4周(第49天)，如上攻擊雞，並在14天的時間過程中每天觀察雞的臨床體徵。在接種之前，在第一次(第21天)和第二次(第49天)接種之後以及在感染後第14天採集血液樣品。在如上所述的相同日期內採集氣管和洩殖腔拭樣。
病毒檢測測定
將氣管和洩殖腔拭子忙存在冷胰蛋白□肉湯培養基(tryptosebroth medium)中。 通過低速離心澄清培養基，收穫上清液，將其等分並且於-70°C下貯存。在冷凍-解凍後，將在同一天從相同雞採集的氣管和洩殖腔拭子樣品混合。提取RNA，使用針對Ml基因(編碼流感病毒基質蛋白質)的定量RT-PCR測定法(Taq Man PCR)測定病毒RNA的存在。首先， 使用引物 5』 -CACTGGGCACGGTGAGC-3』 合成 cDNA，隨後在 TaqMan 螢光探針 5』 -6FAM-TCAGGCC CCCTCAAAGCCGA-X-ph 存在的情況下，通過使用引物 5』 -CTTCTAACCGAGGTCGAAACGTA-3』 作為反向引物進行45個循環的Light Cycler PCR來擴增Ml基因的部分。平行地測試陰性和陽性對照樣品。檢測的下限經測定為約500 TCID500 一些樣品給出不確定的結果，這意味著它們在超過31個循環後僅給出極弱的信號(螢光〈O. 07)。
血細胞凝集抑制測定
按照標準方法，利用1%的雞紅細胞和4HAU (血凝單位)的A/Vietnam/1194/04測試來自雞血樣品的熱滅活的免疫血清的HI活性。紅色扣狀體(button)的形成被評定為血細胞凝集的證據。抗體滴度表示為顯示HI的最高血清稀釋度的倒數。結果H5三聚體的表達、純化和表徵為了在哺乳動物細胞中表達可溶性三聚HA胞外結構域(sHA3)，首先將編碼H5胞外結構域的序列克隆入適當的表達載體。在使用的PCD5載體中，HA序列之前為信號肽編碼序列(以允許重組蛋白質高效分泌)，之後為編碼GCN4異亮氨酸-拉鏈三聚化基序的序列(Pancera等人，2005)和Strep-標籤II (圖2A)。通過將表達質粒瞬時轉染入HEK細胞來實現HA胞外結構域的表達。通過將細胞培養物上清液經歷凝膠電泳，然後使用針對Strep-標籤II的抗體的蛋白質印跡來驗證HA蛋白的表達和分泌(圖2B)。結果顯示,可在用表達質粒轉染細胞後而非在模擬轉染後在細胞培養物上清液中容易地檢測到重組HA蛋白。通過使用Strep-tactin瓊脂糖珠粒在單步驟方案中純化分泌的HA蛋白。蛋白質產率為O. 4-lmg重組蛋白每IOOml細胞培養基。在從細胞培養物上清液純化H5蛋白後，利用Superdex200凝膠過濾柱層析分析H5蛋白的寡聚狀態(圖2C)。大部分HA蛋白以寡聚體(推定地三聚體)的速率洗脫，而僅少量級分在外水體積(void volume)中被發現為聚集體。使用藍-非變性凝膠電泳確認H5寡聚體的三聚體性質。利用唾液酸化的(sialidated)血液糖蛋白胎球蛋白，使用固相結合測定研究純化的H5蛋白的生物學活性。利用綴合有HRP的抗-Str印-標籤II抗體測量HA的結合，如材料和方法部分中詳述的。H5製劑顯示了對胎球蛋白的濃度依賴性結合。該結合為唾液酸依賴性的，因為當用VCNA處理胎球蛋白時，未觀察到結合(圖2D)。綜上所述，生物學活性、可溶性三聚H5在哺乳動物細胞中高效地產生，並且易於純化。sHAa疫苗在雞中抗致死H5N1感染的功效為了評估sHA3在雞中的保護性功效，用10 μ g以Stimune為佐劑的sHA3肌內(i.m.)接種10隻雞兩次(第O天和第21天)，並且3周後，通過鼻內(i.n.)/氣管內(i. t.)接種致死劑量的H5N1A/Vietnam/1194/04病毒進行攻擊。此外，對10隻雞進行模擬接種以用作攻擊對照。如圖3中所顯示的，利用IOug sHA3的接種能夠產生完全的保護作用。沒有一隻接種的雞死亡或顯示指示流感相關疾病的症狀，而所有模擬接種的雞在2天內死亡。血液樣品的血清學分析顯示，所有模擬接種的雞具有低於檢測限的滴度。HI抗體滴度在sHA3加強後增加至最大1024。在加強後觀察到的最低HI滴度為64，該滴度顯然足以保護動物免受致死攻擊。有趣地，50%的雞在第一次接種後3周已產生了等於64或更高的HI抗體滴度。這些結果激勵我們評估賦予保護作用所需的最小sHA3劑量，和檢查利用sHA3的單次劑量是否也可具有保護性。在第二個接種-攻擊實驗中，利用10、2或O. 4ug sHA3接種雞2次或通過單次注射來接種雞，並且如上所述，在4周後通過感染致死劑量的A/Vietnam/1194/04來攻擊雞。利用O. 4ug劑量的sHA3的加強接種足以保護90%的雞免受死亡，然而當施用2或10 μ g的加強接種時，所有雞都存活(圖4B)。此外，結果顯示，利用sHA3的單次接種足以保護雞免受致死感染；當給予2 μ g的劑量時，僅一隻雞死亡，而10 μ g的劑量對於所有雞都具有保護性。甚至Ojyg的單次劑量也能夠保護60%的雞免於死亡。所有接受模擬疫苗(PBS)的雞在2天內死亡。我們還分析，利用sHA3的接種是否減少或阻止病毒脫落。為此目的，在感染後第2、4和7天從來自圖4顯示的實驗的已接種並且被攻擊的雞獲得氣管和洩殖腔拭子。將在同一天從相同雞取樣的氣管和洩殖腔拭子混合在一起，通過使用檢測Ml基因的定量RT PCR測定法來分析病毒RNA在混合的拭子中的存在。結果示於表I中。在接受利用HA抗原的加強接種的雞中，僅2隻雞(兩者均接受最少量的抗原)被測試為陽性。未在任何其它雞中觀察到病毒脫落，雖然3個拭子給出不確定的結果。同樣地，當雞僅接受一次接種時，顯示大部分雞都不脫落任何病毒。在接種IOyg sHA3後，在感染後第4天和第7天沒有一隻雞脫落病毒。結果顯示，病毒脫落的不存在與雞被保護免受HPAIH5N1的致死攻擊相關。
權利要求
1.一種免疫原性組合物，其包含至少一種融合至鏈黴抗生物素蛋白親和標籤的流感病毒蛋白的重組多聚胞外結構域或其部分，和藥學上可接受的稀釋劑。
2.權利要求I的免疫原性組合物，其中所述流感病毒蛋白的重組多聚胞外結構域或其部分選自重組三聚流感血凝素胞外結構域或其部分和重組四聚流感神經氨酸酶胞外結構域或其部分。
3.權利要求2的免疫原性組合物，其中重組流感血凝素胞外結構域或其部分的三聚化由基於GCN4的三聚化結構域提供。
4.權利要求2的免疫原性組合物，其中重組流感神經氨酸酶胞外結構域或其部分的四聚化由基於GCN4的四聚化結構域提供。
5.權利要求1-4中任一項的免疫原性組合物，還包含載體和/或佐劑。
6.一種包含表達盒的載體，所述表達盒包含a)編碼信號序列的核酸序列；b)編碼流感病毒蛋白的重組胞外結構域或其部分的核酸序列；c)編碼三聚化或四聚化序列的核酸序列，和；d)編碼鏈黴抗生物素蛋白親和標籤的核酸序列。
7.一種免疫原性組合物，其包含權利要求6的載體和藥學上可接受的稀釋劑。
8.權利要求7的免疫原性組合物，其中所述載體為病毒載體，例如新城疫病毒衍生的載體。
9.權利要求1_5、7和8中任一項的免疫原性組合物，其用作疫苗。
10.權利要求6的載體在製備用於引發針對流感病毒的免疫應答的免疫原性組合物中的用途。
11.一種用於製備權利要求1-5中任一項的免疫原性組合物的方法，包括a)提供權利要求6的載體；b)用所述表達載體轉化宿主細胞；c)在培養基中培養所述宿主細胞，由此允許表達融合至鏈黴抗生物素蛋白親和標籤的流感病毒蛋白的重組多聚胞外結構域或其部分；d)分離所述融合至鏈黴抗生物素蛋白親和標籤的流感病毒蛋白的重組多聚胞外結構域或其部分，從而製備免疫原性組合物。
12.權利要求11的方法，其中使用所述鏈黴抗生物素蛋白親和標籤來分離所述融合至鏈黴抗生物素蛋白親和標籤的流感病毒蛋白的重組多聚胞外結構域或其部分。
13.一種用於引發個體的抗流感病毒的免疫應答的方法，包括給所述個體施用權利要求1-5中任一項的免疫原性組合物。
14.權利要求13的方法，其中所述個體為哺乳動物或鳥類。
全文摘要
本發明涉及免疫原性組合物，其包含融合至鏈黴抗生物素蛋白親和標籤的重組多聚流感蛋白或其部分，優選重組三聚流感病毒血凝素和/或重組四聚流感病毒神經氨酸酶，或包含編碼此類流感蛋白的核酸序列的載體。本發明還涉及用於製備此類免疫原性組合物的方法及其用途，以及用於引發個體的免疫應答的方法。
文檔編號C07K14/11GK102939102SQ201180025123
公開日2013年2月20日 申請日期2011年4月8日 優先權日2010年4月9日
發明者P·J·M·羅特爾, B·J·博世, C·A·M·德漢 申請人:烏得勒支大學控股有限責任公司