可使甘油脫水的新型酶的製作方法

2023-10-31 02:43:42

專利名稱：可使甘油脫水的新型酶的製作方法
1 發明領域本發明涉及生產1，3-丙二醇的改進的方法和試劑。更具體而言，本發明提供能催化甘油發酵為1，3-丙二醇的新型嗜熱生物和熱穩定酶。本發明也涉及分離這些嗜熱生物的方法，克隆編碼這些酶的多核苷酸的方法，編碼這些酶的多核苷酸，和利用這些酶和生物生產1，3-丙二醇的方法。
2 背景1，3-丙二醇是一種在生產聚酯纖維和生產聚氨脂和環狀化合物中使用的單體。
1，3-丙二醇的多種合成途徑是周知的。例如，1，3-丙二醇能如下合成(1)在磷化氫、水、一氧化碳、氫和一種酸的存在下，利用催化劑轉化環氧乙烷；(2)丙烯醛的催化溶液相水合，隨後還原；(3)在一氧化碳和氫存在下，利用具有元素周期表中VIII組原子的催化劑反應一種碳氫化合物(例如甘油)。然而，傳統化學合成法是昂貴的，並且產生含有環境汙染物的廢液，因而絕非理想的。發展便宜並且更加利於環境的生產1，3-丙二醇的備選方法和試劑是所希望的。
一種備選方法在體內(即，在微生物中)或在體外使用酶催化甘油發酵為1，3-丙二醇。參見，例如，WO98/21339，WO98/21341和US專利號5,821,092、5,254,467、5,633,362和5,686,276。能由甘油產生1，3-丙二醇的菌株在例如檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、梭菌屬(Clostridium)、腸桿菌屬(Enterobacter)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和暗桿菌屬(Pelobacter)中發現。這些細菌通過兩步酶催化反應將甘油轉化為1，3-丙二醇。第一步，脫水酶催化甘油轉化為3-羥基-丙醛(3-HP)和水(方程式1)。第二步，3-HP被NAD+-連接的氧化還原酶還原為1，3-丙二醇(方程式2)。
甘油 3-HP+H2O (方程式1)3-HP+NADH+H+1，3-丙二醇+NAD+(方程式2)1，3-丙二醇不被進一步代謝，因此能在基質中積累到高濃度。總反應導致還原的b-菸鹼腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化為菸鹼腺嘌呤二核苷酸(NAD+)。
甘油向1，3-丙二醇的生物轉化通常在厭氧條件下進行，用甘油作為唯一的碳源，並且不存在其它的外源還原等價受體。在某些菌株中，如在某些檸檬酸桿菌屬、梭菌屬和克雷伯氏菌屬菌株中，甘油代謝的一個平行途徑在運轉，首先包括甘油被NAD+-(或NADP+)連接的甘油脫氫酶氧化為二羥丙酮(DHA)(方程式3)。DHA在被DHA激酶磷酸化為磷酸二羥丙酮(DHAP)後(方程式4)，可用於生物合成和支持通過如糖酵解產生ATP。
(方程式3)(方程式4)與1，3-丙二醇途徑不同，該途徑可為細胞提供碳和能量，並且產生而不是消耗NADH。
在肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)中，在dha調節子中發現編碼甘油脫水酶(dhaBCE)、1，3-丙二醇氧化還原酶(dhaT)、甘油脫氫酶(dhaD)和二羥丙酮激酶(dhaK)的功能上相關連的活性的基因。來自檸檬酸桿菌屬和克雷伯氏菌屬的dha調節子已經在大腸桿菌中表達，顯示能將甘油轉化為1，3-丙二醇(Tong等人，Appl.Environ.Microbiol.573541-46(1991)；Seyfried等人，J.of Bact.1785793-96(1996)；Tobimatsu等人，J.Biol.Chem.27122352-22357(1996))。
由於使用生物學方法和試劑生產1，3-丙二醇所固有的潛在優點，需要發展和確定能將甘油和其它碳底物轉化為1，3-丙二醇的具有優良特徵的新型微生物和酶。本發明通過提供優良的微生物和酶以及鑑定其它優良微生物和酶的方法滿足了這一需要。
3 發明概述本發明涉及生產1，3-丙二醇的改進的方法和試劑。更具體而言，本發明提供能催化甘油發酵為1，3-丙二醇的新型嗜熱生物和熱穩定酶。本發明也涉及分離這些嗜熱生物的方法，克隆編碼這些酶的多核苷酸的方法，編碼這些酶的多核苷酸，和利用這些酶和生物生產1，3-丙二醇的方法。
一方面，本發明提供一種在嗜熱生物中將甘油轉化為1，3-丙二醇的方法，該方法包括提供一種可將甘油發酵為1，3-丙二醇的嗜熱生物；在可產生1，3-丙二醇的條件下培養這種嗜熱生物。在一個優選實施方案中，該方法還包括收集嗜熱生物產生的1，3-丙二醇的步驟。在另一個優選實施方案中，該嗜熱生物是Caloramator viterbiensis，其中由保藏為ATCC號PTA-584的生物衍生的嗜熱生物是特別優選的。
本發明還提供一種由甘油生產1，3-丙二醇的方法，該方法包括將甘油與熱穩定的脫水酶一起溫育，由此將甘油轉化為3-羥基丙醛；將3-羥基丙醛還原為1，3-丙二醇。在一個優選實施方案中，3-羥基丙醛向1，3-丙二醇的還原由一種熱穩定的1，3-丙二醇氧化還原酶催化。在另一個優選實施方案中，該方法還包括收集1，3-丙二醇的步驟。在另一個優選實施方案中，熱穩定的脫水酶來自一種嗜熱生物，如Caloramator viterbiensis，其中由保藏為ATCC號PTA-584的生物衍生的嗜熱生物是特別優選的。
本發明另一方面提供一種來自C.viterbiensis的分離的熱穩定甘油發酵酶，其中來自保藏為ATCC號PTA-584的生物的熱穩定甘油發酵酶是特別優選的。在特別優選的實施方案中，熱穩定甘油發酵酶是一種脫水酶，如甘油脫水酶，或NAD+-連接的氧化還原酶，如1，3-丙二醇氧化還原酶。本發明也提供一種分離的熱穩定甘油發酵酶，它與來自C.viterbiensis的熱穩定甘油發酵酶同源。
本發明也提供一種分離的C.viterbiensis培養物或細胞。在一個非限制性實施方案中，培養物或細胞的基因組與保藏為ATCC號PTA-584的生物的基因組至少85％相同，優選地與保藏為ATCC號PTA-584的生物的基因組90％相同，更優選地與保藏為ATCC號PTA-584的生物的基因組95％相同，最優選地與保藏為ATCC號PTA-584的生物的基因組至少99％相同。在另一個非限制性實施方案中，培養物或細胞的16SrDNA序列與保藏為ATCC號PTA-584的生物的16S rDNA序列至少95％相同，優選地與保藏為ATCC號PTA-584的生物的16S rDNA序列至少98％相同。
另一方面，本發明提供一種克隆編碼熱穩定甘油發酵酶的多核苷酸序列的方法，該方法包括使與已知甘油發酵酶基因的一部分同源的多核苷酸探針與懷疑含有嗜熱生物的環境樣品的多核苷酸分子雜交；分離與至少一種多核苷酸探針結合的多核苷酸序列。在一個非限制性實施方案中，該方法使用聚合酶鏈反應擴增與多核苷酸探針結合的多核苷酸序列。在一個優選實施方案中，熱穩定甘油發酵酶來自確定其可將甘油發酵為1，3-丙二醇的嗜熱生物，其中C.viterbiensis是特別優選的。在另一個優選實施方案中，多核苷酸探針與已知dhaB基因的一部分同源，其中與來自克雷伯氏菌屬的dhaB基因同源的探針是特別優選的。
本發明還提供一種克隆編碼熱穩定甘油發酵酶的多核苷酸序列的方法，該方法包括用來自嗜熱生物的DNA轉化一種不能在甘油上厭氧生長的靶生物；通過在甘油上厭氧生長鑑定那些含有編碼可將甘油發酵為1，3-丙二醇的酶的多核苷酸序列的轉化靶生物。在一個非限制性實施方案中，熱穩定甘油發酵酶來自一種確定其可將甘油發酵為1，3-丙二醇的嗜熱生物，如C.viterbiensis，其中由保藏為ATCC號PTA-584的生物衍生的嗜熱生物是特別優選的。
本發明再另一方面提供一種分離可催化甘油發酵為1，3-丙二醇的嗜熱生物的方法，該方法包括在含有甘油作為主要碳源的培養基中溫育含有嗜熱生物的樣品；分離至少一種可將甘油發酵為1，3-丙二醇的嗜熱生物。在非限制性實施方案中，樣品在約40℃到約100℃的溫度和厭氧條件下溫育。在另一個非限制性實施方案中，樣品從溫度約為環境溫度到約100℃、更優選地約50℃到約100℃的自然來源中獲得。在一個優選實施方案中，該方法還包括檢測嗜熱生物產生1，3-丙二醇和/或乙酸鹽的步驟。
4 附圖簡述


圖1顯示溫度對菌株JW/MS-VS-5的生長的影響，td＝倍增時間。
圖2顯示pH25℃對菌株JW/MS-VS-5在60℃的生長的影響，td＝倍增時間。
圖3顯示基於JW/MS-VS-5和有關菌株的16S rRNA基因序列對比的無根系統發生樹狀圖。鄰接的樹由距離矩陣重建。在分支點處顯示1000個數據組的分析的引導(bootstrap)值(表示為百分數)。定標線條代替每100個核苷酸5個核苷酸置換。
圖4顯示在60℃和厭氧條件下，甲苯厭氧處理的JW/MS-VS-5細胞將甘油轉化為3-HPA的時程測定。
圖5顯示在60℃和厭氧條件下，甲苯厭氧處理的JW/MS-VS-5細胞將1，2-丙二醇轉化為丙醛的時程測定。
5 發明詳述嗜熱生物是在大多數其它生物(例如中溫生物)不能存活的升高溫度下能夠存活並生長的生物。這種對高溫的異常的適應性部分地是由於這些生物利用熱穩定酶催化生命中的生物學反應。熱穩定酶使嗜熱生物能在升高的溫度下催化代謝反應。這些生物能從環境溫度的環境中分離，但更可能從高溫環境中分離，包括例如溫泉、排熱口和洗衣店排出液。嗜熱細菌和酶的異常的熱穩定性使得能在比使用中溫生物和酶能達到的更高的溫度下催化有經濟價值的生物轉化。在許多情況中，在發酵過程中用嗜熱細菌催化希望的體內反應。此外，也能用熱穩定酶在體外或「無細胞」生物轉化中催化，這一般利用固定的酶，以便於控制反應和反應產物的回收。
在升高的溫度下進行生物轉化有許多優點。如同任何化學反應，酶促催化反應的速率通常隨反應溫度的升高而顯著提高。提高進行工業生物轉化的速率可獲得明顯的效益。另外，在大多數可能的汙染生物不能存活的升高溫度下進行反應，能防止反應培養基的微生物汙染。
使用嗜熱生物在高溫下催化生物轉化的另一個優點在於，有時高溫便於從反應培養基中分離希望的產物。例如，美國專利號5,182,199描述了使用熱穩定酶和高溫發酵促進從反應培養基中分離乙醇。
除了對高溫穩定外，通常發現熱穩定酶對一般可滅活酶的其它條件和物質也具有提高的穩定性。熱穩定酶也傾向於比來自中溫生物的酶有更長的貯存壽命。本發明提供酶催化生產1，3-丙二醇的改進的方法和試劑。在某種程度上，本發明第一次提供了能催化甘油發酵為1，3-丙二醇的嗜熱生物和熱穩定酶。這些生物和酶的一個新的特徵是它們在以前鑑定的1，3-丙二醇產生生物和酶被快速滅活的升高溫度下保持存活和催化活性的能力。本發明的方法和組合物能用來在升高的溫度下將甘油生物轉化為1，3-丙二醇，由此比以前描述的方法(特別是在較低溫度下進行的方法)有明顯的優點。本發明還包括鑑定能由甘油產生1，3-丙二醇的嗜熱生物的方法，以及克隆編碼催化該轉化的熱穩定酶的多核苷酸的方法。5.1 在升高的溫度下能將甘油發酵為1，3-丙二醇的嗜熱生物，和分離這些生物的方法在一個實施方案中，本發明提供一種在升高的溫度下能將甘油發酵為1，3-丙二醇的嗜熱生物。
在此使用時，術語「嗜熱生物」是指在高溫下、優選地在高於50℃的溫度下、更優選地在高於60℃的溫度下、再更優選地在高於70℃的溫度下、最優選地在高於85℃的溫度下能夠生長的生物。在高於85℃的溫度下能夠生長的生物被稱作嗜高溫生物。嗜熱生物的例子能在如原核微生物真細菌和古細菌中發現。這些生物存在於熱環境如溫泉、火山區和海底火山口中，並能從中分離。另外，嗜熱生物也能從環境溫度來源中分離。
在本發明的一個優選實施方案中，在升高的溫度下能將甘油發酵為1，3-丙二醇的嗜熱生物是一種Caloramator viterbiensis菌株。C.viterbiensis是能將甘油發酵為1，3-丙二醇和乙酸鹽的嗜熱菌的一個種。C.viterbiensis在此被定義為具有下列鑑定特徵的菌種該種是(1)嗜熱的；(2)能將甘油發酵為1，3-丙二醇；(3)與保藏為ATCC號PTA-584的模式株JW/MS-VS5T有「基本基因組序列同一性」。
在本發明的一個非限制性實施方案中，C.viterbiensis種的一個成員也具有模式株JW/MS-VS5T的下列鑑定特徵。JW/MS-VS5T細胞是直的到略微彎曲的杆狀，尺寸為0.4～0.6μm。細胞單個存在，菌株為革蘭氏陽性。在pH6.0時生長的溫度範圍為33～64℃，58℃時最佳。生長的pH25℃範圍為5.0～7.6，6.0～6.5最佳。使用甘油、葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖、纖維二糖、乳糖、澱粉和酵母提取物觀察到生長。該菌株根本不能發酵木糖、阿拉伯糖、乙酸鹽、乳酸鹽、甲酸鹽、甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、丙酸鹽、丙酮、琥珀酸鹽、乙二醇、1，2-丙二醇、苯酚和苯甲酸鹽。在H2CO2存在時，在自養條件下不發生明顯的生長。甘油的發酵產生乙酸鹽和1，3-丙二醇作為主要有機產物，在生長過程中產生明顯量的H2。生長可被氨苄青黴素、氯黴素、紅黴素、利福平和卡那黴素抑制(全都在100μg/ml時)。同樣濃度的鏈黴素或四環素可延緩生長。經HPLC測定，該菌株DNA的G+C含量為32mol％。
為了鑑定推斷的C.viterbiensis種的成員，術語「基本基因組序列同一性」是指生物基因組序列與模式株JW/MS-VS5T的基因組序列至少90％的同一性，優選地至少95％的同一性，更優選地至少99％的同一性；或者，生物的16S rDNA序列與模式株JW/MS-VS5T的16S rDNA序列至少90％的同一性，優選地至少95％的同一性，更優選地至少99％的同一性。
基本序列同一性可通過比較推斷的C.viterbiensis與JW/MS-VS5T的完整基因組序列來確定。此外，也能通過比較推斷的C.viterbiensis與JW/MS-VS5T的16S rDNA序列確定基本序列同一性。JW/MS-VS5T和推斷的C.viterbiensis的全部或部分基因組序列，特別是生物的16SrDNA序列，能用本領域技術人員周知的常規核酸測序技術確定(參見，例如，Sambrook等人，《分子克隆，實驗室手冊》(1989)和《現代分子生物學手冊》(Ausubel等人，編寫，1989))。然後能用技術人員周知的序列對比方法比較這些序列。例如，能用BLAST電腦程式2.0版計算百分同一性，該程序可在網際網路上獲得http//www.ncbi.nlm.nih.gov。關於BLAST的描述，參見，例如，Altschul等人，J.Mol.Biol.215403-10(1990)和Altschul等人，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997)。
在一個具體實施方案中，本發明提供一種能將甘油發酵為1，3-丙二醇嗜熱微生物，其基因組在低嚴格條件下可與模式株JW/MS-VS5T的基因組雜交。在一個備選的優選實施方案中，本發明提供一種能將甘油發酵為1，3-丙二醇的嗜熱微生物，其16S rDNA序列在低嚴格條件下可與模式株JW/MS-VS5T的16S rDNA序列雜交。使用低嚴格條件的方法可以如下進行(參見Shilo和Weinberg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA786789-6792(1981))含DNA的濾紙在含有35％甲醯胺、5×SSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、5mM EDTA、0.1％ PVP、0.1％ Ficoll、1％BSA和500μg/ml變性鮭精DNA的溶液中在40℃下預處理6小時。雜交在具有下列改變的相同溶液中進行使用0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.2％BSA、100μg/ml鮭精DNA、10％(w/v)硫酸葡聚糖和5-20×106cpm32P標記探針。濾紙在雜交混合液中40℃溫育18-20小時，然後在含有2×SSC、25mMTris-HCl(pH7.4)、5mM EDTA和0.1％SDS的溶液中55℃洗滌1.5小時。將洗滌溶液替換為新鮮的溶液，在60℃下再溫育1.5小時。濾紙乾燥印跡，暴露進行放射自顯影。如必要，濾紙在65-68℃下第三次洗滌，再次暴露於膠片。可以使用的其它低嚴格條件在本領域眾所周知(如種間雜交使用的)。
在另一個具體實施方案中，本發明提供一種能將甘油發酵為1，3-丙二醇的嗜熱微生物，其基因組在中度嚴格條件下可與模式株JW/MS-VS5T的基因組雜交。在一個優選實施方案中，本發明提供一種能將甘油發酵為1，3-丙二醇的嗜熱微生物，其16S rDNA序列在中度嚴格條件下可與模式株JW/MS-VS5T的16S rDNA序列雜交。使用中度嚴格條件的方法能如下進行含DNA的濾紙在含有6×SSC、5×Denhart’s溶液、0.5％ SDS和100μg/ml變性鮭精DNA的溶液中在55℃下預處理6小時。雜交在相同溶液中進行，使用5-20×106cpm32P標記探針。濾紙在雜交混合液中55℃溫育18-20小時，然後在含有1×SSC和0.1％ SDS的溶液中60℃洗滌2次30分鐘。濾紙乾燥印跡，暴露進行放射自顯影。可以使用的其它中度嚴格條件在本領域眾所周知。濾紙的洗滌在含有2×SSC和0.1％SDS的溶液中37℃進行1小時。
在另一個具體實施方案中，本發明提供一種能將甘油發酵為1，3-丙二醇的嗜熱微生物，其基因組在高度嚴格條件下可與模式株JW/MS-VS5T的基因組雜交。在一個優選實施方案中，本發明提供一種能將甘油發酵為1，3-丙二醇的嗜熱微生物，其16S rDNA序列在高度嚴格條件下可與模式株JW/MS-VS5T的16S rDNA序列雜交。使用高度嚴格條件的方法能如下進行含DNA的濾紙的預雜交在由6×SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA、0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.02％BSA和500μg/ml變性鮭精DNA組成的緩衝液中在65℃下進行8小時至過夜。濾紙在含有100μg/ml變性鮭精DNA和5-20×106cpm32P標記探針的預雜交混合液中65℃雜交48小時。濾紙的洗滌在含有2×SSC、0.01％PVP、0.01％Ficoll和0.01％ BSA的溶液中37℃進行1小時。隨後在0.1×SSC中50℃洗滌45分鐘，之後進行放射自顯影。可以使用的其它高度嚴格條件在本領域眾所周知。
C.viterbiensis種還包括模式株JW/MS-VS5T的後代，包括相對於模式株JW/MS-VS5T基因型和/或表型改變的後代。突變(包括定向或隨機誘變引起的)能改變表型和/或基因型。本發明提供具有單個或多個突變的細胞，特別用來提高1，3-丙二醇的產生。例如，耐受底物或產物抑制的能將甘油發酵為1，3-丙二醇的突變株預計在本發明中特別有用。
產生突變體的方法在本領域中常用且眾所周知。例如，可將野生型細胞暴露於多種因素，如輻射或化學誘變劑，然後篩選希望的表型。當通過輻射產生突變時，可以使用紫外線(UV)或電離輻射。用輻射或化學劑產生突變體的具體方法在本領域中得到很好地證明。參見，例如，Brock，《生物技術工業微生物教材》第二版(1989)，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，Mass.或Deshpande，Appl.Biochem.Biotechnol.36227-34(1992)，在此引用作為參考。在誘變處理後，可以用多種方法篩選具有希望的表型的突變體。當對於希望的性質篩選誘變的細胞時，隨機篩查是最常用的。突變體篩選方法在工業微生物領域高度發展並且眾所周知。參見，例如，Brock，同上文。
本發明還提供分離和培養保存能將甘油發酵為1，3-丙二醇的嗜熱生物的方法。這些生物在實施本發明的實施方案中有用，例如，能用它們在升高的溫度下將甘油生物轉化為1，3-丙二醇，或者它們能用作發酵甘油的熱穩定酶或編碼它們的多核苷酸的來源。
適於細菌培養物保存和生長的材料與方法見，例如《普通細菌學方法手冊》(Gerhardt等人編寫)，美國微生物學會，華盛頓，或Brock，同上文。用於細菌細胞生長和保存的試劑和材料能從供應商處獲得，例如Aldrich Chemicals(Milwaukee，Wis.)、DIFCO Laboratories(Detroit，Mich.)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，Md.)或Sigma ChemicalCompany(St.Louis，Mo.)。
本發明的嗜熱生物，如C.viterbiensis，能從有利於嗜熱生物生長的任何環境中分離，例如，排熱口、溫泉或土壤或它們周圍的水和沉積物，或洗衣店排出液。例如由沉積物、水或其混合物組成的樣品從目的環境中收集。測量採樣點的pH和溫度作為從樣品中分離的任一種生物的最適生長條件是希望的。然後用樣品接種基礎培養基，優選地甘油作為唯一或主要碳源的培養基。基礎培養基一般用樣品接種為終濃度約10％(w/v)。培養基的pH優選地接近採樣點。此外，能接種不同pH的多種基礎培養基，以篩選具有不同pH生長依賴性的生物。然後在高溫下溫育富集培養物，優選地至少約50℃，更優選地至少約60℃，最優選地至少約75℃，優選地在厭氧或微需氧環境中進行。培養嗜熱生物的指導見，例如，Weigel，J.，「嗜熱生物的分離與研究方法」，《嗜熱生物普通、分子和應用微生物學》的第4章，T.D.Brock編寫(John Wiley Sons，N.Y.)，第17-37頁。
當富集培養物能利用甘油作為碳源時，均質培養物能如下分離製備一系列稀釋的培養物，使用軟瓊脂覆蓋層(例如含有0.8％瓊脂的基礎培養基)將這些系列塗布於固體基礎培養基(例如1.5％瓊脂)上，挑取單菌落，在相同組成的液體培養基中傳代培養，檢查1，3-丙二醇和/或乙酸鹽的形成。對培養基進行高壓液相層析(HPLC)分析能直接鑑定1，3-丙二醇。例如，能用0.01N硫酸的流動相以等度方式在分析離子交換柱上分析發酵培養基。此外，1，3-丙二醇也能用其它合適的分析技術鑑定，包括但不限於氣相色譜法(GC)和氣相色譜-質譜法(GC-MS)。
能將甘油轉化為1，3-丙二醇的嗜熱生物的一種菌株能用本領域周知的培養保存技術培養保存。這些方法包括冷藏(短貯存時間)、在液氮中冷凍(延長的貯存時間)和凍幹(使細胞脫水)。保存方法的選擇取決於培養物的性質和可以利用的設施。當使用冷凍時，必須仔細控制凍融率，以確保微生物存活，因為冷凍過程中形成的冰晶能破壞膜。甘油通常用作「防凍」劑，以防止冰晶引起的損害，並確保當冷凍培養物融解時回收活微生物的能力。5.2 在升高的溫度下能產生1，3-丙二醇的熱穩定酶在一個實施方案中，本發明提供一種在升高的溫度下催化甘油發酵為1，3-丙二醇中的一個步驟的熱穩定酶，在此被稱為「熱穩定甘油發酵酶」。
在此使用時，術語「熱穩定甘油發酵酶」是指催化甘油發酵為1，3-丙二醇中的至少一個反應步驟的一種酶，它是「熱穩定的」，即，在高溫下(優選地在高於50℃時，更優選地在高於60℃時，再更優選地在高於70℃時，最優選地在高於85℃時)穩定並具活性。如果一種酶在暴露於給定溫度至少5分鐘後，優選地至少30分鐘後，更優選地至少1小時後，再更優選地至少8小時後，最優選地至少24小時或更長後，能保留原始催化活性的至少50％，則該酶在該溫度下「穩定」。在許多情況中，熱穩定酶也有延長的保存期，並且對變性條件(如物理攪拌或接觸有機溶劑)比具有類似功能特性的非熱穩定酶更加穩定。
在一個優選實施方案中，本發明提供一種來源於C.viterbiensis的熱穩定甘油發酵酶。在一個優選但非限制性的實施方案中，本發明提供一種來源於C.viterbiensis的熱穩定的脫水酶。在另一個優選但非限制性的實施方案中，本發明提供一種來源於C.viterbiensis的熱穩定的1，3-丙二醇氧化還原酶。在本發明的一個特別優選的實施方案中，熱穩定甘油發酵酶來源於JW/MS-VS5T株。
在此使用時，術語「脫水酶」是指能催化甘油分子轉化為產物3-羥基丙醛的任一種酶。脫水酶的具體例子包括甘油脫水酶和二醇脫水酶，即優選底物分別為甘油和1，2-丙二醇的的脫水酶。
術語「1，3-丙二醇氧化還原酶」是指一種能催化3-羥基丙醛轉化為1，3-丙二醇、並伴隨有NADH氧化的酶。
催化甘油發酵為1，3-丙二醇中的一個反應步驟的能力可通過測定酶活性確定。甘油發酵活性能用本領域技術人員周知的技術測定。例如，Poppe等人，Eur.J.of Biochem 245398-41(1997)，Honda等人，J.of Bact.1431458-65(1980)，和Macis等人，FEMS Microbiology Letters16421-28(1998)敘述了測定脫水酶活性的方法，在此引用作為參考。例如，Johnson等人，J.of Bact.1692050-54(1987)敘述了測定1，3-丙二醇氧化還原酶活性的方法，在此引用作為參考。酶活性能用甲苯處理的細胞原位測定，如Honda等人所述。也能通過在一般不能發酵甘油的宿主細胞中表達酶，並測定酶的表達是否可使細胞發酵甘油，來確定該酶催化甘油發酵為1，3-丙二醇中的一個反應步驟的能力。
對於本發明，如果熱穩定的1，3-丙二醇產生酶(a)由C.viterbiensis或C.viterbiensis的指定株內源表達，或其胺基酸序列由C.viterbiensis或C.viterbiensis的指定株中存在的多核苷酸編碼序列編碼；(b)在實施本發明中有用，則它「來源於」C.viterbiensis或C.viterbiensis的指定株。在此使用時，如果酶是一種熱穩定甘油發酵酶，即催化甘油發酵為1，3-丙二醇中的至少一個反應步驟，並在高溫下(優選地在高於50℃時，更優選地在高於60℃時，再更優選地在高於70℃時，最優選地在高於85℃時)穩定且具活性，則該酶「在實施本發明中有用」。
本發明還提供一種與來源於C.viterbiensis的熱穩定甘油發酵酶同源的酶。對於本發明，如果(a)一種酶的胺基酸序列由一種多核苷酸編碼序列編碼，該多核苷酸序列在中度嚴格條件下(即，在65℃時在0.5MNaHPO4、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mM EDTA中與濾紙結合的DNA雜交，在42℃時用0.2×SSC/0.1％SDS洗滌(Ausubei等人，1989，《現代分子生物學方法》第一卷，Green Publishing Associates，Inc.，和JohnWiley Sons，Inc.，紐約，第2.10.3頁))可與編碼來源於C.viterbiensis的熱穩定甘油發酵酶的多核苷酸序列的互補序列雜交；(b)它在實施本發明中有用，則該酶與來源於C.viterbiensis的熱穩定甘油發酵酶「同源」。在一個優選實施方案中，該同源酶由一種多核苷酸編碼序列編碼，該多核苷酸序列在高度嚴格條件下(即，在65℃時在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mM EDTA中與濾紙結合的DNA雜交，在68℃時用0.1×SSC/0.1％SDS洗滌(Ausubel等人，同上文))可與編碼來源於C.viterbiensis的熱穩定甘油發酵酶的多核苷酸序列的互補序列雜交，並且在實施本發明中有用。
與來源於C.viterbiensis的熱穩定甘油發酵酶同源的酶能採取多種形式。在本發明的某些實施方案中，該同源酶是來源於C.viterbiensis的熱穩定甘油發酵酶的突變形式，其中一個或多個胺基酸殘基被置換為不同的胺基酸殘基，產生一種在實施本發明中有用的酶。突變可以是保守性的，其中胺基酸殘基被置換為具有類似功能和結構特徵(如酸度、極性或側鏈膨脹度)的另一種胺基酸殘基。突變也可以是非保守性的，其中置換的胺基酸殘基的功能和/或結構特性不是保守的。有時，來源於C.viterbiensis的熱穩定甘油發酵酶的突變形式具有相對於天然酶改變的功能特性，如改變的催化能力、穩定性或最適pH或溫度。這些突變體只要與來源於C.viterbiensis的熱穩定甘油發酵酶同源，即屬於本發明的範圍。
酶的突變形式能用技術人員周知的多種技術產生。美國專利號5,830,696中綜述了大量這些技術，在此引用作為參考，它描述了熱穩定酶的定向進化。此外，突變酶也能在生物中隨機產生，或自然存在。
而且，與來源於C.viterbiensis的熱穩定甘油發酵酶同源的酶也可以是天然C.viterbiensis酶的缺失突變體或截短變體。這些酶形式的應用有時是希望的，例如，當缺失或截短導致相對於相應的天然酶穩定性提高或易於純化時。
本發明還提供一種與來源於C.viterbiensis的熱穩定甘油發酵酶同源的酶，它是來源於C.viterbiensis的熱穩定甘油發酵酶的一種嵌合形式，即，一種融合蛋白。嵌合體能用於例如提高酶的穩定性或便於純化，例如，通過內含能與離子交換、金屬螯合、底物親和或免疫親和基質結合的部分。在一個優選實施方案中，本發明提供一種與固體載體(如纖維素)共價結合的同源酶。
此外，本發明也提供一種與來源於C.viterbiensis的熱穩定甘油發酵酶同源、而來源於不同微生物(優選地嗜熱微生物)的酶。這種酶的一個例子是熱穩定甘油發酵酶「同系物」，它被定義為由不同種的基因編碼的酶，其中本領域技術人員根據大於約80％的核苷酸序列同一性程度，認為該基因是C.viterbiensis甘油發酵基因的同系物。序列同一性能用如上文所述的BLAST程序確定。
在一個實施方案中，本發明提供一種分離的熱穩定甘油發酵酶，術語「分離的」是指該酶至少是部分純化的，即，相對於製品中的其它物質，製品中酶的重量百分比高於自然存在的。在一個優選實施方案中，本發明提供一種分離的熱穩定甘油發酵酶，其純度至少為汙染的蛋白質重量的90％，更優選地至少為蛋白質重量的95％。
下文中描述了在製備和分離上述酶中可用的材料與方法。在一個實施方案中，本發明的酶能從內源表達該酶的嗜熱生物(特別是C.viterbiensis菌株)中分離。此外，也能通過向合適的宿主細胞中引入編碼該酶的多核苷酸序列並表達編碼的基因產物，重組產生本發明的酶。本發明的酶也能利用體外翻譯或化學合成技術產生。5.3 克隆編碼可將甘油轉化為1，3-丙二醇的熱穩定酶的多核苷酸的方法本發明提供一種編碼熱穩定甘油發酵酶的多核苷酸序列或其片段，和鑑定、分離和克隆這些多核苷酸的方法。這些方法包括獲取含有來自嗜熱生物的多核苷酸編碼序列的樣品，篩選編碼熱穩定甘油發酵酶的多核苷酸序列或其片段。樣品可以採用多種形式之一，通過本領域技術人員周知的多種不同技術製備。類似地，可用多種合適的技術實現樣品的篩選，下文中描述了這些技術的一些非限制性例子。
此處公開的多核苷酸分子和寡核苷酸分子的產生和操作在本領域範圍內，能按照以下所述的重組技術進行Sambrook等人，《分子克隆，實驗室手冊》(1989)；《現代分子生物學手冊》(Ausubel等人編寫，1989)；《PCR策略》(Innis等人編寫，1995)；和《PCR技術》(Erlich等人編寫，1992)，全部在此引用作為參考。
在本發明的一些實施方案中，用具有被認為編碼一種甘油發酵酶的核苷酸序列的探針，或代表其部分的探針篩查樣品。探針序列可基於已知甘油發酵酶的胺基酸序列，或其片段，或編碼這種酶的多核苷酸序列。例如，甘油發酵酶的一部分的胺基酸序列能用如Creighton《蛋白質結構與分子原則》(1983)所述的胺基酸測序技術測定，用這些信息產生一組簡併探針。在本發明的一個優選實施方案中，用基於編碼來自嗜熱生物(如C.viterbiensis)的脫水酶或氧化還原酶序列的探針篩查樣品。此外，探針也可基於來自非嗜熱生物(例如，K.pasteurianum、弗氏檸檬酸桿菌或巴氏梭菌(C.pasteurianum))的甘油發酵酶編碼基因，如dhaBCE或dhaT基因，它們分別編碼甘油脫水酶和氧化還原酶。文獻中報導了dhaBCE基因的核苷酸序列(參見，例如，Macis等人，FEMS Microbiology Letters16421-28(1998)(巴氏梭菌)；Seyfried等人，J.of Bacteriology1785793-96(1996)(弗氏檸檬酸桿菌)；Tobimatsu等人，J.Biol.Chem.27122352-57(1996)(K.pasteurianum))。也報導了dhaT基因的核苷酸序列(參見，例如，Luers等人，FEMS Microbiol.Lett.154337-45(1997)(巴氏梭菌)；Daniel等人，J.of Bacteriol.1772151-56(1995)(弗氏檸檬酸桿菌))。本發明提供的特異探針包括基於K.pasteurianum的dhaB基因的引物對(如以下通過說明性實施方案詳述的，dhaB15』(SEQ ID NO1)；dhaB13』(SEQ ID NO2)；dhaB25』(SEQ ID NO3)；dhaB23』(SEQ IDNO4)；dhaB35』(SEQ ID NO5)；dhaB33』(SEQ ID NO6))，它們特別可用於通過聚合酶鏈反應(「PCR」)擴增甘油發酵酶編碼多核苷酸或其片段。能用這種引物對從目的生物中擴增甘油發酵酶編碼多核苷酸的片段，隨後作為探針用於從相同或不同生物中鑑定並克隆全長編碼序列。可標記探針，以在例如cDNA文庫中鑑定同源序列。此外，也能用探針作為引物尤其通過PCR或RT-PCR擴增側翼為可被該引物識別的序列的多核苷酸序列。特別是，能從cDNA或基因組文庫，從分離的生物，或從環境樣品中擴增目的序列，如下詳述。
在本發明的一個實施方案中，將要篩選的樣品是一種懷疑攜帶嗜熱生物的環境樣品，如從利於嗜熱生活的環境中收集的水、土壤或泥樣品。一般而言，以一種方式製備環境樣品，使樣品中存在的核酸可與互補探針如PCR引物相互作用。能根據與上述探針雜交的能力識別編碼甘油發酵酶的多核苷酸或其片段。
從環境樣品中分離和克隆本發明的多核苷酸的一種優選方法是利用PCR。該技術利用編碼同源酶或具有類似活性的酶的多核苷酸之間的序列同源性。該方法使用基於已知甘油發酵酶編碼多核苷酸序列或其部分的一組引物，從環境樣品中擴增同源多核苷酸序列或其片段。能用本領域周知的常規PCR方法從樣品中的DNA中，特別是從樣品中微生物的基因組DNA中擴增同源多核苷酸。此外，也能通過合成RNA的第一鏈cDNA拷貝，並經PCR(如RT-PCR)擴增cDNA，從樣品中的RNA中，特別是mRNA或總RNA中擴增同源多核苷酸。利用本領域技術人員周知的技術，能調節反應的退火條件，使引物以希望的同源性水平雜交，由此可擴增與引物所基於的序列有較多或較少同源性的序列。該方法允許分離完整的甘油發酵酶編碼開放閱讀框(「ORF」)或其片段。甘油發酵酶編碼ORF的一個或多個片段能一起克隆和剪接，以產生完整的ORF。然後能在實施本發明的不同方面中用擴增的甘油發酵酶編碼ORF表達編碼的甘油發酵酶。例如，能將序列導入宿主細胞中，從而使宿主細胞能發酵甘油。此外，為了如無細胞發酵的用途也能純化表達的酶。此外，為了進一步檢測和分離新型熱穩定甘油發酵酶編碼序列，能用ORF序列本身設計新型引物和探針。
在本發明的另一個實施方案中，樣品是由嗜熱生物(特別是已知能將甘油發酵為1，3-丙二醇的生物)製備的一種多核苷酸文庫，優選地是一種基因組或cDNA文庫。關於分子生物學技術的一般背景及如何製備cDNA文庫和基因組文庫，參見，例如，Ausubel等人，同上文；Sambrook等人，同上文；美國專利號5,650,148。如上所述，能用核酸雜交篩選技術結合適當標記的探針篩查該文庫。Benton和Davis，Science196180(1977)(噬菌體文庫)和Grunstein和Hogness，Proc.Natl.Acad.Sci.USA723961-65(1975)(質粒文庫)描述了合適的篩選技術，在此引用作為參考。
在本發明的另一個實施方案中，樣品含有一種分離的生物，或由分離的生物產生的多核苷酸文庫，能用PCR或RT-PCR從中擴增本發明的多核苷酸。優選地，使用的分離的生物是嗜熱生物，並能發酵甘油。
在本發明的一個實施方案中，構建一種表達文庫，它能指導該文庫的多核苷酸組分編碼的基因產物的表達。
在本發明的一個特別優選的實施方案中，通過檢測其組分編碼可催化甘油發酵中一個步驟的基因產物的能力，功能篩查表達文庫。在一個優選實施方案中，通常不能將甘油發酵為1，3-丙二醇的生物用如上所述的DNA文庫(優選地由已知能發酵甘油的嗜熱生物製備的文庫)的組分轉化。然後通過在甘油上厭氧生長，根據將甘油發酵為1，3-丙二醇的能力，篩選轉化的生物。能根據1，3-丙二醇或乙酸鹽的產生篩選轉化的微生物。在甘油上厭氧生長或產生1，3-丙二醇和/或乙酸鹽的能力表明，用來轉化生物的文庫組分編碼一種具有甘油發酵所需酶活性的酶。然後能用標準技術克隆和表徵該文庫組分，並在實施本發明的各方面中使用。
用上述功能克隆策略轉化的微生物可以是先天缺乏發酵甘油的能力的微生物，或由於突變(例如甘油發酵所需的一種基因的無效突變)喪失發酵甘油的能力的微生物。可以用本領域周知的技術將這種突變構建到生物中。微生物可以是，但並非必須是嗜熱生物。優選地，測試的微生物沒有甘油發酵所需的一種酶活性，使得導入一種酶活性能恢復發酵甘油的能力。
此外，能用標準技術結合抗甘油發酵酶的抗體免疫篩選表達的基因產物。關於這種篩選技術，參見，例如，《抗體實驗室手冊》(Harlow和Lane編寫，1988)。5.4 能將甘油發酵為1，3-丙二醇的重組生物本發明也提供一種遺傳改造後表達一種或多種外源(即異源)熱穩定甘油發酵酶的重組生物。在本說明書中使用時，術語「外源」是指該酶由一種異源多核苷酸編碼序列(即對於宿主生物不是天然的或內源的多核苷酸序列)編碼。在一個優選實施方案中，構建重組生物使之表達一種來源於C.viterbiensis的熱穩定甘油發酵酶，或與這種酶同源的酶。在一個特別優選的實施方案中，構建重組生物使之表達一種來源於C.viterbiensis株如JW/MS-VS5T的脫水酶或1，3-丙二醇氧化還原酶。
本發明的一種重組生物能用於實施本發明的多個方面。例如，能用該重組生物作為甘油生物轉化為1，3-丙二醇過程中的催化劑。在另一個非限制性實施方案中，能用該重組生物作為熱穩定甘油發酵酶的來源，它能用技術人員熟悉的蛋白質純化技術分離。
本發明提供適於克隆、轉化和表達編碼熱穩定甘油發酵酶的多核苷酸序列或其片段的多種載體和轉化和表達盒。合適的載體是那些適應於宿主微生物和產生的重組微生物的用途的載體。例如，合適的載體可來源於質粒、病毒(如噬菌體T7或M13衍生的噬菌體)或粘粒。獲得和使用這些載體的方法為本領域技術人員所周知。參見，例如，Sambrook等人，同上文。
載體或盒一般含有指導相關基因轉錄和翻譯的序列、選擇性標記和允許自主複製或染色體整合的序列。合適的載體包含攜帶轉錄起始控制的編碼序列5』的區域和控制轉錄終止的編碼序列3』的區域。在一個優選實施方案中，控制區來源於與轉化的宿主細胞同源的基因。
優選地構建本發明的重組載體，特別是表達載體，使編碼序列與編碼序列轉錄和翻譯所必需的一個或多個調節元件有效結合。在此使用時，術語「調節元件」包括但不限於編碼誘導型和非誘導型啟動子、增強子、操縱子的核苷酸序列和本領域中周知可引導和/或調節多核苷酸編碼序列表達的其它元件。在此使用時，當調節元件有效調節或允許編碼序列的轉錄或其mRNA的翻譯或此兩者時，稱編碼序列與一個或多個調節元件「有效結合」。
這些載體的調節元件在強度和特異性上可能不同。根據使用的宿主/載體系統，能使用多種合適的轉錄和翻譯元件中的任一種。細菌的轉錄調節區或啟動子的非限制性例子包括β-gal啟動子、T7啟動子、TAC啟動子、λ左及右啟動子、trp和lac啟動子和trp-lac融合啟動子。
表達重組蛋白的一般方法在本領域中眾所周知，如R.Kaufman，Methods in Enzymology 185537-566(1990)。任選地，異源序列能編碼包含N端鑑定肽的融合蛋白，該肽提供希望的特性，例如表達的重組產物的穩定性或簡化的純化。
為了引導甘油發酵酶進入宿主細胞的分泌途徑，可在表達載體中含有分泌信號序列。分泌信號序列與編碼甘油發酵酶的多核苷酸序列在正確的閱讀框中連接。分泌信號序列通常位於編碼序列的5』。分泌信號序列可以與宿主生物分泌的蛋白質正常結合。
一旦構建合適的轉化或表達載體，即可利用已知的方法用它轉化合適的宿主細胞，如鈣通透的細胞、電穿孔、原生質體轉化或用重組噬菌體病毒轉染。合適的表達宿主包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)和芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈黴菌屬(Streptomyces)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)的不同種，儘管也可使用其它的作為選擇。
在一個優選實施方案中，本發明提供一種經遺傳構建表達一種或多種外源熱穩定甘油發酵酶的嗜熱重組微生物。這些微生物特別可用於如上所述的甘油向1，3-丙二醇的生物轉化。嗜熱微生物的例子包括芽孢桿菌屬、棲熱菌屬(Thermus)、硫化葉菌屬(Sulfolobus)、熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacter)、熱分枝菌屬(Thermobrachium)和喜熱菌屬(Caloramator)的成員。
選擇的宿主微生物優選地能產生輔因子腺苷-鈷胺素(輔酶B12)。必要時，能引入B12合成基因，微生物和/或培養基能補充維生素B12。5.5 分離熱穩定甘油發酵酶的方法本發明提供一種製備和分離熱穩定甘油發酵酶的方法。在一個優選實施方案中，該酶為基本上純化的形式。在一個非限制性實施方案中，從表達天然熱穩定甘油發酵酶的嗜熱微生物中分離該酶。在另一個非限制性實施方案中，從經構造表達編碼熱穩定甘油發酵酶的外源多核苷酸序列的重組生物中分離該酶。此外，也能用常規溶液或固相肽合成法製備本發明的熱穩定酶，如Creighton，同上文所述。
表達目的熱穩定甘油發酵酶的宿主細胞一般用本領域周知的方法在適於生產該酶的營養培養基中培養。例如，可通過搖瓶培養、在實驗室或工業發酵罐中小規模或大規模發酵(包括連續、分批、補料分批或固態發酵)培養細胞，這在合適的培養基中和可表達和/或分離該酶的條件下進行。合適的營養培養基一般包含碳源和氮源和無機鹽，使用本領域周知的方法。合適的培養基可從供應商處獲得，或者可以按照公開的組成製備(例如，美國典型培養物保藏中心目錄)。
根據使用的宿主細胞和表達載體的性質，酶可以保留在細胞質中，通常是不溶性顆粒(稱為包涵體)，或者可以由細菌分泌序列導向周質間隙。對於前者，裂解細胞，回收並變性顆粒，之後通過稀釋變性劑使該酶重摺疊。對於後者，可以通過破壞細胞，例如超聲處理或滲壓休克，釋放周質間隙的內容物並回收該酶，從周質間隙中回收該酶。如果酶分泌到營養培養基中，可直接從培養基中回收。
然後可利用本領域周知的常規技術回收細胞產生的酶，包括但不限於離心、過濾、抽提、噴霧乾燥、蒸發、差異溶解度(例如硫酸銨沉澱)、層析(例如離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)或電泳法(例如製備、等電聚焦(IEF))(參見，例如《蛋白質純化》(Janson和Ryden編寫，1989)；Scopes，《蛋白質純化原理與實踐》(1994)；Sambrook等人，同上文；Ausubel等人，同上文)。
在一個優選實施方案中，將酶純化為包含便於快速親和純化的融合元件的融合蛋白。有用的純化融合元件包括組氨酸和穀胱甘肽S-轉移酶(GST)標籤。可包含一個蛋白酶識別位點，如凝血酶或因子Xa識別位點，使得能從融合元件上切下希望的蛋白質產物。可用於構建基因融合表達系統的載體能商品獲得，如從Amersham Pharmacia Biotech，Inc.(Piscataway，NJ)購得。
文獻中描述了可用於分離甘油發酵酶的特異蛋白質純化方法(參見，例如，Seyfried等人，J.of Bact.1785793-96(1996)(甘油脫水酶)；Tobimatsu等人，J.of Bact.1814110-13(1996)(甘油脫水酶)；Johnson等人，J.of Bact.1692050-54(1987)(1，3-丙二醇氧化還原酶))。例如，Seyfried等人描述了用維生素B12-瓊脂糖樹脂作為親和基質純化甘油脫水酶。5.6 將甘油生物轉化為1，3-丙二醇的方法本發明提供將甘油轉化為1，3-丙二醇的生物方法。在此使用時，將甘油轉化為1，3-丙二醇的「生物」方法是使用生物催化劑(如甘油發酵酶)作為微生物的組分或在無細胞酶催化反應系統中使用它的方法。特別是，本發明提供能在高溫下進行，由嗜熱生物和/或熱穩定酶催化的生物轉化方法。在一個優選實施方案中，該方法在高於50℃時、更優選地在高於60℃時進行，使用能將甘油發酵為1，3-丙二醇的嗜熱微生物。
在一個非限制性實施方案中，該方法使用一種自然表達熱穩定甘油發酵酶全互補序列的嗜熱微生物，表達的酶足以催化甘油發酵為1，3-丙二醇中的所有反應步驟，例如1，3-丙二醇氧化還原酶、甘油脫水酶和/或二醇脫水酶。在一個特別優選的實施方案中，用一種C.viterbiensis菌株，例如JW/MS-VS5T株，作為生物催化劑。
在一個備選實施方案中，該方法使用一種重組微生物，優選地一種嗜熱重組微生物，它經過遺傳構造可表達一種或多種外源熱穩定甘油發酵酶。嗜熱微生物的例子包括芽孢桿菌屬、棲熱菌屬、硫化葉菌屬、熱厭氧桿菌屬、熱分枝菌屬和喜熱菌屬的成員。在本說明書中使用時，術語「外源」是指該酶由一種異源多核苷酸編碼序列(即對於嗜熱宿主生物不是天然的或內源的多核苷酸序列)編碼。在一個優選實施方案中，異源多核苷酸序列編碼一種來源於C.viterbiensis的熱穩定甘油發酵酶，或與這種酶同源的酶。在一個特別優選的實施方案中，異源多核苷酸序列來源於一種C.viterbiensis菌株。
任選地，在本發明的方法中使用的嗜熱微生物能產生輔因子腺苷-鈷胺素(輔酶B12)。必要時，能引入B12合成基因，微生物和/或培養基中能補充維生素B12。
本發明提供一種用本發明的嗜熱生物將甘油生物轉化為1，3-丙二醇的發酵方法。應當優化發酵條件，平衡成本收益與產量和效率。商業發酵方法的發展一般逐步進行，開始時用小瓶，然後用小發酵罐(10加侖以下)、中度大小的發酵罐(可達幾百加侖)，最後用大規模發酵罐(數千加侖)。在每一生產階段，調節發展條件以最小成本產生最大產量。培養基的有機和無機組成，以及pH、溫度和氧濃度，是使生產效率達到最大的主要變化因素。甚至在分批培養過程中，為了達到最大產量，發酵過程中條件常常變化，並且在發酵過程中監測條件，以確保重要參數保持在允許的限制內。在加入生產過程中使用的微生物菌株之前，反應室和底物溶液應當滅菌。當在較低溫度下發酵時，反應物感染微生物汙染物容易導致用於產生產物的菌株的競爭性置換，具有明顯的不利結果。本發明的一個重要優點是，利用嗜熱生物和/或熱穩定酶，能在大多數可能的汙染物不能存活的高溫下進行反應。
發酵培養基的組成必須包括支持微生物生長和希望的產物形成所必需的養分。必需的養分包括碳源、氮源和磷。根據經濟及生物基礎選擇特定營養來源。根據發酵方法的性質，可在發酵開始時加入所有原材料，或者可以在過程中向微生物中逐漸補加養分。
反應物的pH可大大影響發酵。參與形成希望的產物的酶全都具有最大活性的最適pH範圍和保持活性的有限pH範圍。發酵罐中生物的快速生長能快速改變培養基的pH。例如，酸(如乙酸)的積累能使未緩衝的培養基的pH急劇降低，抑制或終止希望的發酵產物的產生。為了防止這些改變，應當緩衝發酵培養基以防止pH改變。另外，一般連續監測反應溶液的pH，需要時加入酸或鹼，以保持在可接受的允許限度內。在使用JW/MS-VS5T株的發酵過程中，培養基的pH應當保持在約5.0-7.8，優選地約pH 6.0-6.5。
也應當仔細調節反應溫度，以達到最佳產量。能用加熱盤管保持升高的溫度，以達到最佳的產物形成率，並抑制微生物汙染物的感染。加熱盤管也能用於對發酵容器的定期滅菌。能在符合微生物活性和生存力的任何溫度下進行發酵。在一個優選實施方案中，在至少40℃、優選地至少50℃、最優選地至少60℃或更高的溫度下進行本發明。在使用JW/MS-VS5T株的發酵過程中，溫度應當保持在33-64℃，優選地50-64℃，最優選地57-64℃。
除了營養和環境參數外，發酵過程可以設計為分批過程，類似於用微生物培養物接種含有培養液的搖瓶，或是連續流動過程，類似於恆化器。方法設計的選擇取決於希望的產物生產和回收的經濟情況。與分批過程相比，流通發酵罐更易於被不希望的生物汙染，這使得質量控制難以保持，特別是在適中溫度下進行發酵時。然而，流通設計具有可生產能以恆定速度回收的連續產物的優點。由於它們是自然的，分批方法需要一定的啟動時間來起始發酵過程，需要一定的溫育時間使發酵產物積累，需要一定的回收時間使產物與培養基和微生物細胞分離。
在本發明的另一個實施方案中，能用該方法將可發酵碳底物而不是甘油轉化為1，3-丙二醇。在一個非限制性實施方案中，可以通過向微生物中重組導入甘油轉化為1，3-丙二醇所必需的熱穩定1，3-丙二醇產生酶的互補物，構建能將可發酵碳底物(如單糖，如葡萄糖，或多糖)轉化為甘油的嗜熱微生物，使之產生1，3-丙二醇。這些酶可來源於能將甘油轉化為1，3-丙二醇的嗜熱生物，例如C.viterbiensis。美國專利號5,686,276敘述了向非嗜熱生物中重組構建甘油發酵為1，3-丙二醇所需酶活性的技術，在此引用作為參考。
此外，能構建本發明的一種重組微生物，使之將不是甘油的碳源發酵為1，3-丙二醇。這些生物的使用是有利的，特別是對於由便宜的碳源(如葡萄糖或可發酵多糖)生產1，3-丙二醇。例如，可以構建能將甘油發酵為1，3-丙二醇的微生物，使之能將糖酵解中間產物(如二羥丙酮磷酸鹽)轉化為甘油，從而允許將來自非甘油來源的碳引入發酵途徑中。WO98/21340(在此引用作為參考)敘述了通過用含有編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的基因和編碼甘油-3-磷酸磷酸酶的基因之一或兩者的表達盒轉化合適的宿主細胞，由重組生物產生甘油的方法。這些生物能將單糖(如葡萄糖)發酵為甘油。這些生物，或者實際上是可產生這些酶或備選甘油合成途徑酶的任何遺傳工程生物，能作為宿主細胞用於利用本發明的組合物和方法將甘油進一步發酵為1，3-丙二醇。此外，WO98/21339(在此引用作為參考)敘述了可表達編碼甘油-3-磷酸脫氫酶、甘油-3-磷酸酶、甘油脫水酶和1，3-丙二醇氧化還原酶的基因，從而能將葡萄糖和其它糖轉化為1，3-丙二醇的工程重組微生物。因此，本領域技術人員能利用這一策略由任何碳底物生產1，3-丙二醇，它能被轉化為甘油、二羥丙酮、甘油氧化狀態的C3化合物(例如甘油-3-磷酸)或二羥丙酮氧化狀態的C3化合物(例如二羥丙酮磷酸或甘油醛3-磷酸)(參見，例如，WO98/21339)。
在本發明的另一個實施方案中，可以構建使用的重組嗜熱生物，使之表達或以提高的水平表達一種能抑制甘油發酵酶失活的蛋白質。例如，能用WO98/21341(在此引用作為參考)所述的技術引入能逆轉甘油脫水酶的底物介導失活的酶的表達。
在含有將被轉化為1，3-丙二醇的碳底物(優選地作為唯一的或主要的碳源)的培養基中實施本發明的方法。在一個優選實施方案中，使用一種基礎培養基，其中甘油作為唯一或主要的碳源。除了合適的碳源外，發酵培養基必須含有合適的礦物質、鹽、輔因子、緩衝液和本領域技術人員公知適於培養物生長和提高產生1，3-丙二醇所需的酶活性的其它成分。應當特別注意Co(II)鹽和/或維生素B12或其前體。以下實施例中列出了在C.viterbiensis將甘油轉化為1，3-丙二醇中使用的合適培養基的具體非限制性實例。
本發明的方法能在需氧或厭氧條件下進行，厭氧或微需氧條件是優選的。在一個特別優選的實施方案中，該方法在氮或氬空氣下進行，例如在比例為80∶20的N2/CO2空氣下進行。也可加入能與培養基中的分子氧反應並除去它們的化學藥品。例如，巰基醋酸鈉能與游離氧反應，並從溶液中除去它。類似地，胺基酸半胱氨酸和含有巰基的其它化合物也能用來從培養基中清除分子氧。對於液體培養物，可以用氮使培養基起泡，以除去空氣和痕量的氧，之後密封培養容器，以防止氧氣再次進入。
另外，也可以用厭氧培養室排除空氣中的氧。厭氧室的常見形式(如Gas Pak系統)可產生氫，它在厭氧室內作為催化劑與氧反應，產生水。該系統中也產生二氧化碳，以佔據氧氣轉化為水所消耗的氣體體積。
可以通過對培養基進行高壓液相層析(HPLC)分析直接鑑定1，3-丙二醇。例如，能用0.01N硫酸的流動相以等度方式在分析離子交換柱上分析發酵培養基。此外，1，3-丙二醇也能用其它合適的分析技術鑑定，包括但不限於氣相色譜法(GC)和氣相色譜-質譜法(GC-MS)。
1，3-丙二醇能用本領域技術人員公知的技術從發酵培養基中純化，包括蒸餾、離心、過濾和層析分離。例如，通過對反應混合物進行有機溶劑抽提、蒸餾和柱層析，能從細胞培養基中獲得丙二醇，如美國專利號5,356,812所述，在此引用作為參考。對於這種方法，一種特別優秀的有機溶劑是環己烷，如美國專利號5,008,473所述。
此外，也能在使用吸附到或結合於載體(如纖維素)的酶和/或微生物細胞的發酵系統中產生1，3-丙二醇。結合的及這樣固定的酶作為固體表面催化劑。然後使一種含有反應底物(如甘油)的溶液通過固體表面。溫度、pH和氧濃度設置為最佳水平，以達到最大轉化率。當希望的轉化包括一個代謝步驟，例如甘油轉化為1，3-丙二醇形成過程中的一種中間物，或這種中間物轉化為1，3-丙二醇，這一類型的方法是特別合適的。當需要多種酶活性將初始底物轉化為希望的產物時，這種方法更加複雜。該培養基一般必須包含催化所需的任何輔助因子，如酶輔因子(例如維生素B12)和還原相當物。能用上文所述的技術從發酵培養基中純化希望的產物。當使用這些固定系統時，提供保持酶活性和使酶失活或損失減到最小的條件是重要的。當在這類固定系統中使用全細胞而不是無細胞酶時，在過程中保持微生物的生存力是重要的。使用固定細胞的該方法一般包括加入必要的生長底物。
根據本發明的方法使得甘油能被基本上化學計量地轉化為1，3-丙二醇。1，3-丙二醇的產量通常為由3摩爾甘油產生2摩爾1，3-丙二醇的數量級。在本說明書中，基本上被理解為至少80％、優選地至少95％的甘油消耗。
本發明的方法和組合物產生的1，3-丙二醇在生產聚酯和薄膜中有用。例如，Whinfield和Dickson用1，3-丙二醇作為原材料合成了聚(對苯二甲酸1，3-丙二酯)(PPT)。PPT的物理性質優於一般可購得的聚酯聚(對苯二甲酸乙二酯)(PET)。例如，美國專利號5,340,909和5,872,204敘述了合成PPT的其它方法，在此引用作為參考。也能合成其它聚合物。
下列實施例是為了說明，而不是限制本發明。6實施例C.viterbiensis模式株JW/MS-vS5T的分離6.1 材料與方法6.1.1 生物來源該菌株從1997年6月從靠近義大利Viterbo的Bagnaccio泉區淡水溫泉中收集的混合沉澱/水樣品中分離。採樣點的溫度為63℃，pH為6.6-6.7。Canganella等人，J.Basic Microbiol.359-19(1995)更全面地描述了這些條件，在此引用作為參考。
6.1.2 培養基與培養用於富集、分離和培養的基礎培養基按照改進Hungate技術在N2/CO2(80∶20)氣相下製備，如Ljungdahl等人《工業微生物與生物技術手冊》(Demain和Solomon編寫，1896)所述。基礎培養基含有(每升去離子水)0.5g(NH4)2SO4、0.5g NH4Cl、2.0g KH2PO4、0.04g MgCl2·6H2O、0.04g CaCl2·2H2O、4.2g NaHCO3、0.13g Na2S·9H2O、0.13g半胱氨酸-HCl、0.3g酵母提取物、0.001g刃天青、3.0g甘油、2ml維生素溶液(如Wolin等人，J.Biol.Chem.2382882-86(1963)所述)和1ml痕量元素溶液。痕量元素含有(mmol/l)2.0(NH4)2FeSO4·6H2O、1.0CoCl2·6H2O、1.0(NH4)2Ni(SO4)2·6H2O、0.1Na2MoO4·2H2O、0.1Na2WO4·2H2O、0.5ZnSO4·7H2O、0.01CuCl2·2H2O、0.5Na2SeO3、0.1H3BO3、0.5MnCl2·4H2O和0.01 AlK(SO4)2·12H2O。調節pH為6.0(25℃時)。富集物和純培養物通常在Hungate管中的10ml培養基中在N2/CO2(80∶20)空氣下生長。除非另外指出，所有溫育均在60℃下進行。
6.1.3 生長的測定通過在600nm波長下測量光密度的增加測定細菌的生長(spectronic21，Bausch Lomb，Rochester，NY)。
6.1.4 pH和溫度範圍為了確定生長的pH範圍，用815 MP型pH計(Fisher Scientific，Pittsburg，PA)在25℃時測量pH。在pH25℃6.0的基礎培養基中，用溫度梯度培養箱(Scientific Industries，Inc.，Bohemia，N.Y.)在振搖(15spm)下測量生長的溫度範圍。
6.1.5 底物利用用補充了高壓滅菌或過濾除菌的底物代替甘油的基礎培養基測試生物利用不同底物的能力。培養物溫育兩周，通過測量光密度監測其生長。
6.1.6 電子受體在含有甘油(3g/l)作為底物的基礎培養基中研究不同電子受體的可能的用途。由高壓滅菌的貯存液中加入不同電子受體。基礎培養基中生長的培養物用作接種物(10％ v/v)。通過測定亞硝酸鹽產生(對於硝酸鹽)、硫化物產生(對於硫酸鹽和元素硫)或顏色改變(AQDS)監測電子受體(10mM)的利用。
6.1.7 抗生素敏感性通過向含有100g/ml過濾除菌的抗生素的新鮮基礎培養基中轉移指數生長的培養物測定對抗生素的敏感性。培養物溫育兩周。
6.1.8 顯微鏡檢查常規檢查用光學顯微鏡進行(PM 10AD型，Olympus Optical Co.，Ltd，東京，日本，配有相差光學裝置)。透射電鏡檢查用100CX型電子顯微鏡進行(JEOL，東京，日本)。進行超薄切片的樣品用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛製備，用於後染色，如Spurr，J.Ultrastruc.Res.2631-43(1969)所述。革蘭氏染色用Hucker的方法進行(Doetsch，《普通微生物學方法手冊》(Gerhardt等人編寫，1981))。
6.1.9 分析技術甘油、葡萄糖、短鏈有機酸和乙醇的測定如以前Svetlitshnyi等人，Int.J.Syst.Microbiol.461131-37(1996)所述經高壓液相層析(HPLC)進行。分子氫用氣相色譜分析(Svetlitshnyi等人)。亞硝酸鹽的產生用Boehringer Mannheim的酶分析試劑盒(目錄號905608)測定。硫化物用Cord-Ruwisch，J.Microbiol.Methods 433-36(1985)的方法測定。
6.1.10 DNA的G+C含量按照使用說明書用QIAGEN基因組DNA純化方法分離純化DNA。酶促消化DNA，如Whitman等人，Syst.Appl.Microbiol.7235-240(1986)和Mesbah等人，Int.J.Syst.Bacteriol.39159-167(1989)所述通過HPLC分離核苷測定鳥嘌呤+胞嘧啶(G+C)含量。
6.1.11 16S rRNA基因序列測定和系統發生分析基因組DNA的提取、16S rRNA基因的PCR擴增和純化PCR產物的測序如Rainey等人，Int.J.Syst.Bacteriol.4628-96(1996)所述進行。序列反應產物經乙醇沉澱純化，並用310型遺傳學分析儀(AppliedBiosystems，Foster City，Calif.)電泳。利用ae2編輯程序(Maidak等人，Nucleic acids Res 27171-173(1999))，將該研究中獲得的16S rRNA基因序列與以前測定的可從公開資料庫中獲得的低G+C革蘭氏陽性序列對比。PHYLIP軟體包的程序包括DNADIST和NEIGHBOR，用於系統發生分析(Felsenstein(1993)，系統發生推理軟體包，3.5.1版，華盛頓大學遺傳學系，西雅圖)。用Jukes等人在《哺乳動物蛋白質代謝》(Munro編寫，1969)中的方法計算進化距離。用1000上引導數據組和PHYLIP軟體包(Felsenstein，同上文)的SEQBOOT、DNADIST和CONSENSE程序再次分析樹狀結構。
6.1.12 核苷酸序列保藏號本研究中測定的16S rRNA基因序列由GenBank保藏為保藏號AF181848。系統發生分析中使用的參照16S rRNA基因序列的保藏號和菌株名稱如下掘越氏厭氧分枝菌(Anaerobranca horikoshii)DSM9786T(U21809)、解糖熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptorsaccarolyticus)ATCC 43494T(L09178)、Caloramator coolhaasii DSM12679 AF104215、發光喜熱菌(Caloramator fervidus)ATCC432045T(L09187)、印度喜熱菌(Caloramator indicus)ACM3982T(X75788)、解蛋白喜熱菌(Caloramator proteoclasticus)DSM10124T(X90488)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)ATCC19398T(M59085)、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)ATCC13124T(M59103)、甘油穆爾氏菌(Moorella glycerini)DSM11254T(U82327)、熱醋穆爾氏菌(Moorella thermoacetica)LJDT(M59121)、熱自養穆爾氏菌(Moorella thermoautotrophica DSM 1974T(L09168)、普氏產醋桿菌(Oxobacter pfennigii)DSM 3222T(X77838)、產乙醇熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)ATCC 31550T(L09162)、、熱產硫磺熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter thermosulfurigenes) ATCC3374T(L09171)、速生熱分枝菌(Thermobrachium celere)DSM 8682X99238、解脂熱分枝菌(Thermosyntropho lipolytica)DSM11003T(X99980)。
6.2 結果6.2.1 富集和分離含甘油的基礎培養基用大約10％(w/v)的樣品接種，並在60℃下溫育。另外，pH7.5和pH9.0的相同組成的培養基用樣品接種(每個10％(w/v))。只有在pH6.0時才獲得利用甘油的富集培養物。在之後的轉移後(10％ v/v)，製備該富集培養物的稀釋系列，並用軟瓊脂覆蓋層(由含0.8％瓊脂的基礎培養基組成)平板接種於固體基礎培養基(1.5％瓊脂)上。挑取單克隆，在相同組成的液體培養基中傳代培養，通過HPLC測定1，3-丙二醇的形成。為了隨後的平板接種，用基礎培養基及Kell等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.9981-88(1981)所述的已知成分複雜培養基重複該方法幾次。當培養物在振搖下溫育時，在液體培養基中的生長大大增強。在將菌落轉移到振搖下的60℃液體基礎培養基中後，獲得甘油發酵培養物，它被認為是純的，被命名為JW/MS-VS5T株。
6.2.2 菌落和細胞形態學在含基礎培養基的平板上，在7-10天後出現菌落。一旦適應在平板上生長，隨後在新鮮平板上劃線在2-3天後產生菌落。菌落是均一的圓形、白色的，直徑1.0-1.5mm。JW/MS-VS5T株的細胞是直的到略微彎曲的杆狀，直徑0.4-0.6mm，長度2.0-3.0mm。細胞主要單個存在。利用光學顯微鏡沒有觀察到運動性的跡象。利用不同生長階段的細胞，負染後進行的電鏡分析未能顯示鞭毛的存在。在任何生長階段都沒有觀察到孢子的出現。
6.2.3 革蘭氏染色反應和革蘭氏類型細胞只在指數生長早期革蘭氏染色陽性。JW/MS-VS5T株的超薄切片顯示厚的肽聚糖，因而認為生物是革蘭氏陽性的，Wiegel，Int.J.Syst.Bacteriol.47651-56(1997)。這種定位與16S rRNA測序數據一致，後者將該生物歸於梭菌屬-芽孢桿菌屬分支。除了肽聚糖外，還發現了另一個外層，它可能代表S層，但是EM顯微照片不能顯示任何幾何排列。
6.2.4 溫度與pH範圍pH25℃ 6.0時JW/MS-VS5T株生長的溫度範圍為33-64℃，最適溫度為58℃(
圖1)。在67℃或低於33℃時不能檢測到生長。該菌株在pH25 ℃為5.0-7.8時生長，最適為pH25℃6.0-6.5(圖2)。在pH25℃4.7和pH25℃8.0時未檢測到生長。在最適條件下的最短倍增時間為2.8小時。
6.2.5 底物利用與發酵產物利用的底物包括甘油、葡萄糖、果糖、蔗糖、纖維二糖、乳糖、半乳糖、甘露糖(20mM)、澱粉和酵母提取物(5g/l)。JW/MS-VS5T株不能利用木糖、阿拉伯糖、乙酸鹽、乳酸鹽、甲酸鹽、甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、丙酸鹽、丙酮、琥珀酸鹽、乙二醇、1，2-丙二醇、苯酚、苯甲酸鹽和H2/CO2。
如表1所示，甘油發酵產生乙酸鹽和1，3-丙二醇作為唯一的有機代謝產物。沒有檢測到可測量的C1-C3醇、1，3-丙二醇之外的二醇或乙酸之外的有機酸。在這些培養物中產生顯著含量的H2。
獲得的發酵模式提示根據下列方程式的一種甘油轉化3甘油 2 1，3-丙二醇+乙酸鹽+CO2+H26.2.6 電子受體在甘油作為底物存在下，JW/MS-VS5T株不能還原硝酸鹽(10mM)、無定形氧化Fe(III)(90mM)、9，10-蒽醌-2，6-二磺酸(AQDS)、硫酸鹽(10mM)或沉澱的或升華的So(30mM)。在任何這類電子受體的存在下不能實現1，3-丙二醇的產生。在氣相中使用O2(20％v/v)，JW/MS-VS5T株不能生長。
6.2.7 抗生素敏感性氨苄青黴素、氯黴素、紅黴素、利福平和卡那黴素在100mg/ml培養基的濃度時完全抑制生長。加入相同濃度的鏈黴素和四環素導致生長延遲。
6.2.8 DNA鹼基組成基因組DNA的G+C含量為32mol％(HPLC)。
6.2.9 16S rRNA基因序列對比測定了含長度為1480個核苷酸的JW/MS-VS5T株的幾乎全部16SrRNA基因序列。兩個數據組用於系統發生分析。數據組1含有在該研究中測定的序列和從低G+C革蘭氏陽性菌中選擇的參照序列，而數據組2含有新的序列和可從資料庫中獲得的喜熱菌屬和熱分枝菌屬的5個種的序列。基於數據組1的系統發生分析(含有位點98與位點1469(大腸桿菌位點，Brosius等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 754801-4805(1978))之間的1206個確定的核苷酸)顯示新的分離株聚簇為以前所述的喜熱菌屬和熱分枝菌屬輻射內的不同譜系(圖3)。JW/MS-VS5T株與以前所述的喜熱菌屬和熱分枝菌屬的種有91.7％-94.1％的16S rRNA基因序列相似性，與數據組1所含且圖3所示的其它分類群的序列有83.4％-87.1％的相似性。第二個數據組含有新分離株的序列和喜熱菌屬和熱分枝菌屬的其它5個種的序列，並含有位點38與位點1469(大腸桿菌位點，Brosius等人，同上文)之間的1393個確定的核苷酸，用它來計算該簇的分類組之間的成對相似性值。JW/MS-VS5株與以前所述分類組之間的16S rRNA基因序列相似性為91.3-93.7％。在喜熱菌屬/熱分枝菌屬簇內，在JW/MS-VS5株與速生熱分枝菌之間發現最高的序列相似性值(93.7％)。圖5所示的對這些分支的引導分析明顯地支持喜熱菌屬/熱分枝菌屬簇，以及該組與Collins等人，Int.J.Swiss P.Bacteriol.44812-826(1994)所述梭菌屬簇I的關係。
根據系統發生分析(圖3)顯然，該菌株與速生熱分枝菌和3個喜熱菌屬的種最相關，它們構成了系統發生樹的革蘭氏陽性芽孢桿菌-梭菌分支內的不同簇。這4個種是顯示低G+C含量的嗜熱、化能有機營養厭氧菌，這也適用於JW/MS-VS5T株。表2顯示了該簇中所見5個種的形態學和生理性質的對比。
表1.JW/MS-VS5T株的甘油發酵底物 形成的產物[mM] 碳回收率[％]消耗的甘油[mM]1，3-丙二醇 乙酸鹽 H216.2 11.2 4.8 6.5 99用於在基礎培養基中培養JW/MS-VS5T株的甘油的初始濃度為33mM。
表2.本研究中使用的菌株的選擇特性JW/MS-VS5T，速生熱分枝菌，和喜熱菌屬的種發光喜熱菌、印度喜熱菌和解蛋白喜熱菌。
特性菌株 孢子 溫度範圍 最適溫 最適甘油 最短倍增 G+C含量形成 度 pH 利用時間(h) [mol％]JW/MS-VS5T-≥33-≤6458 6.0-6.5 + 2.80 32速生熱分枝菌*-＞(37-45)- 62-67 8.0-8.5 - 0.17 30-31＜(70-80)印度喜熱菌- ＞37-＜8060-65 8.1 NR 0.33 25發光喜熱菌+ ＞37-＜8068 7.0-7.5 NR 0.75 39解蛋白喜熱菌 + ≤30-＜6855 7.0-7.5 NR 0.50 31NR未報導*不同菌株7 實施例JW/MS-VS5T中dhaB樣基因的檢測7.1 材料與方法用肺炎克雷伯氏菌dhaB基因作為陽性對照通過PCR方法表徵JW/MS-VS5T。使用4組引物(a)dhaB1，包括dhaB15』GGA ATT CAGATC TCA GCA ATG AAA AGA TCA AAA CG(SEQ ID NO1)和dhaB13』GCT CTA GAT TAT TCA ATG GTG TCG GG(SEQ IDNO2)；(b)dhaB2，包括dhaB25』GGA ATA CAG ATC TCA GCA ATGCAA CAG ACA ACC C(SEQ ID NO3)和dhaB23』GCT CTA GATCAC TCC CTT ACT AAG TCG(SEQ ID NO4)；(c)dhaB3，包括dhaB35』GGA ATT CAG ATC TCA GCA ATG AGC GAG AAA ACCATG C(SEQ ID NO5)和dhaB33』GCT CTA GAT TAG CTT CCT TTACGC AGC(SEQ ID NO6)；和(d)dhaX，包括dhaX5』AGG TGG TGCGGA TCC TGT CGA ATC CCT A(SEQ ID NO7)和dhaX3』GAT ACGAGA TCT TTA ATT CGC CTG ACC GGC CAG TAG CAG(SEQ IDNO8)。所有引物均購自GIBCO BRL。PCR反應在Hot Start PCR管(Molecular Bio-Products，Inc.)中進行，使用100μl PCR反應試劑。每100μl PCR反應液含有2μl細菌培養物，20μl 1mM dNTPs，10μl10×PCR緩衝液(100mM KCl，100mM(NH4)2SO4，200mMTris-Cl(pH8.75)，20mM MgSO4，1％Triton，1mg/ml BSA)-[Stratagene，La Jolla，CA]，3μl每2條相對引物組(10 OD/μl)，和1μl Pfu DNA聚合酶(2.5U/μl)-[Stratagene，La Jolla，CA]。在自動熱微循環儀(MJ Research)中在3種不同退火溫度下進行PCR擴增以檢測最佳條件。最終條件如下最初5個循環的變性(94℃，1.5mm.)、低嚴格性退火(37℃，1.5mm.)和延伸(72℃，2.5mm.)。在最初的循環後，在較高退火嚴格性下進行另25個循環變性(94℃，1.5mm.)、退火(55℃，1.5mm.)和延伸(72℃，2.5mm.)。向每個樣品中加入10μl 10×DNA加樣染料，在瓊脂糖凝膠上電泳15μl每種PCR產物。
7.2 結果陽性對照如所料的產生合適的帶。未知微生物顯示與dhaB1和dhab3相同大小但與dhaB2和dhaX大小不同的模糊的DNA帶。模糊的帶可能是由於PCR引物與靶基因的低同源性。這些結果表明，JW/MS-VS5T可能攜帶一種dhaB樣基因，它與肺炎克雷伯氏菌中的dhaB具有相同或相似的功能。8 實施例JW/MS-VS5T甘油脫水酶活性的體外測定檢測甲苯處理的JW/MS-VS5T株細胞將甘油轉化為3-羥基丙醛(3-HPA)和將1，2-丙二醇轉化為丙醛的能力。
8.1 材料與方法細胞在補充有0.5g/l酵母提取物和3g/l甘油的礦物鹽培養基pH6.8中60℃厭氧生長。厭氧收穫細胞，在液氮中-70℃貯存。
融解冷凍的細胞，在手套箱中在厭氧條件下用甲苯處理。甲苯處理包括下列步驟(a)用1ml 50mM KPO4pH8.0洗滌細胞；(b)在Eppendorf5415C離心機中以14000轉/分離心細胞6分鐘；(c)用1.5ml 50mM KPO4pH8.0洗滌細胞；(d)再次在Eppendorf 5415C離心機中以14000轉/分離心細胞6分鐘；(e)用2ml 50mM KPO4pH8.0再溶解細胞；(f)加入20μl甲苯；(g)劇烈振蕩15分鐘；(h)在Eppendorf 5415C離心機中以14000轉/分離心細胞10分鐘；(i)用2ml 50mM KPO4pH8.0洗滌細胞；(j)在Eppendorf 5415C離心機中以14000轉/分離心細胞6分鐘；(k)重複步驟(i)和(j)；(l)用50mM KPO4pH8.0再溶解甲苯處理的細胞；(m)在600nm下測量溶解的細胞的吸光度；(n)細胞貯存在-70℃下。
反應混合物含有(1.0ml)15mM KPO4，pH8.0；0.25M KCl；200mM甘油或1，2-丙二醇；甲苯處理的細胞，0.38OD600；和12μM輔酶B12。反應物在60℃下厭氧溫育，在圖4所示的時間取樣。向50μl甲苄基噻唑啉酮腙(MBTH)溶液(6mg/ml於375mM甘氨酸-HCl pH2.7中)中加入100μl樣品，100℃加熱3分鐘，在冰上冷卻30秒，通過以14000轉/分離心5分鐘澄清。
然後通過用如下C8-反相HPLC系統檢測產物分析澄清的上清液(a)柱子是15×4.6cm Supelco，Supelcosil LC-8-DB，3μM顆粒大小；(b)溶劑A是0.1％TFA；(c)溶劑B是90％乙腈，0.08％TFA；(d)梯度是(時間[分鐘]/％B)0/0，7/45，17/65，22/100，24/100，25/0，30/0；(e)排出體積是20μl；(f)注射器牽拉速度是833.3μl/分鐘；(g)在305nm下檢測，以500nm為參照；(h)樣品波長的帶寬是4，參照波長的帶寬是80。利用該系統，3-HPA的滯留時間是8.7分鐘，丙醛為10.7分鐘。
8.2 結果圖4顯示了60℃時甘油轉化為3-HPA和1，2-丙二醇轉化為丙醛的時程。結果表明，甘油脫水酶在60℃(生物的生長溫度)時有活性。該酶被甘油但不被1，2-丙二醇滅活。文獻中報導了其它甘油脫水酶的類似的滅活。然而，來自克雷伯氏菌屬的甘油脫水酶在60℃時無活性。實際上，未報導甘油脫水酶在60℃時有活性。9 生物保藏物和序列表簡述C.viterbiensis模式株JW/MS-VS5T在1999年8月27日按照國際專利程序微生物保藏物識別的布達佩斯條約的條款由ATCC保藏，命名為ATCC PTA-584。「ATCC」是指位於12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852 U.S.A的美國典型培養物保藏中心國際保藏所。命名是指保藏物的保藏號。
JW/MS-VS5T株的16S rDNA序列在Genbank資料庫中保藏為保藏號AF181848。
等同前面所述說明書足以使本領域技術人員實施本發明。實際上，對於分子生物學、生物技術或相關領域技術人員明顯的實施本發明的上述方法的許多修改也在下列權利要求書的範圍之內。
權利要求
1.在嗜熱生物中將甘油轉化為1，3-丙二醇的一種方法，該方法包括提供一種可將甘油發酵為1，3-丙二醇的嗜熱生物；和在可產生1，3-丙二醇的條件下培養該嗜熱生物。
2.權利要求1的方法，其還包括收集嗜熱生物產生的1，3-丙二醇的步驟。
3.權利要求2的方法，其還包括將1，3-丙二醇聚合為聚合物的步驟。
4.權利要求3的方法，其中該聚合物是聚(對苯二甲酸1，3-丙二醇酯)(PPT)。
5.權利要求1的方法，其中嗜熱生物是Caloramator viterbiensis。
6.權利要求5的方法，其中嗜熱生物來源於保藏為ATCC號PTA-584的生物。
7.一種由甘油生產1，3-丙二醇的方法，該方法包括將甘油與一種熱穩定脫水酶溫育，從而將甘油轉化為3-羥基丙醛；和加入能將3-羥基丙醛還原為1，3-丙二醇的還原劑。
8.權利要求7的方法，其中3-羥基丙醛還原為1，3-丙二醇由熱穩定的1，3-丙二醇氧化還原酶催化。
9.權利要求7或8的方法，其還包括收集1，3-丙二醇的步驟。
10.權利要求9的方法，其還包括將1，3-丙二醇聚合為聚合物的步驟。
11.權利要求10的方法，其中該聚合物是聚(對苯二甲酸1，3-丙二醇酯)(PPT)。
12.權利要求8的方法，其中熱穩定的脫水酶來源於一種嗜熱生物。
13.權利要求12的方法，其中該嗜熱生物是Caloramatorviterbiensis。
14.權利要求12的方法，其中該嗜熱生物來源於保藏為ATCC號PTA-584的生物。
15.一種來源於C.viterbiensis的分離的熱穩定甘油發酵酶。
16.一種分離的熱穩定甘油發酵酶，其來源於保藏為ATCC號PTA-584的生物。
17.一種分離的熱穩定甘油發酵酶，它與來源於C.viterbiensis的熱穩定甘油發酵酶同源。
18.權利要求11、12或13的分離的熱穩定甘油發酵酶，它是一種脫水酶。
19.權利要求18的酶，它是甘油脫水酶。
20.權利要求15、16或17的酶，它是1，3-丙二醇氧化還原酶。
21.一種分離的Caloramator viterbiensis培養物或細胞。
22.權利要求21的分離的培養物或細胞，其中培養物或細胞的基因組與保藏為ATCC號PTA-584的生物的基因組至少95％相同。
23.權利要求21的分離的培養物或細胞，其中培養物或細胞的基因組與保藏為ATCC號PTA-584的生物的基因組至少99％相同。
24.權利要求21的分離的培養物或細胞，其中培養物或細胞的16SrDNA與保藏為ATCC號PTA-584的生物的16S rDNA至少95％相同。
25.權利要求21的分離的培養物或細胞，其中培養物或細胞的16SrDNA與保藏為ATCC號PTA-584的生物的16S rDNA至少99％相同。
26.權利要求21的分離的培養物或細胞，它是保藏為ATCC號PTA-584的生物的後代。
27.一種克隆編碼熱穩定甘油發酵酶的多核苷酸序列的方法，該方法包括將與已知甘油發酵酶基因一部分同源的多核苷酸探針與來自懷疑含有嗜熱生物的環境樣品的多核苷酸分子雜交；和分離與該多核苷酸探針結合的多核苷酸序列。
28.權利要求27的方法，其中用第二個多核苷酸探針以聚合酶鏈反應擴增與該多核苷酸探針結合的多核苷酸序列。
29.權利要求27或28的方法，其中熱穩定甘油發酵酶來源於確定可將甘油發酵為1，3-丙二醇的嗜熱生物。
30.權利要求29的方法，其中該嗜熱生物是Caloramatorviterbiensis。
31.權利要求30的方法，其中多核苷酸探針與已知dhaB基因的一部分同源。
32.權利要求31的方法，其中dhaB基因來自克雷伯氏菌屬。
33.權利要求29的方法，其中至少一種多核苷酸探針選自SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO5和SEQ ID NO6。
34.權利要求33的方法，其中該多核苷酸探針和第二種多核苷酸探針是SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。
35.權利要求33的方法，其中該多核苷酸探針和第二種多核苷酸探針是SEQ ID NO5和SEQ ID NO6。
36.一種克隆編碼熱穩定甘油發酵酶的多核苷酸序列的方法，該方法包括用來自一種嗜熱生物的DNA轉化不能在甘油上厭氧生長的靶生物；和通過在甘油上厭氧生長，鑑定轉化的靶生物，其含有編碼可將甘油轉化為1，3-丙二醇的酶的多核苷酸序列。
37.權利要求36的方法，其中熱穩定甘油發酵酶來源於確定為可將甘油發酵為1，3-丙二醇的嗜熱生物。
38.權利要求37的方法，其中該嗜熱生物是Caloramatorviterbiensis。
39.權利要求38的方法，其中Caloramator viterbiensis來源於保藏為ATCC號PTA-584的生物。
40.一種分離可催化甘油發酵為1，3-丙二醇的嗜熱生物的方法，該方法包括在含有甘油作為主要碳源的培養基中溫育含有嗜熱生物的樣品；和分離至少一種可將甘油發酵為1，3-丙二醇的嗜熱生物。
41.權利要求40的方法，其中在約40℃-約100℃的溫度下溫育樣品。
42.權利要求40的方法，其中在厭氧條件下溫育樣品。
43.權利要求40的方法，其中樣品從溫度約為50℃-約100℃的自然來源獲得。
44.權利要求40的方法，其還包括檢測嗜熱生物產生1，3-丙二醇的步驟。
45.權利要求40的方法，其還包括確定嗜熱生物產生乙酸鹽的步驟。
全文摘要
本發明涉及生產1,3－丙二醇的改進的方法和試劑。更具體而言,本發明提供能催化甘油發酵為1,3－丙二醇的新型嗜熱生物和熱穩定酶。本發明也涉及分離這些嗜熱生物的方法,克隆編碼這些酶的多核苷酸的方法,編碼這些酶的多核苷酸,和利用這些酶和生物生產1,3－丙二醇的方法。
文檔編號C12N9/02GK1382219SQ00814743
公開日2002年11月27日 申請日期2000年9月22日 優先權日1999年9月24日
發明者M·瑟費爾德, J·維戈爾, G·懷特狄 申請人:金克克國際有限公司, 喬治亞州大學研究基金會