生物體內功能性細胞的高效採集方法

2023-10-10 02:03:24

專利名稱：生物體內功能性細胞的高效採集方法
技術領域：
本發明涉及用於將生物體內組織中極少量地存在的幹細胞等功能性細胞低侵襲 且高效地回收的新的細胞採集方法。
背景技術：
以往，作為從生物體內採集高功能細胞的方法，例如，當為骨髓造血幹細胞時，有 將針直接刺入長骨或骨盆骨的骨髓中以採集骨髓液，然後在給予人的情況下通過離心分離 將幹細胞團濃縮，以幹細胞表面標記為指標用細胞儀採集、確認螢光標記的細胞等方法；當 為末梢血幹細胞時，有通過給予G-CSF將造血幹細胞動員到末梢血中，然後採集末梢血並 分離造血幹細胞等方法；當為間充質幹細胞時，有直接培養骨髓液、回收附著性增殖細胞， 從而得到間充質幹細胞的方法，通過手術採集脂肪組織等末梢組織並分離、培養其中存在 的間充質幹細胞等方法。但是，從骨髓採集骨髓液由於侵襲性強、伴隨著疼痛、並且有骨髓 內感染引起骨髓炎的危險，因此其施行需要專家來進行極嚴密的醫療技術，並且難以多次 施行。末梢組織的手術採集也存在同樣的風險。利用G-CSF的造血幹細胞動員在經濟上的 負擔重、並且也難以多次施行。如果能夠開發出更高效且安全地採集生物體內功能性細胞的方法，則不用說對於 苦於需要這些細胞的很多難治性疾病的患者來說是個鼓舞人心的好消息。現有技術文獻非專利文獻非專 利文獻 1 Transplantation of hematopoietic stem cells from theperipheral blood. J Cell Mol Med. 2005 ；9 :37-50非專利文獻 2 :Role of mesenchymal stem cells in regenerate medicine application to bone and cartilage repair. Expert Opin Biol Ther. 2008 ；8

發明內容
發明所要解決的課題本發明的課題在於提供用於將生物體內組織中極少量地存在的幹細胞等功能性 細胞低侵襲且高效地回收的新技術。用於解決課題的手段本發明提供僅通過將管低侵襲性地插入生物體內，從而高效地採集生物體內功能 性細胞的全新的技術。具體而言，在用生物低刺激性有機矽樹脂製成的圓筒狀管(單面為開放面、其相 反側面為封閉面，長徑為10毫米、截面積為約2平方毫米)內分別填充HMGB1、透明質酸、 磷酸緩衝液等，然後移植到GFP骨髓移植小鼠背部皮下。移植2周後回收管，採集被動員且 聚集到管內的細胞，對一部分細胞進行細胞培養，一部分進行利用FACS的細胞表面標記的 分析。其結果，與磷酸緩衝液相比，從填充了其他因子的管回收到顯著多的PDGFRa陽性細胞，並確認了這些細胞團中包含具有骨分化能力和軟骨分化能力的間充質幹細胞。本申請基於該認識提供以下的發明。〔1〕一種從由皮下取出到體外的容器回收細胞團的方法。〔2〕根據上述的從由皮下取出到體外的容器回收細胞團的方法，其中，所述細胞團 被以下的(a) (r)中任一項記載的物質、或者以下的(a) (r)中記載的物質中的任意 2種以上物質的混合物從骨髓動員到所述容器內；(a)HMGBl 蛋白質(b)分泌HMGBl蛋白質的細胞 (c)插入有編碼HMGBl蛋白質的DNA的載體(d)HMGB2 蛋白質(e)分泌HMGB2蛋白質的細胞(f)插入有編碼HMGB2蛋白質的DNA的載體(g)HMGB3 蛋白質(h)分泌HMGB3蛋白質的細胞(i)插入有編碼HMGB3蛋白質的DNA的載體(j)S100A8 蛋白質(k)分泌S100A8蛋白質的細胞(1)插入有編碼S100A8蛋白質的DNA的載體(m)S100A9 蛋白質(η)分泌S100A9蛋白質的細胞(ο)插入有編碼S100A9蛋白質的DNA的載體(ρ)透明質酸(q)細胞或組織的提取液(r)細胞或組織的提取液的肝素結合級分。〔3〕一種收集骨髓細胞的方法，其包含由從埋入皮下的容器回收的細胞團分離出 骨髓細胞的工序。〔4〕一種收集骨髓細胞的方法，其包含由從埋入皮下的容器回收的細胞團分離出 骨髓細胞的工序，其中，所述細胞團被以下的(a) (r)中任一項記載的物質、或以下的 (a) (r)中記載的物質中的任意2種以上物質的混合物從骨髓動員到所述容器內；(a)HMGBl 蛋白質(b)分泌HMGBl蛋白質的細胞(c)插入有編碼HMGBl蛋白質的DNA的載體(d)HMGB2 蛋白質(e)分泌HMGB2蛋白質的細胞(f)插入有編碼HMGB2蛋白質的DNA的載體(g)HMGB3 蛋白質(h)分泌HMGB3蛋白質的細胞(i)插入有編碼HMGB3蛋白質的DNA的載體(j)S100A8 蛋白質
(k)分泌S100A8蛋白質的細胞(1)插入有 編碼S100A8蛋白質的DNA的載體(m)S100A9 蛋白質(η)分泌S100A9蛋白質的細胞(ο)插入有編碼S100A9蛋白質的DNA的載體(ρ)透明質酸(q)細胞或組織的提取液(r)細胞或組織的提取液的肝素結合級分。〔5〕根據〔3〕或〔4〕所述的方法，其包含在從細胞團分離出骨髓細胞的工序之前， 從取出到體外的所述容器回收細胞團的工序。〔6〕根據〔2〕或〔4〕所述的方法，其中細胞或組織的提取液是通過包含將細胞或組 織浸漬到溶劑中的工序的方法製造的。〔7〕根據〔2〕或〔4〕所述的方法，其中，細胞或組織的提取液的肝素結合級分是通 過包含以下工序的方法製造的；(a)將細胞或組織浸漬到溶劑中的工序、(b)使工序(a)中得到的提取液與固定化肝素接觸的工序、和(c)從固定化肝素洗脫肝素結合級分的工序。〔8〕一種細胞團，其是通過〔1〕、〔2〕、〔6〕和〔7〕中任一項所述的方法回收的。〔9〕一種骨髓細胞，其是通過〔3〕 〔7〕中任一項所述的方法分離出來的。〔10〕一種組織再生劑，其含有〔8〕所述的細胞團。〔11〕一種組織再生劑，其含有〔9〕所述的骨髓細胞。〔12〕一種回收細胞團的方法，其包含以下工序；(I)將容器埋入皮下的工序、(II)從容器回收細胞團的工序。〔13〕根據〔12〕所述的方法，其包含在工序⑴之後將以下的(a) (r)中任一項 記載的物質、或以下的(a) (r)中記載的物質中的任意2種以上物質的混合物給予血管 或肌肉的工序；(a)HMGBl 蛋白質(b)分泌HMGBl蛋白質的細胞(c)插入有編碼HMGBl蛋白質的DNA的載體(d)HMGB2 蛋白質(e)分泌HMGB2蛋白質的細胞(f)插入有編碼HMGB2蛋白質的DNA的載體(g)HMGB3 蛋白質(h)分泌HMGB3蛋白質的細胞(i)插入有編碼HMGB3蛋白質的DNA的載體(j)S100A8 蛋白質(k)分泌S100A8蛋白質的細胞(1)插入有編碼S100A8蛋白質的DNA的載體
(m)S100A9 蛋白質(η)分泌S100A9蛋白質的細胞(ο)插入有編碼S100A9蛋白質的DNA的載體(ρ)透明質酸(q)細胞或組織的提取液(r)細胞或組織的提取液的肝素結合級分。〔14〕根據〔12〕所述的方法，所述容器含有以下的(a) (r)中任一項記載的物 質、或以下的(a) (r)中記載的物質中的任意2種以上物質的混合物；(a)HMGBl 蛋白質(b)分泌HMGBl蛋白質的細胞(c)插入有編碼HMGBl蛋白質的DNA的載體(d)HMGB2 蛋白質(e)分泌HMGB2蛋白質的細胞(f)插入有編碼HMGB2蛋白質的DNA的載體(g)HMGB3 蛋白質(h)分泌HMGB3蛋白質的細胞(i)插入有編碼HMGB3蛋白質的DNA的載體(j)S100A8 蛋白質(k)分泌S100A8蛋白質的細胞(1)插入有編碼S100A8蛋白質的DNA的載體(m)S100A9 蛋白質(η)分泌S100A9蛋白質的細胞(ο)插入有編碼S100A9蛋白質的DNA的載體(ρ)透明質酸(q)細胞或組織的提取液(r)細胞或組織的提取液的肝素結合級分。〔15〕一種收集骨髓細胞的方法，其包含以下工序；(I)將容器埋入皮下的工序、(II)從容器回收細胞團的工序、(III)從回收的細胞團分離出骨髓細胞的工序。〔16〕根據〔15〕所述的方法，其包含在工序⑴之後，將以下的(a) (r)中任一項記載的物質、或以下的(a) (r)中記載的物質中的任意2種以上物質的混合物給予血 管或肌肉的工序；(a)HMGBl 蛋白質(b)分泌HMGBl蛋白質的細胞(c)插入有編碼HMGBl蛋白質的DNA的載體(d)HMGB2 蛋白質(e)分泌HMGB2蛋白質的細胞(f)插入有編碼HMGB2蛋白質的DNA的載體
(g)HMGB3 蛋白質(h)分泌HMGB3蛋白質的細胞(i)插入有編碼HMGB3蛋白質的DNA的載體(j)S100A8 蛋白質(k)分泌S100A8蛋白質的細胞(1)插入有編碼S100A8蛋白質的DNA的載體(m)S100A9 蛋白質(η)分泌S100A9蛋白質的細胞 (ο)插入有編碼S100A9蛋白質的DNA的載體(ρ)透明質酸(q)細胞或組織的提取液(r)細胞或組織的提取液的肝素結合級分。〔17〕根據〔15〕所述的方法，其中，容器含有以下的(a) (r)中任一項記載的物 質、或以下的(a) (r)中記載的物質中的任意2種以上物質的混合物；(a)HMGBl 蛋白質(b)分泌HMGBl蛋白質的細胞(c)插入有編碼HMGBl蛋白質的DNA的載體(d)HMGB2 蛋白質(e)分泌HMGB2蛋白質的細胞(f)插入有編碼HMGB2蛋白質的DNA的載體(g)HMGB3 蛋白質(h)分泌HMGB3蛋白質的細胞(i)插入有編碼HMGB3蛋白質的DNA的載體(j)S100A8 蛋白質(k)分泌S100A8蛋白質的細胞(1)插入有編碼S100A8蛋白質的DNA的載體(m)S100A9 蛋白質(η)分泌S100A9蛋白質的細胞(ο)插入有編碼S100A9蛋白質的DNA的載體(ρ)透明質酸(q)細胞或組織的提取液(r)細胞或組織的提取液的肝素結合級分。〔18〕根據〔13〕、〔14〕、〔16〕和〔17〕中任一項所述的方法，其中，細胞或組織的提 取液是通過包含將細胞或組織浸漬到溶劑中的工序的方法製造的。〔19〕根據〔13〕、〔14〕、〔16〕和〔17〕中任一項所述的方法，其中，細胞或組織的提 取液的肝素結合級分是通過包含以下工序的方法製造的；(a)將細胞或組織浸漬到溶劑中的工序、(b)使工序(a)中得到的提取液與固定化肝素接觸的工序、和(c)從固定化肝素洗脫肝素結合級分的工序。
〔20〕一種細胞團，其是通過〔12〕 〔14〕中任一項所述的方法回收的。〔21〕一種骨髓細胞，其是通過〔15〕 〔17〕中任一項所述的方法分離出來的。〔22〕一種組 織再生劑，其含有〔20〕所述的細胞團。〔23〕一種組織再生劑，其含有〔21〕所述的骨髓細胞。


圖1為生物體內功能性細胞的高效回收方法的概略圖。通過將填充了生物體內功 能性細胞的特異性動員因子的低刺激性管(矽膠管等)留置在生物體內，從而將末梢循環 中或者組織中存在的功能性細胞選擇性地動員到管內。圖2為顯示管內聚集的細胞(tube-entrapping cells ；TECs)為GFP陽性的照片。圖3為TECs培養開始24小時後的照片。左照片表示附著於培養塑料平皿的增殖 的成纖維細胞樣細胞和上皮細胞樣細胞的亮場像、右照片表示其暗視野的GFP螢光像。圖4為評價從管內回收的TECs的成骨細胞分化能力的照片。將從管回收的細胞 在成骨細胞分化誘導培養基中進行培養，結果確認在約2周時分化為茜素紅染色陽性成骨 細胞。圖5為評價從管內回收的TECs的脂肪細胞分化能力的照片。將從管回收的細胞 在脂肪細胞分化誘導培養基中進行培養，結果確認在約2周時分化為油紅染色陽性脂肪細 胞。圖6為評價從管內回收的TECs的表皮細胞分化能力的照片。將從管回收的細胞 在表皮細胞分化誘導培養基中進行培養，結果確認在約2周時分化為表達表皮細胞特異性 角蛋白5的角化細胞。圖7為研究PDGFRa和CD44在TECs中的表達的圖。確認了 PDGFRa陽性和CD44 陽性細胞被回收到管內。圖8為使用Western blot法檢測新生小鼠皮膚提取液中的HMGB家族的照片。圖9為HMGB1表達載體的圖。圖10為顯示在HEK293細胞表達的純化重組Flag tag-HMGB家族融合蛋白質的 Western blot的結果的照片。圖11為顯示使用了 boyden小室的重組HMGBl、HMGB2、HMGB3的骨髓間充質幹細胞 遷移活性的圖。任一重組蛋白與對照組相比均顯示遷移活性。圖12為顯示在小鼠的皮膚潰瘍治療模型中HMGB家族的治療結果的圖。HMGB1、 HMGB2、HMGB3與對照組相比均顯示顯著地縮小潰瘍面積的效果。圖13為使用boyden小室確認人HMGBl和人皮膚提取液具有使人骨髓來源的間充 質幹細胞遷移的活性的照片。圖14為用肝素柱純化小鼠心臟、小鼠腦和小鼠皮膚提取液中的骨髓間充質幹細 胞誘導活性物質並使用boyden小室確認活性的照片。圖15為使用boyden小室法確認培養細胞株HEK293和HeLa提取液的人骨髓間充 質幹細胞遷移活性的照片。任一培養細胞株均顯示人骨髓間充質幹細胞遷移活性。圖16A為將小鼠固定於腦定位固定裝置，用手術刀在頭部正中切開，使用鑽頭進 行頭部穿孔的照片。圖16B為使用注射器並對腦施加負壓以吸引腦組織的一部分的照片。圖16C為注入5μ1將溶解於纖維蛋白膠製劑(纖維蛋白原)的皮膚提取液肝素柱純化級 分，接著注入5μ 1纖維蛋白膠製劑(凝血酶)後的照片。圖16D和圖16Ε為腦損傷模型治 療2周後的照片。與對照的圖16D相比可見在使用皮膚提取液肝素柱純化級分的治療組的 圖16Ε中GFP陽性細胞聚集。圖16F和圖16G為腦損傷模型治療6周後的照片。與對照的 圖16F相比可見在使用皮膚提取液肝素柱純化級分的治療組的圖16G中GFP陽性細胞聚 集。圖17為表示使用了 boyden小室測定的皮膚提取液對骨髓來源的間充質幹細胞的 遷移能力活性的測定結果的照片。其是用藍色色素對骨髓間充質幹細胞進行染色而得到的 圖像，所述骨髓間充質幹細胞從boyden小室的上槽內通過具有8 μ m的微孔的聚碳酸酯膜 的微孔遷移到含有皮膚提取液的下槽側並附著於膜下槽側。向下層中加入從2日齡小鼠和 6周齡小鼠採集的皮膚的提取液。圖18為使用Western blot法確認皮膚提取液中的S100A8、S100A9的蛋白質的存 在情況的圖。圖19為顯示將皮膚提取液中的!feparin結合蛋白質從肝素親和層析柱利用NaCl 濃度梯度進行洗脫的結果的照片。各級分的蛋白質利用SDS-PAGE進行分離並用銀染色進 行檢測。圖20為表示使用了 boyden小室測定的皮膚提取液對骨髓來源的間充質幹細胞的 遷移能力活性的測定結果的照片。其是用藍色色素對骨髓間充質幹細胞進行染色而得到的 圖像，所述骨髓間充質幹細胞從boyden小室的上槽內通過膜上的微孔遷移到皮膚提取液 的肝素結合的各級分(下槽側)中並附著於膜下槽側。圖21為使用Western blot法檢測皮膚提取液的肝素結合的各級分中的S100A8、 S100A9蛋白質的存在情況的結 果的照片。圖22為S100A8、S100A9表達載體的圖。圖23為表示使用了 boyden小室測定的皮膚提取液對骨髓來源的間充質幹細胞的 遷移能力活性的測定結果的照片。其是用藍色色素對骨髓間充質幹細胞進行染色而得到的 圖像，所述骨髓間充質幹細胞從boyden小室的上槽內通過膜上的微孔遷移到分別含有重 組GST-S100A8、GST-S100A9、皮膚提取液的下層側並附著於膜下槽側。圖24A為從小鼠的尾靜脈給予GST-S100A8、GST-S100A9，並對12小時後末梢血 中的⑶45陰性細胞的級分進行⑶44、PDGFRa ,PDGFR^的FACS而得到的圖。圖24B為以 FACS的結果為基礎，對GST-S100A8、GST-S100A9給予12小時後末梢血中的CD45陰性CD44 陽性PDGFRa陽性細胞、或者⑶45陰性⑶44陽性PDGFRi^陽性細胞的出現進行定量而得 到的圖。圖25為顯示S100A8對正常小鼠的皮膚潰瘍的治療效果的圖。圖26為顯示S100A8對糖尿病小鼠的皮膚潰瘍的治療效果的圖。圖27為顯示被皮膚提取液、末梢血提取液動員到裝置內的細胞對皮膚潰瘍的治 療效果的圖。圖28為顯示用螢光顯微鏡檢測被末梢血提取液的肝素親和層析柱結合成分動員 到裝置內的骨髓細胞的圖。圖29為用螢光顯微鏡檢測被末梢血提取液的肝素親和層析柱結合成分動員到裝置內的骨髓細胞，並用 圖像處理軟體對細胞數進行定量而得到的圖。圖30為用螢光顯微鏡檢測分別使用S100A8、HMGBl、HMGB2、HMGB3動員到裝置內 的骨髓來源的細胞(GFP陽性細胞)的圖(A :S100A81、B =HMGBUC :HMGB2D :HMGB3E 陰性對 照)。圖31為分別使用S100A8、HMGBU HMGB2動員到裝置內的骨髓來源的細胞對在 BALB/cAJcl-nu/nu製作的皮膚潰瘍的治療效果的圖。圖32為HMGBl表達載體的圖。圖33為從小鼠尾靜脈給予皮膚提取液(SE)並採集末梢血的圖。圖34為用抗小鼠PDGFRa抗體、抗小鼠⑶44抗體對給予皮膚提取液(SE) 12小時 後的小鼠末梢血單核細胞級分進行螢光標記，並利用流式細胞儀進行分級的圖。上面3個 為陰性對照的PBS給予組(η = 3)、下面3個為皮膚提取液(SE)給予組(η = 3)。長軸表 示⑶44的表達量、橫軸表示PDGFR α的表達量。藍線圍住的部分顯示⑶44陽性且PDGFR a 陽性細胞群，其在皮膚提取液給予組(SE)中與PBS組相比增加。圖35為從小鼠尾靜脈給予HMGBl並採集末梢血的圖。圖36為用抗小鼠PDGFR α抗體、抗小鼠⑶44抗體對給予HMGBl 12小時的小鼠末梢 血單核細胞級分進行螢光標記，並用流式細胞儀進行分級的圖。左圖為陰性對照的PBS給 予小鼠、右圖為HMGBl給予小鼠的圖。長軸表示CD44的表達量、橫軸表示PDGFRa的表達 量。藍線圍住的部分表示⑶44陽性且PDGFRa陽性細胞群，其在HMGBl給予小鼠中與PBS 給予小鼠相比增加。圖37A為顯示具有⑶44和PDGFR α的細胞的存在頻度的流式細胞儀的結果的圖。 末梢血中的PDGFR α陽性且⑶44陽性細胞和PDGFR α陽性且⑶44陰性細胞的所有細胞群 均在HMGBl給予後增加。圖37B為顯示比較PDGFR α陽性且⑶44陽性細胞、圖37C為顯示 比較PDGFRa陽性且⑶44陰性細胞分別在PBS給予組和HMGBl給予組的末梢血中的出現 頻度的結果的圖。在所有細胞群中，HMGBl給予組均統計學上顯著地增加。
具體實施例方式本發明提供從由皮下取出到體外的容器回收細胞團的方法。另外，本發明還提供一種收集骨髓細胞的方法，其包含由從埋入皮下的容器回收 的細胞團分離出骨髓細胞的工序。所述方法也可以包含在從細胞團分離出骨髓細胞的工序 之前，從取出到體外的所述容器回收細胞團的工序。本發明提供一種回收細胞團的方法，其包含以下工序(I)將容器埋入皮下的工序(II)從容器回收細胞團的工序。另外，本發明還提供一種收集骨髓細胞的方法，其包含以下工序(I)將容器埋入皮下的工序(II)從容器回收細胞團的工序(III)從回收的細胞團分離出骨髓細胞的工序。另外，上述方法還可以包含在工序(I)之後，將容器從皮下取出的工序。作為上述容器的材料，優選有機矽樹脂、乙烯基樹脂、塑料、其他生物低刺激性材料，但並不限制於此。另外，關於容器的大小，雖然在本實施例中使用長徑IOmmX截面積 2mm(容積為20ml、小鼠用)的容器，但只要是能夠插入皮下的尺寸，則不限制於此。關於容 器的厚度，雖然在本實施例中使用壁厚為約0. 5mm的容器，但只要是足夠強度維持所需的 厚度，則不限制於此。關於容器的形狀，雖然在本實施例中使用圓筒形且僅單面開放的容 器，但只要是圓筒、紡錘形、球形、卵形等不會對生物體組織造成損傷的形狀，則沒有特殊制 限。作為本申請中使用的容器，只要是矽膠管、乙烯基樹脂袋、注射用留置針等能夠在生物 體內留置的醫用器材、醫用材料，則沒有特別限制。本發明中，從容器回收的細胞團包括骨髓來源的細胞。本發明的骨髓細胞為除造血系幹細胞和其來源的白細胞、紅細胞、血小板以外的 細胞，目前包括以被稱為骨髓間充質幹細胞或骨髓間質多能幹細胞或骨髓多能幹細胞的細 胞為代表的幹細胞或者存在於骨髓中的組織祖細胞團。作為本發明的骨髓細胞，為能夠通 過骨髓採集(骨髓細胞採集)或者末梢血採集來進行分離的細胞。造血系幹細胞為非附 著細胞，本發明的骨髓細胞可以以附著細胞的形式如下獲得通過對從骨髓採集(骨髓細 胞採集)、末梢血採集獲得的血液中的單核細胞級分進行培養而獲得。另外，本發明的骨髓 細胞包括間充質幹細胞，並優選具有分化為成骨細胞(誘導分化可通過觀察鈣的沉積來識 別)、軟骨細胞(可通過阿辛藍染色陽性、番紅-ο染色陽性等來識別)、脂肪細胞(可通過 蘇丹III染色陽性來識別)，進一步優選具有分化為成纖維細胞、平滑肌細胞、基質細胞、肌 腱細胞等間充質細胞，更進一步優選具有分化為神經細胞、上皮細胞(例如表皮角化細胞、 腸道上皮細胞表達細胞角蛋白家族)、血管內皮細胞的能力，分化後的細胞並不限定於上述 細胞，也包括分化為肝臟、腎臟、胰臟等實質器官細胞的能力。在本發明中，骨髓來源的間充質幹細胞或骨髓間質多能幹細胞或骨髓多能幹細胞 是指存在於骨髓內的細胞，其能夠從骨髓直接採集或者從其他組織(血液、皮膚、脂肪或其 他組織)間接地採集並作為附著於(塑料或者玻璃制)培養皿的細胞進行培養、增殖，其為 具有分化為骨、軟骨、脂肪等間充質組織(間充質幹細胞)、或者分化為骨骼肌、心肌、甚至 分化為神經組織、上皮組織(多能幹細胞)的能力這樣的特徵的細胞，其可以通過骨髓血採 集、末梢血採集、甚至通 過採集脂肪等間充質組織、皮膚等上皮組織、腦等神經組織來獲得。 另外，骨髓來源的間充質幹細胞或骨髓來源的多能幹細胞或骨髓多能幹細胞還具有下述特 徵通過將一度附著於培養皿的這些細胞給予生物體的損傷部位，具有分化為例如構成皮 膚的角質形成細胞等上皮組織、構成腦的神經系統的組織的能力。本發明的骨髓間充質幹細胞或骨髓間質多能幹細胞或骨髓多能幹細胞除了具有 分化為成骨細胞(誘導分化可通過觀察鈣的沉積等來識別)、軟骨細胞(可通過阿辛藍染色 陽性、番紅-0染色陽性等來識別)、脂肪細胞(可通過蘇丹III染色陽性等來識別)的能力 夕卜，優選具有分化為例如成纖維細胞、平滑肌細胞、骨骼肌細胞、基質細胞、肌腱細胞等間充 質細胞、神經細胞、色素細胞、表皮細胞、毛囊細胞(表達細胞角蛋白家族、毛髮角蛋白家族 等)、上皮細胞(例如表皮角化細胞、腸道上皮細胞表達細胞角蛋白家族等)、內皮細胞，並 進一步優選具有分化為肝臟、腎臟、胰臟等實質器官細胞的能力，但分化後的細胞並不限定 於上述細胞。組織祖細胞被定義為具有單方向性地分化為除血液系統以外的特定組織細胞的 能力的未分化細胞，包括具有分化為上述的間充質組織、上皮組織、神經組織、實質器官、血管內皮的能力的未分化細胞。另外，作為本發明的骨髓細胞，可列舉出例如細胞表面標記CD44、PDGFRa和 PDGFR^中的至少1個為陽性的骨髓細胞，但並不限定於這樣的細胞。本發明中 ，將器器埋入皮下的工序如下進行在施行全身(或局部)麻醉後，用 手術刀將皮膚切開幾毫米，使用前端為圓形的金屬棒(蚊式止血鉗等)通過鈍性分離在皮 下脂肪組織內形成需要的空間，在該空間內埋入矽膠管等細胞回收用容器，最後縫合或用 stapler 固定。作為用於將容器留置在皮下的其他方法，可以考慮將注射用針的外筒與內筒(注 射針)一起刺入皮下，然後僅取出內筒而將外筒留置；將插入有導向針的球囊導管的導管 插入皮下，在去除導向針後，用藥液使球囊擴大而留置等方法。作為埋入容器的對象，可列舉出人或非人動物，可例示出例如人、小鼠、大鼠、猴、 豬、狗、兔、倉鼠、豚鼠等，優選人。本發明中，作為從容器回收細胞團的工序，可以是從在埋入皮下的狀態下的容器 回收細胞團的工序、或者是從皮下取出容器，從取出的容器回收細胞團的工序的任一種。例 如，在本申請實施例中，通過切開皮膚將埋入皮下的矽膠管回收，用移液管從管內吸引、回 收細胞，但也可以使用其他方法。作為從在埋入皮下的狀態下的容器回收細胞團的方法，使要埋入皮下的容器的一 端延長為管狀並在取出到體外的狀態下固定，在細胞回收時將注射器固定到管上，利用負 壓吸引、回收細胞。之後，將HMGBl溶液等、細胞誘導液再注入到留置在體內的管內，從而能 夠反覆地回收埋入皮下的容器內的細胞。將能夠實施該方法的形狀的容器留置在體內。本發明中，從回收的細胞團分離出骨髓細胞的工序可以如下進行例如從回收的 細胞團將附著於培養皿的附著性細胞分離。作為其他方法，可以如下進行例如使從取出到體外的管內利用移液管操作回收 的細胞與細胞表面標記⑶44、PDGFRa、PDGFR^中的至少一種反應，在與用不同螢光種類 標記的抗體反應後，用細胞儀以各螢光的有無為指標分別取出具有特定的細胞表面標記的 細胞團。另外，作為其他方法，還有下述方法(MACS)例如代替螢光而使用固定有金屬粒 子的抗體，使其同樣地與各種細胞表面標記反應，利用磁力使與該金屬附著抗體結合的細 胞在管內吸附、固定於一個壁上，使抗體和非反應性細胞充分地洗脫，然後除去磁力，回收 吸附於管內的目標細胞。本發明提供一種從由皮下取出到體外的容器回收細胞團的方法，其中，所述細胞 團被以下的(a) (r)中任一項記載的物質、或以下的(a) (r)中記載的物質中的任意 2種以上物質的混合物從骨髓動員到該容器內。另外，本發明還提供一種收集骨髓細胞的方法，其包含從埋入皮下的容器回收的 細胞團分離出骨髓細胞的工序，其中，所述細胞團被以下的(a) (r)中任一項記載的物 質、或以下的(a) (r)中記載的物質中的任意2種以上物質的混合物從骨髓動員到該容 器內。上述方法還可以包含在從細胞團分離出骨髓細胞的工序之前，從取出到體外的所述 容器回收細胞團的工序。(a)HMGBl 蛋白質
(b)分泌HMGBl蛋白質的細胞(c)插入有編碼HMGBl蛋白質的DNA的載體(d)HMGB2 蛋白質(e)分泌HMGB2蛋白質的細胞(f)插入有編碼HMGB2蛋白質的DNA的載體(g)HMGB3 蛋白質(h)分泌HMGB3蛋白質的細胞(i)插入有編碼HMGB3蛋白質的DNA的載體(j)S100A8 蛋白質 (k)分泌S100A8蛋白質的細胞(1)插入有編碼S100A8蛋白質的DNA的載體(m)S100A9 蛋白質(η)分泌S100A9蛋白質的細胞(ο)插入有編碼S100A9蛋白質的DNA的載體(ρ)透明質酸(q)細胞或組織的提取液(r)細胞或組織的提取液的肝素結合級分。本發明提供一種回收細胞團的方法，其包含以下工序，且包含在工序(I)之後，將 上述的(a) (r)中任一項記載的物質、或上述的(a) (r)中記載的物質中的任意2種 以上物質的混合物給予血管或肌肉的工序。(I)將容器埋入皮下的工序(II)從容器回收細胞團的工序。對於工序(II)，可以從置於體內的容器回收細胞團，也可以從取出到體外的容器 回收細胞團。另外，本發明還提供一種收集骨髓細胞的方法，其包括以下工序，且包含在工序 (I)之後，將上述的(a) (r)中任一項記載的物質、或上述的(a) (r)中記載的物質中 的任意2種以上物質的混合物給予血管或肌肉的工序。(I)將容器埋入皮下的工序(II)從容器回收細胞團的工序(III)從回收的細胞團分離出骨髓細胞的工序。對於工序(II)，可以從置於體內的容器回收細胞團，也可以從取出到體外的容器 回收細胞團。本發明提供一種回收細胞團的方法，其包含以下工序，且容器含有上述的(a) (r)中任一項記載的物質、或上述的(a) (r)中記載的物質中的任意2種以上物質的混合 物。(I)將容器埋入皮下的工序(II)從容器回收細胞團的工序。對於工序(II)，可以從置於體內的容器回收細胞團，也可以從取出到體外的容器 回收細胞團。
另外，本發明提供一種收集骨髓細胞的方法，其包含以下工序，且容器含有上述的(a) (r)中任一項記載的物質、或上述的(a) (r)中記載的物質中的任意2種以上物質 的混合物。(I)將容器埋入皮下的工序(II)從容器回收細胞團的工序(III)從回收的細胞團分離出骨髓細胞的工序。對於工序(II)，可以從置於體內的容器回收細胞團，也可以從取出到體外的容器 回收細胞團。此外，本發明還提供一種回收細胞團的方法，其包含以下工序，且容器含有上述的 (a) (r)中任一項記載的物質、或上述的(a) (r)中記載的物質中的任意2種以上物質 的混合物，並且包含在工序⑴之後，將上述的(a) ω中任一項記載的物質、或上述的 (a) (r)中記載的物質中的任意2種以上物質的混合物給予血管或肌肉的工序。(I)將容器埋入皮下的工序(II)從容器回收細胞團的工序對於工序(II)，可以從置於體內的容器回收細胞團，也可以從取出到體外的容器 回收細胞團。另外，本發明提供一種收集骨髓細胞的方法，其包含以下工序，且容器含有上述的 (a) (r)中任一項記載的物質、或上述的(a) (r)中記載的物質中的任意2種以上物質 的混合物，並且包含在工序⑴之後，將上述的(a) ω中任一項記載的物質、或上述的 (a) (r)中記載的物質中的任意2種以上物質的混合物給予血管或肌肉的工序。(I)將容器埋入皮下的工序(II)從容器回收細胞團的工序(III)從回收的細胞團分離出骨髓細胞的工序對於工序(II)，可以從置於體內的容器回收細胞團，也可以從取出到體外的容器 回收細胞團。作為本發明中的HMGBl蛋白質，可例示出包含序列號1、3或5中記載的胺基酸序 列的蛋白質，但並不限定於這些。本發明的HMGBl蛋白質還包括與包含序列號1、3或5中 記載的胺基酸序列的蛋白質在功能上等同的蛋白質。作為這樣的蛋白質，可列舉出例如1) 由在序列號1、3或5中記載的胺基酸序列中替換、缺失、插入和/或添加1個或多個氨基 酸而得到的胺基酸序列構成，且與包含序列號1、3或5中記載的胺基酸序列的蛋白質在功 能上等同的經分離的蛋白質、和2)為由與包含序列號2、4或6中記載的鹼基序列的DNA在 嚴格的條件下雜交的DNA編碼的蛋白質，且與包含序列號1、3或5中記載的胺基酸序列的 蛋白質在功能上等同的經分離的蛋白質。作為本發明中的HMGB2蛋白質，可例示出包含序列號7、9或11中記載的胺基酸 序列的蛋白質，但並不限定於這些。本發明的HMGB2蛋白質還包括與包含序列號7、9或11 中記載的胺基酸序列的蛋白質在功能上等同的蛋白質。作為這樣的蛋白質，可列舉出例如 1)由在序列號7、9或11中記載的胺基酸序列中替換、缺失、插入和/或添加1個或多個氨 基酸而得到的胺基酸序列構成，且與包含序列號7、9或11中記載的胺基酸序列的蛋白質 在功能上等同的經分離的蛋白質、和2)為由與包含序列號8、10或12中記載的鹼基序列的DNA在嚴格的條件下雜交的DNA編碼的蛋白質，且與包含序列號7、9或11中記載的氨 基酸序列的蛋白質在功能上等同的經分離的蛋白質。作為本發明中的HMGB3蛋白質，可例示出包含序列號13或15中記載的胺基酸序 列的蛋白質，但並不限定於這些。本發明的HMGB3蛋白質還包括與包含序列號13或15中 記載的胺基酸序列的蛋白質在功能上等同的蛋白質。作為這樣的蛋白質，可列舉出例如1) 由在序列號13或15中記載的胺基酸序列中替換、缺失、插入和/或添加1個或多個氨基 酸而得到的胺基酸序列構成，且與包含序列號13或15中記載的胺基酸序列的蛋白質在功 能上等同的經分離的蛋白質、和2)為由與包含序列號14或16中記載的鹼基序列的DNA在 嚴格的條件下雜交的DNA編碼的蛋白質，且與包含序列號13或15中記載的胺基酸序列的 蛋白質在功能上等同的經分離的蛋白質。作為本發明中的S100A8蛋白質，可例示出包含序列號17、19或21中記載的氨基 酸序列的蛋白質，但並不限定於這些。本發明的S100A8蛋白質還包括與包含序列號17、19 或21中記載的胺基酸序列的蛋白質在功能上等同的蛋白質。作為這樣的蛋白質，可列舉出 例如1)由在序列號17、19或21中記載的胺基酸序列中替換、缺失、插入和/或添加1個 或多個胺基酸而得到的胺基酸序列構成，且與包含序列號17、19或21中記載的胺基酸序 列的蛋白質在功能上等同的經分離的蛋白質，和2)為由與包含序列號18、20或22中記載 的鹼基序列的DNA在嚴格的條件下雜交的DNA編碼的蛋白質，且與包含序列號18、20或22 中記載的胺基酸序列的蛋白質在功能上等同的經分離的蛋白質。作為本發明中的S100A9蛋白質，可例示出包含序列號23、25或27中記載的氨基 酸序列的蛋白質，但並不限定於這些。本發明的S100A9蛋白質還包括與包含序列號23、25 或27中記載的胺基酸序列的蛋白質在功能上等同的蛋白質。作為這樣的蛋白質，可列舉出 例如1)由在序列號23、25或27中記載的胺基酸序列中替換、缺失、插入和/或添加1個 或多個胺基酸而得到的胺基酸序列構成，且與包含序列號23、25或27中記載的胺基酸序 列的蛋白質在功能上等同的經分離的蛋白質，和2)為由與包含序列號24、26或28中記載 的鹼基序列的DNA在嚴格的條件下雜交的DNA編碼的蛋白質，且與包含序列號23、25或27 中記載的胺基酸序列的蛋白質 在功能上等同的經分離的蛋白質。與包含序列號:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中記載的胺基酸序 列的蛋白質在功能上等同的經分離的蛋白質可以是包含序列號1、3、5、7、9、11、13、15、17、 19、21、23、25或27中記載的胺基酸序列的蛋白質的同源物或者旁系同源物。關於與包含序 列號1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中記載的胺基酸序列的蛋白質在功能上 等同的蛋白質，本領域技術人員可以通過公知的方法(実験醫學別冊·遺伝子工學〃 > K
, 」，pp246-251、羊土社、1991年発行)來分離。作為與包含序列號:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中記載的氨基 酸序列的蛋白質在功能上等同的蛋白質，可列舉出具有骨髓來源的細胞的誘導活性的蛋白 質。作為由在序列號:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中記載的胺基酸序 列中替換、缺失、插入和/或添加1個或多個胺基酸而得到的胺基酸序列構成、且與包含序 列號1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中記載的胺基酸序列的蛋白質在功能上
等同的蛋白質包括天然存在的蛋白質。一般來說，如通過幹擾素基因等所已知的，真核生物的基因具有多態性(polymorphism)。根據該多態性所產生的鹼基序列的變化的不同而不 同，有時1個或多個胺基酸被替換、缺失、插入和/或添加。屬於這樣自然存在的蛋白質且 具有在序列號1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中記載的胺基酸序列中替換、 缺失、插入和/或添加1個或多個胺基酸而得 到的胺基酸序列，並且與由序列號1、3、5、7、 9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中記載的胺基酸序列構成的蛋白質在功能上等同的蛋 白質也包括在本發明的HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白質中。另外，只要是與由序列號:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中記載的 胺基酸序列構成的蛋白質在功能上等同的蛋白質，則人為製作的變異蛋白質也包括在本發 明中。作為對給定的鹼基序列施加隨機變異的方法，已知例如通過DNA的亞硝酸處理的鹼 基對的替換(Hirose，S. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，79 :7258_7260，1982)。該方 法中，通過對欲導入變異的片段進行亞硝酸處理，能夠在特定的片段中隨機地導入鹼基對 的替換。或者另外，作為在任意位點導入目標變異的技術，有gappedduplex法等(Kramer W. and Fritz HJ.，Methods in Enzymol.，154 :350_367，1987)。將克隆要導入變異的基 因而得到的環狀雙鏈載體分成單鏈，使其與在目標部位具有變異的合成寡核苷酸雜交。使 被限制性內切酶切斷而形成線狀的載體來源的互補單鏈DNA與上述環狀單鏈載體黏著 (anneal)，用DNA聚合酶填充該載體與上述合成核苷酸之間的間隙，進而通過連接形成完 整的雙鏈環狀載體。所改變的胺基酸的數目典型地為50個胺基酸以內、優選為30個胺基酸以內、進一 步優選為5個胺基酸以內(例如1個胺基酸)。在人為地替換胺基酸的情況下，如果替換為性質相似的胺基酸，則容易維持原蛋 白質的活性。本發明的蛋白質包括為在上述胺基酸替換中進行保守性替換而得到的蛋白 質，且與包含序列號1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中記載的胺基酸序列的 蛋白質在功能上等同的蛋白質。在替換對於蛋白質活性來說重要的區域的胺基酸等情況 下，保守性替換是重要的。這樣的胺基酸的保守性替換對於本領域技術人員來說是熟知的。作為相當於保守性替換的胺基酸的組，可列舉出例如鹼性胺基酸(例如賴氨酸、 精氨酸、組氨酸)、酸性胺基酸(例如天冬氨酸、穀氨酸)、不帶電荷的極性胺基酸(例如甘 氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性胺基酸(例如丙氨 酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β支鏈胺基酸(例如蘇 氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族胺基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)等。另外，通過非保守性替換也會使蛋白質的活性等進一步提高(包括例如恆定的活 化型蛋白質(constitutively activated proteins)等)。此外，作為獲得與包含序列號:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中記 載的胺基酸序列的蛋白質在功能上等同的蛋白質的方法，可列舉出利用雜交反應的方法。 即，將編碼如序列號:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26或28所示的本發明的編碼 HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白質的DNA、或者或其斷片製成探針，分離能夠與 其雜交的DNA。若在嚴格的條件下實施雜交反應，能夠選擇同源性高的DNA作為鹼基序列， 其結果是分離的蛋白質含有與HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白質在功能上等 同的蛋白質的可能性增加。同源性高的鹼基序列是指能夠顯示例如70%以上、優選90%以 上的相同性。
另外，嚴格的條件具體地是指例如在6XSSC、40%甲醯胺、25°C下進行雜交、且在 1XSSC、55°C下進行洗滌的條件。嚴格性受鹽濃度、甲醯胺的濃度或溫度等條件的影響，但 只要是本領域技術人員，就能夠設定這些條件以獲得所需的嚴格性。通過利用雜交，能夠將編碼例如除包含序列號1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、 23,25或27中記載的胺基酸序列的蛋白質以外的HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9 蛋白質的同源物的DNA分離。與包含序列號:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中記載的胺基酸序 列的蛋白質在功能上等同的蛋白質通常與序列號1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25 或27中記載的胺基酸序列具有高的同源性。高的同源性是指至少30%以上、優選50%以 上、進一步優選80%以上(例如95%以上)的序列具有相同性。關於鹼基序列或胺基酸 序列的相同性，可以利用使用了網絡的同源性檢索網站來進行[例如在日本DNA資料庫 (DDBJ)中，可以利用FASTA、BLAST、PSI-BLAST和SSEARCH等同源性檢索[例如日本DNA 資料庫(DDBJ)網站上的同源性檢索(Search and Analysis)的網頁http//www. ddbj. nig. ac. jp/E_mail/homology_j· html]ο 另夕卜，在 National Center forBiotechnology Information(NCBI)中，還可以進行使用了 BLAST的檢索(例如NCBI主頁的網站的BLAST NM :http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/ ；Altschul，S. F. et al. ,J. Mol. Biol. ，1990, 215(3) 403-10 ；Altschul，S.F. &Gish,ff.，Meth.Enzymol.，1996,266 460-480 ；Altschul， S. F. et al.，Nucleic Acids Res.，1997，25 :3389_3402)]。例如，在使用Advanced BLAST 2. 1中的胺基酸序列的相同性的計算中，相同 性(identity)的值(％ )可以如下進行檢索來得到程序使用blastp，將Expect值設 定為 10、將 Filter 全部設定為 OFF, Matrix 使用 BL0SUM62，並將 Gap existence cost、 Per residue gap cost 和 Lambda ratio 分別設定為 11、1、0· 85 (預設值)(Karlin, S. and S. F. Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 2264-68 ；Karlin, S. and S. F. Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873_7)。本發明的蛋白質或在功能上與其等同的蛋白質可以是進行了糖鏈等生理性修飾、 螢光或放射性物質等標記或者與其他蛋白質的融合等各種修飾而得到的蛋白質。特別是在 後文所述的基因重組體中，糖鏈的修飾可能因用於表達的宿主的不同而產生差異。但是，即 使在糖鏈的修飾方面存在差異，只要顯示與本說明書中公開的HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8 或S100A9蛋白質相同的性狀，則均屬於本發明的HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋 白質或在功能上等同的蛋白質。HMGBl、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白質不僅可以從生物體材料獲得，而且 可以通過將對其進行編碼的基因整合入適當的表達體系並製成基因重組體(recombinant) 來獲得。為了通過基因工程技術獲得HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白質，可 以將上文所述的編碼HMGBl、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白質的DNA整合入適當 的表達體系並使之表達。作為本發明中可應用的宿主/載體體系，可舉出例如表達載體 PGEX和大腸桿菌。由於pGEX可以使外來基因以與穀胱甘肽S-轉移酶(GST)的融合蛋白 質的方式表達(Gene，67 :31_40，1988)，因此通過熱激將整合了編碼HMGB1、HMGB2、HMGB3、 S100A8或S100A9蛋白質的基因的pGEX導入BL21等大腸桿菌株中，在適當培養一段時間 後，添加 isopropylthio-β -D-galactoside (IPTG)以誘導 GST 融合HMGBl、GST 融合HMGB2、GST融合HMGB3、GST融合S100A8 或GST融合S100A9蛋白質的表達。本發明的GST由於 吸附於穀胱甘肽瓊脂糖4B，因此表達產物能夠容易地通過親和層析法(affinity column chromatography) j^M^^ito此夕卜，作為用於獲得HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白質的重組體的 宿主/載體體系，還可以採用下述的體系。首先，當利用細菌作為宿主時，市售的有利用了 組氨酸標籤(histidine-tag)、HA標籤(HA-tag)、FLAG(FLAG-tag)標籤等的融合蛋白質 的表達用載體。關於酵母，已公知Pichia屬酵母對於具有糖鏈的蛋白質的表達是有效的。 從糖鏈的添加的角度出發，還可以採用利用了以昆蟲細胞為宿主的杆狀病毒載體的表達體 系(Bio/Technology，6 :47_55，1988)。此外，還利用哺乳動物的細胞可以進行利用了 CMV、 RSV或SV40等啟動子的載體的轉染，這些宿主/載體體系均能夠用作HMGB1、HMGB2、HMGB3、 S100A8或S100A9蛋白質的表達體系。另外，還可以利用逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相 關病毒載體等病毒載體來導入基因。得到的本發明的蛋白質可以從宿主細胞內或細胞外(培養基等)分離，然後純化 成實質上純且均一的蛋白質。蛋白質的分離、純化可以使用在通常的蛋白質純化中使用的 分離、純化方法，沒有任何限定。例如，可以適當選擇、組合色譜柱、過濾器、超濾、鹽析、溶劑 沉澱、溶劑提取、蒸餾、免疫沉降、SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電聚焦電泳、透析、重結晶等 以對蛋白質進行分離、純化。作為色譜法，可列舉出例如親和層析法、離子交換色譜法、疏水性色譜法、凝膠過 濾法、逆相色譜法、吸附層析法等(Marshak et al. ,Strategies forProtein Purification and Characterization :A Laboratory Course Manual. EdDaniel R. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)。這些色譜法可以使用液相色譜法例如HPLC、FPLC等液相色譜法 來進行。另外，本發明的蛋白質優選是實質上經純化的蛋白質。這裡，「實質上經純化」是 指本發明的蛋白質的純化度(本發明的蛋白質在蛋白質成分總體中的比例)為50%以上、 60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、100%或者接近100%。接近100%的 上限依賴於本領域技術人員的純化技術和分析技術，例如為99. 999%,99. 99%,99. 9%,
99% 等。另外，只要是具有上述純化度的蛋白質，則可以是通過任何純化方法進行了純化 的蛋白質，包括實質上經純化的蛋白質。例如，可例示出通過適當選擇或組合上述色譜柱、 過濾器、超濾、鹽析、溶劑沉澱、溶劑提取、蒸餾、免疫沉降、SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電 聚焦電泳、透析、重結晶等方法而實質上純化得到的蛋白質，但並不限定於這些。作為本發明的釋放或分泌HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白質的細胞， 基本上生物體內所有組織來源的細胞均可以。作為容易採集和培養的細胞，可例示出成纖 維細胞(例如正常皮膚成纖維細胞和其來源的細胞株)，但並不限定於這些。另外，分泌 HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白質的細胞也可以通過將下述載體導入成纖維細 胞(例如正常皮膚成纖維細胞和其來源的細胞株)等哺乳類細胞、昆蟲細胞或其他細胞來 製作，所述載體是通過將編碼HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白質的DNA、或者通 過將編碼分泌信號的 DNA (ATG CAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG CTG CTGTGG GTT CCA GGT TCC ACT GGT GAC ；序列號29)結合到編碼 HMGBl、HMGB2、HMGB3、S100A8 或S100A9蛋白質的DNA上而得到的DNA插入公知的表達載體或基因治療用載體而製作的。作 為編碼分泌信號的DNA，可例示出具有上述序列的DNA，但並不限定於此。另外，這些細胞所 來源的動物種沒有特別限制，優選使用要給予載體的對象動物種的細胞、對象自身的細胞、 或者與要給予載體的對象具有血緣關係的動物來源的細胞。編碼本發明的HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白質的DNA只要編碼 HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白質，則可以是cDNA、也可以是基因組DNA，另外， 還可以是天然的DNA或是人工合成的DNA。編碼HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋 白質的DNA通常以插入到載體中的狀態給予。作為本發明中的載體，可例示出質粒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒 載體、腺相關病毒載體、仙臺病毒載體、仙臺病毒包膜載體、乳頭狀瘤病毒載體等，但並不限 定於這些。該載體中還可以包括有效地誘導基因表達的啟動子DNA序列、控制基因表達的 因子以及維持DNA的穩定性所需的分子。另夕卜，本發明中還可以利用屬於HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白質的 部分多肽且具有誘導骨髓來源的細胞的活性的多肽、分泌該部分多肽的細胞或插入有編碼 該部分多肽的DNA的載體。透明質酸(hyaluronan)是N-乙醯葡糖胺與葡萄糖醛酸這兩種糖結合、連接而成 的糖胺聚糖(粘多糖)。化學名表示為[—3] -2acetamiod-2deoxy- β -D-glucopyranosy 1-(1 — 4) β -D-glucopyrano-syluronic acid_(l — ]n。天然的透明質酸大多為具有分子 量數為十萬以上的分子量的高分子透明質酸，而人工可以製作2糖 14糖的低分子透明質 酸。例如在醫療技術領域中，當用於注入關節腔內時以透明質酸鈉的形式使用。作為製造方 法，有提取、純化由乳酸菌的一種Str印tococcus zooepidemicus產生的透明質酸的方法， 有從雞的雞冠等提取、純化的方法等。可以對透明質酸進行酯化、過碘酸酸化、異脲偶聯、硫 酸化等各種修飾。另外，還可以進行醚交聯、酯交聯。通過進行這些修飾，能夠增加對分解 的穩定性、不溶性、可製成海綿狀、對物質進行緩釋的性質。另外，CD44為透明 質酸的受體， 因此透明質酸對細胞表面具有⑶44的間充質幹細胞具有遷移活性。在本發明方法中使用的細胞或組織的提取液可通過包含將細胞或組織浸漬到溶 劑中的工序的方法來製造。作為浸漬到溶劑中的細胞或組織，沒有特殊限制，可例示出組織來源的細胞、由組 織來源的細胞建立的細胞株(可例示出例如HeLa、HEK293，但並不限制於這些)、經分離的 細胞、未經分離的細胞(例如分離的組織中存在的細胞)、導入有編碼HMGB1、HMGB2、HMGB3、 S100A8或S100A9蛋白質的DNA的細胞等。作為上述組織，可以是任意組織，可例示出例如 活體皮膚組織、體內活檢(手術)組織(腦、肺、心臟、肝臟、胃、小腸、大腸、胰臟、腎臟、膀 胱、脾臟、子宮、睪丸或血液等)，但並不限定於這些。作為上述溶劑，可例示出生理鹽水、PBS(Phosphate-buffered saline)、 TBS(Tris-buffered saline)，但並不限制於這些。另外，作為將細胞或組織浸漬到溶劑中 的時間，可例示出誘導細胞壞死所需的充足的時間，即1小時 48小時(例如6小時 48 小時)，優選12 24小時，但並不限定於該時間。因此，「將細胞浸漬到溶劑中的工序」也 可以換言之為「在用於誘導壞死所需的足夠的時間內、將細胞浸漬到溶劑中的工序」或「使 細胞壞死的工序」。另外，作為將細胞或組織浸漬到溶劑中的溫度，可例示出4°C 25°C (例如4°C 8°C)、優選為4°C，但並不限制於此。另外，作為將細胞或組織浸漬到溶劑中的pH， 可例示出pH為7 8、優選pH為7. 5，但並不限制於此。另外，作為緩衝液的成分，可列舉 出IOmM 50mM、優選10 20mM的濃度的磷酸緩衝液，但並不限制於此。另外，本發明中， 在將細胞或組織浸漬到溶劑中後，還可以從含有細胞或組織的溶 劑中除去該細胞或該組織。從溶劑中除去細胞或組織的方法可以是本領域技術人員公知 的方法，沒有特殊限制。例如可以通過在4°C 25°C (例如4°C)、且重力加速度為IOG 100000G(例如440G)下進行離心以分離得到上清液，從而從溶劑中除去細胞或組織，但並 不限制於此。可以將該上清液用作細胞或組織的提取液。本發明中使用的通過包含將細胞或組織浸漬到溶劑中的工序的方法製造的細胞 或組織的提取液，可列舉出例如皮膚提取液或末梢血單核細胞提取液(末梢血提取液)，但 並不限制於這些。末梢血提取液的製備方法為在使用注射器等採血後，用冰箱、液氮或乾冰等將細 胞冷凍，然後在0°c以上的溫度下使其再融解。此外，為了除去細胞的不溶成分，可以通過 例如在4°C 25 V (例如40C )、且重力加速度為IOG 100000G (例如440G)下進行離心 以分離得到上清液，從而從溶劑中除去細胞的不溶成分，但並不限制於此。可以將該上清液 用作細胞或組織的提取液。為了除去細胞的不溶成分，代替離心操作，可以使其通過具有 0. 45 μ m的微小孔的硝化纖維素濾膜等來將不溶成分除去。另外，可以通過將採集的末梢血 在4°C的狀態下放置3小時 48小時來誘發細胞壞死，以使從末梢血中的細胞釋放細胞內 成分。可以通過在該後重力加速度為IOG 100000G(例如440G)下進行離心以分離得到 上清液，來從溶劑中將細胞的不溶成分除去，但並不限制於此。可以將該上清液用作細胞或 組織的提取液。為了除去細胞的不溶成分，代替離心操作，還可以使其通過具有0.45μπι的 微小孔的硝化纖維素濾膜等來將不溶成分除去。本發明的方法中使用的細胞或組織的提取液的肝素結合級分可以通過包含以下 工序的方法來製造。(a)將細胞或組織浸漬到溶劑中的工序、(b)使工序(a)中得到的提取液與固定化肝素接觸的工序、和(c)從固定化肝素中將肝素結合級分(也可表述為肝素純化級分、肝素柱純化級 分)洗脫的工序固定化肝素是將肝素共價結合到不溶性載體上而得到的。作為上述不溶性載 體，可例不出 Sepharose beads (Sepharose 4B，Sepharose 6B 等GEHealthcare)，但並 不限制於此。本發明中還可以使用市售的固定化肝素(Hitrap Hepalin HP column :GE Healthcare)0作為細胞或組織的提取液與固定化肝素的接觸條件，可例示出pH為7 8左右 (優選pH為7. 5)，鹽濃度為0 200mM、優選為100 200mM左右，但並不限制於這些。提 取液與固定化肝素接觸的時間沒有特殊限定，但從使肝素結合級分充分地吸附於固定化肝 素的觀點出發，優選保持5分鐘以上。另外，作為溫度，可列舉出4 8°C、優選4°C，但並不 限制於這些。此外，作為吸附於固定化肝素的肝素結合級分的洗脫條件，可例示出pH為7 8左右、鹽濃度為200 IOOOmM (優選為IOOOmM左右)，但並不限制於這些。另外，作為本發明的方法中使用的上述(a) (r)中記載的物質中的任意2種以上物質的混合物，可列舉出例如透明質酸與HMGBl蛋白質、透明質酸與HMGB2蛋白質、透明質酸與HMGB3蛋白質、透明質酸與S100A8蛋白質、透明質酸與S100A9蛋白質、透明質酸與 HMGBl蛋白質與HMGB2蛋白質、透明質酸與HMGB2蛋白質與HMGB3蛋白質、透明質酸與HMGBl 蛋白質與HMGB3蛋白質、透明質酸與HMGBl蛋白質與HMGB2蛋白質與HMGB3蛋白質、透明質 酸與S100A8蛋白質與S100A9蛋白質、透明質酸與HMGBl蛋白質與S100A8蛋白質、透明質 酸與HMGB2蛋白質與S100A8蛋白質、透明質酸與HMGB3蛋白質與S100A8蛋白質、透明質酸 與HMGBl蛋白質與S100A9蛋白質、透明質酸與HMGB2蛋白質與S100A9蛋白質、透明質酸與 HMGB3蛋白質與S100A9蛋白質、細胞或組織的提取液與透明質酸、細胞或組織的提取液的 肝素結合級分與透明質酸等的組合，優選為細胞或組織的提取液與透明質酸的混合液，但 並不限定於這些。關於混合的比例，在溶解到溶劑的狀態下，當將體積比最少的成分作為1 時，可以達到它的10000倍地混合其他成分，優選當將最少的成分作為1時，其他成分可以 以1 10倍的量添加。作為本發明中的提取液、肝素結合級分、HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋 白質的來源的動物種，可列舉出人或非人動物，可例示出例如人、小鼠、大鼠、猴、豬、狗、兔、 倉鼠、豚鼠等，優選為與上述提取液等所給予的動物種相同的動物種。當給予本發明的提取液、肝素結合級分、HMGBU HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9 蛋白質時，其給予方法為給予血管內或肌肉的非經口給予。作為所述的給予方法，具體地可 列舉出注射給予。例如，可以通過血管內注射(動脈內注射、靜脈內注射等)、肌肉內注射、 皮下注射等來將本發明的藥劑給予血管、肌肉或皮下(例如埋入皮下的容器中或容器的附 近)。另外，還可以通過可經皮吸收的貼劑或外用劑來緩釋地使其吸收。另外，可以根據對象的年齡、症狀來選擇適當的給予方法。當給予HMGBl、HMGB2、 HMGB3、S100A8或S100A9蛋白質時，例如每次給予可以在每Ikg體重在0. OOOOOOlmg IOOOmg的範圍中選擇給予量。或者，可以例如在每位對象0. 00001 100000mg/body的範 圍內選擇給予量。當給予分泌HMGBl、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白質的細胞或插 入有編碼HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白質的DNA的基因治療用載體時，可以 按照HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白質的量達到上述範圍內的方式給予。但 是，本發明的本發明中的提取液、肝素結合級分、HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋 白質的給予量並不限於這些給予量。給予時，可以將提取液、肝素結合級分、HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9 蛋白質按照常規方法製成製劑(例如，Remington 『 sPharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U. S. A)，還可以同時含有醫藥上可容許的載 體或添加物。可列舉出例如表面活性劑、賦形劑、著色劑、香料、防腐劑、穩定劑、緩衝劑、懸 浮齊 、等滲齊 、粘合劑、崩解齊 、潤滑齊 、流動性促進齊 、矯味劑等，但並不限制於這些，還可 以適當使用其他常用的載體。具體而言，可列舉出輕質矽酸酐、乳糖、結晶纖維素、甘露醇、 澱粉、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯醇縮醛 二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明膠、中鏈脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯固化蓖麻油60、 白糖、羧甲基纖維素、玉米澱粉、無機鹽類等。另外，當容器含有本發明的提取液、肝素結合級分、HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或 S100A9蛋白質時，提取液、肝素結合級分、HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8或S100A9蛋白質可以如下注入到容器中。具體而言，將各溶劑溶解到生理鹽水中，使用注射器或移液管手工地 注入。或者在管制造時機械地注入。另外，關於容器中含有的本發明的提取液、肝素結合級分、HMGBU HMGB2、HMGB3、 S100A8或S100A9蛋白質在容器中的注入量，可根據細胞回收用容器的容積來適當確定。例 如當留置於腹部皮下脂肪內時，可以注入IOml左右，當留置於其他皮下時，可以達到數ml。本發明提供通過上述回收細胞團的方法回收的細胞團。另外，本發明還提供通過上述收集骨髓細胞的方法回收的骨髓細胞。本發明的細胞團或骨髓細胞可以通過給予遺傳性疾病、皮膚疾病(燒傷、皮膚潰 瘍等)、腦神經疾病(腦梗塞、阿爾茨海默病、脊髓損傷、腦損傷等)、循環器官疾病(心肌梗 塞、心肌症、動脈塞栓症等)、骨軟骨疾病(骨折、風溼病等)等伴隨有組織損傷的疾病來進 行治療。可以通過採集後直接給予靜脈內、動脈內等循環血流內或者可以通過直接給予損 傷組織部位，來使組織再生。或者可以在使用培養皿、培養瓶進行培養操作後，將細胞以分 散的狀態、形成片狀的狀態、形成細胞塊的狀態給予來使組織再生。給予量可以給予細胞1 個 IO14個，優選給予IO2個 IOltl個。因此，本發明還提供一種組織再生劑，其含有通過 上述回收細胞團的方法回收的細胞團或通過上述收集骨髓細胞的方法回收的骨髓細胞。作為再生的組織，沒有特殊限制，只要是損傷的組織，則可以是任意組織，可例示 出例如活體皮膚組織、體內活檢(手術)組織(腦、肺、心臟、肝臟、胃、小腸、大腸、胰臟、腎 髒、膀胱、脾臟、子宮、睪丸或血液等)。特別是，本發明的藥劑可以有效地用於使從體外難以 直接給予藥劑的 組織(腦、心臟等)再生。本發明中，作為損傷組織，可列舉出由引起缺血、 灌注不足/缺氧狀態的各種病理狀態、外傷、燒傷、炎症、自身免疫、基因異常等而導致的損 傷的組織，但並不限定於這些原因。另外，損傷組織也包括壞死組織。作為本發明的組織，只要是骨髓來源的細胞能夠分化的組織，則沒有特殊制限，例 如可例示出皮膚組織、骨組織、軟骨組織、肌肉組織、脂肪組織、心肌組織、神經系統組織、肺 組織、消化道組織、肝/膽/胰組織、泌尿/生殖器等生物體內的所有組織。另外，通過使 用上述組織再生促進劑，難治性皮膚潰瘍、皮膚創傷、水皰症、脫髮症等皮膚疾病就不用說 了，還能夠對腦梗塞、心肌梗塞、骨折、肺梗塞、胃潰瘍、腸炎等的組織損傷進行治療。作為可 給予上述組織再生促進劑的動物種，可列舉出人或非人動物，例如可例示出人、小鼠、大鼠、 猴、豬、狗、兔、倉鼠、豚鼠等，但並不限定於這些。另外，本發明的藥劑還可以給予糖尿病患 者。已知作為糖尿病的皮膚併發症的難治性皮膚潰瘍比正常人的皮膚潰瘍更難以治癒，但 本發明的藥劑可有效地用於這樣的糖尿病患者。本發明的組織再生劑可以通過在採集後用生理鹽水對細胞進行分散，然後給予靜 脈內、動脈內等循環血流內來使組織再生。或者可以通過塗抹、貼到損傷組織部位的表面 等來給予以使組織再生。此外，還可以通過使用注射器等注入到損傷部位的內部來使組織 再生。另外，還可以通過在使用培養皿、培養瓶進行培養操作後，將細胞以分散的狀態、形成 為片狀的狀態、形成為細胞塊的狀態給予損傷部位來使組織再生。給予量可以給予細胞1 個 IO14個，優選給予IO2個 IOiq個。需要說明的是，本說明書中引用的全部現有技術文獻被引入本說明書中以作為參 照。實施例
以下，通過實施例進一步具體地對本發明進行說明，但本發明並不限於這些實施 例。〔實施例1〕目的開發將生物體內組織中極少量地存在的幹細胞等功能性細胞低侵襲且高效 地回收的新技術

方法針對上述目的通過以下的方法來進行研究。1)對8周齡小鼠(雄性)進行放射線(IOGy)照射後，通過尾靜脈移植green fluorescent protein(GFP)轉基因小鼠來源的骨髓細胞(5X106個/0. Iml生理性磷酸緩 衝溶液PH7. 4)，從而製作GFP骨髓移植小鼠。2)將HMGB1、透明質酸、皮膚提取液、生理性磷酸緩衝溶液(pH7. 4)分別填充到用 生物低刺激性材料(有機矽樹脂)製成的管中，將其移植到GFP骨髓移植小鼠背部皮下(圖 1)。3) 2周後取出移植管(圖2)，回收管內聚集的細胞(tube-entrapping cell, TECs)，然後用含有10%胎牛血清的Dulbecco培養基(D-MEM)在37°C、二氧化碳氣體濃度 5%的條件下培養。4)當TECs的培養密度達到培養皿底面積的約80%時，將培養基分別更換為骨分 化誘導培養基、脂肪分化誘導培養基、表皮分化誘導培養基，然後繼續培養。在用各分化誘 導培養基開始培養2周後，對骨分化採用茜素紅染色、對脂肪分化採用油紅染色、對表皮分 化採用針對角蛋白5的免疫染色來進行評價。5)利用流式細胞儀分析TECs的血小板源性生長因子α (PDGFRa)陽性、⑶44陽 性細胞的比例。結果將填充了 HMGB1、透明質酸、皮膚提取液的矽膠管移植到GFP骨髓移植小鼠 皮下，結果顯示在填充了任一溶液的情況下，1周時GFP陽性的骨髓來源的細胞(TECs)大量 聚集於管內。圖2顯示HMGBl填充矽膠管內聚集的GFP陽性細胞圖像。而在填充了磷酸緩 衝液的矽膠管中，回收的附著性TECs的數量顯著地少。對從HMGBl填充矽膠管回收的細胞 進行培養，結果觀察到培養開始後24小時時附著於培養皿的增殖的附著性TECs (圖3)。將 這些遷移到HMGBl填充矽膠管內的附著性TECs用骨分化、脂肪分化和表皮分化誘導培養基 進行培養，結果證明分別顯示分化成茜素紅陽性成骨細胞、油紅陽性脂肪細胞、角蛋白5陽 性表皮細胞的能力，並且附著性TECs中存在具有分化為間充質和上皮的能力的細胞團(圖 4 6)。另外，利用流式細胞儀對已知在間充質幹細胞表面表達的PDGFRa和⑶44在TECs 中的表達情況進行研究，結果顯示，TECs的約60%為PDGFRa和⑶44陽性(圖7)。另外，將以lOOng/ml (PBS)填充了透明質酸矽膠管移植到GFP骨髓移植小鼠背 部皮下，2周後取出，用FACS對被動員到管內的細胞的表面標記進行分析，結果顯示與從 HMGBl管得到的TECs同樣地約60%為⑶44陽性、PDGFR α陽性的P44細胞，具有分化為成 骨細胞或脂肪細胞等間充質細胞或上皮細胞的能力。討論這次本發明的發明人發現通過將分別填充了 HMGB1、透明質酸、皮膚提取液 的矽膠管移植到皮下，從而能夠非常高效地回收具有骨分化能力、脂肪分化能力、表皮分化 能力的骨髓來源的TECs。將這些骨髓來源的TECs中大多表達已知在間充質幹細胞表面表 達的PDGFR α和⑶44的事實以及HMGB1、透明質酸、皮膚提取液均具有間充質幹細胞動員活性的事實結合起來考慮，可見骨髓來源的間充質幹細胞被選擇性地動員到了 TECs。通過選 擇填充到矽膠管中的溶液，能夠根據該溶液內所含的特定功能細胞動員活性物質來選擇性 且高效地回收特定的生物功能細胞。通過該新的發明技術，可期待能夠避免採用將針刺入 骨髓等高侵襲性的方法，而能夠根據需要來回收生物功能細胞，並能夠涉及根據目的的定 制的(order-made)再生醫療技術。另外，回收的細胞還能夠被提供以用作以幹細胞研究為 代表的很多基礎研究的材料，相信其對於基礎、臨床研究的進展、藥物發現、醫療技術的進 步會有很多貢獻。〔實施例2〕目的動員到皮下裝置的骨髓來源的細胞對皮膚潰瘍的治療效果的評價方法1)製作體內埋入型裝置。2)為了製備含有骨髓多能幹細胞動員因子的皮膚組織提取液，將從2隻C57/BL6 新生小鼠(2日齡)得到的游離皮片浸漬到生理性磷酸緩衝液pH7. 4(PBS) 2ml內，在4°C下 孵育24小時，然後為了除去組織，在4°C下以440G離心10分鐘，回收上清液，從而製作皮 膚提取液。另外，為了製備末梢血單核細胞提取液，從2隻4周齡C57/BL6小鼠採集末梢血 全血，然後用PBS將全量稀釋到4mL。在將Ficoll-Paque Plus (GE)液3mL加入離心管後， 在其上層置(overlaid)稀釋血液。以100G(18°C )離心10分鐘，將含有單核細胞的中間 層回收到新的離心管中。為了從回收的中間層中除去Ficoll-Paque Plus液，加入45mL的 PBS以440G(18°C )離心5分 鍾並除去上清液，然後再一次加入45mL的PBS、以440G(18°C ) 離心5分鐘並除去上清液。向沉澱的細胞中加入200μ L的PBS使其懸浮。將細胞懸浮液 在-80°C的冰箱內冷凍30分鐘，從冰箱轉移到冰上使其融解。重複該冷凍融解的操作3次。 然後，以440G(4°C )離心15分鐘並回收上清液(末梢血提取液)。3)對C57/BL6雄性小鼠(6 8周齡)照射致死量放射線(IOGy)，然後立即從尾靜 脈移植GFP(green fluorescent protein)轉基因小鼠來源的骨髓細胞(5X IO6個/0. Iml 生理性磷酸緩衝溶液PH7. 4)。僅將存活到移植後8周以後的小鼠用於以後的實驗。4)向裝置中加入2)中製作的皮膚提取液、末梢血提取液、作為陰性對照的PBS 40 μ L0將該裝置左右各一個(計2個/只)插入3)中製作的小鼠的左右的背部皮下的筋 膜側並使裝置的孔相接。2周後，從小鼠取出裝置。5)除去 C. B-17/lcr-scid/scidJcl8 周齡(日本 Charles River)的背部的毛，然 後在背部左右製作直徑為6mm的圓形的皮膚潰瘍。為了防止小鼠的皮膚收縮，使用雙面膠 帶和醫用粘接劑Aron alpha A (三共)將有機矽樹脂制的外徑為10mm、內徑為6mm、厚度為 Imm的圓盤粘接到潰瘍部。從3)中取出的左右裝置的單側的裝置內部採集細胞，給予皮膚 潰瘍。為了防止潰瘍部分發生乾燥和細菌感染，用直徑為10mm、厚度為Imm的有機矽樹脂 制的圓盤覆蓋潰瘍部。為了保護潰瘍部，用Tegaderm(3M)覆蓋。7天後測定潰瘍的面積。 (圖 27)其結果，陰性對照的潰瘍面即使經過7天也沒有封閉，而與此相對，給予了從血液 提取液中採集的細胞的潰瘍在第5日天即觀察到潰瘍面積的減小。並且，給予了從皮膚提 取液中採集的細胞的潰瘍在第7天觀察到潰瘍面積封閉(圖27)。根據本實施例，確認了將被動員到含有組織提取液的體內埋入型裝置內的骨髓來源的細胞給予皮膚潰瘍部的潰瘍治療效果。利用不是從骨髓採集的骨髓細胞、而是將動員 到體內裝置的細胞進行治療的例子是迄今為止所沒有的新的治療方法。〔實施例3〕1)通過上述實施例2中記載的方法製作皮膚提取液和末梢血提取液。將HiTrap Heparin HP ImL 柱(GE)用 IOmM 磷酸緩衝液 pH. 7. 5IOmL 平衡。將皮 膚提取液、末梢血提取液分別用10倍容積的IOmM磷酸緩衝液pH 7. 5稀釋，使之結合到經 平衡的柱上。使用IOmL的IOmM磷酸緩衝液pH7. 5對柱內進行洗滌，洗出非特異性吸附的 成分。吸附的成分使用含有IOOOmM NaCl的IOmM磷酸緩衝液pH7. 5洗脫，並每個120 μ L 分注到塑料管中。使用Protein assay kit (Bio-Rad)對蛋白量進行定量，回收濃度最高的 3個級分(組織提取液肝素吸附)。2)製作含有0. 1 %透明質酸的PBS，將該透明質酸溶液10 μ L與組織提取液40 μ L 混合，加入實施例2的裝置內。陰性對照使用含有IOOOmM NaCl的IOmM磷酸緩衝液ρΗ7. 5 與透明質酸的混合液。3)與實施例2同樣地製作GFP骨髓移植小鼠，在該小鼠的背部皮下插入2)中制 作的裝置。插入10天後，從皮下取出裝置，回收細胞。回收的細胞在含有10%胎牛血清的 IMDM(Invitrogen)中用培養皿在37°C、5% CO2環境下培養。培養開始1天後更換培養基， 除去非附著性細胞。其後每3天更換一次培養基。細胞回收1周後使用螢光顯微鏡進行觀 察，檢測骨髓來源的細胞(GFP陽性細胞)(圖28)。另外，使用圖像處理軟體(ImageJ)對 GFP陽性細胞數進行測量(圖29)。透明質酸與組織提取液的肝素結合級分混合液(血液提取液(圖28C)、皮膚提取 液(圖28D))與透明質酸單獨(圖2 8B)或PBS(圖28A)相比，觀察到其對動員到裝置內的 骨髓來源的附著系細胞具有強烈的動員活性(圖28、29)。通過本實施例確認了組織提取液的骨髓細胞動員因子可以用肝素柱進行純化。皮 膚提取液中含有HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8、S100A9，由於這些成分結合於肝素柱，因此啟 示骨髓細胞的動員可能與這些細胞相關。另外考慮，由於肝素柱中還結合了多種生長因子 等細胞因子，因此也可能與這些多種因子的綜合效果相關。〔實施例4〕1)使用Trizol (invitrogen)從新生小鼠皮膚提取RNA，然後使用SuperScript III cDNA synthesis kit (Invitrogen)合成 cDNA。以該 cDNA 為模板，使用 PCR(聚合酶 鏈反應)法對S100A8的cDNA進行擴增，為了純化，將其插入哺乳類細胞的表達蛋白質的 質粒載體pCAGGS中，以使在胺基酸序列的N末端添加了 Flag tag和6XHis tag序列的蛋 白質表達。使用聚乙烯亞胺(PEI)將pCAGGS-Flag-His-SlOOAS轉染到人胎腎細胞來源 的HEK293培養細胞株中，48小時後回收細胞和培養上清液。將細胞和培養上清液在4°C 下以4400G離心5分鐘，分別回收上清液和細胞。使回收的上清液進一步通過具有直徑 為0. 8 μ m孔的醋酸纖維素濾膜(Nalgene)，然後使其通過具有0. 45 μ m的孔的硝化纖維素 濾膜(Corning)，從而製備除去了不溶級分的樣品。將該樣品加入用含50mMNaCl的5 OmM Tris HCl pH8. 0 (50mL)平衡的5mL HisTrap FF(GE)中，將吸附成分進一步用含有IOmM咪 唑的50mMNaCl 50mM Tris HCl pH8. 0洗滌，以除去非特異性吸附成分。將特異性吸附成分 從柱中用含有IOOmM咪唑的50mM NaCl 50mM TrisHCl pH8. 0洗脫。將吸附級分分別每個500 μ L分級到有機矽樹脂塗覆的塑料管中，合併含有蛋白質的級分並使之與抗Flag抗體M2珠粒(Sigma)混合，在4°C下緩慢混合12小時，同時使其反應。反應後，將珠粒以440G離 心5分鐘，在除去上清液後，用PBS將珠粒懸浮，然後同樣地進行離心，除去上清液。將珠粒 加入到容量為3mL、內徑為Icm的柱中，用100mMGlycine-pH3. 5從珠粒將吸附蛋白質洗脫， 並用10分之1量的500mM TrisHCl pH 7. 5進行中和。純化的蛋白質量用Protein assay kit (Bio-Rad)進行定量。2)使用Trizol (invitrogen)從新生小鼠皮膚提取RNA，然後使用SuperScript III cDNA synthesis kit (Invitrogen)合成 cDNA。以該 cDNA 為模板，使用 PCR(聚合酶鏈 反應)法對HMGBl的cDNA進行擴增，為了純化，將其插入哺乳類細胞的表達蛋白質的質粒 載體pCAGGS中，以使在胺基酸序列的N末端添加了 Flag tag和6XHis tag序列的蛋白質表 達。使用聚乙烯亞胺(PEI)將pCAGGS-GST-His-HMGBl轉染到人胎腎細胞來源的HEK293培 養細胞株，48小時後回收細胞和培養上清液。將細胞和培養上清液在4°C下以4400G離心5 分鐘，分別回收上清液和細胞。使回收的上清液進一步通過具有直徑為0. 8 μ m孔的醋酸纖 維素濾膜，然後使其通過具有0. 45 μ m的孔的硝化纖維素濾膜，從而製備除去了不溶級分 的樣品。將該樣品加入用含50mMNaCl的5OmM Tris HCl pH8. O (50mL)平衡的5mLHisTrap FF(GE)中，將吸附成分進一步用含有IOmM咪唑的50mMNaC150mM Tris HCl pH8. 0洗滌，以 除去非特異性吸附成分。將特異性吸附成分從柱中用含有IOOmM咪唑的50mM NaCl 50mM Tris HCl pH8.0洗脫。將吸附級分分別每個500μ L分級到有機矽樹脂塗覆的塑料管中，合 並含有蛋白質的級分，然後使用脫鹽柱PDlO (GE)除去咪唑，使用50mM Tris HCl pH. 7. 5， 150mMNaCl進行洗脫。向洗脫的樣品中添加HRV3C(Novagen)，在4°C下使其反應3小時。使 切斷後的樣品結合於用 50mM Tris HCl pH. 7. 5、150mM NaCl 平衡的HiTrap Heparin ImL柱 (GE)上，用 50mM Tris HClpH. 7. 5、150mM NaCl 對柱內部進行洗滌，然後用 50mM Tris HCl pH. 7. 5、IOOOmM NaCl對結合蛋白質進行洗脫。洗脫的樣品每個500 μ L地分注到有機矽樹 脂塗覆的塑料管中。3)將S100A8、HMGBl、HMGB2、HMGB3分別每個40 μ g地加入有機矽樹脂制裝置中，
按照使孔與筋膜相接的方式插入GFP骨髓移植小鼠的左右背部皮下。插入10天後，從皮下 取出裝置並回收裝置內聚集的細胞。細胞在含有10%胎牛血清的IMDM(Invitrogen)中使 用培養皿在37°C、5% CO2環境下培養。培養開始1天後更換培養基以除去非附著性細胞。 其後每隔3天更換一次培養基。細胞回收1周後用螢光顯微鏡進行觀察，檢測骨髓來源的 細胞(GFP陽性細胞)(圖30)。4)在BALB/cAJcl-nu/nu 8周齡(日本Charles River)的背部左右製作直徑為 6mm的圓形的皮膚潰瘍。為了防止小鼠的皮膚發生收縮，使用雙面膠帶和醫用粘接劑Aron alpha A (三共)將有機矽樹脂制的外徑為10mm、內徑為6mm、厚度為Imm的圓盤粘接到潰瘍部。5)使用 0. 5g/l-Trypsin/0. 53mmol/l_EDTA 液(Nacalai Tesque)對 3)的細胞進 行處理，使其從培養皿游離，在用含有10% FBS的IMDM中使胰蛋白酶滅活後，以440G、在 4°C下離心5分鐘，除去上清液，然後給予4)中製作的潰瘍。為了防止局部的乾燥和細菌感 染，用直徑為10mm、厚度為Imm的有機矽樹脂制的圓盤覆蓋潰瘍部。此外，為了保護潰瘍部， 用Tegaderm(3M)覆蓋。7天後測定潰瘍的大小(圖31)。
與陰性對照(E)相比，S100A8、HMGBU HMGB2、HMGB3均可見骨髓細胞的動員活性 (圖 30-A ；S100A8、B ；HMGB1、C ；HMGB2、D ；HMGB3)。特別是 HMGBUHMGB2 觀察到強的動員活性。另外，通過給予被HMGB1、HMGB2、S100A8動員的骨髓來源的細胞來治療皮膚潰瘍， 結果與陰性對照(給予PBS)相比，觀察到潰瘍縮小的效果(圖31)。在本實施例中，S100A8、HMGBl、HMGB2、HMGB3均可見將骨髓來源的附著性細胞 動員到裝置內的動員活性。骨髓內的主要細胞為紅細胞、血球等血細胞系細胞，但這些細 胞幾乎均為非附著性的細胞。作為附著性的細胞，已知有間充質幹細胞等間充質細胞， 另外也包括能夠分化為上皮或神經系統的多能性細胞。根據本實施例，可見被S100A8、 HMGB1、HMGB2動員到裝置內的細胞對皮膚潰瘍的治療效果，因此被動員到裝置內的細胞 為可治療誘導組織損傷的骨髓來源的細胞。也有關於通過將骨髓間充質幹細胞給予皮膚 饋蕩部位從而顯示治療效果的 艮告(Mesenchymal stemcells enhance wound healing through differentiation and angiogenesis. Wu Y, Chen L,Scott PG,Tredget EE.Stem Cells. 20070ct ；25(10) =2648-59. Epub2007Jul 5.)，因此啟示本實施例中的治療效果與 骨髓間充質幹細胞相關。另外，骨髓間充質幹細胞等骨髓來源的細胞已知能夠分化為神經 細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、上皮細胞。利用本裝置採集的細胞能夠用於將這些細胞 供給到損傷組織來進行治療的新的再生誘導醫療技術中。〔參考例1〕目的皮膚提取液中HMGBl家族的鑑定和骨髓間充質幹細胞誘導活性的研究方法使用Western blot法確認新生小鼠皮膚提取液中是否含有HMGB蛋 白家族。作為樣品，將從400隻新生小鼠獲得的游離皮片浸漬到生理性磷酸緩衝液 PH7. 4 (PBS) 400ml內，在4°C下孵育24小時後，為了除去組織，在4°C的條件下以440G離心 10分鐘，回收上清液，使用SDS-PAGE法對得到的皮膚提取液10 μ 1進行電泳，使用印跡裝 置(ATTO)將凝膠中分離的蛋白轉移到PVDF膜上。用含有3%脫脂乳的0. 1% Tween 20的 PBS(S-T-PBS)在室溫下孵育1小時，然後使其分別與用S-T-PBS稀釋至1000倍的兔抗小鼠 HMGBl抗體、兔抗小鼠HMGB2抗體、兔抗小鼠HMGB3抗體在4°C下反應16小時。反應後，將 該PVDF膜用S-T-PBS洗滌5分鐘，5次，然後將該PVDF膜使用用S-T-PBS稀釋2000倍的過 氧化物酶標記山羊抗兔IgG抗體(GE Healthcare)在25°C下孵育1小時。然後用S-T-PBS 洗滌 5 分鐘、5 次，然後使 ECL Western Blotting Detection System(GEHealthcare)與該 PVDF膜反應，在使ECL膠片感光後進行顯影，檢測HMGB1、HMGB2、HMGB3蛋白質的存在情況。使用Trizol (invitrogen)從新生小鼠皮膚提取RNA，然後使用SuperScript III cDNA synthesis kit (Invitrogen)合成 cDNA。以該 cDNA 為模板，使用 PCR(聚 合酶鏈反應)法對HMGB1、HMGB2、和HMGB3的cDNA進行擴增，將其插入哺乳類細 胞的表達蛋白質的質粒載體PCAGGS中，以使在胺基酸序列的N末端添加了 Flag tag(ASp-Tyr-Lys-ASp-ASp-ASp-LyS ；序列號30)的蛋白質表達。將這些質粒載體基因 導入HEK293 (人胎腎細胞來源的培養細胞株)，培養48小時使蛋白質表達。將分別表達 HMGB1、HMGB2、和HMGB3蛋白質的細胞和培養上清液在4°C下孵育16小時，然後以4400g離 心5分鐘，回收上清液。將該上清液每50mL與100μ L的Anti Flag抗體Gel (Sigma)混合，在 4°C下孵育16小時。離心回收Gel，然後用PBS洗滌5次。然後使用3X Flagpeptide (final100 μ g/ml)進行洗脫。用使用了用S-T-PBS稀釋1000倍的小鼠抗Flag抗體、和用S-T-PBS 稀釋2000倍的過氧化物酶標記抗小鼠IgG抗體(GE Healthcare)的Western blot法確認 重組蛋白的表達。使用boyden小室評價這些純化重組蛋白的小鼠骨髓間充質幹細胞遷移 活性。另外，為了觀察HMGB家族在體內的藥效，將8周齡C57BL/6小鼠的背部皮膚切出直 徑為8 μ m的圓形，從而製作皮膚潰瘍模型，然後將純化的HMGB1、HMGB2、HMGB3各(IOOng/ yL)與lg/100mL PBS的濃度的透明質酸溶液分別等量混合，然後將100 μ L給予潰瘍面。 為了使潰瘍面不發生乾燥，用粘著性透明創傷覆蓋/保護材料Tegaderm(3M Healthcare) 覆蓋，測量經時的創傷面積，從而測定治癒效果。此外，為了研究人皮膚提取液和人純化HMGBl是否具有使人骨髓間充質幹細胞遷 移的活性，使用boyden小室進行評價。將面積為Icm2的人皮膚浸漬到Iml的PBS中，在4°C 的條件下孵育16小時，然後在4°C的條件下以440G離心10分鐘。僅回收上清液，將其用作 人皮膚提取液。另外，加入boyden小室的上部的細胞使用人骨髓間充質幹細胞(Cambrex 公司)。(該細胞使用流式細胞儀進行細胞表面抗原的分析的結果為CD105陽性、CD166陽 性、⑶29陽性、⑶44陽性、⑶34陰性、⑶45陰性。此外，在分化誘導試驗中，向脂肪細胞、軟 骨細胞、骨細胞的分化為陽性。)另外，在小室下部加入100ng/wellAHMGBl(R&D&3 )和 用PBS稀釋10倍的人皮膚提取液，使用PBS作為對照。結果Western blot的結果為，除了 HMGBl的條帶以外還檢測到HMGB2和HMGB3 的條帶。因此確認，新生小鼠皮膚提取液中在除HMGBl之外還含有家族蛋白質的HMGB2和 HMGB3 (圖8)。製作分別在蛋白質的N末端添加了 Flag tag的HMGBl、HMGB2、HMGB3的表 達載體(圖9)。將表達載體基因導入HEK293細胞，在使用Flag tag將表達的蛋白質純化 後，使用Western blot法對蛋白質進行確認(圖10)。對使用了這些純化蛋白質的小鼠骨 髓間充質幹細胞遷移活性進行測定，結果確認了任一蛋白質均具有活性(圖11)。每7天測 量在小鼠背部製作的潰瘍面積，結果與非治療組相比，HMGB1、2和3的治療組具有顯著的潰 瘍面積縮小的效果(圖12)。從而可知與小鼠的情況同樣地，人HMGBl和人皮膚提取液也具 有使人骨髓間充質幹細胞遷移的活性(圖13)。討論作為與HMGBl同源性高的蛋白質，已知有HMGB2和HMGB3。期待這些蛋白 質也具有與HMGBl同樣的性質。這裡，確認了從游離皮片提取液中獲得了 HMGBl的家族即 HMGB2和HMGB3。此外，製作了 HMGB1、HMGB2、HMGB3的重組蛋白，確認了在體外的骨髓間充 質幹細胞遷移活性，並確認了在體內的皮膚潰瘍的治療效果。可知新生小鼠游離皮片中的 HMGB家族(HMGB1、HMGB2、HMGB3)和重組HMGB家族具有骨髓間充質幹細胞誘導活性和將 骨髓來源的能夠分化為上皮系的幹細胞誘導到局部的活性，並且，這些被誘導的骨髓來源 的細胞群在損傷組織中能夠分化為表皮角質形成細胞、毛囊和成纖維細胞等各種各樣的細 胞，從而具有促進損傷組織癒合的效果。另外，骨髓間充質幹細胞由於是多能幹細胞，因此 相信對於其他組織損傷狀態例如腦損傷、心肌梗塞、骨折等組織損傷的治療也可期待具有 與全身給予或局部給予HMGB家族同樣的治療效果。另外可知，人與小鼠的各自構成HMGBl的胺基酸序列具有98% (213/215)的同源 性，各自構成HMGB2的胺基酸序列具有96% (202/210)的同源性，各自構成HMGB3的氨基 酸序列具有97% (195/200)的同源性。因此認為，人的HMGB具有與小鼠的HMGB同樣的活 性，根據該結果，可知人的皮膚提取液、HMGBl與小鼠的皮膚提取液、HMGBl同樣地具有誘導骨髓間充質幹細胞的活性。〔參考例2〕目的建立骨髓間充質幹細胞誘導因子組織提取液的製作方法方法將一隻6周齡C57BL6的腦、心臟、腸、腎臟、肝臟和一隻新生小鼠的皮膚浸漬 到生理性磷酸緩衝液pH7. 4 (PBS) Iml內，在4°C下孵育24小時後，為了除去組織，在4°C的 條件下以440G離心10分鐘，回收上清液，從而獲得組織提取液。為了確認得到的提取液中 存在骨髓間充質幹細胞誘導活性，使用boyden小室研究骨髓來源的間充質幹細胞遷移活 性。另外，使用HMGB1ELISA kit (Shino-Test)測量相同的樣品中所含的HMGBl的濃度。然 後，使腦、心臟和皮膚的組織提取液結合於肝素親和層析柱，使用boyden小室確認結合級 分的蛋白質的骨髓間充質幹細胞誘導活性。結果小鼠腦提取液中含有與新生小鼠皮膚提取液等同的HMGB1。此外，小鼠腦的 骨髓間充質幹細胞的誘導活性也與皮膚同樣地得到確認。小鼠腸提取液和小鼠心臟提取液 中幾乎不含有HMGB1，但也可見有骨髓間充質幹細胞的誘導活性。另外，小鼠腦、小鼠心臟的 肝素柱結合級分與小鼠皮膚的肝素柱結合級分同樣地具有誘導骨髓間充質幹細胞的活性 (圖14)。表1示出了測定小鼠各組織提取液的HMGBl濃度與骨髓間充質幹細胞的誘導活 性的結果。表權利要求
1.一種從由皮下取出到體外的容器回收細胞團的方法。
2.根據權利要求1的從由皮下取出到體外的容器回收細胞團的方法，其中，所述細胞 團被以下的(a) (r)中任一項記載的物質、或以下的(a) (r)中記載的物質中的任意 2種以上物質的混合物從骨髓動員到所述容器內；(a)HMGBl蛋白質(b)分泌HMGBl蛋白質的細胞(c)插入有編碼HMGBl蛋白質的DNA的載體(d)HMGB2蛋白質(e)分泌HMGB2蛋白質的細胞(f)插入有編碼HMGB2蛋白質的DNA的載體(g)HMGB3蛋白質(h)分泌HMGB3蛋白質的細胞(i)插入有編碼HMGB3蛋白質的DNA的載體 (j)S100A8蛋白質(k)分泌S100A8蛋白質的細胞(1)插入有編碼S100A8蛋白質的DNA的載體(m)S100A9蛋白質(η)分泌S100A9蛋白質的細胞(ο)插入有編碼S100A9蛋白質的DNA的載體(P)透明質酸(q)細胞或組織的提取液(r)細胞或組織的提取液的肝素結合級分。
3.一種收集骨髓細胞的方法，其包含由從埋入皮下的容器回收的細胞團分離出骨髓細 胞的工序。
4.一種收集骨髓細胞的方法，其包含由從埋入皮下的容器回收的細胞團分離出骨髓細 胞的工序，其中，所述細胞團被以下的(a) (r)中任一項記載的物質、或以下的(a) (r) 中記載的物質中的任意2種以上物質的混合物從骨髓動員到所述容器內；(a)HMGBl蛋白質(b)分泌HMGBl蛋白質的細胞(c)插入有編碼HMGBl蛋白質的DNA的載體(d)HMGB2蛋白質(e)分泌HMGB2蛋白質的細胞(f)插入有編碼HMGB2蛋白質的DNA的載體(g)HMGB3蛋白質(h)分泌HMGB3蛋白質的細胞(i)插入有編碼HMGB3蛋白質的DNA的載體 (j)S100A8蛋白質(k)分泌S100A8蛋白質的細胞(1)插入有編碼S100A8蛋白質的DNA的載體(m)S100A9蛋白質(η)分泌S100A9蛋白質的細胞(ο)插入有編碼S100A9蛋白質的DNA的載體(P)透明質酸(q)細胞或組織的提取液(r)細胞或組織的提取液的肝素結合級分。
5.根據權利要求3或4所述的方法，其中，包含在由細胞團分離出骨髓細胞的工序之 前，從取出到體外的所述容器回收細胞團的工序。
6.根據權利要求2或4所述的方法，其中，細胞或組織的提取液是通過包含將細胞或組 織浸漬到溶劑中的工序的方法製造的。
7.根據權利要求2或4所述的方法，其中，細胞或組織的提取液的肝素結合級分是通過 包含以下工序的方法製造的；(a)將細胞或組織浸漬到溶劑中的工序、(b)使工序(a)中得到的提取液與固定化肝素接觸的工序、和(c)從固定化肝素洗脫肝素結合級分的工序。
8.一種細胞團，其是通過權利要求1、2、6和7中任一項所述的方法回收的。
9.一種骨髓細胞，其是通過權利要求3 7中任一項所述的方法分離出來的。
10.一種組織再生劑，其含有權利要求8所述的細胞團。
11.一種組織再生劑，其含有權利要求9所述的骨髓細胞。
全文摘要
在將填充了具有動員生物體內的特定功能細胞的活性的生物因子的生物低侵襲性容器留置在生物體內，在使特定功能細胞遷移到容器內後，將容器取出到生物體外，或者從留置於生物體內的容器直接回收動員到容器內的功能性細胞團。
文檔編號C12N5/077GK102083962SQ20098012520
公開日2011年6月1日 申請日期2009年4月30日 優先權日2008年4月30日
發明者山崎尊彥, 玉井克人, 知野剛直, 金田安史 申請人:吉諾米克斯股份有限公司, 國立大學法人大阪大學