用於減少嵌合抗原受體強直信號傳導的方法和組合物

2024-04-15 14:23:06 1

用於減少嵌合抗原受體強直信號傳導的方法和組合物
1.相關申請的交叉引用
2.本技術根據35 u.s.c.
§
119要求於2020年6月29日提交的美國臨時申請第63/045,646號的利益，該申請通過引用整體併入本文，包含其相應的序列表。
3.關於聯邦資助的研究或開發的聲明
4.這項工作得到了美國國立衛生研究院、passan基金會(nvd)、美國國防部w81xwh-16-1-0500(sf)和il fondo di gio onlus(sp)的r01 ca193140(gd)、1r35 gm134864(nvd)、ul1 tr002014(nvd)、ro1de028172(sf)、ro3ca239193(sf)和ro3ca216114(sf)的支持。gd還得到了cell medica的支持。內容完全由作者負責，並且不必然代表nih的官方觀點。763.74單克隆抗體及其人源化形式的序列已作為臨時專利提交。
5.序列表的併入
6.序列表特此通過引用整體併入，包含名為p35071wo00_st25.txt的文件，該文件大小為249,328位元組並且創建於2021年6月27日，同樣通過引用整體併入本文。


背景技術：

7.嵌合抗原受體(car)在其最初的概念中是融合蛋白，其中單克隆抗體的重鏈(vh)可變區和輕鏈(v
l
)可變區與不可裂解的柔性接頭組裝以形成單鏈抗體(scfv)，所述單鏈抗體與t細胞受體的信號傳導分子和共刺激胞內域融合。參見eshhar等人，「通過由抗體結合結構域和免疫球蛋白和t細胞受體的γ或ζ亞基組成的嵌合單鏈特異性激活和靶向細胞毒淋巴細胞」，《美國國家科學院院刊(proc.natl.acad.sci.u.s.a)》90:720-724(1993)；finney等人，「在單一基因產物的t細胞中提供初級和共刺激信號傳導的嵌合受體」，《免疫學雜誌(j.immunol.)》161:2791-2797(1998)；imai等人，「具有4-1bb信號傳導能力的嵌合受體引發對急性淋巴細胞白血病的強大細胞毒性」，《白血病(leukemia)》18:676-684(2004)。當將cd19特異性car移植到t細胞中，並將這些細胞輸注到患有急性b細胞白血病的兒科患者中時，獲得了明顯和持續的抗腫瘤活性。參見maude等人，「用於白血病的持續緩解的嵌合抗原受體t細胞」，《新英格蘭醫學雜誌(n.engl.j.med.)》371:1507-1517(2014)。
8.car與腫瘤細胞表達的抗原的接合促進了t細胞的快速和深度激活，其特點是細胞溶解、細胞因子的分泌和增殖。參見dotti等人，「使用表達嵌合抗原受體的t細胞進行治療的設計和開發」，《免疫學綜述(immunol.rev.)》257:107-126(2014)。然而，事實表明car可以引起t細胞的強直信號傳導，這表示持續的抗原獨立激活會導致t細胞迅速耗竭和抗腫瘤活性受損(long等人，「4-1bb共刺激改善了嵌合抗原受體的強直信號傳導引起的t細胞耗竭」，《自然醫學(nat.med.)》21:581-590(2015)(「long等人(2015)」)。第一篇描述car-t細胞強直信號傳導的報告將這種效應歸因於某些scfv的自我聚集傾向，該傾嚮導致細胞表面的car成簇和隨之而來的信號傳導。參見同上。在其他免疫細胞(包含nkt細胞)中也觀察到類似的強直信號傳導。參見xu等人，「共表達gd2特異性嵌合抗原受體和il-15的nkt細胞顯示出體內持久性和對神經母細胞瘤的抗腫瘤活性增強」，《臨床癌症研究(clin.cancer res.)》25(23):7126-7138(2019)。
9.眾所周知，vh和v
l
結構域偶聯形成的scfv有展開的趨勢，導致scfv寡聚。參見worn和pluckthun，「抗體單鏈fv片段的穩定性工程」，《分子生物學雜誌(j mol.biol.)》305:989-1010(2001)(「worn和pluckthun(2001)」)。為了努力穩定scfv，已經開發了多種策略，包含在vh和v
l
結構域之間工程化二硫鍵，在vh和v
l
結構域內引入帶電胺基酸，或將互補決定區(cdr)植入到不同的框架區(fwr)。參見young等人，「通過引入二硫鍵實現單鏈fv抗體片段的熱穩定」，《歐洲生化學會聯合會快報(febs lett.)》377:135-139(1995)；miller等人，「用於開發雙特異性和多價抗體的scfv的穩定性工程」，《蛋白質工程設計與選擇(protein eng des sel)》23:549-557(2010)；和kugler等人，「通過設計的點突變和將cdr移植到人的框架上來穩定和人源化人類淋巴細胞抗原cd19特異性的單鏈fv抗體片段」，《蛋白質工程設計與選擇》22:135-147(2009)。在組裝成car形式的scfv的背景下，由小鼠14g2a單克隆抗體衍生的scfv引起的強直信號傳導被特別歸因於該抗體的fwr。參見long等人(2015)。值得注意的是，將衍生自fmc63單克隆抗體(mab)的scfv的cdr移植到14g2a抗體的fwr中足以引起fmc63 scfv的強直信號傳導，當將這種scfv用於生成car時，表明fwr在引起car形式的scfv的強直信號傳導方面起著關鍵作用。參見同上。
10.tcr介導的強直信號傳導是初始t細胞的特徵明確的穩態特性，並且在促進其長期持久性方面起著關鍵作用。參見myers等人，「強直信號：淋巴細胞為什麼煩惱？」《免疫學趨勢(trends immunol.)》38:844-857(2017)。然而，tcr介導的強直信號傳導需要tcr與以i類或ii類呈現的自體肽的接合，並且嚴格限制在位於淋巴器官的t細胞。參見hochweller等人，「樹突狀細胞控制對外來抗原反應性所需的t細胞強直信號傳導」，《美國國家科學院院刊》107:5931-5936(2010)。與此形成鮮明對比的是，t細胞中car介導的強直信號傳導，從嚴格意義上講，是指獨立於任何特定car接合併且定義為細胞因子如ifnγ的自發釋放的car信號傳導。參見long等人(2015)。觸發car介導的強直信號傳導的事件已被確定為足夠數量的car分子的自發聚集，這會導致信號傳導的啟動。參見long等人(2015)。在這裡，我們證實了強直信號傳導是由於car分子的自我聚集，並進一步證明了car-cd3ζ鏈專門負責自發的細胞因子釋放，因為car-cd3ζ鏈的功能喪失完全取消了infγ的自發釋放。自發的細胞因子釋放，而不是檢測與t細胞耗竭相關的細胞表面標誌物，似乎是界定car強直信號傳導的存在和功能降低的最有力和可靠的測定。
11.已經認識到合成scfv的不穩定性導致其自發聚集，阻礙了可溶性試劑的產生。參見worn和pluckthun(2001)；miller等人，「用於開發雙特異性和多價抗體的scfv的穩定性工程」，《蛋白質工程設計與選擇》23:549-557(2010)。我們先前已經證明了結構建模和計算蛋白設計驅動的誘變可以用來恢復因融合v
l
和vh結構域而扭曲的scfv的特異性。參見krokhotin等人「計算指導的單鏈可變片段設計提高了嵌合抗原受體的特異性」，《分子療法腫瘤學(mol.ther.oncolytics.)》15:30-37(2019)。一般來說，蛋白質的熱力學穩定性(δg)對其生物功能至關重要。蛋白質中的胺基酸突變可以破壞重要的殘基相互作用，改變蛋白質活性位點和蛋白質穩定性。這些不穩定的突變蛋白構象是眾多人類病症本來源。參見redler等人，「作為各種遺傳性病症的共同因素的蛋白質不穩定」，《分子進化雜誌(j mol.evol.)》82:11-16(2016)。因此，量化突變對蛋白質結構的影響對估計蛋白質的穩定性並因此估計其功能是重要的。
12.對於在使用含有不同鉸鏈/間隔區或不同載體/啟動子的car的t細胞中，共刺激
cd28和4-1bb胞內域在加劇或減弱car強直信號傳導方面的作用，已經有相互矛盾的數據報導。參見long等人，(2015)；frigault等人，「介導t細胞組成性或誘導性增殖的嵌合抗原受體的鑑定」，《癌症免疫研究(cancer immunol.res.)》3:356-367(2015)；和watanabe等人，「對car間隔子進行微調提高了t細胞的效力」，《腫瘤免疫學(oncoimmunology)》5:e1253656(2016)。儘管有這些相互矛盾的數據，但還是可以得出結論，scfv的內在不穩定性不能通過使用的共刺激類型或修改car結構的其他組分來糾正。事實上，儘管原始抗體在抗原特異性和親和力方面有優異表現，但car強直信號傳導經常被認為是從進一步car開發中放棄特定scfv的好理由。
技術領域
13.本公開涉及工程化結合結構域、嵌合抗原受體以及用工程化結合結構域和嵌合抗原受體轉化的宿主細胞，以防止免疫細胞中的強直信號傳導。本公開進一步涉及工程化結合結構域、嵌合抗原受體和宿主細胞，其具有含有來自小鼠的胺基酸取代以提供人和小鼠的相容性的人源化框架區。


技術實現要素：

14.本公開提供並包含一種對硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)具有結合特異性的結合成員，所述結合成員包括可變輕鏈序列和可變重鏈序列，所述可變輕鏈序列包括seq id no:1-3所示的輕鏈互補決定區(「lcdr」)lcdr1至lcdr3序列以及選自由seq id no:153至221組成的群組的輕鏈框架序列1(vl-fr1)，選自由seq id no:222至225組成的群組的輕鏈框架序列2(vl-fr2)，選自由seq id no:226至249組成的群組的輕鏈框架序列3(vl-fr3)和選自由seq id no:250至255組成的群組的輕鏈框架序列4(vl-fr4)，所述可變重鏈序列包括seq id no:4至6所示的重鏈互補決定區(「hcdr」)hcdr1至hcdr3序列以及選自由seq id no:256至349組成的群組的重鏈框架序列1(vh-fr1)，選自由seq id no:350至353組成的群組的重鏈框架序列2(vh-fr2)，選自由seq id no:354至360組成的群組的重鏈框架序列3(vh-fr3)和選自由seq id no:361至382組成的群組的重鏈框架序列4(vh-fr4)。
15.本公開提供並包含一種編碼多肽的核酸，所述核酸包括可變輕鏈序列，所述可變輕鏈序列包括seq id no:1-3所示的輕鏈互補決定區(「lcdr」)lcdr1至lcdr3序列以及選自由seq id no:153至221組成的群組的輕鏈框架序列1(vl-fr1)，選自由seq id no:222至225組成的群組的輕鏈框架序列2(vl-fr2)，選自由seq id no:226至249組成的群組的輕鏈框架序列3(vl-fr3)和選自由seq id no:250至255組成的群組的輕鏈框架序列4(vl-fr4)。
16.本公開提供並包含一種編碼多肽的核酸，所述核酸包括可變重鏈序列，所述可變重鏈序列包括seq id no:4至6所示的重鏈互補決定區(「hcdr」)hcdr1至hcdr3序列以及選自由seq id no:256至349組成的群組的重鏈框架序列1(vh-fr1)，選自由seq id no:350至353組成的群組的重鏈框架序列2(vh-fr2)，選自由seq id no:354至360組成的群組的重鏈框架序列3(vh-fr3)和選自由seq id no:361至382組成的群組的重鏈框架序列4(vh-fr4)。
17.本公開提供並包含一種嵌合抗原受體(car)表達構建體，所述構建體包括編碼嵌合抗原受體(car)編碼序列的核酸序列，所述編碼序列包括胞外域序列、跨膜結構域序列和胞內域序列，所述胞外域序列包括與硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)結合的抗體或其抗原結
合片段，所述抗體或其抗原結合片段包括可變輕鏈序列和可變重鏈序列，所述可變輕鏈序列包括seq id no:1-3所示的輕鏈互補決定區(「lcdr」)lcdr1至lcdr3序列以及選自由seq id no:153至221組成的群組的輕鏈框架序列1(vl-fr1)，選自由seq id no:222至225組成的群組的輕鏈框架序列2(vl-fr2)，選自由seq id no:226至249組成的群組的輕鏈框架序列3(vl-fr3)和選自由seq id no:250至255組成的群組的輕鏈框架序列4(vl-fr4)，所述可變重鏈序列包括seq id no:4至6所示的重鏈互補決定區(「hcdr」)hcdr1至hcdr3序列以及選自由seq id no:256至349組成的群組的重鏈框架序列1(vh-fr1)，選自由seq id no:350至353組成的群組的重鏈框架序列2(vh-fr2)，選自由seq id no:354至360組成的群組的重鏈框架序列3(vh-fr3)和選自由seq id no:361至382組成的群組的重鏈框架序列4(vh-fr4)。
18.本公開提供並包含一種嵌合抗原受體(car)，所述嵌合抗原受體(car)包括：胞外域序列、跨膜結構域序列和胞內域序列，所述胞外域序列包括與選自由seq id no:28至65組成的群組的硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)結合的抗體或其抗原結合片段。
19.本公開提供並包含一種編碼car的核酸分子，所述car包括胞外域序列、跨膜結構域序列和胞內域序列，所述胞外域序列包括與選自由seq id no:28至65組成的群組的硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)結合的抗體或其抗原結合片段。
20.本公開提供並包含一種用於生產包括car的免疫細胞的方法，所述方法包括從供體中分離外周血單核細胞("pbmc")，從pbmc中分離自然殺傷t(nkt)細胞、t細胞或自然殺傷(nk)細胞以製備分離的免疫細胞，和將分離的免疫細胞擴增1至20天以通過內源性t細胞受體的刺激以及共刺激受體、細胞因子或兩者的組合的共刺激製備用於基因工程的擴增的免疫細胞，以及引入嵌合抗原受體(car)表達構建體，所述構建體包括胞外域序列，所述胞外域序列包括與硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)結合的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包括選自由seq id no:61至109組成的群組的可變輕鏈和選自由seq id no:110至152組成的群組的可變重鏈。
21.本公開提供並包含一種基因工程化免疫細胞，所述基因工程化免疫細胞包括編碼嵌合抗原受體(car)編碼序列的表達構建體，所述編碼序列包括胞外域序列、跨膜結構域序列和胞內域序列，所述胞外域序列包括與硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)結合的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包括可變輕鏈序列和可變重鏈序列，所述可變輕鏈序列包括seq id no:1-3所示的輕鏈互補決定區(「lcdr」)lcdr1至lcdr3序列以及選自由seq id no:153至221組成的群組的輕鏈框架序列1(vl-fr1)，選自由seq id no:222至225組成的群組的輕鏈框架序列2(vl-fr2)，選自由seq id no:226至249組成的群組的輕鏈框架序列3(vl-fr3)和選自由seq id no:250至255組成的群組的輕鏈框架序列4(vl-fr4)，所述可變重鏈序列包括seq id no:4至6所示的重鏈互補決定區(「hcdr」)hcdr1至hcdr3序列以及選自由seq id no:256至349組成的群組的重鏈框架序列1(vh-fr1)，選自由seq id no:350至353組成的群組的重鏈框架序列2(vh-fr2)，選自由seq id no:354至360組成的群組的重鏈框架序列3(vh-fr3)和選自由seq id no:361至382組成的群組的重鏈框架序列4(vh-fr4)。
22.本公開提供並包含一種細胞群，所述細胞群包括多個基因工程化免疫細胞，所述基因工程化免疫細胞包括編碼嵌合抗原受體(car)編碼序列的表達構建體，所述編碼序列
包括胞外域序列、跨膜結構域序列和胞內域序列，所述胞外域序列包括與硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)結合的抗體或其抗原結合片段，所述car包括可變輕鏈序列和可變重鏈序列，所述可變輕鏈序列包括seq id no:1-3所示的輕鏈互補決定區(「lcdr」)lcdr1至lcdr3序列以及選自由seq id no:153至221組成的群組的輕鏈框架序列1(vl-fr1)，選自由seq id no:222至225組成的群組的輕鏈框架序列2(vl-fr2)，選自由seq id no:226至249組成的群組的輕鏈框架序列3(vl-fr3)和選自由seq id no:250至255組成的群組的輕鏈框架序列4(vl-fr4)，所述可變重鏈序列包括seq id no:4至6所示的重鏈互補決定區(「hcdr」)hcdr1至hcdr3序列以及選自由seq id no:256至349組成的群組的重鏈框架序列1(vh-fr1)，選自由seq id no:350至353組成的群組的重鏈框架序列2(vh-fr2)，選自由seq id no:354至360組成的群組的重鏈框架序列3(vh-fr3)和選自由seq id no:361至382組成的群組的重鏈框架序列4(vh-fr4)。
23.本公開提供並包含一種抑制個體中硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)陽性細胞的方法，所述方法包括使細胞與治療有效量的基因工程化免疫細胞接觸的步驟，其中所述免疫細胞包括嵌合抗原受體(car)，所述car包括胞外域序列、跨膜結構域序列和胞內域序列，所述胞外域序列包括與硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)結合的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或抗原結合片段包括：可變輕鏈序列和可變重鏈序列，所述可變輕鏈序列包括seq id no:1-3所示的輕鏈互補決定區(「lcdr」)lcdr1至lcdr3序列以及選自由seq id no:153至221組成的群組的輕鏈框架序列1(vl-fr1)，選自由seq id no:222至225組成的群組的輕鏈框架序列2(vl-fr2)，選自由seq id no:226至249組成的群組的輕鏈框架序列3(vl-fr3)和選自由seq id no:250至255組成的群組的輕鏈框架序列4(vl-fr4)，所述可變重鏈序列包括seq id no:4至6所示的重鏈互補決定區(「hcdr」)hcdr1至hcdr3序列以及選自由seq id no:256至349組成的群組的重鏈框架序列1(vh-fr1)，選自由seq id no:350至353組成的群組的重鏈框架序列2(vh-fr2)，選自由seq id no:354至360組成的群組的重鏈框架序列3(vh-fr3)和選自由seq id no:361至382組成的群組的重鏈框架序列4(vh-fr4)。
24.本公開提供並包含一種用於治療癌症的方法，所述方法包括向有此需要的受試者施用基因工程化免疫細胞的步驟，所述基因工程化免疫細胞包括與硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)結合的嵌合抗原受體(car)，所述car包括胞外域序列、跨膜結構域序列和胞內域序列，所述胞外域序列包括可變輕鏈序列和可變重鏈序列，所述可變輕鏈序列包括seq id no:1-3所示的輕鏈互補決定區(「lcdr」)lcdr1至lcdr3序列以及選自由seq id no:153至221組成的群組的輕鏈框架序列1(vl-fr1)，選自由seq id no:222至225組成的群組的輕鏈框架序列2(vl-fr2)，選自由seq id no:226至249組成的群組的輕鏈框架序列3(vl-fr3)和選自由seq id no:250至255組成的群組的輕鏈框架序列4(vl-fr4)，所述可變重鏈序列包括seq id no:4至6所示的重鏈互補決定區(「hcdr」)hcdr1至hcdr3序列以及選自由seq id no:256至349組成的群組的重鏈框架序列1(vh-fr1)，選自由seq id no:350至353組成的群組的重鏈框架序列2(vh-fr2)，選自由seq id no:354至360組成的群組的重鏈框架序列3(vh-fr3)和選自由seq id no:361至382組成的群組的重鏈框架序列4(vh-fr4)。
25.本公開提供並包含一種試劑盒，所述試劑盒包括載體、宿主細胞或其組合，所述試劑盒包括編碼嵌合抗原受體(car)編碼序列的核酸序列，所述編碼序列包括胞外域序列、跨膜結構域序列和胞內域序列，所述胞外域序列包括可變輕鏈序列和可變重鏈序列，所述可
變輕鏈序列包括seq id no:1-3所示的輕鏈互補決定區(「lcdr」)lcdr1至lcdr3序列以及選自由seq id no:153至221組成的群組的輕鏈框架序列1(vl-fr1)，選自由seq id no:222至225組成的群組的輕鏈框架序列2(vl-fr2)，選自由seq id no:226至249組成的群組的輕鏈框架序列3(vl-fr3)和選自由seq id no:250至255組成的群組的輕鏈框架序列4(vl-fr4)，所述可變重鏈序列包括seq id no:4至6所示的重鏈互補決定區(「hcdr」)hcdr1至hcdr3序列以及選自由seq id no:256至349組成的群組的重鏈框架序列1(vh-fr1)，選自由seq id no:350至353組成的群組的重鏈框架序列2(vh-fr2)，選自由seq id no:354至360組成的群組的重鏈框架序列3(vh-fr3)和選自由seq id no:361至382組成的群組的重鏈框架序列4(vh-fr4)。
26.本公開提供並包含一種在表達嵌合抗原受體(car)編碼序列的nkt細胞中維持nkt細胞擴增潛力的方法，所述編碼序列包括胞外域序列、跨膜結構域序列和胞內域序列，所述胞外域序列包括與硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)結合的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包括seq id no:1-3所示的輕鏈互補決定區(「lcdr」)lcdr1至lcdr3序列以及選自由seq id no:153至221組成的群組的輕鏈框架序列1(vl-fr1)，選自由seq id no:222至225組成的群組的輕鏈框架序列2(vl-fr2)，選自由seq id no:226至249組成的群組的輕鏈框架序列3(vl-fr3)和選自由seq id no:250至255組成的群組的輕鏈框架序列4(vl-fr4)；可變重鏈序列，所述可變重鏈序列包括seq id no:4至6所示的重鏈互補決定區(「hcdr」)hcdr1至hcdr3序列以及選自由seq id no:256至349組成的群組的重鏈框架序列1(vh-fr1)，選自由seq id no:350至353組成的群組的重鏈框架序列2(vh-fr2)，選自由seq id no:354至360組成的群組的重鏈框架序列3(vh-fr3)和選自由seq id no:361至382組成的群組的重鏈框架序列4(vh-fr4)；所述方法包括表達包括wnt信號傳導途徑中轉錄激活因子的蛋白編碼序列，和培養工程化nkt細胞以製備具有持續擴增潛力的基因工程化nkt細胞群。
27.一種減少小鼠模型中scfv強直信號傳導的方法，所述方法包括識別當作為car的一部分在小鼠免疫細胞中表達時具有強直信號傳導的scfv，生成scfv的結構模型，和進行計算誘變以製備一系列誘變的scfv，計算誘變的scfv的自由能，將誘變的scfv與包括框架1.4(fw1.4)的人源化scfv進行比對，從而識別關鍵的鼠殘基；以及引入一個或多個人到小鼠殘基變化，以增加scfv的穩定性和製備用於小鼠模型的經修飾人源化scfv。
附圖說明
28.參考附圖公開了本公開，其中：
29.圖1呈現了表達編碼scfv 763.74(a)(seq id no:28)的car的car-t細胞的實施例的強直信號傳導結果。圖1a呈現了流式細胞術的代表圖，其顯示了在培養的第8天評估的t細胞中的car表達。763.74(a)cd28和763.74(a)4-1bb表示t細胞中表達的特定car。圖1b呈現了由在沒有任何car特異性激活的情況下表達對照car(ctr)、763.74(a)cd28或763.74(a)4-1bb car的t細胞釋放的ifnγ的量化。在2ml不含細胞因子的完全培養基中以106個細胞/孔在24孔板中鋪板後24小時收集的上清液中測量ifnγ。數據表示為平均值
±
sd，n＝10，*p＝0.0184，***p＝0.0003(ctr相對於763.74(a)cd28)，p＝0.0004(763.74(a)cd28相對於763.74(a)4-1bb)，配對t檢驗。圖1c呈現了由在沒有任何car特異性激活的情況下表達
對照car(ctr)、763.74(a)cd28ζy6f或763.74(a)4-1bbζy6f car的t細胞釋放的ifnγ的量化。數據表示為平均值
±
sd，n＝4。圖1d呈現了代表性共聚焦顯微鏡圖像，其顯示了表達gfp標記的car的t細胞中的gfp聚集(箭頭)，其中car是使用scfv 763.74(a)和cd28或4-1bb胞內域獲得的。表達car(ctr)或gfp的t細胞是對照。顯示了單個場的代表細胞(放大倍數63倍)。
30.圖2呈現了比對，其顯示了逆轉car-t細胞中的強直信號傳導的scfv 763.74(a)的fwr中的胺基酸取代。圖2a呈現了scfv 763.74(a)(seq id no:28)和scfv 763.74(b)(分別為seq id no:68、115和29)的v
l
(seq id no:67)和vh(seq id no:110)的序列。框表示胺基酸取代的位置。圖2b呈現了代表性流式細胞術圖，其顯示了用編碼cd28或4-1bb胞內域的scfv 763.74(a)car和scfv 763.74(b)car工程化的t細胞中的car表達。非轉導(nt)t細胞顯示為陰性對照。圖2c呈現了由在沒有任何car特異性激活的情況下表達不同car的t細胞釋放的ifnγ的量化結果。ctr表示對照car-t細胞。在2ml不含細胞因子的完全培養基中以106個細胞/孔在24孔板中鋪板後24小時收集的上清液中測量ifnγ。數據表示為平均值
±
sd，n＝5，*p＝0.0154 763.74(a)cd28相對於4-1bb；*p＝0.194 763.74(a)相對於(b)4-1bb，配對t檢驗。圖2d呈現了代表性共聚焦顯微鏡圖像，其顯示了表達gfp標記的car的t細胞中的gfp聚集，其中car是使用scfv 763.74(a)或scfv 763.74(b)和cd28或4-1bb胞內域獲得的。顯示了單個場的代表細胞(放大倍數63倍)。
31.圖3呈現了破壞scfv穩定性的scfv 763.74(a)的fwr中的胺基酸取代。圖3a呈現了通過計算建模生成的scfv 763.74(b)的結構構象的帶狀圖，其中顯示了fwr突變。圖3b呈現了選定的胺基酸突變，評價它們對scfv 763.74(b)穩定性的影響。δδg
mut
》0的scfv 763.74(b)結構突變不穩定，隨後影響t細胞中car形式的scfv的自發聚集。圖3c呈現了v123(seq id no:256至274)處突變的計算δδg。圖3d呈現了e127(seq id no:275至295)處突變的計算δδg。
32.圖4呈現了表達具有cd28的763.74(b)car的t細胞在黑色素瘤腫瘤模型中介導腫瘤消除的效果結果。圖4a呈現了代表性流程圖(a)，並且圖4b呈現了實驗的殘餘腫瘤細胞的量化總結，其中使對照t細胞(ctr)和用編碼cd28或4-1bb胞內域的scfv763.74(a)car和scfv 763.74(b)car工程化的t細胞與黑色素瘤細胞系(e:t＝1:5)共培養5天。將細胞收集並用cd3和cd276(b7-h3)mab染色以通過流式細胞術分別識別t細胞和黑色素瘤細胞。數據表示為平均值
±
sd，n＝6，****p《0.0001，雙因素方差分析與bonferroni校正。圖4c呈現了黑色素瘤異種移植模型的實驗方案。皮下注射(s.c.)egfp-ffluc wm115(5
×
105個細胞)，並在7天後向小鼠靜脈內注射(i.v.)對照t細胞(ctr)或用編碼cd28或4-1bb胞內域的scfv 763.74(a)car和scfv763.74(b)car工程化的t細胞(5
×
106個細胞)。圖4d呈現了按照方案(c)治療的小鼠的代表性腫瘤生物發光(bli)(標度：最小＝5
×
106；最大＝5
×
108)。圖4e呈現了(d)中移植的小鼠的腫瘤體積代表圖。虛線代表個體小鼠，並且加粗實線代表組的平均值。4個獨立實驗的總結(對於每種條件，n＝12)，***p＝0.00012；****p《0.0001，雙因素方差分析與bonferroni校正。
33.圖5呈現了表達具有cd28的763.74(b)car的t細胞在膠質母細胞瘤腫瘤模型中的抗腫瘤活性結果。圖5a呈現了膠質母細胞瘤(gbm)異種移植模型的實驗方案。將gbm-ns(1
×
105個細胞)注入尾狀核(i.c)，並在15天後向小鼠瘤內注射對照t細胞(ctr)或用編碼cd28
或4-1bb胞內域的scfv 763.74(a)car和scfv 763.74(b)car工程化的t細胞(2
×
106個細胞)。用磁共振成像(mri)監測腫瘤生長。圖5b至5f呈現了利用注射造影劑的t1加權圖像(t1-wi)和t2加權圖像(t2-wi)進行的代表性mri，其顯示了如(a)中所述治療的小鼠的腫瘤進展和浸潤模式。圖5g呈現了如(a)中所述治療的小鼠的kaplan-meier存活曲線。對於ctr、763.74(a)cd28、763.74(b)4-1bb，n＝7隻小鼠/組。對於763.74(b)cd28和763.74(a)4-1bb，n＝15隻小鼠/組。總存活統計分析使用mantel-cox對數秩檢驗進行。圖5h呈現了在腫瘤內遞送t細胞後的指定時間點，從腫瘤中分離出的car-t細胞中cd69表達的代表性時間過程。數據表示為平均值
±
sd，n＝2。
34.圖6呈現了scfv 763.74(a)的fwr人源化對car強直信號傳導和抗腫瘤活性的影響的結果。圖6a呈現了代表性流式細胞術圖，其顯示了在培養的第8天評估的用編碼cd28(h763.74(#2)cd28和h763.74(#5)cd28)的h763.74(#2)(seq id no:111)和h763.74(#5)(seq id no:114)car工程化的t細胞中的car表達。非轉導(nt)t細胞顯示為陰性對照。圖6b呈現了在2ml不含細胞因子的培養基中以5
×
105個細胞/孔鋪板後，使對照(ctr)、h763.74(#2)cd28和h763.74(#5)cd28 car-t細胞靜置24小時收集的上清液中ifnγ的代表性量化。數據表示為平均值
±
sd，n＝6。圖6c呈現了共培養實驗的代表性流程圖，其中使對照(ctr)或表達h763.74(#2)cd28 car或h763.74(#5)cd28 car的t細胞與黑色素瘤細胞系(e:t＝1:5)一起鋪板5天。將細胞收集並用cd3和cd276(b7-h3)mab染色以通過流式細胞術分別識別t細胞和黑色素瘤細胞。圖6d呈現了黑色素瘤異種移植模型的實驗方案。皮下注射(s.c.)egfp-ffluc wm115(5
×
105個細胞)，並在7天後向小鼠靜脈內注射(i.v.)對照t細胞(ctr)或用763.74(b)cd28 car或h763.74(#2)cd28 car或h763.74(#5)cd28 car工程化的t細胞(5
×
106個細胞)。圖6呈現了根據方案(d)治療的小鼠的腫瘤bli動力學。虛線代表個體小鼠，並且加粗實線代表組的平均值。2個獨立實驗的總結(對於每組，n＝10)。圖6f呈現了將如(d)中所述治療的egfp-ffluc wm115荷瘤小鼠安樂死時外周血、肝和脾中人cd3
+
cd45
+
細胞的量化。數據表示為平均值
±
sd，n＝6。g.處死如(d)中所述治療的egfp-ffluc wm115荷瘤小鼠時外周血中對人cd3
+
cd45
+
細胞門控的car-t細胞的百分比。數據表示為平均值
±
sd，n＝6。
35.圖7呈現了使用衍生自763.74抗體的scfv生成的car的構建體和在t細胞中的表達特徵。圖7a呈現了763.74(a)car構建體的圖。圖7b呈現了在培養第8天評估的在用763.74(a)cd28ζy6f car或763.74(a)4-1bbζy6f car工程化的t細胞中car表達的代表性流程圖和總結。數據表示為平均值
±
sd，n＝4。非轉導(nt)t細胞顯示為陰性對照。
36.圖8呈現了根據本公開的表達scfv 763.74(a)car或763.74(b)car的t細胞的特徵。圖7a呈現了在培養第8天評估的在對照car-t細胞(ctr)和用編碼cd28或4-1bb胞內域的scfv 763.74(a)car和scfv 763.74(b)car工程化的t細胞中的car表達的總結。數據表示為平均值
±
sd，n＝8。非轉導(nt)t細胞顯示為陰性對照。圖8b呈現了如(a)所示的ctr和car-t細胞在培養的第6天和第10天的總細胞數。數據表示為平均值
±
sd，n＝4。圖8c呈現了代表性細胞的顯微鏡圖像，其顯示了car分子在表達gfp標記的763.74(a)cd28 car、763.74(a)4-1bb car、763.74(b)cd28 car和763.74(b)4-1bb car的t細胞的細胞表面上的分布。顯示了通過共聚焦顯微鏡拍攝的單個場的代表性圖像(放大倍數，63倍)。圖8d呈現了由抗獨特型抗體介導的car交聯後，如(c)所述，gfp標記的car分子在t細胞表面上的分布。顯示了通
過共聚焦顯微鏡拍攝的單個場的代表性圖像(放大倍數，63倍)。圖8e呈現了顯示在培養的第10天時通過流式細胞術評估的如(a)所示的ctr和car-t細胞的細胞亞組組成的圖。數據表示為平均值
±
sd，n＝4。圖8f是代表性圖，其呈現了在培養的第10天時通過流式細胞術評估的如(a)所示的ctr和car-t細胞中的耗竭相關標誌物的表達。數據表示為平均值
±
sd，n＝4。
37.圖9呈現了對胺基酸突變對scfv 763.74(b)穩定性影響的評價。圖9a呈現了763.74(a)v-輕的第3位(seq id no:159至1831的第3位)處突變的自由能變化(δδg)。b.t5(seq id no:184至202)處突變的δδg。c.a9(seq id no:203至221)處突變的δδg。d.e83(seq id no:232至249)處突變的δδg。e.q124(seq id no:256至274)處突變的δδg。f.v126(seq id no:315至333)處突變的δδg。g.l230(seq id no:276至295)處突變的δδg。
38.圖10呈現了表達scfv 763.74(a)car和scfv 763.74(b)car的t細胞的抗腫瘤活性的代表性結果。圖10a呈現了通過流式細胞術評估的硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)抗原在黑色素瘤細胞系中的表達。虛線和實線分別代表同種型和cspg4 mab。圖10b呈現了對照car-t細胞(ctr)和用編碼cd28或4-1bb胞內域的scfv 763.74(a)car和scfv 763.74(b)car工程化的t細胞與黑色素瘤細胞系(e:t＝1:5)共同培養24小時後，收集的上清液中ifnγ和il-2產生的代表性量化結果。數據表示為平均值
±
sd，n＝5。圖10c呈現了用egfp-ffluc wm115腫瘤細胞(5
×
105個細胞/小鼠)s.c.移植並用ctr或表達編碼cd28或4-1bb胞內域的scfv 763.74(a)car和scfv 763.74(b)car的t細胞(5
×
106個細胞/小鼠)治療後7天的小鼠的腫瘤bli動力學的代表性結果。虛線代表個體小鼠，並且加粗實線代表組的平均值。四個獨立實驗的總結(對於每種條件，n＝12)，****，p《0.0001，雙因素方差分析與bonferroni校正。
39.圖11呈現了表達編碼cd28的763.74(b)car的t細胞的代表性結果，其顯示在最早的時間點消除了大部分的gbm-ns。圖11a是代表性實驗中不同時間點(2、4、6和24小時)腫瘤細胞的量化總結，其中將對照(ctr)和表達編碼cd28或4-1bb胞內域的scfv 763.74(a)car和scfv 763.74(b)car的細胞與gbm-ns共培養(e:t＝1:5)。數據表示為平均值
±
sd，n＝5。圖11b呈現了car-t細胞與gbm-ns共培養兩小時後的代表性fsc-ssc點陣圖。car-t細胞和腫瘤細胞分別通過評價表達cd45和cspg4的細胞百分比來測量。圖11c呈現了與gbm-ns共培養的car-t細胞中cd69表達的代表性流式細胞術疊加直方圖。
40.圖12呈現了scfv 763.74(a)的人源化過程和突變體的測試。圖12a呈現了scfv人源化和工程化的工作流程。圖12b呈現了通過流式細胞術分析的人源化scfv h763.74(#2)、h763.74(#3)、h763.74(#4)和h763.74(#5)的代表性結合結果。將cspg4
+
mda-mb-231和cspg4-mda-mb-468與scfv(10μg/ml)一起孵育，然後用蛋白-l-生物素(0.3μg/ml)和藻紅素標記的鏈黴親和素(sav-pe)進行染色。圖12c呈現了在培養的第8天評估的ctr t細胞和使用不同h763.74 car生成的t細胞中car表達的總結。數據表示為平均值
±
sd，n＝3。非轉導(nt)t細胞顯示為陰性對照。圖12d呈現了實驗的殘留腫瘤細胞的量化總結，其中將對照(ctr)或不同類型的h763.74 car-t細胞與wm155黑色素瘤細胞系(e:t＝1:5)共培養5天。數據表示為平均值
±
sd，n＝3。然後收集細胞，並用cd3和cd276(b7-h3)mab染色以通過流式細胞術分別識別t細胞和黑色素瘤細胞。圖12e呈現了如(d)所示的24小時共培養(e:t＝1:5)
後收集的上清液中ifnγ和il-2產生的量化。數據表示為平均值
±
sd，n＝5。
41.圖13呈現了人源化scfv的胺基酸序列和代表性的穩定性分析。圖13a呈現了人源化scfv h763.74(#2)(seq id no:37)和h763.74(#5)(seq id no:57)的v
l
(seq id no:69和72)和vh(seq id no:72和114)鏈的序列。胺基酸取代(人至鼠)被框起來。圖13b呈現了在pbs中以1mg/ml配製並在4℃和37℃下儲存2天的人源化scfv h763.74(#2)和h763.74(#5)蛋白的物理穩定性的代表性結果。單體的百分比通過分析型hplc進行分析。
42.圖14呈現了表達基於人源化scfv 763.74的car構建體的t細胞的抗腫瘤活性的代表性結果。圖14a呈現了在培養的第8天評估的對照t細胞(ctr)和使用h763.74(#2)cd28 car和h763.74(#5)cd28 car生成的t細胞中car表達的總結。數據表示為平均值
±
sd，n＝10。圖14b呈現了實驗的殘留腫瘤細胞的量化總結，其中將ctr、h763.74(#2)cd28和h763.74(#5)cd28 car-t細胞與黑色素瘤細胞系(e:t＝1:5)共培養5天。數據表示為平均值
±
sd，n＝4/6。將細胞收集並用cd3和cd276(b7-h3)mab染色以通過流式細胞術分別識別t細胞和黑色素瘤細胞。圖14c呈現了如(b)所示的24小時共培養(e:t＝1:5)後收集的上清液中ifnγ和il-2產生的代表性量化結果。數據表示為平均值
±
sd，n＝5。圖14d呈現了用egfp-ffluc wm115腫瘤細胞(5
×
105個細胞/小鼠)s.c.移植並用對照cart細胞(ctr)和表達h763.74(#2)cd28 car或h763.74(#5)cd28 car的t細胞(5
×
106個細胞/小鼠)治療7天後的小鼠的腫瘤bli(色標：最小＝5
×
106；最大＝5
×
108)的代表性結果。圖14e呈現了在用ctr、h763.74(#2)cd28或h763.74(#5)cd28 car-t細胞治療的wm115荷瘤小鼠中，在不同時間點(第13天：n＝15，第25、31和43天：n＝5)收集的小鼠外周血中人cd3
+
cd45
+
細胞的代表性量化。數據表示為平均值
±
sd，n＝5。圖14f呈現了在如代表性實驗(e)所述的不同時間點(第13天：n＝15，第25、31和43天：n＝5)收集的外周血中對人cd3
+
cd45
+
細胞門控的pd-1
+
細胞的百分比。數據表示為平均值
±
sd，n＝5。圖14g呈現了在如代表性實驗(e)所述處死時外周血、肝和脾中對人cd3
+
cd45
+
細胞門控的pd-1
+
細胞的百分比。數據表示為平均值
±
sd，n＝6-10。
具體實施方式
43.最初定義的car強直信號傳導歸因於t細胞中的負面作用，並且特別是由於快速耗竭而導致抗腫瘤效果不佳。參見long等人(2015)。我們在體外和體內的數據支持這一概念。值得注意的是，在我們的異種移植模型中，糾正scfv穩定性和消除car強直信號傳導顯著增強了編碼cd28胞內域的car-t細胞的抗腫瘤作用，這顯示出快速的抗腫瘤作用。這一觀察結果與先前的工作一致，表明4-1bb顯示出緩慢的抗腫瘤作用，這可能與我們最近發現的4-1bb通過募集car突觸中的磷酸酶複合物而減弱car-cd3γ信號傳導的機制有關。參見zhao等人，「工程化共刺激的結構設計決定了腫瘤排斥動力學和car t細胞的持久性」，《癌細胞(cancer cell)》28:415-428(2015)；sun等人，「4-1bb募集的themis-shp1調節lck介導的嵌合抗原受體導向的t細胞的引發」《癌細胞》37(2):216-225(2020)(「sun等人2020」)。此外，我們想建議確定為car-t細胞因scfv的自我聚集而自發釋放ifnγ的強直信號傳導應被視為與car-t細胞的自發增殖不同的現象。參見frigault等人，「介導t細胞組成性或誘導性增殖的嵌合抗原受體的鑑定」，《癌症免疫研究》3:356-367(2015)。後者反而可能是car-t細胞的積極屬性，它可能在沒有即時抗原刺激的情況下持續存在，尤其是在實體瘤患者中，在該患者中腫瘤細胞在外周血中無法大量獲得。編碼4-1bb的car-t細胞的自發增殖和增強存活
可能是由於持續的nf-kb途徑，而不是近端car信號傳導，並且這種現象需要充分在機制上定義的進一步研究。參見gomes-silva等人，「嵌合抗原受體中的強直4-1bb共刺激阻礙了t細胞的存活並依賴於載體」，《細胞報導(cell rep.)》21:17-26(2017)；li等人，「4-1bb增強car t功能需要nf-κb和traf」，《jci洞察(jci.insight.)》3(2018)；和philipson等人，「4-1bb共刺激通過非經典nf-κb信號傳導促進car t細胞存活」，《科學信號(sci.signal.)》13(2020)。
44.嵌合抗原受體(car)強直信號傳導(定義為用car基因植入的t細胞eous激活和釋放促炎細胞因子)被認為是負面屬性，因為它導致免疫細胞耗竭和抗腫瘤效果不佳。不穩定的鼠scfv會引起自我聚集，並且鼠序列可誘發人類受試者的免疫反應。這裡我們證明了當scfv被組裝成car形式並且car在t細胞中表達時，scfv的不穩定性對引起強直信號傳導至關重要。此外，我們證明強直信號傳導可以通過取代導致scfv的鼠fwr內不穩定性的胺基酸或者通過fwr的人源化而得到糾正。糾正強直信號傳導增強了car-t細胞的抗腫瘤作用。
45.這裡我們報告了car強直信號傳導由單克隆抗體單鏈fv的內在不穩定性引起，該單鏈fv通過包含在car中的cd3γ鏈促進自我聚集和信號傳導。這種現象在編碼cd28或4-1bb共刺激胞內域的car中被檢測到。單克隆抗體單鏈fv的不穩定性由可以通過計算建模來識別的框架區內的特定胺基酸引起。導致框架區不穩定或人源化的胺基酸取代可以糾正car的強直信號傳導，而不會導致抗原特異性的改變，並增強car-t細胞的抗腫瘤效果。
46.這裡我們證明了不穩定的scfv會導致car分子的自我聚集，從而導致car在t細胞中的強直信號傳導。我們生成的cspg4特異性car使用了來自763.74mab的鼠scfv。在大腸桿菌中表達的這種scfv顯示出聚集的趨勢，並且scfv不能以可溶形式生產。
47.這裡我們表明scfv的不穩定性是car自我聚集和強直信號傳導的唯一原因，因為建模驅動的fwr內穩定scfv的特定胺基酸取代會廢除car強直信號傳導。下面呈現的結果通過結構和功能分析證明，scfv的不穩定性導致car自我聚集和強直信號傳導。胺基酸取代或fwr的人源化廢除強直信號傳導並增強car-t細胞的功能性。
48.在eris工具的幫助下，採用計算誘變來描述fwr突變對scfv 763.74(a)結構的影響。計算建模證明了fwr內的胺基酸取代如何影響scfv的穩定性，表明可以實施計算分析來評估和糾正scfv的穩定性而不影響其特異性。最後，我們證明用穩定的人fwr(如框架rfw1.4)取代鼠fwr還糾正了car強直信號傳導，而不改變抗原特異性。參見borras等人，「從兔單克隆抗體中生成穩定的人源化單鏈fv片段的通用方法」，《生物化學雜誌(j biol.chem.)》285:9054-9066(2010)。穩定的人框架rfw1.4可以容納不同來源的cdr，並允許對可溶性scfv蛋白進行分析，以評估其物理化學穩定性。因此，這種方法可用於選擇具有最佳物理和結合特性的scfv來設計car。綜上所述，數據表明穩定的和單體的scfv適用於生成避免抗原獨立性強直信號傳導的car。用人框架rfw1.4工程化的scfv也可能具有低的免疫原性可能性，並有可能以完全有效的方式反覆輸注給患者。
49.我們的數據表明，使用car，cd28和4-1bb都會引起強直信號傳導，其中唯一的區別在於細胞質內的共刺激胞內域尾。
50.重要的是，無論car中使用何種共刺激，scfv的穩定化都會廢除強直信號傳導，這表明不穩定的scfv可以通過fwr的突變或人源化得到拯救，並且cd28和4-1bb共刺激都可以使用。
51.這裡我們顯示了對fwr的胺基酸取代可以穩定scfv並糾正car的強直信號傳導。我們還顯示了用穩定的人fwr取代鼠fwr也會防止car-t細胞的抗原獨立性激活。因此，我們將car強直信號傳導的原因定位為用於car構建的不穩定scfv，並提供基於結構的策略來糾正強直信號傳導。
52.總的來說，我們證明car的強直信號傳導是由於不穩定scfv的自我聚集，並且它可以通過由穩定胺基酸取代或人源化獲得的scfv的fwr來廢除。糾正scfv的穩定性和消除car的強直信號傳導能增強car-t細胞的抗腫瘤作用。
53.本公開提供並包含對硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)(基因id：1464(人)和121021(小鼠))具有結合特異性的結合成員。
54.如本文所用，結合成員通常包括抗體vh和vl結構域。還提供了特定結合成員的vh結構域供本發明使用。在每個vh和vl域內有互補決定區，(分別為"cdr"、"hcdr"和"lcdr")，以及框架區(分別為"fr"、"vh-fr"和"vl-fr")。vh結構域包括hcdr1至hcdr3，並且vl結構域包括lcdr1至lcdr3。抗體分子可以包括抗體vh結構域，其包括vh cdr1、cdr2和cdr3以及框架序列vh-fr1至vh-fr4。其可替代地可以包括或者也可以包括抗體vl結構域，包括vl cdr1、cdr2和cdr3以及框架序列vl-fr1至vl-fr4。本文公開的所有vh和vl序列、cdr序列、cdr組和hcdr組以及lcdr組都代表了特定結合成員的實施例。如本文所述，「cdr組」包括cdr1、cdr2和cdr3。因此，hcdr組是指hcdr1、hcdr2和hcdr3，並且lcdr組是指lcdr1、lcdr2和lcdr3。如本文所用，框架序列可從任何來源獲得，包含但不限於小鼠、人、兔和大鼠。在某些方面，框架序列被修飾為包括來自兩個物種的序列。在某些方面，框架序列是經修飾的人框架序列，其具有引入小鼠殘基來增加穩定性的一個或多個修飾。此類修飾的人源化框架使同一構建體在小鼠和人細胞中都能使用。
55.如本文所用，結合成員包括seq id no:1-3所示的輕鏈互補決定區(「lcdr」)lcdr1至lcdr3序列和seq id no:4至6所示的重鏈互補決定區(「hcdr」)hcdr1至hcdr3序列。
56.本公開提供並包含對硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)具有結合特異性的結合成員，並且包括框架序列。在某些方面，輕鏈框架序列(「vl-fr」)選自由seq id no:153至255組成的群組，其中輕鏈框架序列1(vl-fr1)選自由seq id no:153至221組成的群組，輕鏈框架序列2(vl-fr2)選自由seq id no:222至225組成的群組，輕鏈框架序列3(vl-fr3)選自由seq id no:226至249組成的群組，輕鏈框架序列4(vl-fr4)選自由seq id no:250至255組成的群組。在某些方面，重鏈框架序列(「vh-fr」)選自由seq id no:256至382組成的群組，其中重鏈框架序列1(vh-fr1)選自由seq id no:256至349組成的群組，重鏈框架序列2(vh-fr2)選自由seq id no:350至353組成的群組，重鏈框架序列3(vh-fr3)選自由seq id no:354至360組成的群組，並且重鏈框架序列4(vh-fr4)選自由seq id no:361至382組成的群組。
57.本公開提供並包含一種對cspg4具有結合特異性的結合成員，其中輕鏈框架序列1(vl-fr1)選自由seq id no:153至158組成的群組，輕鏈框架序列2(vl-fr2)選自由seq id no:222至225組成的群組，輕鏈框架序列3(vl-fr3)選自由seq id no:226至231組成的群組，輕鏈框架序列4(vl-fr4)選自由seq id no:250至255組成的群組，重鏈框架序列1(vh-fr1)選自由seq id no:347至349組成的群組，重鏈框架序列2(vh-fr2)選自由seq id no:350至353組成的群組，重鏈框架序列3(vh-fr3)選自由seq id no:354至360組成的群組，並且重鏈框架序列4(vh-fr4)選自由seq id no:361至362組成的群組。在某些方面，可變輕鏈
序列選自由seq id no:69至72組成的群組，並且可變重鏈序列選自由seq id no:111至114組成的群組。在一個方面，可變輕鏈序列是seq id no:69，並且可變重鏈序列是seq id no:111。在一個方面，可變輕鏈序列是seq id no:70，並且可變重鏈序列是seq id no:112。在一個方面，可變輕鏈序列是seq id no:71，並且可變重鏈序列是seq id no:113。在一個方面，可變輕鏈序列是seq id no:71，並且可變重鏈序列是seq id no:114。
58.本公開提供並包含編碼對cspg4具有結合特異性的多肽的核酸序列，其中可變輕鏈序列選自由seq id no:67至109組成的群組，並且可變重鏈序列選自由seq id no:110至152組成的群組。在某些方面，可變輕鏈序列選自由seq id no:69至72組成的群組，並且可變重鏈序列選自由seq id no:111至114組成的群組。在一個方面，可變輕鏈序列是seq id no:69，並且可變重鏈序列是seq id no:111。在一個方面，可變輕鏈序列是seq id no:70，並且可變重鏈序列是seq id no:112。在一個方面，可變輕鏈序列是seq id no:71，並且可變重鏈序列是seq id no:113。在一個方面，可變輕鏈序列是seq id no:71，並且可變重鏈序列是seq id no:114。
59.在某些方面，核酸序列編碼包括可變輕鏈序列的多肽，所述可變輕鏈序列包括seq id no:1-3所示的輕鏈互補決定區(「lcdr」)lcdr1至lcdr3序列以及選自由seq id no:153至221組成的群組的輕鏈框架序列1(vl-fr1)，選自由seq id no:222至225組成的群組的輕鏈框架序列2(vl-fr2)，選自由seq id no:226至249組成的群組的輕鏈框架序列3(vl-fr3)和選自由seq id no:250至255組成的群組的輕鏈框架序列4(vl-fr4)。在一個方面，可變輕鏈序列是seq id no:69。在另一個方面，可變輕鏈序列是seq id no:70。在一個方面，可變輕鏈序列是seq id no:71。在一個方面，可變輕鏈序列是seq id no:72。在另一個方面，可變輕鏈序列是seq id no:73。在一個方面，可變輕鏈序列是seq id no:74。在一個方面，可變輕鏈序列是seq id no:76。在另一個方面，可變輕鏈序列是seq id no:77。在一個方面，可變輕鏈序列是seq id no:78。在一個方面，可變輕鏈序列是seq id no:79。在另一個方面，可變輕鏈序列是seq id no:80。在一個方面，可變輕鏈序列是seq id no:83。在一個方面，可變輕鏈序列是seq id no:96。在另一個方面，可變輕鏈序列是seq id no:97。在一個方面，可變輕鏈序列是seq id no:102。在一個方面，可變輕鏈序列是seq id no:103。在另一個方面，可變輕鏈序列是seq id no:104。在一個方面，可變輕鏈序列是seq id no:105。在一個方面，可變輕鏈序列是seq id no:106。在另一個方面，可變輕鏈序列是seq id no:107。在某些方面，編碼可變輕鏈序列的核酸序列可以與編碼選自由seq id no:110至152組成的群組的重鏈序列的核酸序列組合。
60.在某些方面，核酸序列編碼包括重鏈序列的多肽，所述重鏈序列包括seq id no:4至6所示的重鏈互補決定區hcdr1至hcdr3序列以及選自由seq id no:256至349組成的群組的重鏈框架序列1(vh-fr1)，選自由seq id no:350至353組成的群組的重鏈框架序列2(vh-fr2)，選自由seq id no:354至360組成的群組的重鏈框架序列3(vh-fr3)，和選自由seq id no:361至382組成的群組的重鏈框架序列4(vh-fr4)。在一個方面，可變重鏈序列是seq id no:111。在另一個方面，可變重鏈序列是seq id no:112。在一個方面，可變重鏈序列是seq id no:113。在一個方面，可變重鏈序列是seq id no:114。在另一個方面，可變重鏈序列是seq id no:115。在一個方面，可變重鏈序列是seq id no:116。在一個方面，可變重鏈序列是seq id no:117。在另一個方面，可變重鏈序列是seq id no:118。在一個方面，可變重鏈
序列是seq id no:119。在一個方面，可變重鏈序列是seq id no:120。在另一個方面，可變重鏈序列是seq id no:121。在一個方面，可變重鏈序列是seq id no:122。在一個方面，可變重鏈序列是seq id no:123。在另一個方面，可變重鏈序列是seq id no:135。在一個方面，可變重鏈序列是seq id no:136。在一個方面，可變重鏈序列是seq id no:137。在另一個方面，可變重鏈序列是seq id no:138。在一個方面，可變重鏈序列是seq id no:145。在某些方面，編碼可變重鏈序列的核酸序列可以與編碼選自由seq id no:67至109組成的群組的輕鏈序列的核酸序列組合。
61.本公開提供並包含嵌合抗原受體(「car」)和對硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)具有結合特異性的car的表達構建體。如本文所提供的cdr區如上所述。
62.如本文所用，術語「嵌合抗原受體」或「car」是指人工t細胞受體，其被工程化為在免疫效應細胞上表達並特異性地結合抗原。在某些方面，car包括胞外域、跨膜結構域和胞內域。在某些方面，額外的「間隔子」或「鉸鏈區」被包含在car中。在某些方面，car可以包括胞外域和跨膜結構域，而沒有胞內域，但本技術的更多car包含胞內域並提供細胞內信號傳導。
63.如本文所用，術語「胞外域」是指car的細胞外部分，並且涵蓋信號肽、抗原識別結構域(例如結合成員)和連接抗原識別結構域與跨膜結構域的間隔子或鉸鏈區。當表達時，信號肽可以被去除，通常使用內源性的細胞途徑來去除。
64.如本文所用，「抗原識別結構域」通常包括對特定癌症抗原具有特異性的單鏈可變片段(scfv)。在某些方面，當同一細胞中有兩個或更多個car時，第二個car可包括對另一特定抗原具有特異性的scfv。
65.如本文所用，術語「單鏈可變片段」或「scfv」是由免疫球蛋白的重鏈(vh)和輕鏈(vl)的可變區共價連接形成vh::vl異二聚體的融合蛋白。重鏈(vh)和輕鏈(vl)直接連接或者通過肽編碼接頭(例如，10、15、20、25個胺基酸)連接，該接頭連接vh的n末端與vl的c末端，或者vh的c末端與vl的n末端。接頭通常富含甘氨酸以用於柔性，以及絲氨酸或蘇氨酸以用於溶解性。合適但非限制性實例是seq id no:11。儘管去除了恆定區並引入了接頭，但scfv蛋白保留了原始免疫球蛋白的特異性。單鏈fv多肽抗體可以由包含vh和vl編碼序列的核酸表達，如huston等人(《美國國家科學院院刊》,85:5879-5883,1988)所述。還參見美國專利第5,091,513號、第5,132,405號和第4,956,778號；美國專利公開第20050196754號和第20050196754號所述。合適的vh和vl編碼序列已在上文確定。
66.如本文所用，「間隔子」或「鉸鏈區」是重組蛋白的任選接頭部分，該部分還是跨膜結構域和抗體識別結構域之間的短肽片段。間隔子或鉸鏈區可以是1至20個胺基酸。胞外域的鉸鏈區的實例包含免疫球蛋白的ch2ch3區、igg1的鉸鏈區和cd3的部分。
67.如本文所用，「跨膜結構域」是主要為非極性胺基酸殘基的區域，當蛋白質被表達時，該區域至少要穿越一次雙分子層。一般來說，跨膜結構域由18至21個胺基酸殘基編碼，並且採用α螺旋結構。如本文所用，跨膜結構域可以是本領域中已知的任何種類。在某些方面，跨膜結構域選自由以下組成的群組：cd28(基因id：940，12487)、cd3-ζ(基因id：919；12503cd247)、cd4(基因id：920，12504)、cd8(基因id：924，12525)、cd16(基因id：2214；14131；fcgr3)、nkp44(基因id：9436，ncr2)、nkp46(基因id：9437，17086，ncr1)和nkg2d(基因id：22914；27007klrk1)。在某些方面，跨膜結構域是cd28(基因id：940，12487)跨膜結構
域。
68.如本文所用，術語「胞內域」是指car的細胞內結構域，其提供細胞內的信號傳輸。一般來說，胞內域可以進一步分為兩個部分：刺激結構域和任選的共刺激結構域。在某些方面，胞內域序列選自由以下組成的群組：cd28(基因id：940)、tnf受體超家族成員9(基因id 3604，例如，4-1bb或cd137)、cd247(基因id 919，cd3-ζ)、2b4(基因id：51744，cd244)、白細胞介素21(il-21，基因id 59067)、造血細胞信號轉導蛋白(hcst，基因id 10870，例如，dap10)和跨膜免疫信號傳導銜接子(tyrobp，基因id 7305；dap12)。最常用的胞內域組分是cd3-ζ，其含有3個itam並且在抗原結合後向nkt細胞傳遞激活信號。另一種常用的胞內域是tnf受體超家族成員9(基因id 3604，例如4-1bb或cd137)胞內域。其他合適的刺激結構域可以獲自2b4(cd244)、tnf受體超家族成員9(基因id 3604，例如4-1bb或cd137)、白細胞介素21(il-21，基因id 59067)、造血細胞信號轉導蛋白(hcst，基因id 10870，例如dap10)和跨膜免疫信號傳導銜接子(tyrobp，基因id 7305；dap12)。
69.本公開提供並包含編碼嵌合抗原受體(「car」)的核酸表達構建體和由其產生的car蛋白，所述構建體和car蛋白對硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)具有結合特異性，包括胞外域、跨膜結構域序列和胞內域序列。在某些方面，胞外域可變輕鏈序列包括seq id no:1-3所示的lcdr1至lcdr3序列和seq id no:4至6所示的hcdr1至hcdr3。如本文提供的，胞外域包括選自由seq id no:153至221組成的群組的輕鏈框架序列1(vl-fr1)，選自由seq id no:222至225組成的群組的輕鏈框架序列2(vl-fr2)，選自由seq id no:226至249組成的群組的輕鏈框架序列3(vl-fr3)和選自由seq id no:250至255組成的群組的輕鏈框架序列4(vl-fr4)。如本文提供的，胞外域包括選自由seq id no:256至349組成的群組的重鏈框架序列1(vh-fr1)，選自由seq id no:350至353組成的群組的重鏈框架序列2(vh-fr2)，選自由seq id no:354至360組成的群組的重鏈框架序列3(vh-fr3)和選自由seq id no:361至382組成的群組的重鏈框架序列4(vh-fr4)。本公開的car包含選自由seq id no:67至109組成的群組的可變輕鏈序列和選自由seq id no:110至152組成的群組的可變重鏈序列。在某些方面，胞外域包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv多肽序列。在一個方面，胞外域包括seq id no:28的scfv多肽序列。在一個方面，胞外域包括seq id no:34的scfv多肽序列。在一個方面，胞外域包括seq id no:46的scfv多肽序列。在一個方面，胞外域包括seq id no:47的scfv多肽序列。在一個方面，胞外域包括seq id no:57的scfv多肽序列。
70.對硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)具有結合特異性的編碼嵌合抗原受體(「car」)的核酸表達構建體和由其產生的car蛋白包括胞外域、跨膜結構域序列和胞內域序列，包括選自由cd28(基因id：940，12487)、cd3-ζ(基因id：919；12503cd247)、cd4(基因id：920，12504)、cd8(基因id：924，12525)、cd16(基因id：2214；14131；fcgr3)、nkp44(基因id：9436，ncr2)、nkp46(基因id：9437，17086，ncr1)和nkg2d(基因id：22914；27007klrk1)組成的群組的跨膜結構域。在一個方面，跨膜結構域是cd28跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，跨膜結構域是cd3-ζ跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，跨膜結構域是cd4跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，跨膜結構域是cd8跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，跨膜結構域是cd16跨膜
結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，跨膜結構域是nkp44跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，跨膜結構域是nkp46跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，跨膜結構域是nkg2d跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。胞外域和跨膜結構域可以與選自由cd28(基因id：940)、tnf受體超家族成員9(基因id 3604，例如，4-1bb或cd137)、cd247(基因id 919，cd3-ζ)、2b4(基因id：51744，cd244)、白細胞介素21(il-21，基因id 59067)、造血細胞信號轉導蛋白(hcst，基因id 10870，例如dap10)和跨膜免疫信號傳導銜接子(tyrobp，基因id 7305；dap12)組成的群組的任一胞內域序列組合。
71.對硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)具有結合特異性的編碼嵌合抗原受體(「car」)的核酸表達構建體和由其產生的car蛋白包括胞外域、跨膜結構域序列和胞內域序列，包括選自由cd28(基因id：940)、tnf受體超家族成員9(基因id 3604，例如，4-1bb或cd137)、cd247(基因id 919，cd3-ζ)、2b4(基因id：51744，cd244)、白細胞介素21(il-21，基因id 59067)、造血細胞信號轉導蛋白(hcst，基因id 10870，例如dap10)和跨膜免疫信號傳導銜接子(tyrobp，基因id 7305；dap12)組成的群組的胞內域序列。
72.在一個方面，胞內域是cd28胞內域，跨膜結構域是cd28跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是4-1bb胞內域，跨膜結構域是cd28跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是cd247胞內域，跨膜結構域是cd28跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是2b4胞內域，跨膜結構域是cd28跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是il-21胞內域，跨膜結構域是cd28跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是hcst胞內域，跨膜結構域是cd28跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是tyrobp胞內域，跨膜結構域是cd28跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在某些方面，編碼car的核酸表達構建體進一步編碼至少一個生長因子的蛋白編碼序列、wnt信號傳導途徑中轉錄激活因子的蛋白編碼序列或兩者，其中每個編碼序列與car編碼序列由口蹄疫病毒(fmdv)2a序列或fmdv 2a相關的順式作用水解酶元件(chysel)序列隔開。
73.在一個方面，胞內域是cd28胞內域，跨膜結構域是cd3-ζ跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是4-1bb胞內域，跨膜結構域是cd3-ζ跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是cd247胞內域，跨膜結構域是cd3-ζ跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是cd3-ζ胞內域，跨膜結構域是cd3-ζ跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是il-21胞內域，跨膜結構域是cd3-ζ跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:
1bb胞內域，跨膜結構域是cd16跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是cd247胞內域，跨膜結構域是cd16跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是cd4胞內域，跨膜結構域是cd16跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是il-21胞內域，跨膜結構域是cd16跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是hcst胞內域，跨膜結構域是cd16跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是tyrobp胞內域，跨膜結構域是cd16跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在某些方面，編碼car的核酸表達構建體進一步編碼至少一個生長因子的蛋白編碼序列、wnt信號傳導途徑中轉錄激活因子的蛋白編碼序列或兩者，其中每個編碼序列與car編碼序列由口蹄疫病毒(fmdv)2a序列或fmdv 2a相關的順式作用水解酶元件(chysel)序列隔開。
77.在一個方面，胞內域是cd28胞內域，跨膜結構域是nkp44跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是4-1bb胞內域，跨膜結構域是nkp44跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是cd247胞內域，跨膜結構域是nkp44跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是cd4胞內域，跨膜結構域是nkp44跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是il-21胞內域，跨膜結構域是nkp44跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是hcst胞內域，跨膜結構域是nkp44跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是tyrobp胞內域，跨膜結構域是nkp44跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在某些方面，編碼car的核酸表達構建體進一步編碼至少一個生長因子的蛋白編碼序列、wnt信號傳導途徑中轉錄激活因子的蛋白編碼序列或兩者，其中每個編碼序列與car編碼序列由口蹄疫病毒(fmdv)2a序列或fmdv 2a相關的順式作用水解酶元件(chysel)序列隔開。
78.在一個方面，胞內域是cd28胞內域，跨膜結構域是nkp46跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是4-1bb胞內域，跨膜結構域是nkp46跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是cd247胞內域，跨膜結構域是nkp44跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是cd4胞內域，跨膜結構域是nkp46跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是il-21胞內域，跨膜結構域是nkp46跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是hcst胞內域，跨膜結構域是nkp46跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是tyrobp胞內域，跨膜結構域是nkp46跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv
序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在某些方面，編碼car的核酸表達構建體進一步編碼至少一個生長因子的蛋白編碼序列、wnt信號傳導途徑中轉錄激活因子的蛋白編碼序列或兩者，其中每個編碼序列與car編碼序列由口蹄疫病毒(fmdv)2a序列或fmdv 2a相關的順式作用水解酶元件(chysel)序列隔開。
79.在一個方面，胞內域是cd28胞內域，跨膜結構域是nkg2d跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是4-1bb胞內域，跨膜結構域是nkg2d跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是cd247胞內域，跨膜結構域是nkg2d跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是cd4胞內域，跨膜結構域是nkg2d跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是il-21胞內域，跨膜結構域是nkg2d跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是hcst胞內域，跨膜結構域是nkg2d跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在一個方面，胞內域是tyrobp胞內域，跨膜結構域是nkg2d跨膜結構域，並且胞外域選自scfv序列，該scfv序列選自由seq id no:28至66組成的群組。在某些方面，編碼car的核酸表達構建體進一步編碼至少一個生長因子的蛋白編碼序列、wnt信號傳導途徑中轉錄激活因子的蛋白編碼序列或兩者，其中每個編碼序列與car編碼序列由口蹄疫病毒(fmdv)2a序列或fmdv 2a相關的順式作用水解酶元件(chysel)序列隔開。
80.本公開提供並包含編碼上面提供的嵌合抗原受體的核酸表達構建體，該構建體進一步包括wnt信號傳導途徑中轉錄激活因子的蛋白編碼序列。還提供並包含表達構建體，該構建體編碼多蛋白，其包括car、wnt信號傳導途徑中轉錄激活因子的蛋白序列和最多三個額外的蛋白編碼序列。在一個方面，wnt信號傳導途徑中轉錄激活因子的蛋白序列和最多三個額外的蛋白編碼序列由自主核糖體內自加工肽隔開。在一個方面，自主核糖體內自加工是口蹄疫病毒(fmdv)2a序列或相關的順式作用水解酶元件(chysel)。在某些方面，wnt信號傳導途徑中轉錄激活因子選自由淋巴增強子結合因子1(lef1，基因id 51176)、β-連環蛋白(ctnnb1，基因id 1499)、smad3(基因id 4088)、hnf1同源框a(hnf1a，基因id：6927(alt.tcf1))、轉錄因子7(tcf7，基因id：6932(alt.tcf1))和轉錄輔阻遏物tle家族成員1(tle 1，基因id 7088))組成的群組。
81.在一個方面，表達構建體包括選自scfv序列(選自由seq id no:28至66組成的群組)的胞外域，選自由cd28、cd3-ζ、cd4、cd8、cd16、nkp44、nkp46和nkg2d組成的群組的跨膜結構域以及選自由cd28、4-1bb、cd3-ζ、2b4、白細胞介素21、hcst和tyrobp組成的群組的胞內域，並且該胞內域進一步包括wnt信號傳導途徑中轉錄激活因子的蛋白編碼序列，該wnt信號傳導途徑中轉錄激活因子選自由淋巴增強子結合因子1、β-連環蛋白、smad3、hnf1同源框a、轉錄因子7和轉錄輔阻遏物tle家族成員1組成的群組。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd28跨膜結構域、cd28胞內域以及由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1，其中lef1選自由參考序列(refseq)id no:np_057353.1、np_001124185.1和np_001124186.1組成的群組。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd3-ζ跨膜結構域、cd28胞內域以及
由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd4跨膜結構域、cd28胞內域以及由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd8跨膜結構域、cd28胞內域以及由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd16跨膜結構域、cd28胞內域以及由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkp44跨膜結構域、cd28胞內域以及由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkp46跨膜結構域、cd28胞內域以及由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkg2d跨膜結構域、cd28胞內域以及由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd28跨膜結構域、4-1bb胞內域以及由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd3-ζ跨膜結構域、4-1bb胞內域以及由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd4跨膜結構域、4-1bb胞內域以及由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd8跨膜結構域、4-1bb胞內域以及由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd16跨膜結構域、4-1bb胞內域以及由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkp44跨膜結構域、4-1bb胞內域以及由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkp46跨膜結構域、4-1bb胞內域以及由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkg2d跨膜結構域、4-1bb胞內域以及由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd28跨膜結構域、cd3-ζ胞內域以及由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd3-ζ跨膜結構域、cd3-ζ胞內域以及由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd4跨膜結構域、cd3-ζ胞內域以及由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd8跨膜結構域、cd3-ζ胞內域以及由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd16跨膜結構域、cd3-ζ胞內域以及由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkp44跨膜結構域、cd3-ζ胞內域以及由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkp46跨膜結構域、cd3-ζ胞內域以及由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的
群組的scfv胞外域序列、nkg2d跨膜結構域、cd3-ζ胞內域以及由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1。
82.本公開提供並包含上述表達構建體，該表達構建體包括選自scfv序列(選自由seq id no:28至66組成的群組)的胞外域，選自由cd28、cd3-ζ、cd4、cd8、cd16、nkp44、nkp46和nkg2d組成的群組的跨膜結構域以及選自由cd28、4-1bb、cd3-ζ、2b4、白細胞介素21、hcst和tyrobp組成的群組的胞內域，並且該胞內域進一步包括wnt信號傳導途徑中轉錄激活因子的蛋白編碼序列，並且進一步包括至少一種生長因子的蛋白編碼序列，該生長因子選自由白細胞介素15(il-15)、白細胞介素7(il-7)、白細胞介素12(il-12)、白細胞介素18(il-18)、白細胞介素21(il-21)、白細胞介素27(il-27)、白細胞介素33(il-33)及其組合組成的群組。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd28跨膜結構域、cd28胞內域以及由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-15，其中lef1選自由參考序列(refseq)id no:np_057353.1、np_001124185.1和np_001124186.1組成的群組，lef1和il-15各自由自主核糖體內自加工肽隔開。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd3-ζ跨膜結構域、cd28胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-15。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd4跨膜結構域、cd28胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-15。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd8跨膜結構域、cd28胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-15。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd16跨膜結構域、cd28胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-15。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkp44跨膜結構域、cd28胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-15。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkp46跨膜結構域、cd28胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-15。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkg2d跨膜結構域、cd28胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-15。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd28跨膜結構域、4-1bb胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-15。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd3-ζ跨膜結構域、4-1bb胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-15。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd4跨膜結構域、4-1bb胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-15。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd8跨膜結構域、4-1bb胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-15。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd16跨膜結構域、4-1bb胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-15。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkp44跨膜結構域、4-1bb胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-15。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkp46跨膜結構域、4-1bb胞內
域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-15。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkg2d跨膜結構域、4-1bb胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-15。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd28跨膜結構域、cd3-ζ胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-15。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd3-ζ跨膜結構域、cd3-ζ胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-15。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd4跨膜結構域、cd3-ζ胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-15。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd8跨膜結構域、cd3-ζ胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-15。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd16跨膜結構域、cd3-ζ胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-15。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkp44跨膜結構域、cd3-ζ胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-15。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkp46跨膜結構域、cd3-ζ胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-15。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkg2d跨膜結構域、cd3-ζ胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-15。
83.在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd28跨膜結構域、cd28胞內域以及由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-21，其中lef1選自由參考序列(refseq)id no:np_057353.1、np_001124185.1和np_001124186.1組成的群組，lef1和il-21各自由自主核糖體內自加工肽隔開。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd3-ζ跨膜結構域、cd28胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd4跨膜結構域、cd28胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd8跨膜結構域、cd28胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd16跨膜結構域、cd28胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkp44跨膜結構域、cd28胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkp46跨膜結構域、cd28胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkg2d跨膜結構域、cd28胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd28跨膜結構域、4-1bb胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、
cd3-ζ跨膜結構域、4-1bb胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd4跨膜結構域、4-1bb胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd8跨膜結構域、4-1bb胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd16跨膜結構域、4-1bb胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkp44跨膜結構域、4-1bb胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkp46跨膜結構域、4-1bb胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkg2d跨膜結構域、4-1bb胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd28跨膜結構域、cd3-ζ胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd3-ζ跨膜結構域、cd3-ζ胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd4跨膜結構域、cd3-ζ胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd8跨膜結構域、cd3-ζ胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd16跨膜結構域、cd3-ζ胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkp44跨膜結構域、cd3-ζ胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkp46跨膜結構域、cd3-ζ胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkg2d跨膜結構域、cd3-ζ胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-21。
84.在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd3-ζ跨膜結構域、cd28胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1、il-15和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd4跨膜結構域、cd28胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1、il-15和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd8跨膜結構域、cd28胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1、il-15和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd16跨膜結構域、cd28胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1、il-15和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkp44跨膜結構域、cd28胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1、il-15和
il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkp46跨膜結構域、cd28胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1、il-15和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkg2d跨膜結構域、cd28胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1、il-15和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd28跨膜結構域、4-1bb胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1、il-15和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd3-ζ跨膜結構域、4-1bb胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1、il-15和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd4跨膜結構域、4-1bb胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1、il-15和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd8跨膜結構域、4-1bb胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1、il-15和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd16跨膜結構域、4-1bb胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1、il-15和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkp44跨膜結構域、4-1bb胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1、il-15和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkp46跨膜結構域、4-1bb胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1、il-15和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkg2d跨膜結構域、4-1bb胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1和il-15。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd28跨膜結構域、cd3-ζ胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1、il-15和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd3-ζ跨膜結構域、cd3-ζ胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1、il-15和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd4跨膜結構域、cd3-ζ胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1、il-15和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd8跨膜結構域、cd3-ζ胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1、il-15和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、cd16跨膜結構域、cd3-ζ胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1、il-15和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkp44跨膜結構域、cd3-ζ胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1、il-15和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkp46跨膜結構域、cd3-ζ胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1、il-15和il-21。在一個方面，表達構建體包括選自由seq id no:28至66組成的群組的scfv胞外域序列、nkg2d跨膜結構域、cd3-ζ胞內域以及各自由自主核糖體內自加工肽隔開的lef1、il-15和il-21。
85.本公開還包含並提供了表達構建體，其編碼上面提供的car，並進一步包括編碼靶向mhc i類或mhc ii類基因的小髮夾rna(shrna)序列的dna序列，其中shrna序列被嵌入人
工微小rna(amir)支架中。
86.本公開包含並提供了包括胞外域序列、跨膜結構域序列和胞內域序列的嵌合抗原受體，該胞外域序列包括與硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)結合的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段選自由seq id no:28至65組成的群組，每個序列如上對核酸表達構建體所述的。在一個方面，胞外域序列選自由seq id no:34、46、47和57組成的群組。在另一個方面，胞外域序列包括seq id no:34。在另一個方面，胞外域序列包括seq id no:46。在另一個方面，胞外域序列包括seq id no:47。在另一個方面，胞外域序列包括seq id no:57。上面記載了胞外域、跨膜結構域和胞內域的適當組合。在一個方面，本公開提供了選自由seq id no:28至65組成的群組的胞外域序列與cd28跨膜結構域和cd28胞內域的組合。在一個方面，本公開提供了選自由seq id no:28至65組成的群組的胞外域序列與cd28跨膜結構域和cd3-ζ胞內域的組合。在一個方面，本公開提供了選自由seq id no:28至65組成的群組的胞外域序列與cd28跨膜結構域和4-1bb胞內域的組合。在一個方面，本公開提供了選自由seq id no:28至65組成的群組的胞外域序列與cd3-ζ跨膜結構域和cd28胞內域的組合。在一個方面，本公開提供了選自由seq id no:28至65組成的群組的胞外域序列與cd3-ζ跨膜結構域和cd3-ζ胞內域的組合。在一個方面，本公開提供了選自由seq id no:28至65組成的群組的胞外域序列與cd3-ζ跨膜結構域和4-1bb胞內域的組合。在一個方面，本公開提供了選自由seq id no:28至65組成的群組的胞外域序列與cd4跨膜結構域和cd28胞內域的組合。在一個方面，本公開提供了選自由seq id no:28至65組成的群組的胞外域序列與cd4跨膜結構域和cd3-ζ胞內域的組合。在一個方面，本公開提供了選自由seq id no:28至65組成的群組的胞外域序列與cd4跨膜結構域和4-1bb胞內域的組合。
87.本說明書進一步提供並包含用上述定義的表達構建體和核酸序列轉化或轉染的宿主細胞。優選地，對宿主細胞進行基因工程化以引入外源核酸序列，轉錄和翻譯該外源核酸序列以表達一種或多種蛋白質。引入外源核酸序列可以用本領域已知的方法進行，包含轉化、轉染和轉導。在一個方面，宿主細胞是細菌。在其他方面，宿主細胞是選自自然殺傷t(nkt)細胞、t細胞和自然殺傷(nk)細胞的免疫細胞。在一個方面，宿主細胞是t細胞。在另一個方面，宿主細胞是nkt細胞。在進一步的方面，宿主細胞是i型nkt細胞。在又一個方面，宿主細胞是cd62l陽性的i型nkt細胞。如本文所提供的，宿主細胞是宿主細胞群的一部分。
88.本說明書提供並包含包括多個基因工程化免疫細胞的細胞群，該免疫細胞包括編碼嵌合抗原受體(car)編碼序列的表達構建體，該編碼序列包括胞外域序列，該胞外域序列包括與上述硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)結合的抗體或其抗原結合片段。表達構建體的具體組合已在上文描述並特此通過引用併入。
89.在本公開的某些方面，細胞群包括基因工程化免疫細胞，其包括自然殺傷t(nkt)細胞、t細胞或自然殺傷(nk)細胞。在一個方面，群體中的基因工程化免疫細胞包括多個cd62l陽性的i型nkt細胞。在一個方面，群體包括多個cd62l陽性的i型nkt細胞，其至少佔所述多個細胞的50％。
90.本公開提供並包含一種用於生產免疫細胞的方法，該方法包括上面詳細描述的用於表達car的表達構建體。如本文提供的，該方法包括從供體中分離pbmc，從pbmc中分離自然殺傷t(nkt)細胞、t細胞或自然殺傷(nk)細胞以製備分離的免疫細胞，將分離的免疫細胞擴增1至20天以通過內源性t細胞受體的刺激以及共刺激受體、細胞因子或兩者的組合的共
刺激製備用於基因工程化的擴增的免疫細胞，和引入嵌合抗原受體(car)表達構建體，該構建體包括胞外域序列，該胞外域序列包括與硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)結合的抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包括選自由seq id no:61至109組成的群組的可變輕鏈和選自由seq id no:110至152組成的群組的可變重鏈。在一個方面，製備用於基因工程化的免疫細胞的步驟進一步包括使用抗t細胞、抗nk細胞或抗nkt微珠從pbmc中分離免疫細胞。在一個方面，刺激包括用選自il-7、il-12、il-15、il-21、tnf-α或其組合的生長因子進行培養。在一個方面，免疫細胞是nkt細胞。在進一步的方面，nkt細胞是i型nkt細胞，並且擴增分離的nkt細胞的步驟包括在至少agalcer和生長因子的存在下，將i型nkt細胞培養至少1天以製備用於基因工程化的nkt細胞。
91.在一個方面，用於擴增分離的免疫細胞1至20天以製備用於基因工程化的擴增的免疫細胞的培養期為1至2天、1至3天、1至4天、1至5天、1至6天、1至7天、1至8天、1至9天、1至10天、1至11天、1至12天、1至13天、1至14天、1至15天、1至16天、1至17天、1至18天、1至19天、1至20天、2至3天、2至4天、2至5天、2至6天、2至7天、2至8天、2至9天、2至10天、2至11天、2至12天、2至13天、2至14天、2至15天、2至16天、2至17天、2至18天、2至19天、2至20天、3至4天、3至5天、3至6天、3至7天、3至8天、3至9天、3至10天、3至11天、3至12天、3至13天、3至14天、3至15天、3至16天、3至17天、3至18天、3至19天、3至20天、4至5天、4至6天、4至7天、4至8天、4至9天、4至10天、4至11天、4至12天、4至13天、4至14天、4至15天、4至16天、4至17天、4至18天、4至19天、4至20天、5至6天、5至7天、5至8天、5至9天、5至10天、5至11天、5至12天、5至13天、5至14天、5至15天、5至16天、5至17天、5至18天、5至19天、5至20天、6至7天、6至8天、6至9天、6至10天、6至11天、6至12天、6至13天、6至14天、6至15天、6至16天、6至17天、6至18天、6至19天、6至20天、7至8天、7至9天、7至10天、7至11天、7至12天、7至13天、7至14天、7至15天、7至16天、7至17天、7至18天、7至19天、7至20天、8至9天、8至10天、8至11天、8至12天、8至13天、8至14天、8至15天、8至16天、8至17天、8至18天、8至19天、8至20天、9至10天、9至11天、9至12天、9至13天、9至14天、9至15天、9至16天、9至17天、9至18天、9至19天、9至20天、10至11天、10至12天、10至13天、10至14天、10至15天、10至16天、10至17天、10至18天、10至19天、10至20天、11至12天、11至13天、11至14天、11至15天、11至16天、11至17天、11至18天、11至19天、11至20天、12至13天、12至14天、12至15天、12至16天、12至17天、12至18天、12至19天、12至20天、13至14天、13至15天、13至16天、13至17天、13至18天、13至19天、13至20天、14至15天、14至16天、14至17天、14至18天、14至19天、14至20天、15至16天、15至17天、15至18天、15至19天、15至20天、16至17天、16至18天、16至19天、16至20天、17至18天、17至19天、17至20天、18至19天、18至20天或19至20天以製備用於基因工程化的基因工程化nkt細胞群。在一個方面，用於生產包括該表達car的表達構建體的免疫細胞的方法中的分離的免疫細胞是t細胞。在另一個方面，分離的免疫細胞是nk細胞。在一個方面，分離的免疫細胞是i型nkt細胞。在進一步的方面，擴增的免疫細胞是cd62l陽性的i型nkt細胞。如本文所提供的，用於生產免疫細胞的方法包含分離為i型nkt細胞的免疫細胞，並通過在至少agalcer、il-2和il-21存在下的培養來擴增i型nkt細胞。如上所提供的，表達構建體可進一步包含表達外源性生長因子。在另一個方面，表達構建體包含wnt信號傳導途徑中的轉錄激活因子。還包含和提供了加入編碼靶向mhc i類或mhc ii類基因的小髮夾rna(shrna)序列的dna序列，其中shrna序列被嵌入人工微小rna(amir)支架中。在某些方面，蛋白編碼序列可以由口蹄疫病
毒(fmdv)2a序列或fmdv 2a相關的順式作用水解酶元件(chysel)序列隔開。
92.本公開提供並包含用於抑制個體中硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)陽性細胞的方法，包括使細胞與治療有效量的基因工程化免疫細胞接觸的步驟，其中所述免疫細胞包括嵌合抗原受體(car)，該car包括跨膜結構域序列、胞內域序列和胞外域序列，該胞外域序列包括與硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)結合的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或抗原結合片段包括：可變輕鏈序列和可變重鏈序列，所述可變輕鏈序列包括seq id no:1-3所示的輕鏈互補決定區(「lcdr」)lcdr1至lcdr3序列以及選自由seq id no:153至221組成的群組的輕鏈框架序列1(vl-fr1)，選自由seq id no:222至225組成的群組的輕鏈框架序列2(vl-fr2)，選自由seq id no:226至249組成的群組的輕鏈框架序列3(vl-fr3)和選自由seq id no:250至255組成的群組的輕鏈框架序列4(vl-fr4)，所述可變重鏈序列包括seq id no:4至6所示的重鏈互補決定區(「hcdr」)hcdr1至hcdr3序列和選自由seq id no:256至349組成的群組的重鏈框架序列1(vh-fr1)，選自由seq id no:350至353組成的群組的重鏈框架序列2(vh-fr2)，選自由seq id no:354至360組成的群組的重鏈框架序列3(vh-fr3)和選自由seq id no:361至382組成的群組的重鏈框架序列4(vh-fr4)。如本文所用，抑制個體中硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)陽性細胞包括抑制增殖、抑制活性或兩者的組合。
93.在根據本公開的某些方面，用於抑制個體中硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)陽性細胞的方法包括基因工程化免疫細胞，其為自然殺傷t(nkt)細胞、t細胞或自然殺傷(nk)細胞。在一個方面，基因工程化免疫細胞是t細胞。在另一個方面，基因工程化免疫細胞是nkt細胞。在又一個方面，nkt細胞是i型nkt細胞。在進一步的方面，i型nkt細胞是cd62l陽性的i型nkt細胞。在某些方面，基因工程化的i型nkt細胞包括大部分的所述基因工程化免疫細胞。在進一步的方面，基因工程化的i型nkt細胞包括大部分的cd62l陽性的i型nkt細胞。
94.本公開提供並包含一種用於治療癌症的方法，所述方法包括向有此需要的受試者施用基因工程化免疫細胞的步驟，所述免疫細胞包括與硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)結合的嵌合抗原受體(car)，所述car包括跨膜結構域序列、胞內域序列和胞外域序列，所述胞外域序列包括與硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)結合的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或抗原結合片段包括：可變輕鏈序列和可變重鏈序列，所述可變輕鏈序列包括seq id no:1-3所示的輕鏈互補決定區(「lcdr」)lcdr1至lcdr3序列以及選自由seq id no:153至221組成的群組的輕鏈框架序列1(vl-fr1)，選自由seq id no:222至225組成的群組的輕鏈框架序列2(vl-fr2)，選自由seq id no:226至249組成的群組的輕鏈框架序列3(vl-fr3)和選自由seq id no:250至255組成的群組的輕鏈框架序列4(vl-fr4)，所述可變重鏈序列包括seq id no:4至6所示的重鏈互補決定區(「hcdr」)hcdr1至hcdr3序列以及選自由seq id no:256至349組成的群組的重鏈框架序列1(vh-fr1)，選自由seq id no:350至353組成的群組的重鏈框架序列2(vh-fr2)，選自由seq id no:354至360組成的群組的重鏈框架序列3(vh-fr3)和選自由seq id no:361至382組成的群組的重鏈框架序列4(vh-fr4)。
95.本文提供了治療表達cpspg4的癌症的方法。在一個方面，該方法提供了對癌症的治療，所述癌症選自由黑色素瘤、轉移性黑色素瘤疾病膠質母細胞瘤、未分化甲狀腺癌、軟組織肉瘤、膠質瘤和白血病組成的群組。在一個方面，使用本公開的方法進行治療的癌症是轉移性黑色素瘤疾病，該轉移性黑色素瘤疾病選自淺表擴散性黑色素瘤、惡性雀斑樣痣、惡性雀斑樣痣黑素瘤、肢端雀斑樣黑色素瘤或結節性黑色素瘤。在一個方面，該方法提供了對
軟組織肉瘤的治療，該軟組織肉瘤選自平滑肌肉瘤、去分化脂肪肉瘤、未分化多形性肉瘤(ups)、惡性纖維組織細胞瘤、高級別梭形細胞肉瘤、黏液纖維肉瘤、惡性周圍神經鞘膜瘤(mpnst)和滑膜肉瘤。參見pmid:32900797。在一個方面，使用所公開的方法進行治療的癌症是膠質母細胞瘤。參見pmid：34113233。在另一個方面，該方法提供了對未分化甲狀腺癌的治療。參見pmid：34078123。根據權利要求71所述的方法，其中所述癌症是膠質瘤、星形細胞瘤或少突神經膠質瘤。參見pmid：32599896。在一個方面，使用所公開的方法進行治療的癌症是白血病，包含但不限於b細胞前體白血病和mll-易位白血病。參見pmid：31195686。
96.本公開提供並包含通過向有此需要的受試者施用治療量的本文公開的基因工程化免疫細胞來治療表達cpspg4的癌症。在一個方面，基因工程化免疫細胞是自然殺傷t(nkt)細胞、t細胞或自然殺傷(nk)細胞。在一個方面，基因工程化免疫細胞是t細胞。在另一個方面，基因工程化免疫細胞是nkt細胞。在進一步的方面，基因工程化nkt細胞是i型nkt細胞。在又一個方面，基因工程化i型nkt細胞是cd62l陽性的i型nkt細胞。在某些方面，基因工程化i型nkt細胞包括大部分的所述基因工程化免疫細胞。在某些方面，基因工程化i型nkt細胞包括大部分的所述基因工程化cd62l陽性的i型nkt細胞。
97.本公開提供並包含包括上述表達載體、宿主細胞或其組合的試劑盒。在一個方面，該試劑盒包括具有編碼跨膜結構域序列、胞內域序列和胞外域序列的核酸序列的載體或細胞，所述胞外域序列包括與硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)結合的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或抗原結合片段包括：可變輕鏈序列和可變重鏈序列，所述可變輕鏈序列包括seq id no:1-3所示的輕鏈互補決定區(「lcdr」)lcdr1至lcdr3序列以及選自由seq id no:153至221組成的群組的輕鏈框架序列1(vl-fr1)，選自由seq id no:222至225組成的群組的輕鏈框架序列2(vl-fr2)，選自由seq id no:226至249組成的群組的輕鏈框架序列3(vl-fr3)和選自由seq id no:250至255組成的群組的輕鏈框架序列4(vl-fr4)，所述可變重鏈序列包括seq id no:4至6所示的重鏈互補決定區(「hcdr」)hcdr1至hcdr3序列以及選自由seq id no:256至349組成的群組的重鏈框架序列1(vh-fr1)，選自由seq id no:350至353組成的群組的重鏈框架序列2(vh-fr2)，選自由seq id no:354至360組成的群組的重鏈框架序列3(vh-fr3)和選自由seq id no:361至382組成的群組的重鏈框架序列4(vh-fr4)。
98.本公開提供並包含一種用於在表達嵌合抗原受體(car)編碼序列的nkt細胞中維持nkt細胞擴增潛力的方法，所述編碼序列包括胞外域序列、跨膜結構域序列和胞內域序列，所述胞外域序列包括與硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)結合的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包括seq id no:1-3所示的輕鏈互補決定區(「lcdr」)lcdr1至lcdr3序列以及選自由seq id no:153至221組成的群組的輕鏈框架序列1(vl-fr1)，選自由seq id no:222至225組成的群組的輕鏈框架序列2(vl-fr2)，選自由seq id no:226至249組成的群組的輕鏈框架序列3(vl-fr3)和選自由seq id no:250至255組成的群組的輕鏈框架序列4(vl-fr4)；可變重鏈序列，所述可變重鏈序列包括seq id no:4至6所示的重鏈互補決定區(「hcdr」)hcdr1至hcdr3序列以及選自由seq id no:256至349組成的群組的重鏈框架序列1(vh-fr1)，選自由seq id no:350至353組成的群組的重鏈框架序列2(vh-fr2)，選自由seq id no:354至360組成的群組的重鏈框架序列3(vh-fr3)和選自由seq id no:361至382組成的群組的重鏈框架序列4(vh-fr4)；所述方法包括表達包括wnt信號傳導途徑中轉錄激活因子的蛋白編碼序列，和培養所述工程化nkt細胞以製備具有持續擴增潛力的基
因工程化nkt細胞群。
99.在某些方面，根據本公開的具有持續擴增潛力的基因工程化nkt細胞群佔總細胞群的至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在某些方面，根據本公開的具有持續擴增潛力的基因工程化nkt細胞群佔至少10％至高達80％、10％至90％、10％至95％、10％至98％、10％至99％以及高達100％，其中非工程化nkt細胞佔總群體的低於99.9％。在某些方面，根據本公開的具有持續擴增潛力的基因工程化nkt細胞群佔總細胞群的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在某些方面，根據本公開的具有持續擴增潛力的基因工程化nkt細胞群佔至少50％至高達70％、50％至高達80％、50％至90％、50％至95％、50％至98％、50％至99％以及高達100％，其中非工程化nkt細胞佔總群體的低於99.9％。在某些方面，工程化nkt細胞進一步表達car。在其他方面，工程化nkt細胞表達car和外源性生長因子。
100.在某些方面，根據本公開的具有持續擴增潛力的基因工程化nkt細胞群包括至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的cd62l(+)nkt細胞。在某些方面，根據本公開的具有持續擴增潛力的基因工程化nkt細胞群包括50％至55％、50％至60％、約50％至65％、50％至70％、50％至75％、50％至80％、50％至85％、50％至90％、50％至95％、50％至100％、55％至60％、55％至65％、55％至70％、55％至75％、55％至80％、55％至85％、55％至90％、55％至95％、55％至100％、60％至65％、60％至70％、60％至75％、60％至80％、60％至85％、60％至90％、60％至95％、60％至100％、65％至70％、65％至75％、65％至80％、65％至85％、65％至90％、65％至95％、65％至100％、70％至75％、70％至80％、70％至85％、70％至90％、70％至95％、70％至100％、75％至80％、75％至85％、75％至90％、75％至95％、75％至100％、80％至85％、80％至90％、80％至95％、80％至100％、85％至90％、85％至95％、85％至100％、90％至95％、90％至100％或95％至100％的cd62l(+)nkt細胞。在某些方面，根據本公開的具有持續擴增潛力的基因工程化nkt細胞群包括50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的cd62l(+)nkt細胞。在某些方面，工程化的cd62l(+)nkt細胞進一步表達car。在其他方面，工程化的cd62l(+)nkt細胞表達car和外源性生長因子。
101.本公開提供並包含維持nkt細胞擴增潛力的方法，所述方法包括以下步驟：工程化nkt細胞以至少表達包括wnt信號傳導途徑中轉錄激活因子的蛋白編碼序列，和培養工程化nkt細胞以製備具有持續擴增潛力的基因工程化nkt細胞群，其中培養所述工程化nkt細胞一段時間。
102.在某些方面，包括工程化nkt細胞步驟的用於維持nkt細胞擴增潛力的方法進一步包括從具有持續擴增潛力的基因工程化nkt細胞群中分離出所需的細胞。在一個方面，該方法進一步包括通過cd62l的表達分離工程化nkt細胞，以產生選定的cd62l(+)基因工程化nkt細胞群。在一個方面，該方法進一步包括通過4-1bb的表達來分離工程化nkt細胞，以產生選定的4-1bb(+)基因工程化nkt細胞群。
103.本公開的用於維持nkt細胞擴增潛力的方法提供並包含具有持續擴增潛力的基因工程化nkt細胞群在浸潤到人源化nsg小鼠中神經母細胞瘤異種移植物時表現出體內持久
性。
104.本公開提供並包含用於減少nkt細胞耗竭的方法，所述方法包括以下步驟：工程化nkt細胞以至少表達包括wnt信號傳導途徑中轉錄激活因子的蛋白編碼序列，和培養工程化nkt細胞以製備具有持續擴增潛力的基因工程化nkt細胞群，以產生細胞群，其中基因工程化nkt細胞包括總細胞群中大於10％的cd62l(+)nkt細胞。在某些方面，10％或更多的具有持續擴增潛力的基因工程化cd62l(+)nkt細胞群包括i型nkt細胞。在某些方面，總群體包括i型nkt細胞、ii型nkt細胞、輻照的pbmc細胞、非nkt細胞和非工程化細胞。在某些方面，工程化的cd62l(+)nkt細胞進一步表達car。在其他方面，工程化的cd62l(+)nkt細胞表達car和外源性生長因子。
105.本公開提供並包含一種減少小鼠模型中scfv強直信號傳導的方法，所述方法包括：識別當作為car的一部分在小鼠免疫細胞中表達時具有強直信號傳導的scfv；生成所述scfv的結構模型，和進行計算誘變以製備一系列誘變的scfv；計算所述誘變的scfv的自由能；將所述誘變的scfv與包括框架1.4(fw1.4)的人源化scfv進行比對，從而識別關鍵的鼠殘基；以及引入一個或多個人到小鼠殘基變化，以增加所述scfv的穩定性和製備用於小鼠模型的經修飾的人源化scfv。在一個方面，該方法包括經修飾的人源化fw1.4，其包括seq id no:7至10的輕鏈框架區(vl-fr)1至4、seq id no:11的接頭區或seq id no:12至15的重鏈框架區(vh-fr)1至4中的至少一者。在一個方面，經修飾的人源化scfv包括選自由seq id no:16至27組成的群組的經修飾的fr區。如本文所用，強直信號傳導通過細胞因子如infγ的自發釋放來測量。在根據本公開的某些方面，減少小鼠模型中作為car一部分的scfv的強直信號傳導的方法導致infγ水平與相同培養條件下含有非car的細胞釋放的infγ水平不可區分。在其他方面，與作為car一部分的非突變scfv相比，強直信號傳導減少至少兩倍。在另一個方面，與作為car一部分的非突變scfv相比，強直信號傳導減少至少五倍。在另一個方面，與作為car一部分的非突變scfv相比，強直信號傳導減少至少十倍。在另一個方面，與作為car一部分的非突變scfv相比，強直信號傳導減少至少五十倍。在某些方面，與作為car一部分的非突變scfv相比，強直信號傳導減少100倍。在一個方面，與作為car一部分的非突變scfv相比，強直信號傳導減少10至100倍。在一個方面，與作為car一部分的非突變scfv相比，強直信號傳導減少5至50倍。在一個方面，與作為car一部分的非突變scfv相比，強直信號傳導減少10至200倍。在其他方面，通過infγ的自發釋放測量的強直信號傳導減少，其中infγ的水平低於200pg/ml/5
×
105個細胞。在其他方面，通過infγ的自發釋放測量的強直信號傳導減少，其中infγ的水平低於100pg/ml/5
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105個細胞。在其他方面，通過infγ的自發釋放測量的強直信號傳導減少，其中infγ的水平低於10pg/ml/5
×
105個細胞。在某些方面，作為根據本公開的car的一部分的scfv突變後，強直信號傳導的水平達到或接近infγ的檢測水平。在某些方面，具有減少的強直信號傳導的免疫細胞具有持續的擴增潛力和增加的功能性。在某些方面，具有減少的強直信號傳導的免疫細胞具有持續的擴展潛力、減少的免疫細胞耗竭和提高的體內抗腫瘤效果。
106.如本說明書提供的用於減少小鼠模型的強直信號傳導的方法包括，小鼠免疫細胞是自然殺傷t(nkt)細胞、t細胞或自然殺傷(nk)細胞。在一個方面，小鼠免疫細胞是t細胞。在另一個方面，小鼠免疫細胞是nkt細胞。在進一步的方面，nkt細胞是i型nkt細胞。在又一個方面，nkt細胞是cd62l陽性的i型nkt細胞。
107.除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語都具有本發明所屬技術領域的技術人員通常理解的含義。以下參考文獻為技術人員提供了本發明中使用的許多術語的一般定義。singleton等人，《微生物學和分子生物學詞典(dictionary of microbiology and molecular biology)》(第2版，1994)；《劍橋科技詞典(the cam bridge dictionary of science and technology)》(walker編輯,1988)；《遺傳學術語(the glossary of genetics)》,第5版,r.rieger等人(編輯),springer verlag(1991)；和halemarham，《哈珀-柯林斯生物學詞典(the harper collins dictionary of biology)》(1991)。除非另有說明，否則如本文所用的以下術語具有以下賦予它們的含義。
108.術語「包括(comprises/comprising)」、「包含(includes/including)」、「具有(having)」及其同源詞意味著「包含但不限於」。術語「由...組成(consisting of)」意指「包含但限於」。術語「基本上由...組成」是指組合物、方法或結構可以包含其它成分、步驟和/或部分，但條件是另外的成分、步驟和/或部分不會實質上改變所要求保護的組合物、方法或結構的基本和新穎特徵。
109.除非上下文清楚地另外指明，否則如本文所用的單數形式「一個」、「一種」以及「所述」包含複數指示物。例如，術語「細胞」或「至少一個細胞」可以包含多個細胞，包含其混合物。
110.貫穿本技術，本公開的各個實施例可以以範圍格式呈現。應當理解的是，採用範圍格式的描述僅為了方便和簡潔起見，並且不應當解釋為是對本公開的範圍的硬性限制。因此，對範圍的描述應被視為已經具體公開了所有可能的子範圍以及所述範圍內的單獨數值。例如，例如1至6的範圍描述應被視為已經具體地公開了例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等的子範圍，以及所述範圍內的個別數字，例如1、2、3、4、5和6。無論範圍的廣度如何，這都適用。
111.如本文所使用的，術語「方法」是指用於完成給定任務的方式、手段、技術和程序，包含但不限於化學、藥理學、生物學、生物化學以及醫學領域的從業者已知的或容易依據已知方式、手段、技術和程序開發的那些方式、手段、技術和程序。
112.如本文所用，「治療」是指試圖改變接受治療的個體或細胞的病程的臨床幹預，並且可以為了預防或在臨床病理學過程中進行。治療的療效包含但不限於防止疾病的發生或復發、減輕症狀、減少疾病的任何直接或間接病理後果、防止轉移、降低疾病進展的速度、改善或緩解疾病狀態以及緩解或改善預後。通過防止疾病或病症的進展，治療可以防止受影響或被診斷的受試者或被懷疑患有病症的受試者因病症而惡化，而且治療還可以防止有病症風險或被懷疑患有病症的受試者的病症或病症症狀的發生。
113.對本發明的方法有用的核酸分子包含編碼本發明多肽或其片段的任何核酸分子。此類核酸分子不需要與內源性核酸序列100％相同，但會編碼與所述序列相同的多肽。
114.術語「受試者」、「個體」和「患者」在本文可互換使用，並指任何脊椎動物受試者，包含但不限於哺乳動物，優選人類和其他靈長類動物，包含非人類靈長類動物，如實驗室動物，包含齧齒動物如小鼠、大鼠和豚鼠；該術語並不表示特定年齡。因此，成人和新生兒個體都意圖被涵蓋在內。
[0115]「有效量」是指足以具有治療效果的量。在一個實施例中，「有效量」是足以阻止、改善或抑制腫瘤形成的持續增殖、生長或轉移(例如，侵入或遷移)的量。
[0116]
術語「分離的」、「純化的」或「生物純的」是指不同程度地不含在其天然狀態中發現的正常伴隨的組分的材料。「分離」表示與原始來源或周圍環境的分離程度。「純化」表示比分離更高的分離程度。「純化的」或「生物純的」蛋白質充分不含其它材料，使得任何雜質不會實質上影響蛋白質的生物學性質或引起其他不良後果。也就是說，如果本發明的核酸或肽在通過重組dna技術產生時基本上不含細胞材料、病毒材料或培養基，或化學合成時基本上不含化學前體或其它化學品，則本發明的核酸或肽是純化的。純度和均一性通常使用分析化學技術，例如聚丙烯醯胺凝膠電泳或高效液相色譜法確定。術語「純化的」可以表示核酸或蛋白質在電泳凝膠中產生基本上一條條帶。對於可以進行修飾(例如磷酸化或糖基化)的蛋白質，不同的修飾可以產生不同的分離的蛋白質，可以單獨純化該蛋白質。
[0117]
如本文所用，術語「可操作地連接」是指連接兩個或更多個生物分子從而至少保留與生物分子相關的生物學功能、活性和/或結構。提及多肽，該術語是指兩個或更多個多肽的連接得到保留各個多肽組分的至少一些各自單獨活性的融合多肽。兩個或更多個多肽可以直接連接或經由接頭連接。提及核酸，該術語是指第一多核苷酸與第二多核苷酸鄰近，當合適的分子(例如，轉錄激活蛋白)結合到第二多核苷酸時，第二多核苷酸指導第一多核苷酸的轉錄。
[0118]
如本文所用，「細胞群」是指多個細胞，並且可進一步包括不同細胞類型的混合物以及同質群體。
[0119]
術語「識別」是指選擇性地結合靶標。識別細胞的免疫細胞通常表達與該細胞表達的抗原結合的受體。在根據本公開的某些方面，免疫細胞表達與硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)結合的car。
[0120]
如本文所用，「自主核糖體內自加工肽」是18個胺基酸的小肽，其避免了蛋白酶將多肽處理成獨立的蛋白質的需要。這些肽首次在口蹄疫病毒中被發現，當作為兩種蛋白質之間的接頭引入時，這些肽提供了多肽的自主核糖體內自加工。類似的序列已經在皮可比那病毒(pircornaviradae)的其他成員中被確認。參見de felipe，「跳過共表達問題：新的2a
『
chysel』技術」，《基因疫苗和療法(genetic vaccines and therapy)》2:13(2004)。
[0121]
如本文所用，術語「工程化」是指對細胞進行基因修飾，以引入一個或多個外源核酸序列。優選地，工程化引入的外源核酸序列被轉錄和翻譯以表達蛋白質。引入外源核酸序列可以用本領域已知的方法進行，包含轉化、轉染和轉導。
[0122]
如本文所用，術語「wnt信號傳導途徑中轉錄激活因子」一般是指當外源性地在細胞中表達時，激活wnt/β-連環蛋白信號傳導途徑下遊的基因的蛋白質。wnt信號傳導途徑中轉錄激活因子包含表達wnt信號傳導的正向調節因子如lef1，以及抑制負向調節因子如gsk3β。wnt信號傳導的轉錄激活因子還包含小分子激活因子，包含但不限於blagodatski等人「天然來源的小分子wnt途徑調節劑：歷史、現有技術和前景」，《細胞(cells)》9:589(2020)和verkaar等人，「β-連環蛋白信號傳導的新型小分子激活因子的發現」，《公共科學圖書館(plos one)》6(4):e19185(2011)中描述的那些，並且包含wnt信號傳導的負向調節因子的抑制劑，如tws119(參見ding等人，「控制幹細胞命運的合成小分子」，《美國國家科學院院刊》100(13):7632-7(2003))。
[0123]
如本文所用，短語「表達生長因子」是指一種或多種生長因子的外源性表達，其一般在異源啟動子的控制下並且更常常作為chysel序列下遊多蛋白的一部分。
[0124]
雖然已經參考某些實施例描述了本公開，但是本領域技術人員將理解，在不脫離本公開的範圍的情況下，可以進行各種改變並且可以用等同物替換其元件以適應特定情況。因此，意圖是本公開不限於作為預期用於實施本公開的最佳模式而公開的特定實施例，而是本公開將包含落入所附權利要求的範圍和精神內的所有實施例。
[0125]
本文引用的任何參考文獻通過引用以其整體併入。
[0126]
實施例：
[0127]
實施例1：一種對硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)具有結合特異性的結合成員，所述結合成員包括可變輕鏈序列和可變重鏈序列，所述可變輕鏈序列包括seq id no:1-3所示的輕鏈互補決定區(「lcdr」)lcdr1至lcdr3序列以及選自由seq id no:153至221組成的群組的輕鏈框架序列1(vl-fr1)；選自由seq id no:222至225組成的群組的輕鏈框架序列2(vl-fr2)；選自由seq id no:226至249組成的群組的輕鏈框架序列3(vl-fr3)；和選自由seq id no:250至255組成的群組的輕鏈框架序列4(vl-fr4)；所述可變重鏈序列包括seq id no:4至6所示的重鏈互補決定區(「hcdr」)hcdr1至hcdr3序列以及選自由seq id no:256至349組成的群組的重鏈框架序列1(vh-fr1)；選自由seq id no:350至353組成的群組的重鏈框架序列2(vh-fr2)；選自由seq id no:354至360組成的群組的重鏈框架序列3(vh-fr3)；和選自由seq id no:361至382組成的群組的重鏈框架序列4(vh-fr4)。
[0128]
實施例2：根據實施例1所述的對cspg4具有結合特異性的結合成員，其中所述輕鏈框架序列1(vl-fr1)選自由seq id no:153至158組成的群組；所述輕鏈框架序列2(vl-fr2)選自由seq id no:222至225組成的群組；所述輕鏈框架序列3(vl-fr3)選自由seq id no:226至231組成的群組；並且所述輕鏈框架序列4(vl-fr4)選自由seq id no:250至255組成的群組；所述重鏈框架序列1(vh-fr1)選自由seq id no:347至349組成的群組；所述重鏈框架序列2(vh-fr2)選自由seq id no:350至353組成的群組；所述重鏈框架序列3(vh-fr3)選自由seq id no:354至360組成的群組；並且所述重鏈框架序列4(vh-fr4)選自由seq id no:361至362組成的群組。
[0129]
實施例3：根據實施例1或2所述的對cspg4具有結合特異性的結合成員，其中所述可變輕鏈序列包括選自由seq id no:67至109組成的群組的序列，並且所述可變重鏈序列包括選自由seq id no:110至152組成的群組的序列。
[0130]
實施例4：一種編碼多肽的核酸，所述核酸包括可變輕鏈序列，所述可變輕鏈序列包括seq id no:1-3所示的輕鏈互補決定區(「lcdr」)lcdr1至lcdr3序列以及選自由seq id no:153至221組成的群組的輕鏈框架序列1(vl-fr1)；選自由seq id no:222至225組成的群組的輕鏈框架序列2(vl-fr2)；選自由seq id no:226至249組成的群組的輕鏈框架序列3(vl-fr3)；和選自由seq id no:250至255組成的群組的輕鏈框架序列4(vl-fr4)。
[0131]
實施例5：一種編碼多肽的核酸，所述核酸包括可變重鏈序列，所述可變重鏈序列包括seq id no:4至6所示的重鏈互補決定區(「hcdr」)hcdr1至hcdr3序列以及選自由seq id no:256至349組成的群組的重鏈框架序列1(vh-fr1)；選自由seq id no:350至353組成的群組的重鏈框架序列2(vh-fr2)；選自由seq id no:354至360組成的群組的重鏈框架序列3(vh-fr3)；和選自由seq id no:361至382組成的群組的重鏈框架序列4(vh-fr4)。
[0132]
實施例6：一種嵌合抗原受體(car)表達構建體，所述構建體包括編碼嵌合抗原受體(car)編碼序列的核酸序列，所述編碼序列包括胞外域序列；跨膜結構域序列；和胞內域
序列，所述胞外域序列包括與硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)結合的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包括可變輕鏈序列和可變重鏈序列，所述可變輕鏈序列包括seq id no:1-3所示的輕鏈互補決定區(「lcdr」)lcdr1至lcdr3序列，選自由seq id no:153至221組成的群組的輕鏈框架序列1(vl-fr1)；選自由seq id no:222至225組成的群組的輕鏈框架序列2(vl-fr2)；選自由seq id no:226至249組成的群組的輕鏈框架序列3(vl-fr3)；和選自由seq id no:250至255組成的群組的輕鏈框架序列4(vl-fr4)；所述可變重鏈序列包括seq id no:4至6所示的重鏈互補決定區(「hcdr」)hcdr1至hcdr3序列以及選自由seq id no:256至349組成的群組的重鏈框架序列1(vh-fr1)；選自由seq id no:350至353組成的群組的重鏈框架序列2(vh-fr2)；選自由seq id no:354至360組成的群組的重鏈框架序列3(vh-fr3)；和選自由seq id no:361至382組成的群組的重鏈框架序列4(vh-fr4)。
[0133]
實施例7：根據實施例6所述的嵌合抗原受體(car)表達構建體，其中所述跨膜結構域選自由以下組成的群組：cd28(基因id：940，12487)、cd3-ζ(基因id：919；12503cd247)、cd4(基因id：920，12504)、cd8(基因id：924，12525)、cd16(基因id：2214；14131；fcgr3)、nkp44(基因id：9436，ncr2)、nkp46(基因id：9437，17086，ncr1)和nkg2d(基因id：22914；27007klrk1)。
[0134]
實施例8：根據實施例6或7所述的嵌合抗原受體(car)表達構建體，其中所述胞內域序列選自由以下組成的群組：cd28(基因id：940)、tnf受體超家族成員9(基因id 3604，例如，4-1bb或cd137)、cd247(基因id 919，cd3-ζ)、2b4(基因id：51744，cd244)、白細胞介素21(il-21，基因id 59067)、造血細胞信號轉導蛋白(hcst，基因id 10870，例如，dap10)和跨膜免疫信號傳導銜接子(tyrobp，基因id 7305；dap12)。
[0135]
實施例9：根據實施例6至8中任一項所述的嵌合抗原受體(car)表達構建體，其進一步包括編碼wnt信號傳導途徑中轉錄激活因子的蛋白序列的序列。
[0136]
實施例10：根據實施例6至9中任一項所述的嵌合抗原受體(car)表達構建體，其中所述表達構建體編碼多蛋白，所述多蛋白包括所述wnt信號傳導途徑中轉錄激活因子的蛋白序列和最多三個額外的蛋白編碼序列。
[0137]
實施例11：根據實施例6至10中任一項所述的嵌合抗原受體(car)表達構建體，其中所述wnt信號傳導途徑中轉錄激活因子的蛋白序列和最多三個額外的蛋白編碼序列由自主核糖體內自加工肽隔開。
[0138]
實施例12：根據實施例6至11中任一項所述的嵌合抗原受體(car)表達構建體，其中所述自主核糖體內自加工是口蹄疫病毒(fmdv)2a序列或相關的順式作用水解酶元件(chysel)。
[0139]
實施例13：根據實施例6至12中任一項所述的嵌合抗原受體(car)表達構建體，其中所述轉錄激活因子選自由淋巴增強子結合因子1(lef1，基因id 51176)、β-連環蛋白((ctnnb1，基因id 1499))、smad3(基因id 4088)、hnf1同源框a(hnf1a，基因id：6927(alt.tcf1))、轉錄因子7(tcf7，基因id：6932(alt.tcf1))和轉錄輔阻遏物tle家族成員1(tle 1，基因id 7088)組成的群組。
[0140]
實施例14：根據實施例6至13中任一項所述的嵌合抗原受體(car)表達構建體，其中所述lef1選自由參考序列(refseq)id no:np_057353.1、np_001124185.1和np_001124186.1組成的群組。
[0141]
實施例15：根據實施例6至14中任一項所述的嵌合抗原受體(car)表達構建體，其進一步包括至少一個生長因子的蛋白編碼序列。
[0142]
實施例16：根據實施例6至15中任一項所述的嵌合抗原受體(car)表達構建體，其中所述生長因子選自由白細胞介素15(il-15)、白細胞介素7(il-7)、白細胞介素12(il-12)、白細胞介素18(il-18)、白細胞介素21(il-21)、白細胞介素27(il-27)、白細胞介素33(il-33)及其組合組成的群組。
[0143]
實施例17：根據實施例6至16中任一項所述的嵌合抗原受體(car)表達構建體，其中所述生長因子的蛋白編碼序列與所述car編碼序列由口蹄疫病毒(fmdv)2a序列或fmdv 2a相關的順式作用水解酶元件(chysel)序列隔開。
[0144]
實施例18：根據實施例6至17中任一項所述的嵌合抗原受體(car)表達構建體，其中所述胞外域序列進一步包括間隔子結構域。
[0145]
實施例19：根據實施例6至18中任一項所述的嵌合抗原受體(car)表達構建體，其中所述胞內域包括與cd3-ζ鏈框內融合的4-1bb信號序列。
[0146]
實施例20：根據實施例6至19中任一項所述的嵌合抗原受體(car)表達構建體，其進一步包括編碼靶向mhc i類或mhc ii類基因的小髮夾rna(shrna)序列的dna序列，其中shrna序列被嵌入人工微小rna(amir)支架中。
[0147]
實施例21：一種嵌合抗原受體(car)，其包括：胞外域序列；跨膜結構域序列；和胞內域序列，所述胞外域序列包括與硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)結合的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段選自由seq id no:28至65組成的群組。
[0148]
實施例22：根據實施例21所述的嵌合抗原受體(car)，其中所述胞外域序列選自由seq id no:34、46、47和57組成的群組。
[0149]
實施例23：根據實施例21或22所述的嵌合抗原受體(car)，其中所述胞外域序列包括seq id no:34。
[0150]
實施例24：根據實施例2或221所述的嵌合抗原受體(car)，其中所述胞外域序列包括seq id no:46。
[0151]
實施例25：根據實施例21或22所述的嵌合抗原受體(car)，其中所述胞外域序列包括seq id no:47。
[0152]
實施例26：根據實施例21或22所述的嵌合抗原受體(car)，其中所述胞外域序列包括seq id no:57。
[0153]
實施例27：根據實施例21至26中任一項所述的嵌合抗原受體(car)，其中所述跨膜結構域序列選自由以下組成的群組：cd28(基因id：940，12487)、cd3-ζ(基因id：919；12503cd247)、cd4(基因id：920，12504)、cd8(基因id：924，12525)、cd16(基因id：2214；14131；fcgr3)、nkp44(基因id：9436，ncr2)、nkp46(基因id：9437，17086，ncr1)和nkg2d(基因id：22914；27007klrk1)。
[0154]
實施例28：根據實施例21至27中任一項所述的嵌合抗原受體(car)，其中所述胞內域序列選自由以下組成的群組：cd28(基因id：940)、tnf受體超家族成員9(基因id 3604，例如，4-1bb或cd137)、cd247(基因id 919，cd3-ζ)、2b4(基因id：51744，cd244)、白細胞介素21(il-21，基因id 59067)、造血細胞信號轉導蛋白(hcst，基因id 10870，例如，dap10)和跨膜免疫信號傳導銜接子(tyrobp，基因id 7305；dap12)。
[0155]
實施例29：一種編碼car的核酸分子，所述car包括胞外域序列；跨膜結構域序列；和胞內域序列，所述胞外域序列包括與硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)結合的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段選自由seq id no:28至65組成的群組。
[0156]
實施例30：根據實施例29所述的編碼car的核酸分子，其中所述胞外域序列選自由seq id no:34、46、47和57組成的群組。
[0157]
實施例31：根據實施例29或30所述的編碼car的核酸分子，其中所述胞外域序列包括seq id no:34。
[0158]
實施例32：根據實施例29或30所述的編碼car的核酸分子，其中所述胞外域序列包括seq id no:46。
[0159]
實施例33：根據實施例29或30所述的編碼car的核酸分子，其中所述胞外域序列包括seq id no:47。
[0160]
實施例34：根據實施例29或30所述的編碼car的核酸分子，其中所述胞外域序列包括seq id no:57。
[0161]
施例35：根據實施例29至34中任一項所述的編碼car的核酸分子，其中所述跨膜結構域序列選自由以下組成的群組：cd28(基因id：940，12487)、cd3-ζ(基因id：919；12503cd247)、cd4(基因id：920，12504)、cd8(基因id：924，12525)、cd16(基因id：2214；14131；fcgr3)、nkp44(基因id：9436，ncr2)、nkp46(基因id：9437，17086，ncr1)和nkg2d(基因id：22914；27007klrk1)。
[0162]
實施例36：根據實施例29至35中任一項所述的編碼car的核酸分子，其中所述胞內域序列選自由以下組成的群組：cd28(基因id：940)、tnf受體超家族成員9(基因id 3604，例如，4-1bb或cd137)、cd247(基因id 919，cd3-ζ)、2b4(基因id：51744，cd244)、白細胞介素21(il-21，基因id 59067)、造血細胞信號轉導蛋白(hcst，基因id 10870，例如，dap10)和跨膜免疫信號傳導銜接子(tyrobp，基因id 7305；dap12)。
[0163]
實施例37：一種宿主細胞，其用根據實施例6至20中任一項所定義的表達構建體和根據實施例29至35中任一項所定義的核酸序列轉化或轉染。
[0164]
實施例38：根據實施例37所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞選自由細菌、自然殺傷t(nkt)細胞、t細胞和自然殺傷(nk)細胞組成的群組。
[0165]
實施例39：根據實施例37或38所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是t細胞。
[0166]
實施例40：根據實施例37或38所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是nkt細胞。
[0167]
實施例41：根據實施例37、38或40中任一項所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞是i型nkt細胞。
[0168]
實施例42：一種用於生產包括car的免疫細胞的方法，所述方法包括從供體中分離pbmc；從所述pbmc中分離自然殺傷t(nkt)細胞、t細胞或自然殺傷(nk)細胞以製備分離的免疫細胞；和將所述分離的免疫細胞擴增1至20天以通過內源性t細胞受體的刺激以及共刺激受體、細胞因子或兩者的組合的共刺激製備用於基因工程化的擴增的免疫細胞；以及引入嵌合抗原受體(car)表達構建體，所述構建體包括胞外域序列，所述胞外域序列包括與硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)結合的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包括選自由seq id no:61至109組成的群組的可變輕鏈和選自由seq id no:110至152組成的群組的可變重鏈。
[0169]
實施例43：根據實施例42所述的用於生產包括car的免疫細胞的方法，其中所述分離的免疫細胞是t細胞。
[0170]
實施例44：根據實施例41或42所述的用於生產包括car的免疫細胞的方法，其中所述分離的免疫細胞是nk細胞。
[0171]
實施例45：根據實施例41或42所述的用於生產包括car的免疫細胞的方法，其中所述分離的免疫細胞是i型nkt細胞。
[0172]
實施例46：根據實施例41、42或43中任一項所述的用於生產包括car的免疫細胞的方法，其中所述擴增的免疫細胞是cd62l陽性的i型nkt細胞。
[0173]
實施例47：根據實施例45或46所述的用於生產包括car的免疫細胞的方法，其中所述分離的免疫細胞是i型nkt細胞，並且所述擴增包括在至少agalcer、il-2和il-21存在下進行培養。
[0174]
實施例48：一種基因工程化免疫細胞，所述細胞包括編碼嵌合抗原受體(car)編碼序列的表達構建體，所述編碼序列包括胞外域序列；跨膜結構域序列；和胞內域序列，所述胞外域序列包括與硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)結合的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包括可變輕鏈序列和可變重鏈序列，所述可變輕鏈序列包括seq id no:1-3所示的輕鏈互補決定區(「lcdr」)lcdr1至lcdr3序列以及選自由seq id no:153至221組成的群組的輕鏈框架序列1(vl-fr1)；選自由seq id no:222至225組成的群組的輕鏈框架序列2(vl-fr2)；選自由seq id no:226至249組成的群組的輕鏈框架序列3(vl-fr3)；和選自由seq id no:250至255組成的群組的輕鏈框架序列4(vl-fr4)；所述可變重鏈序列包括seq id no:4至6所示的重鏈互補決定區(「hcdr」)hcdr1至hcdr3序列以及選自由seq id no:256至349組成的群組的重鏈框架序列1(vh-fr1)；選自由seq id no:350至353組成的群組的重鏈框架序列2(vh-fr2)；選自由seq id no:354至360組成的群組的重鏈框架序列3(vh-fr3)；和選自由seq id no:361至382組成的群組的重鏈框架序列4(vh-fr4)。
[0175]
實施例49：根據實施例47或48所述的基因工程化免疫細胞，其中所述基因工程化免疫細胞是自然殺傷t(nkt)細胞、t細胞或自然殺傷(nk)細胞。
[0176]
實施例50：根據實施例47或49所述的基因工程化免疫細胞，其中所述宿主細胞是t細胞。
[0177]
實施例51：根據實施例47或49所述的基因工程化免疫細胞，其中所述宿主細胞是nkt細胞。
[0178]
實施例52：根據實施例47、49或51中任一項所述的基因工程化免疫細胞，其中所述宿主細胞是i型nkt細胞。
[0179]
實施例53：根據實施例47、49、51或52中任一項所述的基因工程化免疫細胞，其中所述宿主細胞是cd62l陽性的i型nkt細胞。
[0180]
實施例54：根據實施例48所述的基因工程化免疫細胞，其中所述基因工程化免疫細胞包括多個細胞。
[0181]
實施例55：根據實施例48或54所述的基因工程化免疫細胞，其中所述基因工程化免疫細胞包括多個cd62l陽性的i型nkt細胞。
[0182]
實施例56：根據實施例48、54或55中任一項所述的基因工程化免疫細胞，其中所述多個cd62l陽性的i型nkt細胞包括所述多個細胞的至少50％。
[0183]
實施例57：根據實施例48至56中任一項所述的基因工程化免疫細胞，其進一步包括編碼靶向mhc i類或mhc ii類基因的小髮夾rna(shrna)序列的dna序列，其中shrna序列被嵌入人工微小rna(amir)支架中。
[0184]
實施例58：一種細胞群，所述細胞群包括多個基因工程化免疫細胞，所述基因工程化免疫細胞包括編碼嵌合抗原受體(car)編碼序列的表達構建體，所述編碼序列包括胞外域序列；跨膜結構域序列；和胞內域序列，所述胞外域序列包括與硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)結合的抗體或其抗原結合片段，所述car包括可變輕鏈序列和可變重鏈序列，所述可變輕鏈序列包括seq id no:1-3所示的輕鏈互補決定區(「lcdr」)lcdr1至lcdr3序列以及選自由seq id no:153至221組成的群組的輕鏈框架序列1(vl-fr1)；選自由seq id no:222至225組成的群組的輕鏈框架序列2(vl-fr2)；選自由seq id no:226至249組成的群組的輕鏈框架序列3(vl-fr3)；和選自由seq id no:250至255組成的群組的輕鏈框架序列4(vl-fr4)；所述可變重鏈序列包括seq id no:4至6所示的重鏈互補決定區(「hcdr」)hcdr1至hcdr3序列以及選自由seq id no:256至349組成的群組的重鏈框架序列1(vh-fr1)；選自由seq id no:350至353組成的群組的重鏈框架序列2(vh-fr2)；選自由seq id no:354至360組成的群組的重鏈框架序列3(vh-fr3)；和選自由seq id no:361至382組成的群組的重鏈框架序列4(vh-fr4)。
[0185]
實施例59：根據實施例58所述的細胞群，其中所述基因工程化免疫細胞包括自然殺傷t(nkt)細胞、t細胞或自然殺傷(nk)細胞。
[0186]
實施例60：根據實施例58或59所述的細胞群，其中所述基因工程化免疫細胞包括多個cd62l陽性的i型nkt細胞。
[0187]
實施例61：根據實施例58、59或60所述的細胞群，其中所述多個cd62l陽性的i型nkt細胞包括所述多個細胞的至少50％。
[0188]
實施例62：一種抑制個體中硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)陽性細胞的方法，所述方法包括使細胞與治療有效量的基因工程化免疫細胞接觸的步驟，其中所述免疫細胞包括嵌合抗原受體(car)，所述car包括胞外域序列；跨膜結構域序列；和胞內域序列，所述胞外域序列包括與硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)結合的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或抗原結合片段包括：可變輕鏈序列和可變重鏈序列，所述可變輕鏈序列包括seq id no:1-3所示的輕鏈互補決定區(「lcdr」)lcdr1至lcdr3序列以及選自由seq id no:153至221組成的群組的輕鏈框架序列1(vl-fr1)；選自由seq id no:222至225組成的群組的輕鏈框架序列2(vl-fr2)；選自由seq id no:226至249組成的群組的輕鏈框架序列3(vl-fr3)；和選自由seq id no:250至255組成的群組的輕鏈框架序列4(vl-fr4)；所述可變重鏈序列包括seq id no:4至6所示的重鏈互補決定區(「hcdr」)hcdr1至hcdr3序列以及選自由seq id no:256至349組成的群組的重鏈框架序列1(vh-fr1)；選自由seq id no:350至353組成的群組的重鏈框架序列2(vh-fr2)；選自由seq id no:354至360組成的群組的重鏈框架序列3(vh-fr3)；和選自由seq id no:361至382組成的群組的重鏈框架序列4(vh-fr4)。
[0189]
實施例63：根據實施例62所述的方法，其中所述抑制包括抑制增殖、抑制活性或兩者的組合。
[0190]
實施例64：根據實施例62或63所述的方法，其中所述基因工程化免疫細胞是自然殺傷t(nkt)細胞、t細胞或自然殺傷(nk)細胞。
[0191]
實施例65：根據實施例62至64中任一項所述的方法，其中所述基因工程化免疫細胞是t細胞。
[0192]
實施例66：根據實施例62至64中任一項所述的方法，其中所述基因工程化免疫細胞是nkt細胞。
[0193]
實施例67：根據實施例62至64或66中任一項所述的方法，其中所述nkt細胞是i型nkt細胞。
[0194]
實施例68：根據實施例62至64、66或67中任一項所述的方法，其中所述i型nkt細胞是cd62l陽性的i型nkt細胞。
[0195]
實施例69：根據實施例62至64或66至68中任一項所述的方法，其中所述i型nkt細胞包括大部分的所述基因工程化免疫細胞。
[0196]
實施例70：根據實施例62至64或66至69中任一項所述的方法，其中所述i型nkt細胞包括大部分的所述基因工程化cd62l陽性的i型nkt細胞。
[0197]
實施例71：一種用於治療癌症的方法，所述方法包括向有此需要的受試者施用基因工程化免疫細胞的步驟，所述基因工程化免疫細胞包括與硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)結合的嵌合抗原受體(car)，所述car包括胞外域序列；跨膜結構域序列；和胞內域序列，所述胞外域序列包括：可變輕鏈序列和可變重鏈序列，所述可變輕鏈序列包括seq id no:1-3所示的輕鏈互補決定區(「lcdr」)lcdr1至lcdr3序列以及選自由seq id no:153至221組成的群組的輕鏈框架序列1(vl-fr1)；選自由seq id no:222至225組成的群組的輕鏈框架序列2(vl-fr2)；選自由seq id no:226至249組成的群組的輕鏈框架序列3(vl-fr3)；和選自由seq id no:250至255組成的群組的輕鏈框架序列4(vl-fr4)；所述可變重鏈序列包括seq id no:4至6所示的重鏈互補決定區(「hcdr」)hcdr1至hcdr3序列以及選自由seq id no:256至349組成的群組的重鏈框架序列1(vh-fr1)；選自由seq id no:350至353組成的群組的重鏈框架序列2(vh-fr2)；選自由seq id no:354至360組成的群組的重鏈框架序列3(vh-fr3)；和選自由seq id no:361至382組成的群組的重鏈框架序列4(vh-fr4)。
[0198]
實施例72：根據實施例71所述的方法，其中所述癌症選自由黑色素瘤、轉移性黑色素瘤疾病[淺表擴散性黑色素瘤、惡性雀斑樣痣、惡性雀斑樣痣黑素瘤、肢端雀斑樣黑色素瘤和結節性黑色素瘤]；膠質母細胞瘤、未分化甲狀腺癌、軟組織肉瘤、膠質瘤和白血病組成的群組。
[0199]
實施例73：根據實施例71或72所述的用於治療癌症的方法，其中所述基因工程化免疫細胞是自然殺傷t(nkt)細胞、t細胞或自然殺傷(nk)細胞。
[0200]
實施例74：根據實施例71至73中任一項所述的用於治療癌症的方法，其中所述基因工程化免疫細胞是t細胞。
[0201]
實施例75：根據實施例71、72或73中任一項所述的用於治療癌症的方法，其中所述基因工程化免疫細胞是nkt細胞。
[0202]
實施例76：根據實施例71、72或75中任一項所述的用於治療癌症的方法，其中所述nkt細胞是i型nkt細胞。
[0203]
實施例77：根據實施例71、72、75或76中任一項所述的用於治療癌症的方法，其中所述i型nkt細胞是cd62l陽性的i型nkt細胞。
[0204]
實施例78：根據實施例71、72或75至77中任一項所述的用於治療癌症的方法，其中
所述i型nkt細胞包括大部分的所述基因工程化免疫細胞。
[0205]
實施例79：根據實施例71、72或75至78中任一項所述的用於治療癌症的方法，其中所述i型nkt細胞包括大部分的所述基因工程化cd62l陽性的i型nkt細胞。
[0206]
實施例80：一種試劑盒，所述試劑盒包括載體、宿主細胞或其組合，所述試劑盒包括編碼嵌合抗原受體(car)編碼序列的核酸序列，所述編碼序列包括胞外域序列；跨膜結構域序列；和胞內域序列，所述胞外域序列包括與硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)結合的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包括可變輕鏈序列和可變重鏈序列，所述可變輕鏈序列包括seq id no:1-3所示的輕鏈互補決定區(「lcdr」)lcdr1至lcdr3序列以及選自由seq id no:153至221組成的群組的輕鏈框架序列1(vl-fr1)；選自由seq id no:222至225組成的群組的輕鏈框架序列2(vl-fr2)；選自由seq id no:226至249組成的群組的輕鏈框架序列3(vl-fr3)；和選自由seq id no:250至255組成的群組的輕鏈框架序列4(vl-fr4)；所述可變重鏈序列包括seq id no:4至6所示的重鏈互補決定區(「hcdr」)hcdr1至hcdr3序列以及選自由seq id no:256至349組成的群組的重鏈框架序列1(vh-fr1)；選自由seq id no:350至353組成的群組的重鏈框架序列2(vh-fr2)；選自由seq id no:354至360組成的群組的重鏈框架序列3(vh-fr3)；和選自由seq id no:361至382組成的群組的重鏈框架序列4(vh-fr4)。
[0207]
實施例81：一種在表達嵌合抗原受體(car)編碼序列的nkt細胞中維持nkt細胞擴增潛力的方法，所述編碼序列包括胞外域序列；跨膜結構域序列；和胞內域序列，所述胞外域序列包括與硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)結合的抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包括seq id no:1-3所示的輕鏈互補決定區(「lcdr」)lcdr1至lcdr3序列以及選自由seq id no:153至221組成的群組的輕鏈框架序列1(vl-fr1)；選自由seq id no:222至225組成的群組的輕鏈框架序列2(vl-fr2)；選自由seq id no:226至249組成的群組的輕鏈框架序列3(vl-fr3)；和選自由seq id no:250至255組成的群組的輕鏈框架序列4(vl-fr4)；可變重鏈序列，所述可變重鏈序列包括seq id no:4至6所示的重鏈互補決定區(「hcdr」)hcdr1至hcdr3序列以及選自由seq id no:256至349組成的群組的重鏈框架序列1(vh-fr1)；選自由seq id no:350至353組成的群組的重鏈框架序列2(vh-fr2)；選自由seq id no:354至360組成的群組的重鏈框架序列3(vh-fr3)；和選自由seq id no:361至382組成的群組的重鏈框架序列4(vh-fr4)；所述方法包括表達包括wnt信號傳導途徑中轉錄激活因子的蛋白編碼序列，和培養所述工程化nkt細胞以製備具有持續擴增潛力的基因工程化nkt細胞群。
[0208]
實施例82：一種減少小鼠模型中scfv強直信號傳導的方法，所述方法包括：識別當作為car的一部分在小鼠免疫細胞中表達時具有強直信號傳導的scfv；生成所述scfv的結構模型，和進行計算誘變以製備一系列誘變的scfv；計算所述誘變的scfv的自由能，將所述誘變的scfv與包括框架1.4(fw1.4)的人源化scfv進行比對，從而識別關鍵的鼠殘基；以及引入一個或多個人到小鼠殘基變化，以增加所述scfv的穩定性和製備用於小鼠模型的經修飾的人源化scfv。
[0209]
實施例83：根據實施例82所述的減少小鼠模型中scfv強直信號傳導的方法，其中fw1.4包括seq id no:7至10的輕鏈框架區(vl-fr)1至4，seq id no:11的接頭區，和seq id no:12至15的重鏈框架區(vh-fr)1至4。
[0210]
實施例84：根據實施例82或83所述的減少小鼠模型中scfv強直信號傳導的方法，其中所述經修飾的人源化scfv包括經修飾的選自由seq id no:16至27組成的群組的經修飾fr區。
[0211]
實施例85：根據實施例82至84中任一項所述的減少小鼠模型中scfv強直信號傳導的方法，其中所述免疫細胞是自然殺傷t(nkt)細胞、t細胞或自然殺傷(nk)細胞。
[0212]
實施例86：根據實施例82至85中任一項所述的減少小鼠模型中scfv強直信號傳導的方法，其中所述免疫細胞是t細胞。
[0213]
實施例87：根據實施例82至85中任一項所述的減少小鼠模型中scfv強直信號傳導的方法，其中所述免疫細胞是nkt細胞。
[0214]
實施例88：根據實施例82至85或87中任一項所述的減少小鼠模型中scfv強直信號傳導的方法，其中所述nkt細胞是i型nkt細胞。
[0215]
實施例89：根據實施例82至85、87或88中任一項所述的減少小鼠模型中scfv強直信號傳導的方法，其中所述i型nkt細胞是cd62l陽性的i型nkt細胞。
[0216]
實例：
[0217]
細胞系。腫瘤細胞系wm115(黑色素瘤)和sk-mel-2獲自美國典型培養物保藏中心(atcc)(crl-1675)。m14細胞由ferrone博士提供。腫瘤細胞系mda-mb-468和mda-mb-231獲自德國微生物及細胞保藏中心gmbh(acc 738和acc 732)。用於生產逆轉錄病毒載體的293t細胞獲自atcc。在含有5％ co2的溼潤氣氛中，在37℃下，用適當培養基(rpmi-1640(吉畢科公司(gibco))或dmem(吉畢科公司))將所有細胞維持培養，該培養基補充有10％ fbs(希格瑪公司(sigma))、1％ l-穀氨醯胺(吉畢科公司)和1％青黴素/鏈黴素(吉畢科公司)。用編碼螢火蟲螢光素酶基因和融合蛋白增強型gfp(egfp-ffluc)的sfgγ逆轉錄病毒載體轉導wm115細胞。參見hoyos等人，「用白細胞介素15和自殺基因工程化cd19特異性t淋巴細胞，以增強其抗淋巴瘤/白血病的效果和安全性」，《白血病(leukemia)》24:1160-1170(2010)。使細胞保持培養低於6個連續月，之後使用來自原擴增小瓶的等分試樣。常規測試所有腫瘤細胞系以排除支原體汙染，並通過流式細胞術評估轉基因和腫瘤標誌物的表達以確認身份。如前所述生成膠質母細胞瘤衍生的神經球。參見pellegatta等人，「膠質母細胞瘤和神經球中硫酸軟骨素蛋白多糖4的組成型和tnfα誘導型表達：對car-t細胞療法的影響」，《科學轉化醫學(sci.transl.med.)》10(2018)(「pellegatta等人，(2018)」)。
[0218]
逆轉錄病毒上清液的生成、t細胞的分離、轉導和體外擴增。逆轉錄病毒上清液通過對293t細胞的瞬時轉染製備並用於轉導t細胞。參見diaconu等人，「誘導型胱天蛋白酶-9選擇性地調節cd19特異性嵌合抗原受體修飾的t細胞的毒性」，《分子治療學(mol.ther.)》25:580-592(2017)(「diaconu等人2017」)。健康志願獻血者的血沉棕黃層(buffy coat)購自墨西哥灣沿岸地區血液中心(gulf coast regional blood center)(德克薩斯州休斯頓)。根據製造商的方案，通過lymphoprep(精確化學和科學公司(accurate chemical and scientific corporation))密度梯度離心法分離外周血單核細胞(pbmc)。t細胞在由以下組成的完全培養基中培養：45％ click's培養基(爾灣科學公司(irvine scientific)、45％ rpmi-1640(海克隆公司(hyclone))、10％ fbs(海克隆公司)、1％ l-穀氨醯胺(吉畢科公司)和1％青黴素/鏈黴素(吉畢科公司)。在含有il7(10ng/ml，派普泰克(peprotech))和il15(5ng/ml，派普泰克)的完全培養基中將t細胞激活、轉導並擴增，如先前所報導的。參
見diaconu等人2017。
[0219]
免疫表型。t細胞用來自bd生物科學公司(bd biosciences)的針對cd3(apc-h7，克隆sk7)、cd45ra(pe，克隆hi100)、ccr7(fitc，克隆150503)、ctla4(bv421，克隆bni3)、pd-1(pe-cy7，克隆eh12.1)、lag3(pe，克隆t47-530)、tim3(bv711，克隆7d3)和cd45(apc，克隆2d1)的抗體(ab)染色。抗cd45(percp，克隆rea747)和抗cd69(apc，克隆rea824)來自美天旎生物公司(miltenyi biotec)的reaffinity。腫瘤細胞用來自bd生物科學公司的針對cd276(bv421，克隆7-517)的ab和763.74mab(抗cspg4)染色，然後用來自bd生物科學公司的大鼠抗小鼠igg1二抗(pe，克隆x56)染色。763.74(a)和(b)car的表達使用抗獨特型抗體評估，ctr car(抗cd19 car)的表達使用抗獨特型抗體(獲自ferrone博士)評估，然後用來自bd生物科學公司的大鼠抗小鼠igg1二抗(pe，克隆x56)染色。表達h763.74 car後，用英傑公司(invitrogen)的鏈黴親和素蛋白rpe綴合物進行染色。數據採集在bd lsrfortessa或canto ii流式細胞儀上使用bd facs-diva軟體或在macsquant(美天旎生物公司)上進行。數據分析用flowjo軟體(版本9或10)或flowlogic軟體(版本7.2，美天旎生物公司)進行。
[0220]
共聚焦顯微鏡。根據製造商的說明(abcam免疫螢光方案)製備t細胞。簡言之，car-gfp
+
細胞用cytofix緩衝液(bd生物科學公司)固定，並用一滴含dapi的prolong diamond抗淬滅封片劑(英傑公司)安裝在蓋玻片上。數據採集在lsm700 zeiss共聚焦顯微鏡上使用zen軟體(zeiss顯微鏡)進行。數據分析用fiji軟體進行。
[0221]
共培養實驗和elisa。對於自發的ifnγ釋放測定，在2ml不含細胞因子的完全培養基中將1
×
106個t細胞置於24孔板中。在不含細胞因子的完全培養基中，以1:5的效靶(e:t)比在24孔板中共培養t細胞(2
×
104個細胞/孔)與腫瘤細胞系(m14-wt或wm115；105個細胞/孔)。培養5天後，收穫細胞並對cd3(apc-h7，克隆sk7，來自bd生物科學公司)和cd276(bv421，克隆7-517，來自bd生物科學公司)單克隆抗體(mab)染色，以分別檢測t細胞和腫瘤細胞。參見landoni等人，「高親和力的t細胞受體使自然殺傷t細胞特異性重定向並超越內源性不變t細胞受體」，《癌症免疫研究》8:57-69(2020)。通過流式細胞術計算培養物中殘留的腫瘤細胞的百分比。培養24小時後收穫自發釋放和培養上清液，用duoset人ifnγelisa試劑盒(安迪生物公司(rd systems))測量100ml上清液中的ifnγ。數據採集在synergy2酶標儀(美國寶特(biotek))上使用gen5軟體進行。在不含血清但含b27補充劑的gbm-ns培養基中，以1:5的e:t比將gbm-ns(5
×
105個細胞)與t細胞一起鋪板於24孔板中。將t細胞在gbm-ns培養基中維持3天後，然後鋪板共培養物。參見pellegatta等人(2018)。在共培養2、4、6和24小時後的不同時間點收集gbm-ns和t細胞，並通過流式細胞術分別根據cspg4和cd45的表達測量殘留的腫瘤細胞和t細胞。car-t細胞的激活通過評價cd69的表達來測量。
[0222]
計算分析。為了生成scfv的3d構象，針對rcsb資料庫對scfv的主序列進行blast搜索，以識別具有高序列相似性的同源模板結構。blastp分析識別scfv片段1696為潛在的模板，解析度為序列同一性為70.51％。參見rezacova等人，「單克隆抗體抑制hiv-1和hiv-2蛋白酶的結構基礎」，《結構(structure.)》9:887-895(2001)(「rezacova等人，(2001)」)。scfv片段1696(pdb id：1jp5)的晶體結構用作模板以通過同源建模對scfv進行建模。同上。使用modeller-9v19生成四十個模型，並選擇分子目標函數得分最小的結構作為scfv的代表構象。參見webb和sali，「使用modeller進行比較蛋白質結構建模」，《當前蛋白質科學方案(curr.protoc.protein sci.)》86:2(2016)。由於立體衝突在建模的和低分
辨率的結構中是常見的，因此採用chiron來優化scfv的結構。參見kota等人，「gaia：蛋白質結構模型的自動質量評估」，《生物信息(bioinformatics.)》27:2209-2215(2011)。chiron通過對蛋白質結構進行短dmd模擬來解決原子衝突，其中對骨架的擾動最小或無擾動。參見ding等人，「用全原子離散分子動力學進行蛋白質的從頭摺疊」，《結構》16:1010-1018(2008)；shirvanyants等人，「離散分子動力學：用於精細蛋白質表徵的高效和通用型模擬方法」，《物理化學雜誌(j phys.chem.)》b 116:8375-8382(2012)；和dokholyan等人，「蛋白質類模型摺疊的離散分子動力學研究」，《摺疊描述(fold.des)》3:577-587(1998)。隨後考慮將鬆弛的scfv1結構用於使用eris分子套件的電子誘變研究。參見yin等人，「eris：蛋白質穩定性的自動估計器」，《自然方法(nat.methods)》4:466-467(2007)。eris方案誘導蛋白質的突變，並估計突變體(δg
mut
)和野生型(δg
wt
)構象的自由能。eris使用monte-carlo算法在突變位點周圍進行快速的側鏈重新包裝和骨架鬆弛，隨後使用medusa力場評價δg
wt
和δg
mut
。參見同上；和yin等人，「medusascore：準確的基於力場的虛擬藥物篩選的評分函數」，《化學信息與建模雜誌(j chem.inf.model.)》48:1656-1662(2008)。eris算法通過採用下式計算蛋白質突變後的自由能變化。δδg
mut
＝δg
mut-δg
wt
。評價δδg
mut
值以估計穩定化(δδg
mut
《0)或去穩定(δδg
mut
》0)突變。eris得到了廣泛的驗證，並被用於設計新型蛋白質。參見zhu等人，「合理設計的碳水化合物封閉的表位引發hiv-1env特異性抗體」，《自然通訊(nat.commun.)》10:948(2019)；dagliyan等人，「工程化外在病症以控制活細胞中的蛋白質活性」，《科學(science)》354:1441-1444(2016)；和dagliyan等人，「配體控制的蛋白質構象轉換的合理設計」，《美國國家科學院院刊》110:6800-6804(2013)。
[0223]
異種移植模型。黑色素瘤小鼠實驗按照unc動物飼養和機構動物護理和使用委員會(iacuc)指南進行，並得到unc iacuc(id：17029)的批准。gbm小鼠實驗根據義大利實驗動物護理原則(d.lgs.26/2014)和歐盟理事會指示(86/609/eec和2010/63/ue)，按照米蘭的fondazione irccs istituto neurologico carlo besta的指示進行。對於黑色素瘤模型，向雌性和雄性nsg小鼠(7-9周齡，獲自unc動物中心)皮下(s.c.)注射0.5
×
106個egfp-ffluc標記的wm115腫瘤細胞。腫瘤細胞注射後七天(第0天)，向小鼠i.v.注射5
×
106個car-t細胞。每周用卡尺測量s.c.腫瘤，並使用ivis動力學體內成像系統(珀金埃爾默(perkinelmer))通過生物發光(bli；總流量，光子/秒)來監測黑色素瘤腫瘤細胞生長。根據unc指南，將腫瘤生長或出現不適跡象的小鼠處死。當處死小鼠後，從在細胞過濾器上粉碎的心臟、脾和肝收集外周血，並用2ml pbs洗滌。分析外周血、脾和肝以通過流式細胞術使用countbright絕對計數珠(英傑公司)檢測t細胞的存在[用針對cd3(apc-h7，克隆sk7)、cd45(apc，克隆2d1)、pd-1(pe/cy7，克隆eh12.1)和car特異性抗獨特型的抗體染色]。對於gbm模型，使用移植有gbm-ns的裸鼠來評價car-t細胞的抗腫瘤活性。向5至6周齡小鼠以2μl pbs1x尾狀核內(i.c.)注射0.1
×
106個gbm-ns。相對於前囟，坐標為後0.7mm，左側3mm，深3.5mm，並在尾狀核內。腫瘤細胞注射後第15天，使用相同的腫瘤坐標，以5μl pbs1x i.c.注射car-t細胞。對於存活研究，每周對小鼠進行三次監測，並且根據機構指南在出現不適症狀時對其進行安樂死。
[0224]
磁共振成像(mri)。mri使用水平孔徑的臨床前掃描儀(biospec 70/20usr，布魯克公司(bruker)，埃特林根，德國)進行。系統的磁場強度為7t(1h頻率300mhz)，並且孔徑為20cm。掃描儀配備有主動屏蔽的梯度系統，其集成墊片設置為二階。最大梯度幅值為440mt/
m。所有的採集都使用交叉線圈配置進行：72mm線性鳥籠線圈用於射頻激發，並且小鼠腦表面線圈接收信號。用1.5％-2％的異氟烷(60:40n2o:o2(vol:vol)，流速0.8l/min)對小鼠進行麻醉。為了檢測研究期間的麻醉深度和動物健康狀況，用氣動傳感器監測呼吸頻率。將小鼠安置在配備有氣體麻醉用鼻錐和三點固定系統(牙棒和耳塞)的動物床上。用gbm-ns注射和用car-t細胞治療的小鼠在不同的時間點接受高解析度的mri調查，方案如下：在腹膜內施用釓基造影劑之前和之後獲取t2加權快速採集回波減少(rare)序列(tr＝3360ms，te＝35ms，面內解析度＝100
×
100um2，片厚＝400um，4個平均值，總採集時間為5分36秒)和兩個t1加權rare序列(tr＝510ms，te＝8ms，面內解析度＝78
×
78um2，片厚＝400um，6個平均值，總採集時間為9分47秒)。所有的序列都沿著相同的冠狀幾何圖形(400um厚的連續切片)獲得，切片包在嗅球的後方和小腦的前方。造影劑引起的t1信號增強被解釋為是由於血腦屏障病變引起的。
[0225]
scfv 763.74(a)的人源化。鼠scfv 763.74(a)的人源化通過將其cdr移植到穩定的人框架rfw1.4中進行。參見borras等人，「從兔單克隆抗體中生成穩定的人源化單鏈fv片段的通用方法」，《生物化學雜誌》285:9054-9066(2010)。fw(在此稱為rfw1.4)的序列如下：
[0226]
eivmtqspstlsasvgdrviitc(seq id no:7)*lcdr1*
[0227]
wyqqkpgkapklliy(seq id no:8)*lcdr2*
[0228]
gvpsrfsgsgsgteftltisslqpddfatyyc(seq id no:9)*lcdr3*
[0229]
fgqgtkltvlg(seq id no:10)
[0230]
(ggggsggggsggggsggggs)(seq id no:11)
[0231]
evqlvesggglvqpggslrlsctasg(seq id no:12)*hcdr1*
[0232]
wvrqapgkglewvg(seq id no:13)*hcdr2*
[0233]
rftisrdtskntvylqmnslraedtavyycar(seq id no:14)*hcdr3*
[0234]
wgqgtlvtvss(seq id no:15)。
[0235]
星號將框架的胺基酸序列與cdr序列分開。由(gly4ser)4組成的多肽接頭用於連接v
l
和vh鏈並在圓括號中顯示。763.74(a)的人源化版本通過用關鍵的鼠殘基替代人框架殘基來設計。參見yin,s.、ding,f.和dokholyan,n.v.2007。eris：蛋白質穩定性的自動估計器。《自然方法》4:466-467。
[0236]
scfv片段的表達和純化。使用相應的表達質粒轉化的大腸桿菌bl21(de3)在含有適當抗生素的lb培養基中於37℃下生長。在吸光度(a600)為1的情況下，通過加入1mm的異丙基-1-硫代-β-d半乳糖吡喃糖苷來啟動蛋白質表達。誘導後四小時，收穫大腸桿菌細胞並通過超聲處理破壞。包涵體通過反覆洗滌和離心步驟分離，並在6m鹽酸胍的存在下以10mg/ml的濃度溶解。通過加入20mm的二硫蘇糖醇來減少溶解的包涵體。重摺疊在重摺疊緩衝液(4m尿素，50mm甘氨酸，2mm胱氨酸，2mm半胱氨酸ph 10.0)中在室溫下過夜進行。以10kda為截止值，使用切向流過濾進行濃度提升和緩衝液交換後，使用疏水相互作用色譜法，然後使用尺寸排除色譜法純化scfv。
[0237]
scfv的結合研究。通過流式細胞術使用cspg4
+
mda-mb-231和cspg4-mda-mb-468細胞進行結合研究。使細胞與各自的scfv、生物素化的蛋白l以及最後與鏈黴親和素-藻紅蛋白一起孵育。在facsaria iii(bd生物科學公司)儀器上使用facsdiva軟體採集細胞。
[0238]
scfv的穩定性。在pbs ph-7.2中以1mg/ml配製人源化scfv。在4℃或37℃下儲存48
小時後，對樣品進行目測檢查，並在280nm處測量蛋白質濃度。通過sec-hplc分析樣品以確定單體、二聚體和高分子量低聚體就總峰面積而言的百分比。使用tskgel g2000 swxl柱，二醇相，l
×
i.d.30cm
×
7.8mm，5μm粒徑(西格瑪奧德裡奇(sigma-aldrich)，08540)進行尺寸排除色譜法。以1mg/ml裝入五(5)μl的scfv。流動相為pbs ph 7.2.
[0239]
統計分析。數據總結為平均值
±
sd。使用學生t檢驗或雙因素方差分析來確定治療組之間的統計學上的顯著差異，適當時採用bonferroni的多重比較校正(prism6:graphpad軟體)。使用kaplan-meier方法進行存活分析，並應用mantel-cox對數秩檢驗(prism 6:graphpad軟體)。所有小於0.05的p值都被認為是統計上顯著的。
[0240]
結果：
[0241]
scfv的框架工作區(fwr)內的胺基酸取代廢除了car強直信號傳導。car靶向硫酸軟骨素蛋白多糖4(cspg4)抗原，其中抗原結合部分是獲自在體外和體內均表達cspg4的763.74鼠單克隆抗體(mab)靶向腫瘤細胞的scfv 763.74(a)。參見pellegatta等人，(2018)和geldres等人，「針對硫酸軟骨素蛋白多糖4重定向的t淋巴細胞在體外和體內均控制多種實體瘤的生長」，《臨床癌症研究》20:962-971(2014)。然而，表達編碼cd28或4-1bb共刺激胞內域的scfv 763.74(a)car(圖1a)的t細胞在沒有抗原刺激的情況下顯示出ifnγ的釋放，這一現象被定義為car強直信號傳導(圖1b)。參見long等人(2015)。表達scfv 763.74(a)car的t細胞的自發ifnγ釋放嚴格依賴於car信號傳導，因為阻止酪氨酸磷酸化的car-cd3γ鏈的免疫受體酪氨酸激活基序(itam)的酪氨酸突變完全廢除了自發的ifnγ釋放(圖1c和圖7a、b)。為了研究car分子在t細胞的細胞表面上的分布，生成了scfv 763.74(a)car，其中car的cd3ζ鏈在cooh末端與gfp融合。使用共聚焦顯微鏡成像，scfv 763.74(a)car顯示在沒有car交聯的情況下形成膜簇，可能表明car分子的自我聚集(圖1d)。scfv 763.74(a)的序列獲自分泌鼠igg1 mab的雜交瘤763.74的早期代次，其識別人cspg4的肽表位。參見reinhold等人，「受體移植的t細胞對黑色素瘤細胞的特異性裂解被針對受體scfv結構域的抗獨特型單克隆抗體所增強」，《調查性皮膚病學雜誌(j invest dermatol.)》112:744-750(1999)。眾所周知，雜交瘤的培養傳代會影響雜交瘤的生長速度和分泌抗體的產量。參見correa等人，「傳代數對分泌mrsa抗pbp2a單克隆抗體的雜交瘤的生長和生產力的影響」，《細胞技術學(cytotechnology)》68:419-427(2016)。還描述了在培養傳代過程中，從雜交瘤衍生出來的亞克隆中的cdr和fwr都可能發生胺基酸取代。參見xin和cutler，「體外雜交瘤傳代可能導致甘露聚糖結合凝集素抗體對傳播性念珠菌病的預防能力下降」，《感染與免疫(infect.immun.)》74:4310-4321(2006)。鑑於這種可能性，對763.74雜交瘤的後期代次的v
l
和vh結構域進行測序。我們得到了兩個v
l
和vh序列，其中在v
l
和vh兩者的fwr(fr1和fr3)中均識別到胺基酸取代(圖2a)。組裝新的scfv，稱為scfv 763.74(b)，生成新的scfv 763.74(b)car，並將得到的序列與scfv 763.74(a)car進行並行比較，以獲得強直信號傳導的證據。所有的car在t細胞中同樣表達(圖2b和圖8a)，並且car-t細胞在體外同樣擴增(圖8b)。然而，表達編碼cd28或4-1bb共刺激胞內域的scfv 763.74(b)car的t細胞沒有顯示出ifnγ的自發釋放(圖2c)。使用gfp標記的car的共聚焦顯微鏡觀察到scfv 763.74(b)car在t細胞膜上更均勻地分布(圖1d和圖8c)。值得注意的是，無論表達的scfv類型如何，由抗獨特型mab(mk2-23 mab)介導的在t細胞中表達的car交聯都會引起car分子的顯著簇形成，進一步表明共聚焦顯微鏡識別的簇真正反映了car聚集體的形成(圖8d)。對表達scfv 763.74
(a)car或scfv 763.74(b)car的t細胞的表型分析沒有顯示記憶和耗竭標誌物表達的差異，表明在製造用於臨床使用的car-t細胞通常需要的10-14天的培養期間，強直信號傳導可能不會誘發耗竭表型(圖8e、f)。參見ramos等人，「靶向惡性腫瘤相關的κ輕鏈的t淋巴細胞的臨床反應」，《臨床研究雜誌(j.clin.invest)》126:2588-2596(2016)；ramos等人，「cd30特異性嵌合抗原受體重定向的淋巴細胞後的臨床和免疫學反應」，《臨床研究雜誌》127:3462-3471(2017)。總的來說，這些數據表明，scfv抗體的fwr內的胺基酸取代足以導致car形式的scfv的自我聚集和定義為ifnγ的基礎釋放的t細胞中的強直信號傳導。
[0242]
scfv的fwr內的胺基酸取代會導致蛋白質去穩定化。為了研究scfv 763.74(a)和scfv 763.74(b)之間的胺基酸差異是否會導致scfv去穩定化，通過同源建模生成scfv 763.74(b)的3d構象，並對結構進行優化以供電子誘變(圖3a)。eris工具被用來描述fwr突變、l3k、t5s、a9s、e83q、i123v、q124k、v126k、q127e和l230v對scfv 763.74(b)結構的影響。eris估計上述突變的δδg
mut
分別為2.41、1.26、2.29、0.47、0.79、1.87、4.58、2.70和0.67kcal/mol(圖3b)。具體地，該突變使scfv 763.74(a)結構去穩定化(δδg
mut
》0)，隨後影響car的自發聚集。此外，為了交叉驗證scfv 763.74(b)的結構構象，進行eris分析以識別fwr突變位點的穩定化突變(δδg
mut
《0)。分析表明，突變如e83l、e83i、t5m和q124m導致了負的δδg
mut
，說明它們具有潛在的穩定能力(圖9)。此外，殘基如i123和q127被識別為scfv 763.74(b)結構穩定性的關鍵。在i123或q127位置取代其他19個胺基酸中的任何一個，都會極大地使scfv 763.74(b)結構去穩定化(δδg》0)，從而影響蛋白質的聚集(圖3c)。總的來說，這些數據表明，scfv mab的frw內的胺基酸取代會使蛋白質去穩定化並導致scfv的自我聚集，並且計算引導的分析可以用來穩定蛋白質結構。
[0243]
scfv的fwr內的胺基酸取代增強了car-t細胞的功能。scfv的fwr內的胺基酸取代的作用影響car-t細胞對黑色素瘤細胞系wm115(cspg4+)和m14(cspg4-)的抗腫瘤活性(圖10a)。與ifnγ的自發釋放同時，當car-t細胞和腫瘤細胞以1比5的比例鋪板時，在第4天共培養結束時，表達具有4-1bb的763.74(a)car的t細胞顯示出體外消除腫瘤細胞的能力受到影響(殘留腫瘤細胞43.6％
±
26.0％)(圖4a、b)。相比之下，cd28共刺激似乎使763.74(a)car和763.74(b)car完全消除腫瘤(殘留的腫瘤細胞分別為2.2％
±
2.7％和2.9％
±
2.6％)。值得注意的是，與表達具有4-1bb的763.74(a)car的t細胞相比，表達具有4-1bb共刺激的763.74(b)car的t細胞顯示出改善的抗腫瘤效果，但並沒有完全消除腫瘤細胞(殘留的腫瘤細胞分別為14.1％
±
8.0％和43.6％
±
26.0％)(圖4a、b)。car-t細胞沒有消除缺乏cspg4表達的黑色素瘤細胞系m14，表明抗原特異性不受fwr內胺基酸取代的影響。值得注意的是，只有表達763.74(b)car的t細胞在含wm115腫瘤細胞的培養上清液中持續釋放可檢測量的th1細胞因子(圖10b)。使用egfp-ffluc wm115異種nsg小鼠模型，763.74(b)car-t細胞的優越抗腫瘤效果在體內更加明顯(圖4c)。表達具有cd28的763.74(b)car的t細胞表現出最突出的以腫瘤生物發光(圖4d和圖10c)和腫瘤大小(圖4e)形式測量的抗腫瘤效果。表達763.74(b)car的car-t細胞的增強功能在我們先前描述的膠質母細胞瘤(gbm)腫瘤模型中得到了證實，其中裸鼠的大腦中移植了原發性gbm衍生的神經球(gbm-ns)，並通過car-t細胞的瘤內接種進行治療。參見pellegatta等人，「膠質母細胞瘤和神經球中硫酸軟骨素蛋白多糖4的組成型和tnfα誘導型表達：對car-t細胞療法的影響」，《科學轉化醫學》10(2018)(「pellegatta等人2018」)；參見圖5a。在這個模型中，通過磁共振成像(mri)監測腫瘤移植
和進展。在用對照t細胞或表達編碼cd28的763.74(a)car的t細胞治療的小鼠中，觀察到快速的腫瘤進展，並且在這些動物中，腫瘤塊佔據了整個半球並滲透到對側半球(圖5b、c)。用表達編碼cd28的763.74(b)car的t細胞治療的小鼠顯示出最明顯的抗腫瘤效果，這表現為更小和更受限的病變(圖5d)，但用表達編碼4-1bb的763.74(a)car或763.74(b)car的t細胞治療的小鼠也能觀察到腫瘤控制，即使抗腫瘤效果不太明顯(圖5e、f)。與使用對照t細胞治療的小鼠相比，表達編碼4-1bb的763.74(a)car或763.74(b)car的t細胞延長了存活(p《0.0001)。然而，表達編碼cd28的763.74(b)car的t細胞對延長存活最為有效(與ctr相比，p《0.0001；與具有4-1bb的763.74(a)相比，p＝0.04；與具有4-1bb的763.74(b)相比，p＝0.01)。觀察到表達編碼cd28的763.74(a)car的t細胞的適度活性，因為沒有小鼠存活超過110天。pellegatta等人2018(圖5g)。為了進一步表徵表達編碼cd28的763.74(b)car的t細胞在該gbm模型中的顯著抗腫瘤作用，研究了緊接顱內輸注後的t細胞的激活狀態。在car-t細胞輸注後的2、4、6、12、24和48小時，移植腫瘤塊。觀察到表達具有cd28的763.74(b)car的t細胞在接種後2小時內上調了cd69(42.5
±
2.1％的cd69
+ t細胞)，並在24小時內保持高cd69水平(22.5
±
1.5％的cd69
+
t細胞)，這與先前表明編碼cd28胞內域的car-t細胞快速活躍的報告一致。參見zhao等人「工程化共刺激的結構設計決定了腫瘤排斥動力學和car t細胞的持久性」《癌細胞》28:415-428(2015)；sun等人2020。(圖5h)。體外的其他實驗進一步證明了表達具有cd28的763.74(b)car的t細胞的快速抗腫瘤作用(圖11)。
[0244]
scfv的fwr的人源化廢除了car強直信號傳導。鼠源scfv的人源化是提出以防止對car的體液和t細胞反應的策略。參見sun等人，「新型人源化her2特異性嵌合受體的構建和評價」，《乳腺癌研究(breast cancer res.)》16:r61(2014)；johnson等人，「用於膠質母細胞瘤的人源化抗egfr變體iii嵌合抗原受體t細胞的合理開發和表徵」，《科學轉化醫學》7:275ra22(2015)。用人fwr取代scfv的鼠fwr可以用來廢除car強直信號傳導。將763.74(a)的序列和穩定的人框架rfw1.4進行比對，並識別關鍵胺基酸。參見ewert等人，「細胞外和細胞內應用的抗體的穩定性改進：cdr移植到穩定框架和基於結構的框架工程化」，《方法(methods)》34:184-199(2004).在第一輪工程化中，設計了一個在rfw1.4序列中沒有突變的cdr移植物和七個在關鍵區域有多達24個突變的變體(圖12a)。單獨的人源化scfv變體(即只有car的細胞外結構域)和野生型鼠scfv在大腸桿菌中表達，重新摺疊並通過尺寸排除色譜法(sec)純化。野生型鼠scfv變體由於聚集而不能重摺疊。因此，我們無法以可溶形式對其進行純化。這一結果進一步表明，鼠763.74(a)scfv是不穩定的。在rfw1.4中沒有突變的人源化變體被表達，但不與cspg4結合。幾乎所有其他人源化scfv變體都被成功表達並能結合cspg4
+
細胞。在接下來的幾輪工程化中，使具有最小的763.74(a)鼠fw殘基數量的人源化變體進一步進行vh和v
l
的鏈改組。共產生了26種人源化scfv。具有最小鼠fwr殘基數量和保留cspg4結合活性的四種人源化scfv(h763.74#2、h763.74#3、h763.74#4和h763.74#5)被選擇用於進一步研究(圖12b)。生成帶有含cd28胞內域的所有四種人源化scfv763.74(a)的car，並與腫瘤細胞進行體外共培養實驗。表達h763.74.car#2和h763.74.car#5的t細胞在體外表現出更好的抗腫瘤活性和更高的ifnγ和il-2產量的趨勢，並被選擇用於進一步研究(圖12c-e)。為了表徵兩種選定的人源化scfv h763.74.car#2和h763.74.car#5(圖13a)，用純化的可溶性scfv進行儲存穩定性研究。蛋白質以1mg/ml製備並在4℃和37℃下儲存48小時。孵育後，通過sec分析樣品以估計單體蛋白的百分比。在測試條件下，沒有觀察到
可檢測到的蛋白質損失，並且單體的百分比保持高於91％-97％(圖13b)。這種方法表明所有四種選定的人源化scfv在測試條件下都是單體的，並且在4℃和37℃下儲存時不會二聚或聚集。h763.74.car#2和h763.74.car#5在t細胞中的表達是充分的(圖6a和圖14a)，並且t細胞沒有顯示出ifnγ的自發釋放(圖6b)。表達h763.74.car#2和h763.74.car#5的t細胞在體外成功地控制了cspg4
+
wm115黑色素瘤細胞的生長(殘留的腫瘤細胞分別為11％
±
15％和10％
±
17％)，同時它們不靶向cspg4-m14黑色素瘤細胞系，表明抗原特異性得到保持(圖6c和圖14b)。表達h763.74.car#2和h763.74.car#5的t細胞的抗腫瘤活性被ifnγ和il-2的具體產量所證實(圖14c)。在異種wm115黑色素瘤小鼠模型中，將表達h763.74.car#2和h763.74.car#5的t細胞與表達編碼cd28胞內域的763.74(b)car的t細胞進行比較(圖6d)。表達h763.74.car#2和h763.74.car#5的t細胞顯示出強大的抗腫瘤活性(圖6e和圖14d)。此外，在不同時間點在治療小鼠的外周血中可以檢測到t細胞(圖14e)，並且在安樂死時在肝和脾中可以檢測到t細胞(圖6f)，並且t細胞保留了car表達(圖6g)。值得注意的是，與具有cd28的763.74(b)car相比，表達h763.74.car#2和h763.74.car#5的t細胞並沒有顯示出pd-1的表達增加(圖14f、g)。總的來說，這些數據表明scfv的人源化可以用來消除car分子的強直信號傳導，從而保持特定的抗腫瘤效果。