一種高效包裹蛋白質的細胞外囊泡及其製備方法

2024-04-12 20:02:05 1

1.本發明涉及生物藥物載體製備技術領域，具體涉及一種高效包裹蛋白質的細胞外囊泡及其製備方法。


背景技術：

2.hek293t細胞是一種衍生自人胚胎腎細胞的細胞系,它具有高產量、易生長、內源性生物量少等優點，且易於處理和轉染，具有較高的細胞外囊泡產生能力。
3.evs是從細胞膜上脫落或者由細胞分泌的雙層膜結構的囊泡狀小體，直徑從10nm到1000nm不等，其中含有各種類型的分子貨物，如蛋白質、mrna、mirna以及各種代謝物。據報導，evs可用於遞送蛋白質，並表現出良好的生物活性和有效性，表明它們有望成為一類新的藥物遞送載體。與人造藥物載體(例如脂質體)相比，evs免疫原性更低。此外，hek293t細胞來源的evs在動物模型上目前並未顯示出具有生物毒性，因此其可成為理想的藥物遞送載體。
4.蛋白質類藥物是醫藥研發領域中最活躍,進展最快的部分，是二十一世紀最有前途的產業之一，但由於很多蛋白質類藥物存在理化性質不穩定如容易被氧化和水解、半衰期較短、清除速率快等缺點，導致其在體內吸收性差，生物利用度低且副作用大，而evs可作為這類蛋白質的天然藥物載體從而克服這些缺點。雖然evs可以通過共孵育、超聲和電穿孔等方式將藥物包裹在其中，但也存在著操作繁瑣，破壞evs完整性和載藥效率低等缺點，使evs能夠精準的包裹蛋白質的方法仍舊有限。


技術實現要素：

5.為解決上述技術問題，本發明提供了一種高效包裹蛋白質的細胞外囊泡及其製備方法，該製備方法可形成一個包裹目的蛋白質的細胞外囊泡的載蛋白質體系，該體系具有包裹效率高，可包裹目的蛋白質廣泛，容易製備等優點。
6.本發明的第一個目的是提供了一種高效包裹蛋白質的細胞外囊泡的製備方法，包括以下步驟：
7.s1，獲得目的基因片段；
8.s2，骨架載體pcdh-sap其特點在於其中含有sap signal序列，此信號肽序列位於目的基因的5』端，可將目的基因特異性表達的蛋白質靶向定位至細胞外囊泡中，即目的蛋白質被包裝至細胞外囊泡內，從而隨著細胞外囊泡的分泌而轉運至靶細胞；
9.所述信號序列的核苷酸序列如seq id no.1所示；
10.s3，將目的基因(goi)與骨架載體pcdh-sap進行連接，獲得pcdh-sap-goi載體(因seq id no.1為32個鹼基對，所以從sap開始到goi起始密碼子的鹼基對數應為3的倍數，如不是須添加相應數量的鹼基對至5』端限制性內切酶位點和goi序列之間)；
11.s4，使用hek293t細胞對pcdh-sap-goi載體進行慢病毒包裝，獲得lv-sap-goi慢病毒載體，然後感染hek293t細胞並篩選獲得293t-sap-goi細胞系，該細胞系將穩定表達目的
基因，由於目的基因5』端含有sap信號肽，因而特異性表達的蛋白質將定位於細胞外囊泡中；
12.s5，分離得到細胞外囊泡evs-go，該evs中富集特異性表達的目的蛋白質。
13.進一步地，s1中，目的基因片段的獲得：以成年動物組織的cdna文庫作為模板，以核苷酸序列如seq id no.2所示的f引物和核苷酸序列如seq id no.3所示的r引物為引物對進行pcr，獲得5』端和3』端分別為mcs區域限制性內切酶位點的目的基因片段。
14.進一步地，s3中，目的基因與骨架載體pcdh-sap的連接，首先要對mcs區域進行限制性內切酶消化，隨後再進行酶連。
15.進一步地，s4中，慢病毒感染hek293t細胞後的篩選具體過程為：lv-sap-goi慢病毒載體感染hek293t細胞三天後進行兩次嘌呤黴素的抗藥性陽性細胞篩選，最終存活的細胞為經目的蛋白質修飾陽性的hek293t細胞，命名為293t-sap-goi。
16.進一步地，s5中，分離過程為：培養293t-sap-goi細胞，培養液配方為dmem高糖基礎培養基和10％去除外囊泡的胎牛血清以及1％雙抗，3天後收集上清，使用0.22μm濾器過濾上清液，隨後以300
×
g離心10min以除去細胞；2000
×
g離心20min和8000
×
g離心30min以除去細胞碎片；最後在4℃下以110,000
×
g離心70min，去除上清液後用pbs重懸再次離心，即可獲得細胞外囊泡evs-goi。
17.進一步地，s5中，製備得到的細胞外囊泡evs-goi來源為人胚胎腎細胞。
18.本發明的第二個目的是提供了一種上述的製備方法製備得到的細胞外囊泡。
19.與現有技術相比，本發明的有益效果在於：
20.1、本發明發現，將目的蛋白質裝載入含有特定信號序列的載體後，可使目的蛋白質高度表達於細胞外囊泡內，使得細胞外囊泡具有高效包裹目的蛋白質的能力；
21.2、本發明使用表達目的蛋白質片段的細胞外囊泡作為藥物載體，構建了一種高效包裹目的蛋白質的細胞外囊泡的載蛋白質體系。該體系具有包裹效率高，可包裹目的蛋白質廣泛，容易製備等優點。
附圖說明
22.圖1為本發明中pcdh-sap-copgfp載體結構圖；
23.圖2為本發明中evs與evs-cg(evs-copgfp)的evs標記物(syntenin和alix)的western blot分析及體外細胞攝取圖；
24.其中，圖a表示來自293t的evs和evs-cg對evs標記物(syntenin和alix)的western blot分析圖；
25.圖b表示evs-cg的細胞攝取圖；
26.圖3為本發明中pcdh-sap-olig2載體結構圖；
27.圖4為本發明中evs與evs-og(evs-olig2)的evs標記物(syntenin和alix)和目的蛋白質olig2的western blot分析、電子顯微鏡圖及納米顆粒跟蹤分析(nanoparticle tracking analysis，nta)表徵圖；
28.其中，圖a表示來自293t的evs和evs-og對ev標記物(syntenin和alix)和目的蛋白質olig2的western blot分析圖；
29.圖b表示evs與evs-og的電子顯微鏡圖；
signal technology，7074s)在室溫孵育1h。最後，在化學發光分析系統中觀察。
44.hek293t細胞接種於24孔培養板中，密度為4
×
104細胞/孔，用5μm dil(red,40726es10,yeasen)染色20min後吸乾染料工作液並用培養基清洗三次，每次五分鐘。然後加入250μg evs-cg共培養24h後，用尼康eclipseci-s顯微鏡(tokyo,japan)觀察evs-cg的體外細胞攝取情況。
45.實驗結果如圖2所示：western blot證實evs和evs-cg均表達evs特異性標記syntenin和alix(見圖2a)。dil染色顯示evs-cg被細胞攝取(見圖2b)。
46.實施例2
47.一種膜內表達olig2治療蛋白的細胞外囊泡的製備方法，具體包括如下步驟：
48.s1，治療性蛋白質基因olig2的獲得：選用成年鼠腦組織的cdna文庫作為模板，設計olig2基因的正向引物(f引物)和反向引物(r引物)，所述f引物的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述r引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，通過pcr獲得5』端和3』端分別為mcs區域的xhoi和ecori限制性內切酶位點的olig2片段；
49.seq id no.4：aatggactcggacgccagcct
50.seq id no.5：tcacttggcgtcggaggtga
51.s2，骨架載體pcdh-sap其特點在於其中含有sap signal序列，此信號肽序列位於目的基因的5』端，可將目的基因特異性表達的蛋白質靶向定位至細胞外囊泡中，即目的蛋白質被包裝至細胞外囊泡內，從而隨著細胞外囊泡的分泌而轉運至目的細胞，所述骨架載體pcdh-sap結構見圖3。
52.seq id no.1：atgggatgtatcaatagtaagcggaaggacgc
53.s3，通過mcs區域的限制性內切酶xhoi和ecori消化，將目的蛋白質與骨架載體pcdh-sap進行連接，獲得pcdh-sap-olig2載體。
54.s4，使用hek293t細胞對pcdh-sap-olig2載體進行慢病毒的包裝，獲得lv-sap-olig2慢病毒載體，使用lv-sap-olig2慢病毒載體感染hek293t細胞三天後進行嘌呤黴素(1μg/ml)的陽性細胞抗藥性篩選，存活的細胞培養三天後再次進行嘌呤黴素(2.5μg/ml)的抗藥性篩選，最終存活的細胞為經pcdh-sap-olig2修飾陽性的hek293t細胞，命名為293t-sap-olig2，對照細胞為293t。
55.s5，以3
×
105cells/ml的濃度分別培養對照細胞293t和293t-sap-olig2細胞，培養液配方為dmem高糖基礎培養基和10％去除外囊泡的胎牛血清以及1％雙抗，3天後收集上清，使用0.22μm濾器過濾上清液，隨後以300
×
g離心10min以除去細胞；2000
×
g離心20min和8000
×
g離心30min以除去細胞碎片；最後在4℃下以110,000
×
g離心70min，去除上清液後用pbs重懸再次在4℃下以110,000
×
g離心70min，即可獲得細胞外囊泡，分別命名為evs和evs-og。
56.二、細胞外囊泡的鑑定，具體包括如下步驟：
57.分別向evs、evs-og和293t細胞中加入ripa裂解緩衝液(solarbio，r0020)和蛋白酶抑制劑苯甲磺醯氟(solarbio，p0100)，使用bca試劑盒(zoman biotechnology)檢測蛋白質濃度。將提取的蛋白質與蛋白質上樣緩衝液混合進行聚丙烯醯胺凝膠電泳。然後將蛋白質轉移至pvdf膜(immobilon，ipvh00010)，封閉後與抗體syntenin(abcam，ab186429)、抗alix(abcam，ab19903)和抗olig2(abcam，ab109186)在4℃孵育過夜。隨後使用兔辣根過氧
化物酶偶聯的二抗(cell signal technology，7074s)在室溫孵育1h。最後，在化學發光分析系統中觀察。
58.分別取20μl evs和evs-og並添加到碳膜銅網上，放置10min，然後在室溫下用1％醋酸鈾染色10min並清洗銅網，最後在空氣乾燥的環境中於透射電子顯微鏡(hitachi ht 7800)下觀察。
59.evs和evs-og在過濾後(孔徑＝100nm)的pbs中稀釋，樣品用pbs洗滌三次後用zetaview pmx 110(particle metrix,meerbusch,germany)進行檢測。最後用zetaview 8.05.10軟體對顆粒的平均尺寸、粒度分布和顆粒數量進行分析。
60.實驗結果如圖4所示：western blot證實evs和evs-og均表達evs特異性標記syntenin和alix。電子顯微鏡圖像清楚地顯示evs和evs-og均呈現雙層膜結構和茶杯狀形態(見圖4b)。nta表徵圖顯示evs和evs-og粒徑大小正常(見圖4c)。western blot證實evs-og表達目的蛋白質olig2(見圖4d)。
61.儘管已描述了本發明的優選實施例，但本領域內的技術人員一旦得知了基本創造性概念，則可對這些實施例作出另外的變更和修改。所以，所附權利要求意欲解釋為包括優選實施例以及落入本發明範圍的所有變更和修改。
62.顯然，本領域的技術人員可以對本發明進行各種改動和變型而不脫離本發明的精神和範圍。這樣，倘若本發明的這些修改和變型屬於本發明權利要求及其等同技術的範圍之內，則本發明也意圖包含這些改動和變型在內。