鏈黴菌5X4及其作為植物病害生防細菌的用途的製作方法
2024-04-05 07:13:05
本發明涉及植物病害的生物防治，屬於植物保護學科中的生物防治研究與應用領域。
背景技術：
植物病害是制約植物安全生長的主要障礙之一，目前防治方法主要是噴施化學藥劑。由於環境條件適宜，保護地作物病害發生嚴重，頻繁使用化學藥劑存在抗藥性和農藥殘留等風險，研製和使用生物農藥可有效降低化學藥劑的使用量。對植物病原菌具有拮抗作用的微生物是研製生物農藥的主要來源，這類微生物種類繁多、分布廣泛，即使同一種微生物由於分布於不同地區，其拮抗作用強弱或機制也有一定差異。挖掘生防微生物資源，首先是用目標病菌廣泛篩選拮抗菌，這是生物防治研究領域的基礎工作。
對拮抗菌的基礎研究包括拮抗性強弱、抑菌譜、拮抗性能的穩定性、拮抗機理、抗菌物質種類與代謝等。研製生物農藥包括拮抗菌的發酵條件優化、助劑使用、劑型研製等。生物農藥田間應用包括防治病害的最適時間、防治方法、使用劑量與次數等。所有這些都必須建立在獲得拮抗性能較好的生防微生物菌株的基礎上。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一株拮抗性能較好的生防微生物菌株，針對防治保護地作物病害化學藥劑使用量大、次數多、容易引起抗藥性和農藥殘留問題，應減少化學藥劑的使用，增強生物防治措施。本發明中從土壤中篩選獲得鏈黴菌5X4菌株，經前期初步研究，5X4具有較強的拮抗植物病原真菌的能力。對其進一步研究，具有研發新型生物農藥的可能。
本發明公開了一種鏈黴菌(Streptomyces sp.)5X4，其菌株保藏編號為CGMCC No.12605。
本發明所述鏈黴菌5X4其能抑制多種植物病原真菌生長，可用於防治植物病害的生防細菌的用途。
進一步地，所述植物病害是由灰黴病菌、桃枝枯病菌、桃褐腐病菌、油菜菌核病菌和黃瓜枯萎病菌引起的。
5X4菌株是以灰葡萄孢為目標真菌，從土壤中篩選得到。經分子生物學方法鑑定為鏈黴菌(Streptomyces sp.)。5X4能有效抑制草莓灰黴病菌(Botrytis cinerea)的生長，對其它病菌如桃枝枯病菌(Phomopsis amygdali)、桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)和黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)等也有較好的拮抗作用。轉移二十代後測定，其拮抗性能穩定。田間防治草莓灰黴病試驗顯示，該菌株的發酵產物對草莓灰黴病有較好的防治作用，防效明顯優於化學藥劑嘧黴胺和速克靈，防治效果分別提高了25％和30％左右。
附圖說明
圖1為鏈黴菌5X4對草莓灰黴病菌的拮抗效果；
圖2為不同培養時間下鏈黴菌5X4發酵產物對草莓灰黴病菌的抑制作用；
圖3為第2次施用鏈黴菌5X4發酵物10d後田間草莓灰黴病發生情況；
圖4為放線菌5X4基於16S rDNA的系統發育進化樹。
本發明所述5X4菌株於2016年6月12日保存於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，(北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所)，分類命名為鏈黴菌(Streptomyces sp.)，保藏編號為CGMCC No.12605。
具體實施方式
1、菌株分離
(1)分別取不同地區土樣1g，加水製成一定濃度的土壤懸浮液，再進行梯度稀釋103～105倍，取100μl稀釋液塗板，置28℃培養箱中培養48h；
(2)挑取單菌落於高氏一號培養基上進一步劃線培養、純化，並挑取單菌落保存備用。
2、拮抗活性測定
(1)以草莓灰黴病菌為目標真菌，採用對峙培養法測定分離菌株的拮抗性，24℃培養4～5d，測定抑菌帶寬。共從土壤中分離得放線菌174株，其中7株對草莓灰黴病菌具有強拮抗作用(抑菌帶≥1.00cm)，放線菌5X4的抑菌帶寬達1.50cm(表1、圖1)。
表1對草莓灰黴病菌具強拮抗活性的放線菌菌株
(2)選取具最強拮抗活性的菌株5X4，同樣方法測定其拮抗譜，發現其對桃枝枯病菌、桃褐腐病菌、油菜菌核病菌和黃瓜枯萎病菌等植物病原真菌有較強的拮抗作用(表2)；
表2放線菌5X4對不同植物病原真菌的拮抗作用
(3)將獲得菌株在高氏一號培養基上繼代培養5、10、15和20代後，通過對峙培養檢測其對目標菌株拮抗作用的穩定性，結果表明，轉代培養並不影響其拮抗能力，轉管5代、10代、15代和20代後，其對草莓灰黴病菌的抑菌帶寬分別為1.50、1.45、1.53和1.47cm；
(4)分別取培養1、2、4和6d的5X4發酵濾液，加入高氏一號培養基中(V/V＝1/5)，測定其對草莓灰黴病菌生長的抑制作用，以28℃培養4d的發酵液抑菌效果最佳，抑制率達76.30％(圖2)；
3、田間防效測定
(1)將試驗菌株用高氏一號培養液震蕩培養4d，獲得放線菌懸浮液；
(2)選擇果實已發病的草莓生長田塊，除去所有病果，噴施菌液於果實表面；
(3)以防治草莓灰黴病常用藥劑速克靈和嘧黴胺為化學藥劑對照，清水為空白對照。共施藥2次，間隔10d。每小區20m2，3次重複。
(4)第2次施藥10d後，施藥小區草莓灰黴病的嚴重程度與對照相比明顯減輕(圖3)，5X4培養懸浮液的田間防效可達69.11％，比嘧黴胺和速克靈的防效分別高25％和30％左右(表3)。
表3放線菌5X4對草莓灰黴病的田間防效
4、菌株種類鑑定
(1)CTAB法提取細菌基因組；
(2)以提取的基因組DNA為模板，用16S rDNA通用引物16s_63f和16s_1387作為上下遊引物進行PCR擴增，對擴增產物測序；
(3)將測得的序列在GenBank中比對分析，利用Mega軟體構建系統發育進化樹，鑑定其為鏈黴菌(圖4)。