作為診斷方法的igfbp-4片段檢測的製作方法

2023-10-17 01:40:59 2

專利名稱：作為診斷方法的igfbp-4片段檢測的製作方法
技術領域：
本發明描述了一種用於診斷人疾病，包括心血管疾病和癌症疾病的方法，其包括檢測患者血液中的IGFBP-4(胰島素樣生長因子結合蛋白-4)片段。本發明提供了對IGFBP-4的源自其被特定蛋白酶PAPP-A切割後的IGFBP-4分子的蛋白水解片段(N和C端兩者)特異性的抗體及抗體表位。識別這些特定表位的抗體僅對IGFBP-4片段是特異性的，並且與完整的全長IGFBP-4分子沒有或者具有較低的交叉反應。可以使用抗體來開發用於定量或定性檢測人血液中的IGFBP-4片段的免疫測定法。
背景技術：
胰島素樣生長因子I (IGF-I)和胰島素樣生長因子II (IGF-II)(先前稱為生長調節素)在結構上與胰島素相關，並且是人血漿中循環的兩種最豐富的多肽生長因子(1)。 IGF是負責正常組織生長和再生的多能生長因子。另外，已經提示了 IGF通過其葡萄糖降低和胰島素致敏作用而對葡萄糖穩態具有有益的影響。然而，認為不是所有IGF效應都是有利的；如此，流行病學研究提示了 IGF-I和IGF-II還牽涉常見的癌症、動脈粥樣硬化和2 型糖尿病的形成O)。IGF是由許多細胞類型，包括平滑肌細胞和巨噬細胞分泌的。IGF的細胞效應是由膜結合性高親和力受體介導的。IGF受體是兩種獨特類型的，並且是由極其多種細胞表達的。IGF是有力的平滑肌細胞促細胞分裂劑，而且提示了這些多肽通過旁分泌、自分泌或內分泌機制促成動脈粥樣硬化損傷的形成(3)。在血漿和其它生物學流體中，IGF與來自稱作IGF結合蛋白(IGFBP)的結構相關蛋白質家族的蛋白質複合。IGFBP結合約99%的循環IGF集合。此蛋白質家族包括至少六種 IGFBP0 IGFBP與IGF受體不同。認為IGFBP調控IGF在不同組織，包括骨中的效應(4)。IGFBP-4最初以25kDa蛋白質從人骨細胞條件化培養基純化。後來，還從自多種細胞類型收集的條件化培養基純化出IGFBP-4，並且在多種細胞類型中揭示了 IGFBP-4的表達(5，6)。自人胎盤和骨肉瘤互補DNA(cDNA)文庫推導人IGFBP-4蛋白的一級結構(7，8)。 人IGFBP-4的cDNA編碼258個殘基的蛋白質，其通過除去信號序列而加工成具有單一天冬醯胺連接的糖基化位點的237個殘基的成熟蛋白質6kDa) (7)。雖然培養時的多種細胞類型分泌IGFBP-4的糖基化和非糖基化04_25kDa)形式兩者，但是非糖基化通常是正常人血液中最豐富的(5，6)。IGFBP-4在6種IGFBP間的獨特之處在於在可變L域中具有兩個額外的半胱氨酸殘基。IGFBP-4的這些獨特特性可以負責IGFBP-4的與眾不同的生物學功能(13)。成年人血清中的IGFBP-4的均值水平高於IGFBP-I、IGFBP_2、和IGFBP-6的水平； 與IGFBP-5的水平相似；並且小於IGFBP-3水平。血清IGFBP-4隨年齡而升高的趨勢與對 IGFBP-I和IGFBP-2報告的趨勢相似，但是與IGFBP-3和IGFBP-5水平隨年齡下降不同，提示了在人血清中，不同IGFBP的水平隨年齡增加而差別地受到調節(12)。雖然血清IGFBP-4的精確功能性作用不完全清楚，但是體外研究已經顯示了， IGFBP-4抑制骨細胞和其它細胞類型中的IGF活性。Mohan等(9，10)表明IGFBP-4抑制IGF-I和IGF-II兩者誘導的雞胚顱蓋細胞和MC3T3-E1小鼠成骨細胞的細胞增殖。IGFBP-4 抑制多種細胞類型中的IGF-I和IGF-II刺激的DNA合成(6)。IGFBP-4合成可以通過系統激素和局部生長因子在轉錄或翻譯後水平調節(11)。 體外研究揭示了，甲狀旁腺素、1，25_ 二羥基維生素D、IGF-I、IGF-II、轉化生長因子-beta、 和成骨蛋白-1/骨形態生成蛋白-7是人骨細胞中的IGFBP-4生成的主要調節物(8，9)。特定的蛋白酶解是IGFBP-4功能的一種主要的調節機制。在由人和綿羊皮膚成纖維細胞兩者條件化的培養基中第一次報告了 IGF依賴性IGFBP-4特異性蛋白酶。此蛋白酶後來鑑定為妊娠相關血漿蛋白-A (PAPP-A)。還在來自培養的人成骨細胞、血管平滑肌細胞、 顆粒細胞、滋養層和脫落性子宮內膜基質細胞的條件化培養基中以及在卵巢濾泡液和人妊娠血清中檢出相同的蛋白水解活性(13)。在1974年，自人妊娠血清以與嗜曙紅細胞主要鹼性蛋白的原形式(proform) (proMBP)的四聚體複合物第一次分離PAPP-A。揭示了 PAPP-A屬於大的Metzincin金屬蛋白酶家族。顯示了重組PAPP-A是一種能夠在M135/K136(使用單字母胺基酸殘基代碼)間的單一位點切割IGFBP-4的活性蛋白酶。PAPP-A的IGFBP-4切割僅僅在IGFBP與IGF複合時的情況中是可能的。PAPP-A還在S143/K144間切割IGFBP-5，但是在此情況中，不需要 IGF的存在。在Bayes-Genis等(16)的研究後，妊娠相關血漿蛋白A第一次被提示為動脈粥樣硬化斑塊不穩定性的生物學標誌物。這些作者已經表明不穩定性斑塊的胞外基質中的高水平PAPP-A。數項研究已經顯示了急性冠狀動脈症候群(ACQ患者血液中的PAPP-A濃度比在穩定性冠狀動脈疾病患者或對照受試者的血液中高。如此，PAPP-A提示為與冠狀動脈血液凝結有關的心血管疾病，諸如不穩定性咽峽炎和心肌梗死的標誌物。假設在動脈粥樣硬化斑塊中，由活化的平滑肌細胞表達的PAPP-A可以發揮切割與IGF複合的IGFBP-4，如此增強IGF生物利用度的活性酶的功能。IGF系統可以促成動脈粥樣硬化斑塊形成、脫穩定化、和導致急性冠狀動脈事件的破裂(17)。顯示了 IGFBP-4是由腫瘤起源，諸如肺腺癌、非小細胞肺癌、乳腺癌、結腸癌、濾泡性甲狀腺癌、胃癌、膠質瘤、肝細胞瘤、骨髓瘤、成神經細胞瘤、骨肉瘤和前列腺癌的不同細胞表達。體外和體內研究提示了 IGFBP-4可能通過抑制自分泌IGF作用在多種腫瘤的生長調節中起重要的作用。IGF生物利用度的調節在腫瘤生長和形成中可以發揮至關重要的作用(13)。似乎提示PAPP-A濃度的血漿測量的可獲得證據對於辨別不穩定性動脈粥樣硬化斑塊患者及用於鑑定癌症患者可以是有價值的。然而，現在已經證實精確的PAPP-A血漿測量不是容易的任務。首先，這是由於如下的實情，即此蛋白質在患者血漿中存在著極低的水平。還顯示了肝素注射也可以影響患者血漿中的PAPP-A水平(18)。我們已經提示了，PAPP-A酶活性產物的測量可以比直接的PAPP-A測量具有更高的臨床價值，因為此類產物應當在血液中以比PAPP-A更高的濃度呈現，並且其在血液中的濃度應當不受肝素注射影響。本發明致力於利用IGFBP-4片段作為身體中升高的PAPP-A活性的標誌物，並且因此作為與升高的PAPP-A濃度和活性有關的不同疾病的標誌物。不管患者樣品中是否存在完整的IGFBP-4，為了特異性測量IGFBP-4的蛋白水解片段而設計的免疫測定法對於診斷或預測多種病理學，包括ACS和癌症可以具有實踐價值。發明_既述本發明涉及人病理學，包括心血管疾病和癌症的新的血液標誌物，即IGFBP-4的蛋白水解片段的發現。在我們的研究中，我們已經顯示了動脈粥樣硬化斑塊中表達的PAPP-A是一種活性蛋白酶。將來自動脈粥樣硬化血管的PAPP-A純化至同質性，並且顯示了其能夠在存在 IGF-II的情況中有效切割IGFBP-4。PAPP-A在胺基酸殘基M135與K136間切割IGFBP-4， 產生兩個IGFBP-4片段，BP"N端片段」(包含完整的IGFBP-4分子的N端至M135的胺基酸殘基)和「C端片段」(包含完整的IGFBP-4分子的K136至C端的胺基酸殘基)。獲得對IGFBP-4蛋白水解片段特異性的且沒有展現與全長分子的交叉反應性或展現出低的與全長分子的交叉反應性的單克隆抗體。這些單抗能夠僅識別通過PAPP-A在胺基酸殘基M135與K136間對IGFBP-4切割生成的新表位，並且沒有或者具有低的與完整的(完全大小的)IGFBP-4分子的交叉反應。特別地，本發明的抗體以比它們識別全長 IGFBP-4高的親和力特異性識別通過酶依賴性IGFBP-4切割起源的新表位。使用與識別完整的IGFBP-4的另一種抗體配對的這些片段特異性抗體之一，設計數種三明治式免疫測定法。這些測定法適合於IGFBP-4片段量化，而不管樣品中是否存在全長 IGFBP-4 (圖 2B)。免疫測定法適用於測量ACS患者和健康供體血液中的IGFBP-4的這兩種蛋白水解片段。顯示了 IGFBP-4蛋白水解片段的水平在ACS患者的血液中比在健康供體的血液中顯著更高。ACS患者的血漿中的IGFBP-4片段的均值水平比在健康供體的血漿中高3. 2倍(ρ < 0. 0005)(圖3)。基於這些觀察結果，我們已經提示了可以使用IGFBP-4的這兩種蛋白水解片段作為動脈粥樣硬化斑塊脫穩定化和破裂的標誌物。如此，在本發明中，我們描述了 IGFBP-4的片段作為人病理學，包括心血管疾病的新標誌物；使用患者血液中的IGFBP-4片段測量來預後和診斷ACS的方法。附圖簡述

圖1 :IGFBP_4的蛋白水解片段的Western印跡檢測，其表明自動脈粥樣硬化組織純化的PAPP-A的蛋白酶活性。通過以下處理IGFBP-4 (每道200ng)第1 道，重組 PAPP-A ； 第2道，動脈粥樣硬化組織PAPP-A ；第3 道，沒有 PAPP-A ；第4道，分子量標誌物；以kDa顯示。使用兔抗-IGFBP-4多克隆抗體來免疫染色。圖2A =ELISA中的IGFBP-4片段特異性單抗測試將IOng全長重組IGFBP-4或通過PAPP-A依賴性切割生成的IGFBP-4片段在聚苯乙烯板上吸附。清洗後，在30分鐘期間在搖動的情況中將片段特異性單抗IBP3、IBP12、 IBP27、IBP13和IBP28(10微克/ml)在孔中溫育。通過與辣根過氧化物酶(底物TMB)綴合的抗小鼠IgG多克隆抗體檢測特異性結合的抗體。圖2B 對IGFBP-4片段特異性的三明治式免疫測定法。
免疫測定法捕捉單抗IBP513、IBP521(200ng/ 孔)。檢測單抗用穩定的Eu3+螯合物標記的IBP12、IBP27、和IBP30 (1微克/ml)。抗原100ng/ml全長重組IGFBP-4或通過PAPP-A依賴性切割生成的IGFBP-4片段。溫育體積0.1ml。溫育時間於室溫30分鐘。CPS 每秒的計數；AW450nm) :450nm的吸光度單位。圖3 人血漿中的IGFBP-4片段檢測免疫測定法捕捉單抗IBP521(2OOng/ 孔)。檢測單抗通過穩定的Eu (3+)螯合物標記的IBP30 (1微克/ml)。MAB IBP521識別完全大小的IGFBP-4及通過PAPP-A介導的蛋白酶解生成的其C 端片段MAb IBP30僅特異性識別IGFBP-4的C端片段，並且不識別完全大小的IGFBP-4。溫育體積0. Iml0溫育時間於室溫30分鐘。CPS 每秒的計數。發明詳述本發明描述了 IGFBP-4的N和C端蛋白水解片段作為生物標誌，與健康供體血漿相比，所述生物標誌在ACS或一些癌症患者的血漿樣品中以顯著更高的水平呈現。可以使用IGFBP-4片段的免疫測定法來早期檢測ACS或癌症，或者來測定疾病形成風險的程度。遵循標準的方案來開發對IGFBP-4肽以及完整的IGFBP-4特異性的單克隆抗體。 用於動物免疫以獲得IGFBP-4片段特異性的單克隆抗體的合成肽對應於PAPP-A依賴性切割位點處的IGFBP-4蛋白水解片段。合成肽含有出於偶聯目的的額外的末端半胱氨酸(與假定的蛋白水解位點相反)。通過質譜術分析來確認序列，並將肽與載體蛋白綴合。使用所得的綴合物作為抗原以進行小鼠免疫。依照本領域技術人員已知的標準技術(19-22)來製備肽結合單克隆抗體。數輪動物免疫後，將小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞系的細胞融合。此類方案還包括對形成的雜交瘤克隆篩選生成的抗體期望的特異性的階段。為了獲得本發明的抗體，雜交瘤克隆篩選為對與 IGFBP-4蛋白水解片段對應的IGFBP-4肽特異性結合，且同時不與完整的IGFBP-4起反應。 此方法使得能夠找出生成對IGFBP-4的新表位特異性的單克隆抗體的數個雜交瘤克隆，所述新表位在對蛋白質的PAPP-A依賴性切割過程中形成(圖2A)。在進行的實驗中，選擇一組如下的單克隆抗體，其對通過PAPP-A依賴性切割生成的IGFBP-4的蛋白水解片段特異，並且具有小於5%的與完整的IGFBP-4的交叉反應性。然而，應當注意，獲得的交叉反應性百分比取決於例如所使用的方法，並且不應認為5%是低交叉反應性的限制性數值。用對完整的(完全大小的)IGFBP-4特異性的單克隆抗體在三明治式免疫測定法中測試獲得的肽特異性抗體以尋找兩位點抗體組合，其適合於開發用於特異性測定 IGFBP-4蛋白水解片段，而不管完整的全長IGFBP-4的存在的三明治式免疫測定法。使用對完整的IGFBP-4特異性的單克隆抗體作為捕捉抗體，而使用對IGFBP-4的蛋白水解片段特異性的單克隆抗體作為檢測抗體。在一些實施方案中，抗體的相反構型也是有可能的。本發明中所描述的三明治式免疫測定法對IGFBP-4的蛋白水解片段是高度特異性的(圖2B)。在本發明中，通過穩定的Eu3+螯合物標記開發的三明治式免疫測定法的檢測抗體。在多個其它實施方案中，可以通過能夠生成不同類型的信號的不同類型的標記物來標記檢測抗體，所述信號可以使用多種標準的方法，諸如檢測發光、化學發光、螢光、吸光度、 放射性、或者通過顯微術、成像等來顯現或檢測。免疫測定法可以包括免疫組合化學、酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、Western印跡、濁度法、比濁法、免疫放射測定法、側向流動、免疫組織/細胞化學和本領域技術人員已知的其它方法。可以使用免疫測定法來測定樣品中的生物標誌的存在或缺乏及樣品中的生物標誌的量。可以通過與參照或標準品，諸如完整的IGFBP-4或已知存在於樣品中的不同多肽比較(或者為與其的比率)來測定樣品中的IGFBP-4蛋白水解片段的量。還可以通過與參照或標準品，諸如參照或對照樣品中的內源或重組或合成IGFBP-4片段的量比較來測定樣品中的IGFBP-4蛋白水解片段的量。因而，樣品中的生物標誌的量不需要以絕對項量化，但是可以相對於參照或對照以相對項測量。在本發明中，實施檢測ACS的血漿樣品中的IGFBP-4的蛋白水解片段。通過使用 IBP521-IBP30三明治式對揭示片段的顯著增加(圖3)。本發明的多個實施方案包括檢測患者血漿樣品中的IGFBP-4的N端或C端或同時的C端和N端片段以評估ACS形成風險。本發明的又一個實施方案是用於檢測IGFBP-4蛋白水解片段或測量樣品中的 IGFBP-4蛋白水解片段量的免疫測定試劑盒。試劑盒可以包含(i)對N端或C端IGFBP-4 蛋白水解片段特異性的單克隆抗體，( )對完整的IGFBP-4的任何合適的表位特異性的第二單克隆檢測抗體，和(iii)至少與IGFBP-4片段序列部分對應的內源IGFBP-4片段或重組蛋白的標準品或校正物製備物。可以適當地標記第二單克隆抗體以檢測抗體-IGFBP-4 片段複合物。在一些實施方案中，用於IGFBP-4片段競爭性測量的試劑盒可以包含(i)對N端或C端IGFBP-4蛋白水解片段特異性的單克隆抗體，(ii)至少與IGFBP-4片段序列部分對應的內源IGFBP-4片段或重組蛋白的標準品或校正物製備物。可以通過IGFBP-4片段的所述經標記的標準品製備物的競爭性除去程度來測定分析樣品中的IGFBP-4片段水平。實施例1 生成對蛋白酶解介導的IGFBP-4新表位特異性的小鼠單克隆抗體。為了小鼠免疫而獲得的合成肽肽-1(SEQ ID NO. 1)肽-2(SEQ ID NO. 2)使用固相Fmoc化學Q3)來合成肽_1和肽2。在對烷氧基苯甲醇樹脂上製備肽。 在自樹脂切割後，通過反相高壓液相層析來純化粗製肽製備物。用水中的0.1 %三氟乙酸梯度和乙腈中的0. 三氟乙酸應用C18製備柱。通過分析C18高壓液相層析和質譜術(具有士0. 5道爾頓精確性的基質輔助雷射解吸/離子化質譜術)來測定純度(> 95% )。IGFBP-4肽-1(SEQ ID NO. 1)含有與IGFBP-4片段122_1；35相同的胺基酸序列，其具有來自N端的一個額外的半胱氨酸殘基。IGFBP-4肽-2 (SEQ ID NO. 2)含有與IGFBP-4 片段136-150相同的胺基酸序列，其具有來自C端的一個額外的半胱氨酸殘基。使用這些額外的半胱氨酸殘基的硫氫基基團來製備與載體蛋白的肽綴合物。
通過使用獲得Pierce (Rockford, IL)的磺基-SMCC依照製造商的指令實施肽與載體蛋白的綴合物的製備。對於綴合物，將2. 5mg載體蛋白，即牛血清清蛋白(BSA)或卵清蛋白(兩者都獲自 Sigma Chemicals, St. Louise, Mo.)在 IOmM KHPO4 U 50mM NaCl, pH 7. 4 (PBS)中以濃度10mg/ml溶解。將0. Iml 二甲亞碸中溶解的2毫克磺基-SMCC添加至蛋白質溶液。於室溫實施載體蛋白活化的反應達2小時。使用NAP-5柱(獲自GE Healthcare Life Sciences，Piscataway，NJ)通過凝膠過濾除去過量的磺基-SMCC。用 IOmM KHPO4, 150mM NaCl, pH 7. 2預平衡NAP-5柱。然後，將2mg合成肽-1或肽-2添加至蛋白質溶液以開始綴合。在冰上在不斷搖動的情況中實施此反應達2小時。通過使用用PBS預平衡的凝膠過濾NAP-5柱自蛋白質-肽綴合物除去未反應的肽級分。根據通過使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳揭示的蛋白質分子量的3-5kDa增加確認肽與合適的載體蛋白的綴合。將綴合物等分取樣，並於-20°C貯存，直至使用。用肽_(載體蛋白)綴合物免疫小鼠用肽-蛋白質綴合物將5隻BALB/c小鼠的組免疫5次。組1 第一次免疫腹膜內地在具有60%弗氏完全佐劑的PBS中的0. 2ml 10微克 BSA-肽-1 ；第二次免疫第30天，腹膜內地在具有60%弗氏不完全佐劑的PBS中的0. 2ml 5微克BSA-肽-1 ；第三次免疫第60天，腹膜內地在PBS中的0. 2ml 2. 5微克BSA-肽-1。組2 第一次免疫腹膜內地在具有60%弗氏完全佐劑的PBS中的0. 2ml 10微克 BSA-肽-2 ；第二次免疫第30天，腹膜內地在具有60%弗氏不完全佐劑的PBS中的0. 2ml 5微克BSA-肽-2 ；第三次免疫第60天，腹膜內地在PBS中的0. 2ml 2. 5微克BSA-肽-2。第三次免疫後20天，選擇具有最高滴度的肽特異性抗體的小鼠來進行最後一次免疫和雜交。給小鼠靜脈內注射對於組1的0. 2ml在PBS中的10微克BSA-肽-1及對於組2的0. 2ml在PBS中的10微克BSA-肽-2。次日以相同的方案重複靜脈內注射(第五次免疫)。然後，第五次免疫後2天，將經免疫小鼠的脾在無菌條件下分離，並將均漿化的組織與小鼠骨髓瘤細胞系sp2/0融合，如先前所描述的(19-22)。通過酶聯免疫吸附測定法(ELISA)來對培養雜交瘤的條件化培養基篩選抗體。通過ELISA分別用作為預吸附的抗原使用的卵清蛋白-肽-1或卵清蛋白-肽-2來選擇生成對肽1或肽2特異性的抗體的雜交瘤。對於別的測試，使用NSO細胞系中表達的人重組IGFBP_4(獲自Sigma Chemicals, St. Louise, Mo.)及預吸附的抗原。對於測定法，在免疫測定聚苯乙烯板(獲自Corning, Cambridge, ΜΑ)上吸附每孔50ng/0. 11 PBS的卵清蛋白-肽-1、或卵清蛋白-肽_2、或人重組IGFBP-4。在抗原吸附40分鐘後，將平板清洗兩次， 並用含有去汙劑Tween 20,0. 的PBS(PBST)封閉10分鐘。然後，將平板與0. 05ml通過培養雜交瘤30分鐘收集的條件化培養基一起溫育，並用PBST清洗2次。通過與每孔0. Iml 在PBST中1 1000稀釋的與HRP綴合的二級抗小鼠IgG多克隆抗體一起溫育30分鐘來揭示與預吸附的抗原結合的小鼠抗體。二抗來自Sigma Chemicals, St. Louise, Mo。與二抗一起溫育後，用PBST將平板清洗6次，並添加3，3』，5，5』 -四甲基聯苯胺(TMB)過氧化物酶底物，其含有0. 03%過氧化氫。在溫育15分鐘後通過添加0. Iml 0. 5M磷酸來停止反應，並於450nm測量孔中的吸光度。用Labsystems Multiscan微板讀板儀(Labsystems， Finland)來實施吸光度的測量。選擇生成對與卵清蛋白(於上文所描述的450nm條件的吸光度超過背景大於0. 5)綴合的合適的肽特異性的，並且同時不與人重組IGFBP-M450nm的吸光度超過背景小於 0. 025)起反應的抗體的雜交瘤來進行進一步的工作。通過有限稀釋克隆此類雜交瘤。將分泌感興趣的單克隆抗體的雜交瘤克隆在含有10%胎牛血清(HyClone Laboratories, Logan, UT)的Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(DMEM)中培養。抗體的親和純化在腹膜內注射選定的雜交瘤克隆後在小鼠腹水中生成單克隆抗體。通過使用蛋白 A親和層析自腹水純化抗體。樹脂來自GE Healthcare Life Sciences (Piscataway，NJ)， 並且依照製造商的指令來實施純化。將純化的單克隆抗體於4°C作為50%硫酸銨中的懸浮液貯存。單克隆抗體特異性的調查為了確認選定的單克隆抗體的特異性，獲得IGFBP-4蛋白水解片段。依照較早所描述的條件(14)來實施PAPP-A依賴性蛋白水解反應。將2微克人重組IGFBP-4在存在 2mM CaCl2,1. 8 微克 IGF-II (獲自 Sigma Chemicals, St. Louise, Mo)、40ng 人重組 PAPP-A(HyTest，Turku, Finland)和 2 微升蛋白酶抑制劑混合物(獲自 Sigma Chemicals, St. Louise，Mo)的情況中在0. 23ml 50mMTris-HCl, pH 7. 5中溫育。將反應於37°C實施 15小時，並通過於-20°C冷凍樣品來停止。通過Western印跡通過使用1微克/ml獲自 Abeam (Cambridge, ΜΑ)的特異性兔多克隆抗體來測定對IGFBP-4的PAPP-A依賴性切割的程度(圖1)。使用親和純化的抗體在間接ELISA中實施針對IGFBP-4蛋白水解片段的選定的單克隆抗體的特異性研究(圖2Α)。將IOng全長重組IGFBP-4或通過PAPP-A依賴性切割生成的IGFBP-4片段(上文所描述的製備物)在聚苯乙烯板上吸附。溫育40分鐘後，將平板清洗兩次，並用含有去汙劑Tween 20,0. 1 %的PBS(PBST)封閉10分鐘。然後，將分泌的單抗 (10微克/ml)於室溫在搖動的情況中溫育30分鐘，並且此後，用PBST清洗兩次。通過每孔 0.1ml在PBST中以1 1000稀釋的與HRP綴合的抗小鼠IgG多克隆抗體檢測特異性結合的抗體。二抗來自Sigma ChemicalsJt. Louise，Mo。與二抗一起溫育後，用PBST將平板清洗6次，並添加含有過氧化物酶底物的3，3』，5，5』 -四甲基聯苯胺(TMB)，其補充有0. 03% 過氧化氫。在溫育15分鐘後通過添加0. Iml 0. 5M磷酸來停止反應，並於450nm測量吸光度。最終，選擇對通過PAPP-A依賴性切割生成的IGFBP-4的蛋白水解片段特異性的，並且具有小於5%的與完整的IGFBP-4的交叉反應性的單克隆抗體組IBP28，IBP27, IBP12, IBP3, IBP4, IBP7, IBP13, IBP18, IBP19, IBP20, IBP30, IBP167, IBP166, IBP168, IBP174, IBP160, IBP161，IBP164, IBP171。所有單克隆抗體是IgG同種型的，只是IBP30是IgM同種型的。用於量化IGFBP-4片段的三明治式免疫測定法的設計還在三明治式免疫測定法中檢查親和純化的單克隆抗體的特異性(圖2B)。開發出數種三明治式測定法，其利用對IGFBP-4的蛋白水解片段(N或C端；在間接ELISA中小於5%的與全長分子的交叉反應)特異性的一種單克隆抗體和識別完整IGFBP-4的任何表位的另一種單抗。實施例2中描述了對完整IGFBP-4特異性的小鼠單克隆抗體的生成。為了實施三明治式螢光免疫測定法，我們使用經穩定的Eu3+螯合物標記的檢測單抗，如由Hyytia等所描述的04)。此測定法中的捕捉抗體對於完整的IGFBP-4是特異性的，而檢測抗體對IGFBP-4的蛋白水解新表位是特異性的。將100 μ L磷酸鹽緩衝液鹽水中每孔2 μ g的捕捉抗體(IBP513，IBP521)在96孔免疫測定板中在不斷搖動時於室溫溫育30 分鐘。將平板用補充有 0. 15MNaCl，0. 025% Tween 20 和 0. 5g/l NaN3 的 IOmM Tris-HCl (pH 7. 8)緩衝液(緩衝液A)清洗。清洗後，將0. Iml測定緩衝液(50mM Tris-HCl緩衝液、pH 7. 7，9g/lNaCl、0. 01% Tween 40,0. 5% BSA 和 0. 5g/l NaN3)添加至平板，所述測定緩衝液含有lOOng/ml全長人重組IGFBP-4或通過PAPP-A依賴性切割生成的IGFBP-4片段。將平板於室溫在不斷搖動的情況中溫育30分鐘。用緩衝液A清洗後，添加0. Iml在測定緩衝液中的檢測抗體(IBP12、IBP27和IBP30)的溶液(lmg/1)。將平板於室溫在不斷搖動的情況中溫育30分鐘。用緩衝液A清洗後，添加每孔0. 2ml增強溶液(1. 75M NaSCNUM NaCl,5% 甘油、20% 1-丙醇、5mM Na2CO3>50mM甘氨酸-NaOH，pH 10. 0)，並於室溫在溫和搖動的情況中溫育3分鐘。在Victor 1420多標記物計數器(WalIac-Perkin Elmer)上測量Eu3+的螢光。以每秒的計數(CPQ表達螢光。開發的三明治式免疫測定法能夠僅檢測通過PAPP-A依賴性切割生成的IGFBP-4 片段，並且與全長IGFBP-4沒有交叉反應(或非常低小於)。實施例2 生成對完整的IGFBP-4特異性的小鼠單克隆抗體小鼠的免疫用哺乳動物NSO細胞系中表達的人重組IGFBP-4將5隻BALB/c小鼠免疫5次。蛋白質獲自Sigma Chemicals, Μ. Louise，Mo。第一次免疫腹膜內地在具有60%弗氏完全佐劑的PBS中的0. 2ml 5微克IGFBP-4 ；第二次免疫第30天，腹膜內地在具有60%弗氏不完全佐劑的PBS中的0. 2ml 2微克IGFBP-4 ；第三次免疫第60天，腹膜內地在PBS中的 0. 2ml 2 微克 IGFBP-4。第三次免疫後20天，選擇具有最高滴度的蛋白質特異性抗體的小鼠來進行接著的免疫和雜交。對於第四次，給小鼠靜脈內注射0. 2ml在PBS中的2微克IGFBP-4。次日依照相同的方案實施最後一次靜脈內注射(第五次免疫)。兩天後，將經免疫小鼠的脾在無菌條件下分離，並將均漿化的組織與小鼠骨髓瘤細胞系sp2/0融合，如先前所描述的(19-22)。使用ELISA方法對培養雜交瘤的條件化培養基篩選IGFBP-4特異性抗體。依靠間接的ELISA來選擇生成對完整的IGFBP-4特異性的抗體的雜交瘤。對於測定法，將每孔 50ng/0. Iml PBS的全長人重組IGFBP-4在免疫測定聚苯乙烯板上吸附。溫育40分鐘後，將平板清洗兩次，並用含有去汙劑Tween 20，0. 1 %的PBS(PBST)封閉10分鐘。然後，將平板與0. 05ml通過自含有培養雜交瘤的孔收集的條件化培養基一起溫育30分鐘。溫育後，將平板用PBST清洗2次。清洗後，將平板與每孔0. Iml與HRP (在PBST中以1 1000稀釋) 綴合的抗小鼠IgG多克隆二抗一起溫育30分鐘。與二抗一起溫育後，將平板用PBST清洗六次，並添加含有TMB和0. 03%過氧化氫的過氧化物酶底物。在溫育15分鐘後通過添加 0. Iml 0. 5M磷酸來停止反應，並於450nm測量孔中的吸光度。通過有限稀釋方法來克隆生成對全長IGFBP-4(於450nm的上文所描述的條件的吸光度超過背景大於0. 特異性的抗體的雜交瘤。將分泌感興趣的單克隆抗體的雜交瘤克隆在含有10%胎牛血清的DMEM中培養。抗體的親和純化在腹膜內注射選定的雜交瘤克隆後在小鼠腹水中生成對全長IGFBP-4特異性的單克隆抗體。通過使用蛋白A親和層析自腹水純化抗體。樹脂來自GEHealthcare LifeSciences (Piscataway, NJ)，並且依照製造商的指令實施純化。將純化的單克隆抗體於4°C 作為50%硫酸銨中的懸浮液貯存。實施例3 動脈粥樣硬化患者PAPP-A的蛋白水解活性將人動脈粥樣硬化冠狀動脈血管樣品於-70°C貯存，直至使用。在含有0. 15M NaCUO. 5% Triton X100、和蛋白酶抑制劑混合物的50mM Tris-HCl (pH7. 8)緩衝液中組織勻漿化後自動脈粥樣硬化冠狀動脈血管提取PAPP-A。依靠親和層析來純化提取的PAPP-A0 利用PAPP-A特異性單克隆抗體4G11 (獲自HyTest，Turku，Finland)來製備用於PAPP-A純化的親和基質。為了確認純化的蛋白質與PAPP-A的同一性，使用用數種PAPP-A特異性單克隆抗體的Western印跡分析和液相層析/串聯質譜術分析。對於對動脈粥樣硬化患者PAPP-A的蛋白水解活性分析，將2微克人重組IGFBP-4 在 0.23ml 50mM Tris-HCl, pH 7. 5 中在存在 2mM CaCl2、1. 8 微克 IGF-II (獲自 Sigma Chemicals, St. Louise, Mo.)、40ng動脈粥樣硬化患者PAPP-A、和2微升蛋白酶抑制劑混合物(獲自Sigma Chemicals, St. Louise, Mo)中溫育。於37°C實施反應達15小時，並通過於_20°C冷凍樣品來停止。通過Western印跡使用IGFBP-4特異性兔多克隆抗體(獲自 Abeam, Cambridge, ΜΑ)測定對IGFBP-4的PAPP-A依賴性切割的程度(圖1)。顯示了動脈粥樣硬化患者PAPP-A以與重組PAPP-A相同的效率切割IGFBP-4。如此，第一次顯示了人斑塊中表達的內源PAPP-A是一種能夠在存在IGF-II的情況中切割IGFBP-4的活性蛋白酶。實施例4 測量ACS患者血漿樣品中的IGFBP-4片段。通過片段特異性三明治式免疫測定法測試43名ACS患者(具有ST段升高)的血液及來自34名健康供體的血漿樣品。將所有血漿樣品在存在EDTA的情況中自患者收集， 並在測量前於-70°C貯存。對於三明治式免疫測定法測量，將0. Iml磷酸鹽緩衝鹽水中每孔2微克的捕捉抗體IBP521在96孔免疫測定板中於室溫在不斷搖動時溫育30分鐘。用緩衝液A清洗後，將用測定緩衝液以1 1稀釋的0.1ml患者血漿樣品添加至平板。將平板於室溫在不斷搖動的情況中溫育30分鐘。用緩衝液A清洗後，添加測定緩衝液中的0. Iml檢測抗體IBP30(lmg/ 1)。將平板於室溫在不斷搖動的情況中溫育30分鐘。用緩衝液A清洗後，添加每孔O.aiil 增強溶液，並於室溫在溫和搖動的情況中溫育3分鐘。使用Victor 1420多標記物計數器 (Wallac-PerkinElmer)來測量Eu3+螢光。ACS患者血漿中的IGFBP-4片段水平比在健康供體血漿中高3. 2倍(ρ < 0. 0005)(圖3)。圖上顯示了均值數值士標準偏差。以每秒的計數(CPQ表達螢光。參考文獻1.Spencer EM. Modern concepts of insulin-like growth factors. New York Elsevier,1991.2. Frystyk J. , Free insulin-like growth factors-measurements and relationships to growth hormone secretion and glucose homeostasis. Growth Horm IGF Res. 2004 ； 14 (5) :337-75.3. Ferns GA et al. The insulin-like growth factors :their putative role in atherogenesis. Artery 1991 ； 18 (4) :197-225.4. Rosenfeld RG, Lamson G, Pham H, Oh Y, Conover C,De Leon DD, Donovan SM,Ocrant IiGiudice L Insulin—like growth factor-binding proteins. Recent Prog Horm Res. 1990 ；46 :99-159.5.Baxter RC, Martin JL Binding proteins for the insulin-like growth factors :structure, regulation and function. Prog in Growth Factor Res. 1989 ；1 49-68.6. Rechler MM.，Insulin-like growth factor binding proteins. Vitam Horm. 1993 ；pp. 471-114.7. La Tour D，Mohan S，Linkhart TA，Baylink DJ，Strong DD. Inhibitory insulin-like growth factor binding protein :cloning，complete sequence，and physiologic regulation. Mol Endocrinol. 1990 ；4 :1806-1814.8.Shimasaki S,Uchiyama F，Shimonaka M，Ling N. , Molecular cloning of the cDNAs encoding a novel insulin-like growth factor binding protein from rat and human. Mol Endocrinol. 1990，4 :1451-1458.9. Mohan S，Bautista C，Wergedal J，Baylink DJ.Isolation of an inhibitory insulin-like growth factor(IGF)binding protein from bone cell conditioned medium :a potential local regulator of IGF action. Proc Nat Acad Sci USA. 1989 ； 86 :8338-8342.10. Mohan S,Nakao Y，Honda Y，et al.，Studies on the molecular mechanisms by which insulin-like growth factor(IGF)binding protein-4(IGFBP-4)and IGFBP-5 modulate IGF actions in bone cells. J Biol Chem. 1995 ；270 :20424-20431.11. Mohan S，Strong DD, Linkhart TA, Baylink DJ. Regulation and actions of insulin-like growth factor binding protein (IGFBP-4 and IGFBP-5 in bone physiological and clinical implications. In :Baxter RC, Gluckman PD, Rosenfeld RG, eds. The insulin-like growth factors and their regulatory proteins.Excerpta Medica ；1994 ；205-215.12. Honda Y，Landale EC，Strong DD, Baylink DJ.，Recombinant Synthesis of Insulin-Like Growth Factor-Binding Protein-4(IGFBP-4) -Development，Validation， and Application of a Radioimmunoassay for IGFBP-4 in Human Serum and Other Biological Fluids. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1996 ；81 (4) 1389-1396.13. Zhou R， Diehl D， Hoeflich A， Lahm H， Wolf E. ， IGF-binding protein-4 biochemical characteristics and functional consequences.Journal of Endocrinology 2003 ；178 :177-193.14.Overgaard MT, Haaning J，Boldt HB, Olsen IM, Laursen LS, Christiansen M， Gleich GJ, Sottrup-Jensen L， Conover CA, Oxvig C Expression of recombinant human pregnancyassociated plasma protein—A and identification of the proform of eosinophil major basic protein as its physiological inhibitor. Journal of Biological Chemistry,2000 ；275 :31128-31133.15.Bayes-Genis AiConover CA,Schwartz RS. The insulin-like growth factoraxis :A review of atherosclerosis and restenosis. Circ Res. 2000 ；86 :125-30.16.Bayes-Genis A，Conover CA, Overgaard MT, Bailey KR, Christiansen M， Holmes DR Jr, et al. Pregnancy-associated plasma protein A as a marker of acute coronary syndromes. N Engl J Med. 2001 ；345 :1022-9.17. Libby P，What happens inside an atherosclerotic plaque ？ International Congress Series，2004 ; 1262253-25618. Wittfooth S，Qin Q，Pettersson K.，Perfomance of immunofluorometric point-of-care assays for free pregnancy-associated plasma protein A detection in whole blood samples. Clin Chem Lab Med ；2008 ；46 (1)18-2019. Kohler G, Milstein C.，Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975 ；256 (5517) :495-7.20. Kohler G，Milstein C.，Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion. Eur J Immunol. 1976 ；6 (7) :511-9.2 1 . Kohler G，Howe SC, Milstein C. , Fusion between immunoglobulin-secreting and nonsecreting myeloma cell lines.Eur J Immunol. 1976 ；6 (4) :292-5.22. Hammerling，G. J.，Hammerling，U.，and Kearney, J. F. eds.，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas，published by Elsevier,North-Holland,New York， 1981 ；pp. 563-587.23. Fields CGiFields GBiNoble RLiCross TA. ,Solid phase peptide synthesis of 15N-gramicidins A， B， and C and high performance liquid chromatographic purification. Int J Pept Protein Res. 1989 ；33 (4) :298-303.24. HyytiaHiRistiniemi NiAiras LiPettersson KiHellman JiDevelopment of an immunoassay for the detection of cystatin C dimers. J Immunol Methods 2010 ； 355(1-2) :14-20.
權利要求
1.一種抗體，其識別通過對IGFBP-4的酶依賴性切割起源的新表位，該新表位包含如 SEQ ID NO :3中所描述的胺基酸序列或與SEQ ID NO :3具有至少80%同源性的胺基酸序列。
2.依照權利要求1的抗體，其以比其識別全長IGFBP-4更高的親和力特異性識別通過酶依賴性IGFBP-4切割起源的新表位。
3.一種抗體，其特異性識別通過對IGFBP-4的酶依賴性切割起源的新表位，並且其不識別全長IGFBP-4，所述新表位包含如SEQ ID NO :3中所描述的胺基酸序列或與SEQ ID NO 3具有至少80%同一性的胺基酸序列。
4.依照權利要求3的抗體，其特異性識別通過在胺基酸殘基M135與K136間的酶依賴性IGFBP-4切割起源的新表位，並且其不識別全長IGFBP-4。
5.依照權利要求1的抗體，其特異性識別通過在M135與K136胺基酸殘基間的酶依賴性IGFBP-4切割起源的新表位。
6.依照權利要求5的抗體，其以比其識別全長IGFBP-4更高的親和力特異性識別通過在M135與K136胺基酸殘基間的酶依賴性IGFBP-4切割起源的新表位。
7.依照權利要求1的抗體，其以比其識別全長IGFBP-4更高的親和力特異性識別由於 PAPP-A在M135與K136胺基酸殘基間對IGFBP-4切割起源的新表位。
8.與依照權利要求1至4中任一項的抗體具有相同特異性的適體或另一種結合劑。
9.依照權利要求1至4中任一項的抗體，其是單克隆抗體或其片段。
10.依照權利要求1至4中任一項的抗體，其是多克隆抗體或其片段。
11.依照權利要求1至4中任一項的抗體，其是重組抗體或其片段。
12.一種定性或定量檢測IGFBP-4蛋白水解片段的方法，其利用依照權利要求1至4中任一項的至少一種抗體來進行。
13.一種定性或定量檢測IGFBP-4蛋白水解片段的方法，其利用依照權利要求8的至少一種適體或結合劑來進行。
14.依照權利要求12或13的方法，其是診斷免疫測定法。
15.依照權利要求14的方法，其用於診斷心血管疾病。
16.依照權利要求14的方法，其用於診斷癌症。
17.依照權利要求12或13的方法，其是進一步包括使用包含與通過酶依賴性IGFBP-4 切割起源的所述新表位對應的表位的內源或重組IGFBP-4蛋白水解片段或合成肽的製備物作為標準品來製備校正曲線的診斷方法。
18.依照權利要求17的方法，其進一步包括將如檢出的IGFBP-4蛋白水解片段的水平與製備的所述校正曲線比較。
19.依照權利要求14的方法，其中所述免疫測定法是使用第一捕捉抗體和第二檢測抗體的三明治式免疫測定法。
20.包含與通過酶依賴性IGFBP-4切割起源的所述新表位對應的表位的內源或重組 IGFBP-4蛋白水解片段或合成肽作為標準品或校正物用於包含依照權利要求1至4中任一項的至少一種單克隆抗體或依照權利要求8的適體或結合劑的免疫測定法的用途。
21.包含與通過酶依賴性IGFBP-4切割起源的所述新表位對應的表位的內源或重組 IGFBP-4蛋白水解片段或合成肽作為抗原以生成與權利要求1至4中任一項的抗體具有相同特異性的抗體的用途。
22.一種用於診斷性測定患者樣品中的IGFBP-4蛋白水解片段的免疫測定試劑盒，該試劑盒包含(a)與權利要求1至4中任一項的抗體具有相同特異性的抗體，(b)對全長IGFBP-4的任何表位特異性的另一種抗體，和(c)如權利要求20中所限定的標準品或校正物製備物。
23.—種診斷方法，包括通過使用利用權利要求1至4中任一項的至少一種抗體，或依照權利要求8的適體或結合劑的測定法來測量患者樣品中的PAPP-A蛋白水解活性。
24.酶活性內源或重組PAPP-A，其作為標準品或校正製備物用於依照權利要求23的診斷方法。
全文摘要
本發明涉及一種用於診斷心血管或癌症疾病的方法，其通過檢測患者樣品中的IGFBP-4(胰島素樣生長因子結合蛋白-4)片段來進行。還公開了特異性識別通過對IGFBP-4的酶依賴性切割起源的新表位的抗體。
文檔編號C07K16/18GK102471379SQ201080029212
公開日2012年5月23日 申請日期2010年6月29日 優先權日2009年6月29日
發明者A.B.波斯特尼科夫, A.G.卡特盧卡, A.V.卡利託諾夫, T.I.索羅維瓦 申請人:西特斯特有限公司