天山雲杉胚性愈傷組織高效增殖培養基的製作方法
2023-10-06 20:02:29 1
本發明屬於無性繁殖技術領域，具體涉及天山雲杉胚性愈傷組織高效增殖培養基。
背景技術：
植物體細胞胚（體胚）發生是雙倍體或者單倍體的體細胞在特定條件下，未經性細胞融合而是通過合子胚胎發生類似的途徑發育出新個體的過程。植物組織培養中體細胞胚的發生不僅具有普遍性，而且具有數量多，速度快，結構完整的特點，在應用上是一種有效大規模的無性繁殖方法。
目前天山雲杉主要通過有性繁殖產生後代。因為，種子成熟率低、生長較慢、繁殖和品種選育困難，所以無性繁殖一直受到各國林業決策部門的重視與林木育種工作者以及森林經營者的特別關注，尤其是現代生物技術的蓬勃發展，如植物組織培養及體細胞胚胎發生技術，具有繁殖效率高、周期短、不受自然條件制約、穩定、選育優良品種，對造林工程具有重大意義等特點。天山雲杉體細胞胚愈傷組織的誘導培養已取得了一定的進展，愈傷組織的增殖是體細胞胚胎培養的關鍵，而在天山雲杉體細胞胚愈傷組織的專用增殖培養基鮮見報導。
技術實現要素：
為了解決現有技術中存在的問題，本發明提供了一種天山雲杉胚性愈傷組織高效增殖培養基。
本發明報導了天山雲杉體細胞胚增殖階段的技術研究，為實現天山雲杉體細胞胚培養的更廣泛應用提供堅實的理論基礎，同時建立了天山雲杉胚性愈傷組織增殖培養的技術平臺，為天山雲杉遺傳改良種質創新、縮短育種周期奠定了研究基礎。
本發明提供天山雲杉胚性愈傷組織高效增殖培養基，所述培養基為改良SH增殖培養基或改良BM2增殖培養基；
其中，（1）所述改良SH增殖培養基的配方為：
大量元素
硝酸鉀(KNO3) 2500mg/L
硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 400mg/L
磷酸二氫銨（NH4）H2PO4 300mg/L
氯化鈣(CaCl2·2H2O) 200mg/L
微量元素
五水硫酸銅(CuSO4·5H2O) 0.2mg/L
硼酸(H3BO3) 5mg/L
一水硫酸錳(MnSO4·H2O) 10mg/L
二水鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O) 0.1mg/L
七水硫酸鋅(ZnSO4·7H2O) 1mg/L
碘化鉀(KI) 1mg/L
六水氯化鈷(CoCl2·6H2O) 0.1mg/L
鐵鹽
乙二胺四乙酸鐵鈉(FeNaEDTA) 35mg/L
有機物
煙酸(Nicotinie Acid) 5mg/L
鹽酸硫胺素(Thiamine-HCl) 5mg/L
鹽酸吡哆醇(Pyridoxine-HCl) 0.5 mg/L
肌醇(Myo-Inositol) 1000mg/L
水解酪蛋白(Caseinhydrolysat) 1000mg/L
蔗糖（Saccharose） 20g/L
卡拉膠(Gelrite) 3000mg/L
L-穀氨醯胺 500mg/L
外源生長調節劑
2,4-D 1.10mg/L
6-BA 0.44mg/L；
（2）所述改良BM2增殖培養基的配方為：
大量元素
氯化鈣(CaCl2·2H2O) 134.5mg/L
硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 400mg/L
磷酸二氫鉀KH2PO4 340mg/L
微量元素
四水硫酸錳(MnSO4·4H2O) 11.15mg/L
一水硫酸錳(MnSO4·H2O) 20.8mg/L
七水硫酸鋅(ZnSO4·7H2O) 8mg/L
硼酸(H3BO3) 5mg/L
碘化鉀(KI) 1mg/L
六水氯化鈷(CoCl2·6H2O) 0.025mg/L
五水硫酸銅(CuSO4·5H2O) 0.24mg/L
二水鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O) 0.2mg/L
鐵鹽
乙二胺四乙酸鐵鈉(FeNaEDTA) 65.1mg/L
有機物
肌醇(Myo-Inositol) 1000mg/L
煙酸(Nicotinie Acid) 0.25mg/L
鹽酸吡哆醇(Pyridoxine-HCl) 0.25mg/L
鹽酸硫胺素(Thiamine-HCl) 0.5mg/L
L-甘氨酸（Glycine） 1mg/L
水解酪蛋白(Caseinhydrolysat) 500mg/L
蔗糖（Saccharose） 20g/L
卡拉膠(Gelrite) 3000mg/L
L-穀氨醯胺 450mg/L
外源生長調節劑
2,4-D 1.10mg/L
6-BA 0.44mg/L。
作為優選，所述培養基為改良SH增殖培養基。
本發明還提供上述增殖培養基的製備方法，製備時，首先，每升添加除L-穀氨醯胺外的配方量的各組分後，純淨水作為溶劑，攪拌均勻後調pH值至5.8±0.02，然後添加Gelrite（卡拉膠）作為固化劑，封口準備消毒；在121℃，2×107 Pa的壓力下進行15min高壓滅菌後，將培養基自然冷卻至60℃時加入配方量（用孔徑為0.22μm的濾器過濾滅菌）的L-穀氨醯胺。然後將培養基倒入培養皿中自然冷卻凝固，放置1d後再使用。
本發明還提供上述天山雲杉胚性愈傷組織高效增殖的接種方法，其特徵在於：是將天山雲杉胚性愈傷組織接種於權利要求1或2所述的培養基中，將尺寸為70.3×28mm的培養器皿接種0.65g胚性愈傷組織後（分成4塊接種於增殖培養基上），蓋上蓋子，在黑暗中，溫度為23±2℃條件下培養，每周稱一次新鮮增殖量並觀察增殖的生長狀態，直至愈傷組織生長進入停止，各處理均重複5次。首先，將愈傷組織與培養基分離，然後轉入無菌培養皿（稱量前去皮）進行新鮮增殖的稱量。記錄數據後再將胚性愈傷組織接回原處繼續培養。為了避免汙染，上述操作均在超淨臺內進行。繪製生產曲線，確定最佳繼代周期。
本發明建立了天山雲杉胚性愈傷組織增殖的的技術平臺，確定天山雲杉胚性愈傷組織增殖的培養基：改良SH，DCR，1/2DCR，BM和MSG培養基；其中最佳天山雲杉胚性愈傷組織增殖的培養基為改良SH，並提出天山雲杉胚性愈傷組織增殖的培養條件。本發明為實現天山雲杉胚性愈傷組織增殖培養的更廣泛應用提供堅實的理論基礎，同時建立了天山雲杉胚性愈傷組織培養的技術平臺，為天山雲杉遺傳改良種質創新、縮短育種周期奠定了研究基礎。
附圖說明
附圖用來提供對本發明的進一步理解，並且構成說明書的一部分，與本發明的實施例一起用於解釋本發明，並不構成對本發明的限制。在附圖中：
圖1為天山雲杉胚性愈傷組織在5種不同增殖培養基上的增殖量與增殖率表現；
（SHT表示SH培養基，其中的T表示為天山雲杉）。
圖2為不同的天山雲杉胚性愈傷組織在改良SH培養基中的增殖情況。
具體實施方式
以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
一、最適培養基的選擇
培養基是植物組織培養的重要基質，沒有一種培養基能夠適合一切類型的植物組織或器官，在建立一項新的培養系統時，首先必須找到一合適的培養基培養才有可能成功。
本實驗採用DCR、1/2DCR、SH、BM2和MSG為5種增殖培養基，再分別添加外源生長調節劑：1.10mg/L 2,4-D+0.44mg/L 6-BA，作為本實驗的5種增殖培養基，並將其分別命名為改良DCR增殖培養基、改良1/2DCR增殖培養基、改良SH增殖培養基、改良BM2增殖培養基和改良MSG增殖培養基。
五種增殖培養基的配方及製備方法如下：
（1）改良SH增殖培養基的配方如下：
大量元素
硝酸鉀(KNO3) 2500mg/L
硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 400mg/L
磷酸二氫銨（NH4）H2PO4 300mg/L
氯化鈣(CaCl2·2H2O) 200mg/L
微量元素
五水硫酸銅(CuSO4·5H2O) 0.2mg/L
硼酸(H3BO3) 5mg/L
一水硫酸錳(MnSO4·H2O) 10mg/L
二水鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O) 0.1mg/L
七水硫酸鋅(ZnSO4·7H2O) 1mg/L
碘化鉀(KI) 1mg/L
六水氯化鈷(CoCl2·6H2O) 0.1mg/L
鐵鹽
乙二胺四乙酸鐵鈉(FeNaEDTA) 35mg/L
有機物
煙酸(Nicotinie Acid) 5mg/L
鹽酸硫胺素(Thiamine-HCl) 5mg/L
鹽酸吡哆醇(Pyridoxine-HCl) 0.5 mg/L
肌醇(Myo-Inositol) 1000mg/L
水解酪蛋白(Caseinhydrolysat) 1000mg/L
蔗糖（Saccharose） 20g/L
卡拉膠(Gelrite) 3000mg/L
L-穀氨醯胺 500mg/L
外源生長調節劑
2,4-D 1.10mg/L
6-BA 0.44mg/L。
（2）改良DCR增殖培養基的配方如下：
大量元素
硝酸鉀(KNO3) 340mg/L
硝酸銨（NH4NO3） 400mg/L
硝酸鈣Ca(NO3)2·4H2O 556mg/L
氯化鈣(CaCl2·2H2O) 85mg/L
硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 370mg/L
磷酸二氫鉀KH2PO4 170mg/L
微量元素
四水硫酸錳(MnSO4·4H2O) 16.9mg/L
七水硫酸鋅(ZnSO4·7H2O) 8.6mg/L
硼酸(H3BO3) 6.2mg/L
碘化鉀(KI) 0.83mg/L
六水氯化鈷(CoCl2·6H2O) 0.025mg/L
五水硫酸銅(CuSO4·5H2O) 0.25mg/L
二水鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O) 0.25mg/L
氯化鎳（NiCl2） 0.025mg/L
鐵鹽
乙二胺四乙酸鐵鈉(FeNaEDTA) 65.1mg/L
有機物
肌醇(Myo-Inositol) 200mg/L
煙酸(Nicotinie Acid) 0.5mg/L
鹽酸吡哆醇(Pyridoxine-HCl) 0.5mg/L
鹽酸硫胺素(Thiamine-HCl) 1.0mg/L
L-甘氨酸（Glycine） 2mg/L
蔗糖（Saccharose） 20g/L
卡拉膠(Gelrite) 3000mg/L
L-穀氨醯胺 730mg/L
外源生長調節劑
2,4-D 1.10mg/L
6-BA 0.44mg/L。
（3）改良BM2增殖培養基的配方如下：
大量元素
氯化鈣(CaCl2·2H2O) 134.5mg/L
硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 400mg/L
磷酸二氫鉀KH2PO4 340mg/L
微量元素
四水硫酸錳(MnSO4·4H2O) 11.15mg/L
一水硫酸錳(MnSO4·H2O) 20.8mg/L
七水硫酸鋅(ZnSO4·7H2O) 8mg/L
硼酸(H3BO3) 5mg/L
碘化鉀(KI) 1mg/L
六水氯化鈷(CoCl2·6H2O) 0.025mg/L
五水硫酸銅(CuSO4·5H2O) 0.24mg/L
二水鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O) 0.2mg/L
鐵鹽
乙二胺四乙酸鐵鈉(FeNaEDTA) 65.1mg/L
有機物
肌醇(Myo-Inositol) 1000mg/L
煙酸(Nicotinie Acid) 0.25mg/L
鹽酸吡哆醇(Pyridoxine-HCl) 0.25mg/L
鹽酸硫胺素(Thiamine-HCl) 0.5mg/L
L-甘氨酸（Glycine） 1mg/L
水解酪蛋白(Caseinhydrolysat) 500mg/L
蔗糖（Saccharose） 20g/L
卡拉膠(Gelrite) 3000mg/L
L-穀氨醯胺 450mg/L
外源生長調節劑
2,4-D 1.10mg/L
6-BA 0.44mg/L。
（4）改良MSG增殖培養基的配方如下：
大量元素
硝酸鉀(KNO3) 100mg/L
氯化鈣(CaCl2·2H2O) 440mg/L
硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 320mg/L
氯化鉀（KCl） 475mg/L
磷酸二氫鉀KH2PO4 170mg/L
微量元素
四水硫酸錳(MnSO4·4H2O) 22.3mg/L
七水硫酸鋅(ZnSO4·7H2O) 8.6mg/L
硼酸(H3BO3) 6.2mg/L
碘化鉀(KI) 0.83mg/L
六水氯化鈷(CoCl2·6H2O) 0.025mg/L
五水硫酸銅(CuSO4·5H2O) 0.25mg/L
二水鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O) 0.25mg/L
鐵鹽乙二胺四乙酸鐵鈉(FeNaEDTA) 65.1mg/L
有機物
肌醇(Myo-Inositol) 100mg/L
煙酸(Nicotinie Acid) 0.5mg/L
鹽酸吡哆醇(Pyridoxine-HCl) 0.5mg/L
鹽酸硫胺素(Thiamine-HCl) 1.0mg/L
蔗糖（Saccharose） 20g/L
卡拉膠(Gelrite) 3000mg/L
L-穀氨醯胺 1460mg/L
外源生長調節劑
2,4-D 1.10mg/L
6-BA 0.44mg/L。
上述五種增殖培養基的配製方法均為：
製備時，首先，每升添加除L-穀氨醯胺外的配方量的各組分後，純淨水作為溶劑，攪拌均勻後調pH值至5.8±0.02，然後添加Gelrite（卡拉膠）作為固化劑，封口準備消毒；在121℃，2×107 Pa的壓力下進行15min高壓滅菌後，將培養基自然冷卻至60℃時加入配方量（用孔徑為0.22μm的濾器過濾滅菌）的L-穀氨醯胺。然後將培養基倒入培養皿中自然冷卻凝固，放置1d後再使用。
應用上述培養基對天山雲杉胚性愈傷組織進行增殖的方法如下：
將胚性愈傷組織（T6，T7，T36，T43，T48）分別接種於上述五種增殖培養基（培養器皿尺寸為70.3×28mm）上進行培養。每培養器皿中接種0.65g的愈傷組織（分成4塊接種於增殖培養基）。蓋上蓋子，在黑暗中，溫度為23±2℃條件下培養。每周稱一次新鮮增殖量並觀察增殖的生長狀態，直至愈傷組織生長進入停止，各處理均重複5次。稱重時，首先，將愈傷組織與培養基分離，然後轉入無菌培養皿（稱量前去皮）進行新鮮增殖的稱量。記錄數據後再將胚性愈傷組織接回原處繼續培養。為了避免汙染，上述操作均在超淨臺內進行。繪製生產曲線，確定最佳繼代周期。
二、結果與分析
影響胚性愈傷組織增殖的因素之一是培養基，本發明將胚性愈傷組織接種於5種不同培養基上增殖培養，結果顯示5種培養基其增殖量與增殖率表現出不一樣的變化（見圖1），試驗數據統計結果表示，使用改良BM2和SH培養基的增殖量和增殖率高於其他培養基，分別為5.74g和為4.55g，增殖率達到782.7%和600%。其他3種培養基（MSG、DCR、1/2DCR）的增殖率低，分別為3.41g、2.69g、2.61g，增殖率達到424.4%、313.2%、301.5%。通過原始統計數據進行方差分析、顯著性檢驗，結果表示，BM2和SH培養基的增殖量顯著差異（P0.05）。增殖量的高低排序為BM>SH>MSG>DCR>1/2DCR。結果表明，BM2和SH培養基的增殖效果明顯優於其他3個培養基。雖然BM2培養基的增殖效果最好，但其繼代一次後褐化現象嚴重。SH培養基繼代培養後能夠保持較好的胚性，褐化現象較少。
基於此，為了研究個體之間的增殖是否存在差異性，分別選取了5種天山雲杉個體胚性愈傷組織(T6，T7，T36，T43，T48)，接種在SH培養基上的增殖情況。試驗數據統計結果表明，5種不同個體胚性愈傷組織增殖量變化不明顯(圖2)。5種個體的增殖量分別為4.63g、4.56g、4.50g、4.11g、4.09g。高低排序為T6>T36>T48>T43>T7。通過方差分析結果表示，各個體之間增殖量無顯著性差異(P>0.05)。
圖2中，a、b：增殖培養基的胚性愈傷組織；c：胚性胚柄團的顯微鏡觀察；d：胚性愈傷組織的顯微鏡下觀察尺寸：10mm(a，b)；100μm(c，d)。
實施例1
本發明的天山雲杉胚性愈傷組織高效增殖培養基為改良SH增殖培養基，具體配方如下：
大量元素
氯化鈣(CaCl2·2H2O) 134.5mg/L
硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 400mg/L
磷酸二氫鉀KH2PO4 340mg/L
微量元素
四水硫酸錳(MnSO4·4H2O) 11.15mg/L
一水硫酸錳(MnSO4·H2O) 20.8mg/L
七水硫酸鋅(ZnSO4·7H2O) 8mg/L
硼酸(H3BO3) 5mg/L
碘化鉀(KI) 1mg/L
六水氯化鈷(CoCl2·6H2O) 0.025mg/L
五水硫酸銅(CuSO4·5H2O) 0.24mg/L
二水鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O) 0.2mg/L
鐵鹽
乙二胺四乙酸鐵鈉(FeNaEDTA) 65.1mg/L
有機物
肌醇(Myo-Inositol) 1000mg/L
煙酸(Nicotinie Acid) 0.25mg/L
鹽酸吡哆醇(Pyridoxine-HCl) 0.25mg/L
鹽酸硫胺素(Thiamine-HCl) 0.5mg/L
L-甘氨酸（Glycine） 1mg/L
水解酪蛋白(Caseinhydrolysat) 500mg/L
蔗糖（Saccharose） 20g/L
卡拉膠(Gelrite) 3000mg/L
L-穀氨醯胺 450mg/L
外源生長調節劑
2,4-D 1.10mg/L
6-BA 0.44mg/L。
本發明的培養基的製備方法為：
製備時，首先，每升添加除L-穀氨醯胺外的配方量的各組分後，純淨水作為溶劑，攪拌均勻後調pH值至5.8±0.02，然後添加Gelrite（卡拉膠）作為固化劑，封口準備消毒；在121℃，2×107 Pa的壓力下進行15 min高壓滅菌後,將培養基自然冷卻至60℃時加入配方量（用孔徑為0.22μm的濾器過濾滅菌）的L-穀氨醯胺。然後將培養基倒入培養皿中自然冷卻凝固，放置1d後再使用。
本發明的天山雲杉胚性愈傷組織高效增殖的接種方法為：
將胚性愈傷組織接種於上述增殖培養基（培養器皿尺寸為70.3×28mm）上進行培養，每個培養器皿中接種0.65g的胚性愈傷組織（分成4塊接種於增殖培養基上）後，蓋上培養器皿蓋子，在黑暗中，溫度為23±2℃條件下培養。稱量時，首先，將愈傷組織與培養基分離，然後轉入無菌培養皿（稱量前去皮）進行新鮮增殖的稱量。記錄數據後再將胚性愈傷組織接回原處繼續培養。每周稱一次新鮮增殖量並觀察增殖的生長狀態，直至愈傷組織生長進入停止。為了避免汙染，上述操作均在超淨臺內進行。繪製生產曲線，確定最佳繼代周期。各處理均重複5次。
實施例2
本發明的天山雲杉胚性愈傷組織高效增殖培養基為改良BM2增殖培養基，具體配方如下：
大量元素
氯化鈣(CaCl2·2H2O) 134.5mg/L
硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 400mg/L
磷酸二氫鉀KH2PO4 340mg/L
微量元素
四水硫酸錳(MnSO4·4H2O) 11.15mg/L
一水硫酸錳(MnSO4·H2O) 20.8mg/L
七水硫酸鋅(ZnSO4·7H2O) 8mg/L
硼酸(H3BO3) 5mg/L
碘化鉀(KI) 1mg/L
六水氯化鈷(CoCl2·6H2O) 0.025mg/L
五水硫酸銅(CuSO4·5H2O) 0.24mg/L
二水鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O) 0.2mg/L
鐵鹽
乙二胺四乙酸鐵鈉(FeNaEDTA) 65.1mg/L
有機物
肌醇(Myo-Inositol) 1000mg/L
煙酸(Nicotinie Acid) 0.25mg/L
鹽酸吡哆醇(Pyridoxine-HCl) 0.25mg/L
鹽酸硫胺素(Thiamine-HCl) 0.5mg/L
L-甘氨酸（Glycine） 1mg/L
水解酪蛋白(Caseinhydrolysat) 500mg/L
蔗糖（Saccharose） 20g/L
卡拉膠(Gelrite) 3000mg/L
L-穀氨醯胺 450mg/L
外源生長調節劑
2,4-D 1.10mg/L
6-BA 0.44mg/L。
本實施例的培養基的製備方法和應用其增殖天山雲杉胚性愈傷組織的方法與實施例1相同。
最後應說明的是：以上所述僅為本發明的優選實施例而已，並不用於限制本發明，儘管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對於本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特徵進行等同替換。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。