一種基因組dna微陣列晶片及其製備和使用方法
2024-04-05 15:00:05
專利名稱：一種基因組dna微陣列晶片及其製備和使用方法
技術領域：
本發明涉及一種基因組DNA微陣列晶片及其製備和使用方法是將不同的生物個體的基因組DNA經適當的處理後，通過點樣裝置將處理後的DNA固定於經特殊處理的固體基板(如玻璃、矽片、凝膠、塑料、橡膠、陶瓷和微球等)上構成微陣列晶片。該基因組DNA微陣列晶片可包含成百上千個不同個體的基因組DNA，可同時對大量樣本進行突變及單核苷酸多態性(SNP)分析，尋找有生物學功能的或與疾病相關的基因多態位點，發現重要的生物功能和疾病相關基因。該基因組DNA微陣列晶片具有方便、實用、可靠和高通量檢測等特點。
基因突變和多態性的生物學功能研究一般要對大量(數百至數萬)個體的基因組DNA進行分析。目前，突變和單核苷酸多態性檢測方法是採用已有的成熟技術，如DNA測序、限制性酶切長度多態性(RFLP)、單鏈構象多態性(SSCP)和等位基因特異的寡聚核苷酸雜交(ASO)等。這些技術雖然能完成對突變或核苷酸多態性的檢測，但由於它們必須對每一個個體的基因組DNA進行逐個分析和檢測，包括基因組DNA的提取，PCR擴增，測序分析等。不但耗時長、工作量大，而且，還要耗費大量的研究費用。因此，發展可同時用於多個基因組多態性和突變檢測的快速、高效、自動化技術是目前人們追求的目標。
基因晶片是近年來在生命科學領域中迅速發展起來的一項高新技術。所謂基因晶片就是按特定的排列方式固定有大量基因探針(寡核苷酸探針或cDNA探針)的矽片、玻片、塑料片。基因晶片技術是高效地大規模獲取相關生物信息的主要手段。目前，該技術應用領域主要有基因表達譜分析、新基因發現、基因突變及多態性分析、基因組文庫作圖、疾病診斷和預測、藥物篩選、基因測序等。九十年代初以美國為主開始進行的各種生物晶片的研製，不到十年的功夫，晶片技術得以迅速發展，並呈現發展高峰。但在目前的晶片檢測中，樣品的前期處理極為繁瑣(如DNA提取、聚合酶鏈式反應擴增、螢光標記等)。基因晶片技術在基因多態性的研究和檢測方面也受到了人們的關注。例如，美國Affymetrix公司等發展了一種可用於基因組中上千個單核苷酸多態性(SNP)檢測的基因晶片技術，而成為生物晶片行業的領頭雁。但是，目前的生物晶片技術都不能對大量的不同個體的基因組進行同時分析，而只能對某個基因組中多個基因多態位點進行同時進行高通量分析和檢測的微陣列晶片對於功能基因組的研究是十分重要的。
技術方案本發明的核心是怎樣實現基因組DNA的高效率的固定，以及對於固定的基因組DNA進行序列的檢測。本發明提出經適當的限制性內切酶對基因組DNA進行消化形成較短的片段，然後與可溶性高分子聚合物(如多聚賴氨酸等)混合，並通過紫外交聯儀交聯，形成分子刷。最後，通過點樣裝置將交聯後的基因組DNA固定於經特殊處理(如醛基)的固體基板(如玻璃、矽片、凝膠、塑料、橡膠、陶瓷和微球等)上構成微陣列晶片。
一種基因組DNA微陣列晶片，其特徵在於(1)從一組不同生物個體的細胞中分別製備其基因組DNA樣品，(2)分別將這些基因組DNA樣品固定於同一載體的不同位置上，構成基因組DNA微陣列晶片。
一種基因組DNA微陣列晶片製備方法。其特徵在於(1)從細胞中提取出的基因組DNA；(2)基因組DNA通過限制性內切酶消化後得到DNA片段總和作為基因組DNA樣品，且限制性內切酶的識別位點中不包含待測的突變或單核苷酸多態性SNP位點；(3)其基因組DNA樣品中摻入可溶性的高分子聚合物材料形成DNA複合物；(4)將複合物點在載體上製成基因組DNA微陣列晶片。可溶性的高分子聚合物材料採用多聚賴氨酸、聚乙烯醇、聚乙氟亞胺、聚烯丙基亞胺等。固定基因組樣品的載體為固體基板，採用玻璃、矽片、凝膠、塑料、橡膠、陶瓷。製備微陣列晶片所用的載體是經醛基、巰基、氨基特殊基團修飾。
基因組DNA微陣列晶片其使用方法為在微陣列晶片上加入與被檢測基因位點相關DNA探針、進行連接或延伸，實現對某一物種基因組的大量個體樣本差異性分析。根其特徵在於連接採用T4DNA連接酶，在片延伸所採用的是DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)或Taq DNA聚合酶。特徵在於在片延伸所摻入的標記物採用螢光基團或生物素。其特徵在於晶片使用結果檢測採用螢光檢測、化學發光檢測、酶化學法檢測、膠體金檢測。
有益效果本發明是一種製備簡單、結果可靠、使用方便的DNA晶片及其製備和使用方法。應用該基因組DNA微陣列晶片可以在試驗中對成千上萬個體的基因組DNA的某些序列差異進行分析和檢測，從而實現基因多態性檢測的高效率和低成本。通過高分子聚合物(如多聚賴氨酸等)，可以將基因組DNA固定於經特殊處理(如醛基)的固體基板(如玻璃、矽片、凝膠、塑料、橡膠、陶瓷和微球等)上構成微陣列晶片。最後，利用在片延伸技術對突變和單核苷酸多態性進行分析。高分子聚合物(如多聚賴氨酸等)對基因組DNA具有聚合作用。本方法無須聚合酶鏈式反應擴增便可以進行突變和單核苷酸多態性檢測，大大簡化了樣品前期處理的過程。而且該方法製備的基因組DNA微陣列晶片可包含成百上千個不同生物個體的基因組DNA，可同時對大量樣本進行突變和單核苷酸多態性(SNP)分析，尋找有生物學功能的或與疾病相關的基因。目前的任何技術(包括DNA晶片技術)都無法實現這一功能。因此該基因組DNA晶片能被廣泛應用於突變和單核苷酸多態性(SNP)檢測。
圖1為本發明基因組DNA微陣列晶片製備流程圖。
圖2為本發明使用方法中在片延伸流程圖。
圖中1、基因組DNA；2、內切酶酶切後的總的DNA短片段；3、高分子聚合物(如多聚賴氨酸等)；4、載體；5、突變或SNP位點；6、寡聚核苷酸探針；7、螢光或生物素標記物。
參照附圖1，一種基因組DNA微陣列晶片製備方法。具體如下1、提取基因組DNA 1；2、用適當的限制性內切酶酶切基因組DNA 2；3、將酶切後的總的DNA片段與高分子聚合物(如多聚賴氨酸)3混合，並用紫外交聯儀交聯，形成複合物；4、利用點樣裝置將交聯後的基因組DNA複合物固定於經特殊處理(如醛基)的固相載體4固體基板，(如玻離、矽片、凝膠、塑料、橡膠、陶瓷和微球等)構成微陣列晶片。5、在溼潤的環境下，室溫密閉放置過夜。然後，用0.1％的十二烷基硫酸鈉(SDS)去除未結合的交聯複合物，然後用雙蒸水徹底清洗，乾燥，即製備成一種基因組DNA微陣列晶片。
參照附圖2一種基因組DNA微陣列晶片使用方法，具體如下1、根據待測的突變或SNP位點5，合成互補的寡聚核苷酸探針6，將突變或SNP位點設計在3』端；2、將寡聚核苷酸探針與上述微陣列晶片雜交數小時；3、去除未結合的寡聚核苷酸探針，然後用雙蒸水徹底清洗，乾燥後待用；4、利用DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)或Taq DNA聚合酶做在片延伸，在延伸過程中摻入螢光或生物素標記物7。含有突變或SNP位點的樣本就會摻入標記物，相反就不會摻入標記物。通過螢光或其它方法檢測便可以判斷晶片上哪些樣本含有相關的突變或SNP位點。
權利要求
1.一種基因組DNA微陣列晶片，其特徵在於(1)從一組不同生物個體的細胞中分別製備其基因組DNA樣品，(2)分別將這些基因組DNA樣品固定於同一載體的不同位置上，構成基因組DNA微陣列晶片。
2.權利要求1所述的一種基因組DNA微陣列晶片製備方法，其特徵在於(1)從細胞中提取出的基因組DNA；(2)基因組DNA通過限制性內切酶消化後得到DNA片段總和作為基因組DNA樣品，且限制性內切酶的識別位點中不包含待測的突變或單核苷酸多態性SNP位點；(3)其基因組DNA樣品中摻入可溶性的高分子聚合物材料形成DNA複合物；(4)將複合物點在載體上製成基因組DNA微陣列晶片。
3.根據權利要求2所述的一種基因組DNA微陣列晶片及其製備方法，其特徵在於可溶性的高分子聚合物材料採用多聚賴氨酸、聚乙氟亞胺、聚烯丙基亞胺。
4.根據權利要求1和2所述的一種基因組DNA微陣列晶片及其製備方法，其特徵在於製備微陣列晶片的載體為固體基板，採用玻璃、矽片、凝膠、塑料、橡膠、陶瓷、微球。
5.根據權利要求1或2所述的一種基因組DNA微陣列晶片及其製備方法，其特徵在於製備微陣列晶片所用的載體是經醛基、巰基、氨基特殊基團修飾。
6.權利要求1所述的一種基因組DNA微陣列晶片，其使用方法為在微陣列晶片上加入與被檢測基因位點相關DNA探針、通過化學反應進行連接或延伸，實現對某一物種基因組的大量個體樣本差異性分析。
7.根據權利要求5所述的一種基因組DNA微陣列晶片的使用方法，其特徵在於連接反應採用的是T4DNA連接酶，在片延伸所採用的是DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)或TaqDNA聚合酶。
8.根據權利要求5所述的一種基因組DNA微陣列晶片使用方法，其特徵在於在片延伸所摻入的標記物採用螢光基團或生物素。
9.根據權利要求5所述的一種基因組DNA微陣列晶片使用方法，其特徵在於晶片使用結果檢測採用螢光檢測、化學發光檢測、酶化學法檢測、膠體金檢測。
全文摘要
本發明涉及一種基因組DNA微陣列晶片及其製備和使用方法。其特徵(1)從一組不同生物個體的細胞中分別製備其基因組DNA樣品，(2)分別將這些基因組DNA樣品固定於同一載體的不同位置上，構成基因組DNA微陣列晶片。製備方法(1)從細胞中提取出的基因組DNA；(2)基因組DNA通過限制性內切酶消化後得到DNA片段總和作為基因組DNA樣品，且限制性內切酶的識別位點中不包含待測的突變或單核苷酸多態性SNP位點；(3)其基因組DNA樣品中摻入可溶性的高分子聚合物材料形成複合物；(4)將其點在載體上製成晶片。其使用方法為在微陣列晶片上加入與被檢測基因位點相關DNA探針、帶有標記物的核苷酸單體和聚合酶，以基因組的DNA為模板，進行探針的延伸，進行檢測。
文檔編號C12Q1/68GK1438325SQ0311294
公開日2003年8月27日 申請日期2003年3月10日 優先權日2003年3月10日
發明者陸祖宏, 祭美菊, 侯鵬, 何農躍, 李松 申請人:東南大學