一種微生物的分子標記及其構建和應用的製作方法

2024-02-29 08:22:15

專利名稱：一種微生物的分子標記及其構建和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及免疫學領域，具體的說是一種微生物的分子標記及其構建和應用。
背景技術：
CpG-DNA是含有未甲基化CpG的DNA序列，能夠刺激脊椎動物的免疫系統。這種 序列通常可以用人工合成方法獲得，稱為CpG寡核苷酸(CpG 0DN)，也可以構建於質粒DNA 中。由於CpG-DNA廣泛存在於細菌DNA中，但很少存在於脊椎動物DNA中，因而CpG-DNA是 一種細菌等微生物的分子標記，可以被脊椎動物免疫系統識別。識別CpG-DNA的免疫分子 是Toll樣受體家族成員TLR9 ；TLR9與CpG-DNA作用誘發多種免疫反應，包括促使淋巴細胞 增值，激活自然殺傷細胞、巨噬細胞等免疫因子等。基於其免疫促進活性，CpG-DNA被認為是 一種具有良好應用前景的免疫佐劑和抑菌因子。由於CpG-DNA具有種屬特異性，因而不同 物種的有效CpG-DNA序列不同。目前魚類CpG-DNA的研究大多針對虹鱒、大西洋鮭魚等，針 對牙鮃的CpG-DNA研究很少。由於牙鮃是我國重要的海水養殖魚類，具有廣闊的市場和很 高的經濟價值，因而開展牙鮃特異性CpG-DNA研究對我國水產養殖業發展具有切實意義。

發明內容
本發明目的在於提供一種微生物的分子標記及其構建和應用。為實現上述目的，本發明採用的技術方案為一種微生物的分子標記微生物的分子標記為牙鮃特異性CpG-DNA序列，為序列 表SEQ ID中的鹼基序列所示。構建1)將質粒pCN3用BamHI酶切後與寡聚核苷酸CPG43用T4DNA連接酶於室溫連 接2-4小時，連接液轉化入大腸桿菌DH5 a後在含有安卡青黴素的LB固體培養基上培養 24-30小時，挑取轉化子，提取質粒，待用；所述CPG43為5，-GATCGCGCGCGCGCGTCTATTCGTCG TTGGTTGTCGTTTTGGTG-3，；2)將上述所得質粒用BamHI酶切後與寡聚核苷酸CPG40用T4DNA連接酶於室溫 連接2-4小時，連接液轉化入大腸桿菌DH5 a後在含有安卡青黴素的LB固體培養基上培養 24-30小時，挑取轉化子，提取質粒，即為具有序列表SEQ ID中的鹼基序列的質粒；所述CPG40 為 5，-GATCACGTACGTACGTCTATGATCTCGCTCGCTCGCCTATG-3，。應用所述序列表SEQ ID中的鹼基序列能顯著抑制致病性細菌的侵染。所序列表 SEQ ID中的鹼基序列能顯著抑制遲緩愛德華氏菌或嗜水氣單胞菌侵染。所述具有序列表 SEQ ID中的鹼基序列的質粒的PBS溶液至濃度為20ug/ml，具有序列表SEQID中的鹼基序 列的質粒的PBS溶液以100-120ul的劑量腹腔注射牙鮃能顯著抑制遲緩愛德華氏菌或嗜水 氣單胞菌侵染。本發明具有如下優點1.能夠非特異性抑制病原侵染。本發明的微生物的分子標記CpG-DNA能夠使魚類抵禦多種常見細菌病原的侵染。2.製備簡單，造價低廉。由於本發明的微生物的分子標記CpG-DNA攜帶於質粒上， 因而可以在細菌中擴增，通過常規質粒提取即可獲得，避免了昂貴的人工合成途徑。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步說明。實施例旨在對本發明進行舉例描述，而 非以任何形式對本發明進行限制。在本發明實施例中所涉及到的常規性實驗方法均採用如下方法1.質粒提取、DNA(PCR)產物純化、DNA片段從凝膠中回收、細菌基因組二 DNA提取 皆使用「天根生化科技(北京)有限公司」的相應試劑盒。2.質粒、DNA連接液轉化進入大腸桿菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell Molecular Cloning :A Laboratory Mannual. Cold Spring HarborLaboratory Press 2001)；3.所有限制性內切酶和連接酶皆購自於「紐英倫生物技術有限公司」，北京。4.所有寡核苷酸合成皆由「上海生工生物工程技術服務有限公司」合成。實施例1牙鮃特異性CpG-DNA序列具序列表SEQ ID中的鹼基序列。序列表SFQ ID為GATCGCGCGCGCGCGTCTATTCGTCGTTGGTTGTCGTTTTGGTGGATCACGTACGTACGTCTATGATCTCGCTCGCTCGCCTAT(a)序列特徵 長度84 類型核苷酸序列 鏈型單鏈 拓撲結構線性(b)分子類型DNA(c)假設否(d)反義否(e)最初來源人工設計實施例2含有牙鮃特異性CpG-DNA序列的質粒的構建M M 14 pCN3(參 B Jiao X, Zhang M, Hu Y, and Sun L. Construction and evaluation of DNA vaccinesencoding Edwardsiella tarda antigens. Vaccine. 2009 ； 27 :5195-5202.進行構建)用 BamHI 酶切後與寡聚核苷酸 CPG43(5，-GATCGCGCGCGCGCGTCT ATTCGTCGTTGGTTGTCGTTTTGGTG-3，)用T4DNA連接酶於室溫連接2_4小時，連接液轉化入大 腸桿菌DH5 a後在含有100ug/ml的安卡青黴素的LB固體培養基上培養24-30小時，挑取 轉化子，提取質粒，即為質粒pC2M。將pC2M用BamHI酶切後與寡聚核苷酸CPG40 (5』_GATCA CGTACGTACGTCTATGATCTCGCTCGCTCGCCTATG-3，)用 T4DNA 連接酶於室溫連接 2-4 小時，連接 液轉化入大腸桿菌DH5後在含有lOOug/ml的安卡青黴素的LB固體培養基上培養24-30小 時，挑取轉化子，提取質粒，即為具有序列表SEQ ID中的鹼基序列的質粒，經測序可知質粒中含有有序列表SEQ ID中的鹼基序列。實施例2pC4M的抑菌應用1)遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌懸液的製備。在LB培養基中分別培養遲緩愛 德華氏菌TX1(保存於CGMCC，編號為CGMCC No. 2330)和嗜水氣單胞菌AH1. 927 (購於中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，編號1.927)使兩種菌的菌懸液分別培 養至0D_均為0. 6，然後分別以5000g，4°C離心lOmin，收集各自的菌體，將TX1懸浮於PBS 中至終濃度為5X 106cfu/ml，即為遲緩愛德華氏菌懸液；將T4懸浮於PBS中至終濃度為 2X 107cfu/ml，即為嗜水氣單胞菌懸液。所述LB組成成分按重量百分比計1.0%蛋白腖，0.5%酵母粉，1.0%氯化鈉， 97. 5%蒸餾水；所述PBS組成成分按重量百分比計0. 8 % NaCl，0. 02 % KC1，0. 358 % Na2HP04. 12H20，0. 024% NaH2P04，98. 798%蒸餾水。2)將96條牙鮃(每條重約7g)隨機分為4組，每組24條。將這4組分別命名為 A、B、C和D組。將A和C組的每條魚腹腔注射lOOul具有序列表SEQ ID中的鹼基序列的 質粒的PBS溶液，其中每lOOul含有2ug具有序列表SEQ ID中的鹼基序列的質粒。將B和 D組(對照組)的每條魚腹腔注射lOOul PBS。2天後將A和B組魚每條腹腔注射lOOul上 述步驟1)的遲緩愛德華氏菌懸液；將C和D組魚每條腹腔注射lOOul上述步驟1)的嗜水 氣單胞菌懸液。在以後的20天中，每天觀察並記錄各組魚的死亡情況。20天後，統計各組 魚的總死亡數目A組，10條；B組，20條，C組，8條；D組，20條。利用下列公式計算相對免 疫保護效率(RPS)RPS = 100 X (1-免疫組魚的總死亡百分比/對照組魚的總死亡百分比)由此得出具有序列表SEQ ID中的鹼基序列的質粒針對遲緩愛德華氏菌和嗜水氣 單胞菌的免疫保護效率分別為50%和60%。結論具有序列表SEQ ID中的鹼基序列的質粒能夠顯著抑制遲緩愛德華氏菌和 嗜水氣單胞菌侵染。
權利要求
一種微生物的分子標記，其特徵在於微生物的分子標記為牙鮃特異性CpG-DNA序列，為序列表SEQ ID中的鹼基序列所示。
2.一種按權利要求1所述的微生物的分子標記的構建，其特徵在於1)將質粒PCN3用BamHI酶切後與寡聚核苷酸CPG43用T4DNA連接酶於室溫連接2_4 小時，連接液轉化入大腸桿菌DH5 α後在含有安卡青黴素的LB固體培養基上培養24_30小 時，挑取轉化子，提取質粒，待用；所述 CPG43 為 5，-GATCGCGCGCGCGCGTCTATTCGTCGTTGGTTGT CGTTTTGGTG-3，；2)將上述所得質粒用BamHI酶切後與寡聚核苷酸CPG40用T4DNA連接酶於室溫連 接2-4小時，連接液轉化入大腸桿菌DH5 α後在含有安卡青黴素的LB固體培養基上培養 24-30小時，挑取轉化子，提取質粒，即為具有序列表SEQ ID中的鹼基序列的質粒；所述 CPG 40 為 5』 -GATCACGTACGTACGTCTATGATCTCGCTCGCTCGCCTATG-3，。
3.一種按權利要求1所述的微生物的分子標記的應用，其特徵在於所述序列表SEQ ID中的鹼基序列能顯著抑制致病性細菌的侵染。
4.按權利要求3所述的微生物的分子標記的應用，其特徵在於所序列表SEQID中的 鹼基序列能顯著抑制遲緩愛德華氏菌或嗜水氣單胞菌侵染。
5.按權利要求3所述的微生物的分子標記的應用，其特徵在於所述具有序列表SEQ ID中的鹼基序列的質粒的PBS溶液至濃度為20ug/ml，具有序列表SEQ ID中的鹼基序列的 質粒的PBS溶液以100-120ul的劑量腹腔注射牙鮃能顯著抑制遲緩愛德華氏菌或嗜水氣單 胞菌侵染。
全文摘要
本發明涉及免疫學領域，具體的說是一種微生物的分子標記及其構建和應用。微生物的分子標記為牙鮃特異性CpG-DNA序列，為序列表SEQ ID中的鹼基序列所示。所述序列表SEQ ID中的鹼基序列能顯著抑制致病性細菌的侵染。本發明所得牙鮃特異性CpG-DNA序列對多種常見病原菌具有抑制作用，因而在牙鮃病害防治中具有良好的應用前景。
文檔編號A61K31/7088GK101851621SQ201010151850
公開日2010年10月6日 申請日期2010年4月16日 優先權日2010年4月16日
發明者劉春勝, 孫黎 申請人:中國科學院海洋研究所