一種製備荔枝菌母種的組織分離方法與流程
2024-03-26 19:20:05
本發明屬於生物技術領域，具體涉及一種製備荔枝菌母種的組織分離方法。
背景技術：
荔枝菌(Litchi chinensis Bacterium)是生長在廣東地區荔枝林潮溼白蟻窩上，經過高溫多雨、驟出太陽驟降大雨催谷，迅速生長起來的食用菌，素稱為「菌中之王」。能冠宇如此稱號，是因為荔枝菌兼具肉質細嫩、口感清香、味道鮮甜等獨特風味，加之其對生長環境要求十分苛刻，只生長在荔枝林內潮溼的白蟻窩上，無法人工培植，每年生長周期只有短短20來天，愈加顯得荔枝菌的彌足珍貴。目前有關荔枝菌的研究集中在其菌絲體培養條件的篩選，尚無其母種分離技術的報導，而母種培育制種是實現荔枝菌人工培植的關鍵。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種製備荔枝菌母種的組織分離方法，以期在最大限度保持野生荔枝菌菌株特性的同時獲得高產、優質、抗逆性強、適應性強的荔枝菌菌種，為實現荔枝菌的人工高產栽培奠定基礎。
為實現上述發明目的，本發明採用的技術方案如下：
一種製備荔枝菌母種的組織分離方法，所述方法為選取荔枝菌成熟度為40～45％的幼嫩子實體，去雜，無菌水洗淨後用75～90％乙醇浸泡50～90s，無菌水衝洗3遍，再用3％NaClO、0.1％HgCl2或0.1％2，4－己二烯酸鉀浸泡1.5min，無菌水衝洗3遍，無菌解剖刀輕輕切開子實體，挑取其中大小為0.25～0.35cm3的中間組織接種即得純培養。
在其中一個實施例中，所述子實體為菌柄與菌蓋銜接處、菌蓋、菌褶、菌柄或擔孢子。
在其中一個實施例中，所述中間組織的接種培養基按重量份包括荔枝殼粉50～60份、瓊脂粉20～25份、葡萄糖5～8份、馬鈴薯10～20份、白蟻巢浸提液25～35份。
在其中一個實施例中，所述荔枝殼粉的粒度為60～100目。
在其中一個實施例中，所述培養基還含有濃度為60～90U/ml的鹽酸四環素。
在其中一個實施例中，所述白蟻巢浸提液的提取方法為收集白蟻蟻巢，風乾，以1:1.2～1.5g/ml的比例加入冷水浸泡6～10min，煮沸12～15min後冷卻至室溫，過濾即得白蟻巢浸提液。
組織分離是利用菌體幼嫩的活組織在適宜的培養基和生長條件下由子實體發育階段回復到菌絲生長階段，是獲得純菌種的一種方法，它比孢子培養法簡便，培養時間短，不易汙染雜菌，成活率高，能保持原菌株的特性，遺傳穩定變異小，不僅適於孢子不易收集或萌發的食用菌，也適於穩定優良品種的遺傳性。
與現有技術相比，本發明採用組織分離的方法製備荔枝菌母種，分離全過程均保持無菌操作，結合野生荔枝菌的生長習性同時在培養基中添加適量抗生素，抑制雜菌生長，能最大限度保持野生荔枝菌菌株特性，所獲得的母種菌絲健壯、顏色潔白、生長迅速，為實現荔枝菌的人工高產栽培奠定了產業技術基礎，經濟價值大。
具體實施方式
為使本技術領域的技術人員能更好地理解本發明的技術方案，下面結合實施例對本發明技術方案進行詳細說明。
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
1.白蟻巢浸提液的提取
實施例1
收集白蟻蟻巢，風乾，以1:1.2g/ml的比例加入冷水浸泡6min，煮沸12min後冷卻至室溫，過濾即得白蟻巢浸提液。
實施例2
收集白蟻蟻巢，風乾，以1:1.35g/ml的比例加入冷水浸泡8min，煮沸13.5min後冷卻至室溫，過濾即得白蟻巢浸提液。
實施例3
收集白蟻蟻巢，風乾，以1:1.5g/ml的比例加入冷水浸泡10min，煮沸15min後冷卻至室溫，過濾即得白蟻巢浸提液。
2.接種培養基配方
實施例4
60目荔枝殼粉50份、瓊脂粉20份、葡萄糖5份、馬鈴薯10份、白蟻巢浸提液25份，鹽酸四環素的濃度為60U/ml。
實施例5
80目荔枝殼粉55份、瓊脂粉22.5份、葡萄糖6.5份、馬鈴薯15份、白蟻巢浸提液30份，鹽酸四環素的濃度為75U/ml。
實施例6
100目荔枝殼粉60份、瓊脂粉25份、葡萄糖8份、馬鈴薯20份、白蟻巢浸提液35份，鹽酸四環素的濃度為90U/ml。
3.組織分離法製備荔枝菌母種
實施例7
一種製備荔枝菌母種的組織分離方法，所述方法為選取荔枝菌成熟度為40％的幼嫩菌柄與菌蓋銜接處子實體，去雜，無菌水洗淨後用75％乙醇浸泡50s，無菌水衝洗3遍，再用3％NaClO浸泡1.5min，無菌水衝洗3遍，無菌解剖刀輕輕切開子實體，挑取其中大小為0.25cm3的中間組織接種至實施例4培養基中25℃培養4～6d，直至菌絲長滿，菌絲濃密，粗壯，潔白狀態即得純培養物。
所得純培養物在1～4℃條件下保存備用，或者即可用於繁殖原種。
實施例8
一種製備荔枝菌母種的組織分離方法，所述方法為選取荔枝菌成熟度為42.5％的幼嫩菌蓋子實體，去雜，無菌水洗淨後用82.5％乙醇浸泡70s，無菌水衝洗3遍，再用0.1％HgCl2浸泡1.5min，無菌水衝洗3遍，無菌解剖刀輕輕切開子實體，挑取其中大小為0.30cm3的中間組織接種至實施例5培養基中25℃培養4～6d，直至菌絲長滿，菌絲濃密，粗壯，潔白狀態即得純培養物。
所得純培養物在1～4℃條件下保存備用，或者即可用於繁殖原種。
實施例9
一種製備荔枝菌母種的組織分離方法，所述方法為選取荔枝菌成熟度為45％的幼嫩菌柄與菌蓋銜接處、菌蓋、菌褶、菌柄或擔孢子子實體，去雜，無菌水洗淨後用90％乙醇浸泡90s，無菌水衝洗3遍，再用0.1％2，4－己二烯酸鉀浸泡1.5min，無菌水衝洗3遍，無菌解剖刀輕輕切開子實體，挑取其中大小為0.35cm3的中間組織接種至實施例6培養基中25℃培養4～6d，直至菌絲長滿，菌絲濃密，粗壯，潔白狀態即得純培養物。
所得純培養物在1～4℃條件下保存備用，或者即可用於繁殖原種。
顯然，上述9個實施例僅是本發明的部分實施例，而不是全部實施例。基於本發明的啟示，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動的前提下所得到的所有其它實施方式，都屬於本方面所保護的範圍。