鑑定與跨膜蛋白相互作用的化合物的方法

2024-04-03 04:54:05

專利名稱：鑑定與跨膜蛋白相互作用的化合物的方法
技術領域：
本發明涉及篩選能夠與跨膜蛋白相互作用的化合物的方法。本發明進一步涉及篩選能夠二聚化或寡聚化形成兩個或兩個以上蛋白質複合體的跨膜蛋白的方法。
背景技術：
在下文的描述中，本說明書末尾列出了具體的參考文獻，這些文獻均以參見的方式引入本說明書中。
跨膜蛋白分為幾個主要類別，包括G蛋白偶聯受體、轉運蛋白、酪氨酸激酶受體、細胞因子受體和LDL(低密度脂蛋白)受體。根據結構和序列的同源性，可將G蛋白偶聯受體(GPCR)分為幾個家族。家族1(也稱為家族A或視紫紅質樣家族)是到目前為止最大的亞類，其包括下列分子的受體小分子如兒茶酚胺、多巴胺和去甲腎上腺素，肽如阿片樣物質、促生長素抑制素和血管加壓素，糖蛋白激素如促甲狀腺激素，刺激激素和增味劑分子的全部種類(George等，2002年)。家族2或稱家族B包括例如胰高血糖素、甲狀旁腺激素和胰液素的受體。這些GPCR的特徵為均具有含有幾個半胱氨酸的長氨基末端，所述半胱氨酸可形成二硫鍵橋。家族3或稱家族C包括的受體例如促代謝型穀氨酸受體、Ca2+敏感性受體和γ氨基丁酸(GABA)B受體。上述受體也具有複雜的氨基末端的特徵。雖然所有GPCR均具有七次跨膜(TM)螺旋，但是各個GPCR家族之間並沒有序列同源性。
GPCR是已知的最大的一類細胞表面信號傳導的中介分子，其分布在體內的每個細胞上。GPCR的作用調節了全部生理功能，例如包括腦、心臟、腎、肺、免疫系統和內分泌系統的功能。過去10年中的大量努力鑑定出了許多新的GPCR，包括先前已知配體的多受體亞型和尚未鑑定出內源性配體的許多受體，後者稱為「孤兒」受體或oGPCR(Lee等，2001年；Lee等，2002年；Bailey等，2001年)。
目前，GPCR已經成為臨床上用於治療各種疾病的許多藥物的成功靶點，估計當前市場上約50％藥物的靶向這些分子。在已知的GPCR中，大約335種受體是藥物開發的潛在靶點，其中195種的配體已知，剩餘的140種為oGPCR，後者的配體等待鑑定。儘管各種方法學上的進步加速了發現新受體的速度，但是發現配體和藥物的速度卻遠遠落後了。雖然常規的、小規模的藥理學篩選分析方法最初被用於發現許多GPCR的配體和藥物，但是人們一直在尋找更為新穎的分析方法。
由於超過80％的細胞表面受體是GPCR，因此其成為新藥開發的豐富資源，並構成了與新藥開發高度相關的蛋白靶點群。因為GPCR與藥物之間的相互作用可被限制在僅具有所述受體的細胞表面和組織上，所以與GPCR相互作用的藥物具有高度選擇性的潛能。發現GPCR並意識到其是重要的藥物靶點，這一點引起了人們在製藥學方面的強烈興趣，該興趣在於設計出檢測和篩選與GPCR相互作用的化合物的更好方法。因而，為了實現以更快的速度篩選和發現藥物的目標，迫切需要開發一些改良的分析方法。需要將檢測受試化合物和所述受體之間相互作用的能力最優化，這是藥物開發過程中最初的基礎步驟。
用以加速鑑定全部GPCR的改良的配體鑑定策略將對所述受體的生理功能進行定義，人們並認識到其在發現新藥中的潛能。儘管明確了的藥物靶點中蘊藏著巨大財富，但是即使在經過鑑定的GPCR中，也只發現少量高選擇性亞型特異性的藥物，而製藥機構也正面臨著缺乏有前途的先導化合物的局面。與前3年相比，在1999-2001年的三年中，排名前20的製藥公司認可的新藥產品的數量顯著減少(Smith，2002年)。因此，確實需要改良的多用途的分析系統，該系統能夠以快速有效的方式測試和鑑定內源性配體和與所述受體相互作用的新化合物，並且該系統適於自動化。
由於無法預測需要激活oGPCR的信號傳導通路，因此需要一套檢測所述受體與化合物相互作用的分析系統，該系統獨立於前述預測，其中，所述受體激活了效應器系統(例如腺苷酸環化酶、PLC(磷脂酶C)、cGMP(環鳥苷酸單磷酸)和磷酸二酯酶的活性)。將配體與GPCR和oGPCR配對是一項重要的工作；然而，GPCR配體和效應器系統的多樣性會限制一些已有的配體鑑定分析方法的使用，因此需要新的方法來發現藥物。
最近，幾種採用精密分析系統的方法檢測了組織提取物、大配體庫和感興趣的特定配體，成功地發現了許多所述oGPCR的內源性配體。所述方法收集在參考文獻「反向藥理學(Reverse Pharmacology)」(Howard等，2001年)中。各種檢測方法被用來分析細胞針對一種激動劑化合物而誘導出來的活性，這些方法包括螢光成像板讀數器(FluorescenceImaging Plate Reader)分析方法(FLIPR，分子設備公司(Molecular DevicesCorp.)，桑尼維爾(Sunnyvale)，加利福亞州)和Barak等人(1997年)，以及專利號為5,891,646和6,110,693的美國專利公開的以下方法在刺激GPCR的條件下，使用β-視紫紅質抑制蛋白(arrestin)-綠色螢光融合蛋白對視紫紅質抑制蛋白向細胞表面的轉位進行成像。
所述方法的潛在缺陷在於(1)成像結果並非受體本身；(2)蛋白轉位的成像需要複雜的計算機分析技術；(3)篩選拮抗劑之前必需鑑定出激動劑；和(4)信號傳導的發生必需存在特異性G蛋白偶聯。
傳統的GPCR的配體結合和信號傳導的模型建立在單受體參與所述過程的假設上，並且該GPCR的單受體模型已經被廣泛接受。然而，從20世紀90年代中期開始，大量的報導證實了許多GPCR的寡聚化現象(George等的綜述，2002年)，並且目前已認識到寡聚化現象是GPCR結構和生物學功能的一個固有特性。某些受體亞型也會形成異源寡聚體，而這些所述受體的功能特徵與同源受體群有所不同。目前，對GPCR寡聚化現象的研究並沒有發現二聚體和更大複合物之間的差別，因此「二聚體」一詞是可以與「寡聚體」和「多聚體」互換的。並沒有結論性的數據能夠確定功能性的GPCR的寡聚體有多大。重要的是，通過異源寡聚化作用產生的新特性表明了GPCR產生多種功能的機制。GPCR的同源寡聚化作用作為一種普遍存在的現象而被接受了，而大量GPCR已知能夠組裝形成異源寡聚體受體複合物(George等，2002年)。例如，GABA-B1和GABA-B2受體的單體沒有功能，而只有在共表達時才會形成功能性受體(White等，1998年)。異源寡聚體受體複合物的組裝可形成新的受體-配體結合、信號傳導或細胞內轉運特性。例如，共轉染μ和δ阿片受體導致具有功能性特徵的寡聚體的形成，所述功能性特徵不同於兩種單個受體的任何一種的功能特徵(George等，2000年)。μ和δ阿片受體相互作用形成的寡聚體產生了新的藥理學特性和G蛋白偶聯特性。當μ和δ阿片受體同時表達時，高選擇性的激動劑(DAMGO、DPDPE和嗎啡)的效能降低，且發生效能排序的改變，而某些內源性配體內嗎啡肽1(endomorphin-1)和亮啡肽(Leu-enkephalin)的親和力增加，上述現象表明形成了新的配體結合袋(George等，2000年)。與單獨表達的μ和δ受體不同，共表達所述受體顯示出對百日咳毒素不敏感的信號傳導，該現象可能是由於與不同亞型的G蛋白相互作用引起。因此，從鑑定潛在的藥物靶點，到尋找確定一對特定GPCR能否形成異源寡聚體的方法來看，上述現象都是非常有用的。
在很多報導中，通過其具有的免疫共沉澱的能力已經嘗試性地鑑定出了一些異源寡聚體。然而，兩個GPCR免疫共沉澱的結果有兩種可能的解釋不是兩個受體在物理上直接相互作用，就是二者都通過與一個共同的第三個蛋白質(或多個蛋白質)接觸而相互作用。通過發展能量轉移檢測方法來檢測受體寡聚體是一種替代的方法，該方法採用生物發光共振能量轉移(BRET)或螢光共振能量轉移(FRET)的原理。雖然採用所述方法檢測的能量轉移的兩個受體分子上標記的螢光團的間距少於100埃，但是能否可靠地區別受體構象的變化和從頭寡聚化仍不清楚。
轉運蛋白屬於蛋白質泵，其能夠將分子、離子和其它化學物質運入和運出細胞，且事實上存在於所有細胞中。根據結構、序列的同源性和轉運的分子的不同，可將轉運蛋白分為幾個家族。不同的轉運蛋白分別用於轉運下列物質單胺神經遞質如多巴胺、5-羥色胺、去甲腎上腺素和GABA，胺基酸如甘氨酸、牛磺酸、脯氨酸和穀氨酸，囊泡單胺、乙醯膽鹼和GABA/甘氨酸，糖類如葡萄糖和二糖，有機陽離子和有機陰離子，寡肽和肽，脂肪酸、膽汁酸和核苷，水和肌酸。從細胞內向外轉運大分子的泵例如P-糖蛋白(多藥耐藥性蛋白質)家族，所述大分子例如藥物、毒素和抗生素。也有幾種相關的轉運蛋白的功能依然未知(Masson等，1999年)。所述轉運蛋白屬於膜蛋白，且含有一段通常具有12個跨膜結構域的多肽。穀氨酸和天冬氨酸轉運蛋白屬於一個單獨的家族，該家族的成員具有6-10個跨膜結構域，並與其它轉運蛋白沒有同源性(Masson等，1999年)。該家族成員的氨基端和羧基端均位於膜的胞內一側。
單胺轉運蛋白被認為參與了大量神經和精神疾病的發病過程，所述疾病包括抑鬱症、帕金森氏病、精神分裂症、藥物成癮症、抽動穢語症候群(Tourette′s syndrome)和注意力缺陷障礙。多巴胺轉運蛋白(DAT)是精神興奮藥例如古柯鹼和哌醋甲酯的主要靶點。今天，所述轉運蛋白已經成為臨床上用於治療各種疾病的許多藥物的成功靶點，尤其是抗抑鬱藥物，包括氟西汀、舍曲林(sertraline)和其它相關的5-羥色胺選擇性的再攝取抑制物(SSRI)。儘管隨著分子技術的進步，已經鑑定出了已知的轉運蛋白，但是發現配體和藥物的速度卻落後了。傳統上，藥理學篩選檢測方法被用來發現某些轉運蛋白的配體和藥物，但是目前急需尋找新的檢測方法。用以加快確定全部轉運蛋白的改良的配體鑑定策略，將進一步確定所述轉運蛋白的生理功能，並認識到所述轉運蛋白在發現新藥物中的潛能。即使在經過鑑定的轉運蛋白中，也只發現少量的高選擇性的特異藥物。
酪氨酸激酶受體家族成員具有類似的結構特徵，該特徵為該家族成員均具有一個胞外配體結合結構域、單個跨膜結構域和一個胞內結構域，所述胞內結構域具有起信號傳導作用的酪氨酸激酶活性。受體酪氨酸激酶有許多亞家族，例如表皮生長因子(EGF)受體(也稱為HER1或erbB1)，其為該亞家族四個成員中的一個，其他成員為HER2、HER3和HER4。EGF受體(EGF-R)的主要配體是EGF、TGF-α(轉化生長因子α)、肝素結合表皮生長因子、雙調蛋白、betacellulin和epiregulin(Shawver等，2002年)。EGF-R的激活導致該受體與另一個EGF-R單體二聚化，或者與所述HER亞家族的另一個成員二聚化。家族成員之間形成的異源二聚體形成了配體結合和信號傳導的顯著的多樣性(Yarden和Sliwkowski，2001年)。EGF-R在各種組織廣泛表達，並介導了許多重要功能，例如細胞生長和組織修復。EGF-R的過表達見於許多類型的癌症中，例如頭頸部癌、肺癌、喉癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、結腸癌、腎癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌、甲狀腺癌、黑色素瘤和神經膠質瘤，且與所述癌症預後不良相關(Nicholson等，2001年)。因此，人們具有極大的興趣並有必要來開發以EGF-R為靶標的藥物，以及輔助鑑定所述藥物的方法。
受體酪氨酸激酶的其他亞家族有例如血管內皮因子受體(四個成員)和成纖維細胞生長因子受體(四個成員)。所述受體在血管生成作用中具有重要作用，也在以致癌作用為特徵的不受控制的血管增殖中具有重要作用(Hanahan和Folkman，1996年)。
細胞因子受體是跨膜蛋白，其具有一個胞外配體結合結構域和一個胞內結構域，後者具有內在激酶活性或者能夠與胞內激酶相互作用的接頭區域。根據所述受體的結構複雜性，可將其分為數個亞類。「簡單」受體包括生長激素受體、紅細胞生成素受體和白介素受體，「複雜」受體包括腫瘤壞死因子受體家族、4-螺旋細胞因子受體家族、胰島素/胰島素樣受體家族和粒細胞集落刺激受體(Grotzinger，2002年)。
胰島素和胰島素樣生長因子(IGF)受體家族控制代謝、生殖和生長(Nakae等，2001年)。已知有9種不同的胰島素樣肽、與之相互作用的3種已知受體和1個胰島素受體(IR)相關受體孤兒成員，所述3種已知受體是IR、IGF-1R(IGF-1受體)和IGF-2R(IGF-2受體)。細胞表面的每個所述受體均以同源二聚體或異源二聚體形式存在。IR亞家族也與EGF-R家族相關。
由單一mRNA(信使核糖核酸)產生的IR經歷切割和二聚化後轉位至質膜。IR的每個單體組分包括一個跨膜結構域；完整的受體包括兩個α亞單位和兩個β亞單位，並由二硫鍵連接。β亞單位包括一個跨膜區和胞內區。所述受體是一種酪氨酸激酶，其能夠催化幾種胞內底物的磷酸化。
低密度脂蛋白(LDL)受體家族作為貨物轉運蛋白，能夠調節脂蛋白和蛋白酶的水平(Strickland等，2002年)。所述家族識別出的9個成員均具有類似的結構，該結構包括一個胞外區、一個單一跨膜結構域和一個位於胞漿中的尾部。LDL受體在清除脂蛋白的過程中起重要作用，並且其遺傳缺失會導致血流中LDL的積累。
第一個鑑定出的顯示能夠指導蛋白轉運進入核的基序(motif)是例如胺基酸序列(PKKKRKV)，其包含在SV40大T抗原蛋白中。Importinα-β受體複合物能夠識別核定位序列(NLS)基序，並結合於NLS(Gorlich等，1996年)。所述複合物是胞漿蛋白，其能夠識別含有NLS的蛋白質，並轉運這些蛋白質使其錨定在核孔上。然後整個複合物錨定在核孔複合物上(Weis等，1998年；Schlenstedt等，1996年)，而後者屬於核膜。核膜是一種具有開孔的邊界，所述開孔介導了核轉運過程(Weis等，1998年)。
關於GPCR定位於核內的報導非常罕見。這樣的一個例子是GPCR血管緊張素1型(AT1)受體，其具有指導GPCR進入細胞核的內源性NLS(Lu等，1998年)，所述作用為NLS序列參與了將AT1受體定向至核的過程提供了佐證。上述作者和Chen等人(2000年)報導，在激動劑的作用下，核內AT1受體的量增加。甲狀旁腺激素受體的細胞核定位已經有報導(Watson等，2000年)。然而，GPCR超家族的成員中很少含有介導所述受體轉位至核的內源性NLS。
因此，仍然需要用於鑑定與跨膜蛋白相互作用的化合物的新的、更為簡便的方法，所述跨膜蛋白例如GPCR、轉運蛋白等。也需要用於檢測跨膜蛋白寡聚化作用的改良的、更為明確的方法。

發明內容
本發明人指出，整合入跨膜蛋白(不含有內源性的功能性NLS)的核定位序列(NLS)能夠以時間依賴和不依賴配體的方式，將所述蛋白從細胞表面運送入細胞核。為了使從細胞表面開始的運送跨膜蛋白的過程可見，這些跨膜蛋白上攜帶有可用各種方法檢測到的成分。已經證明，在基礎條件下，含有整合的合成NLS的各種蛋白家族的膜蛋白，以從細胞表面向細胞核轉移的方式再分布。
通過確定候選化合物能否調節以不依賴配體的形式轉運跨膜蛋白運離細胞膜，上述方法可被開發用於鑑定與跨膜蛋白相互作用的化合物。
目前，使用基於所述過程的方法來確定蛋白分子能否寡聚化也是可能的。
根據一個實施方案，本發明提供了一種用於篩選能與至少一種跨膜蛋白相互作用的候選化合物的方法，所述方法包括用至少一段編碼包含跨膜蛋白的蛋白質的核苷酸序列轉染細胞，並允許在該細胞中表達編碼的蛋白，所述跨膜蛋白包括至少一個核定位序列和可檢測成分；將所述細胞與候選化合物接觸；以及通過檢測細胞中可檢測成分的分布情況，來確定該細胞中所述被表達的蛋白的分布情況；其中，如果檢測發現，相對於未接觸候選化合物的對照細胞中的可檢測成分的分布情況，所述細胞中可檢測成分的分布情況發生改變，則表明所述化合物與跨膜蛋白相互作用。
根據採用所述方法的一個進一步的實施方案，在將細胞與候選化合物接觸前，先將其與已知能夠與至少一種跨膜蛋白相互作用的化合物接觸。其中，如果檢測發現相對於對照細胞中的可檢測成分的分布情況，所述細胞中可檢測成分的分布情況發生改變，則表明所述候選化合物與跨膜蛋白相互作用，所述對照細胞未接觸候選化合物而接觸已知能夠與跨膜蛋白相互作用的化合物。
根據一個實施方案，本發明提供一種用於篩選能與至少一種跨膜蛋白相互作用的候選化合物的方法，所述方法包括用至少一段編碼含有NLS的跨膜蛋白的核苷酸序列轉染細胞，並在該細胞中表達編碼的蛋白質；將所述細胞與候選化合物接觸；以及通過分離所述細胞的細胞膜成分、將該跨膜蛋白的標記配體與該細胞膜成分接觸和檢測與該細胞膜成分結合的配體的水平，來確定存在於該細胞膜上的含有NLS的跨膜蛋白水平；其中，如果檢測發現，相對於未接觸候選化合物的對照細胞的細胞膜中跨膜蛋白的水平，所述細胞膜中跨膜蛋白的水平發生改變，則表明所述化合物與跨膜蛋白相互作用。
根據一個進一步的實施方案，本發明提供了一種用至少一種核苷酸序列的轉染的分離細胞，所述核苷酸序列編碼包括跨膜蛋白的一種蛋白質，所述跨膜蛋白含有至少一個NLS和一個可檢測成分。
根據一個進一步的實施方案，本發明提供了一種確定第一種蛋白質和第二種蛋白質能否寡聚化的方法，該方法包括用第一種核苷酸序列和第二種核苷酸序列轉染細胞，前者編碼含有一個NLS的第一種蛋白質，後者編碼包括可檢測成分的第二種蛋白質，並允許在該細胞中表達所述編碼的第一種蛋白質和第二種蛋白質；以及確定該細胞中所述可檢測成分的分布情況；其中，如果檢測發現相對於對照細胞，所述可檢測成分位於或鄰近於細胞核，或者細胞表面所述可檢測成分的水平降低，則表明第一種蛋白質和第二種蛋白質能夠相互作用。


該部分描述了本發明中的某些實施方案，並引用如下附圖圖1顯示了作為典型GPCR的多巴胺D1受體的結構示意圖，並對其進行修改以含有一個NLS。
圖2顯示了HEK細胞表面的螢光(相對螢光單位)強度，該細胞轉染了含有NLS的多巴胺D1受體，並以各種濃度的丁克嗎(butaclamol)處理該細胞。
圖3顯示了HEK細胞表面的螢光強度，該細胞轉染了含有NLS的HA(血凝素)-多巴胺D1受體，並單獨以各種濃度的SCH23390或者與SKF81279(100nM(納摩爾每升))共同處理該細胞。
圖4顯示了HEK細胞表面的螢光強度，該細胞轉染了含有NLS的HA-多巴胺D1受體，並單獨以0.5μM(微摩爾每升)的SCH23390或者與各種濃度的SKF81297共同處理該細胞。
圖5顯示了HEK細胞的細胞膜成分上結合的3H-SCH23390的含量，該細胞轉染了含有NLS的多巴胺D1受體，並以丁克嗎(▲)處理該細胞，以未處理的細胞(■)為對照。
具體實施例方式
在一個實施方案中本發明提供了一種新的和簡便的方法，該方法用於篩選能夠與跨膜蛋白相互作用的候選化合物。
本文所用的候選化合物與跨膜蛋白的「相互作用」一詞是指，化合物作為跨膜蛋白的配體，能夠與該蛋白結合，或能夠調節該跨膜蛋白脫離細胞膜的轉運過程。
鑑定與跨膜蛋白相互作用的化合物，是鑑定藥物開發中先導的化合物的方法中的第一個重要步驟。
本發明人最初採用GPCR進行工作，發現當有核真核細胞轉染了編碼GPCR的核苷酸序列，並且該細胞允許表達該核苷酸序列之後，表達的GPCR首先被運送到細胞膜，而後轉運至細胞核，所述GPCR含有合成的整合NLS或自然存在的NLS。所述過程不依賴於配體的激活卻依賴於參與的跨膜蛋白，並發生在約6-72小時之間，平均為24-48小時。所述現象與在細胞中表達的不含NLS的GPCR不同的是，表達的GPCR主要定位在細胞表面，少量存在於胞漿中，而在細胞核中則無法檢測到。
本發明人也發現，從細胞膜向核轉運或運輸表達的所述含有NLS的GPCR的過程，可被使用與GPCR相互作用的化合物來處理轉染細胞的方式調節。因此，篩選具有與GPCR相互作用能力的候選化合物可以通過檢測表達的GPCR從細胞膜向核轉運的調節情況來實現。
本發明人進一步發現所述觀察到的情況通常可以廣泛地用於各種跨膜蛋白，並非只限於GPCR。
本文所用的「跨膜蛋白」一詞是指具有至少一個跨膜結構域的細胞膜上的單鏈蛋白質。
本發明人指出，如果在有核細胞中表達各種跨膜蛋白，從而使其含有NLS，則表達的全部所述蛋白均首先聚集在細胞膜上，然後以不依賴於配體激活的形式離開細胞膜轉運進入細胞核，所述各種跨膜蛋白來自於GPCR的幾個家族、轉運蛋白、細胞因子受體、酪氨酸激酶和低密度脂蛋白受體。
極多種類的跨膜蛋白結構表明本發明的方法具有廣泛的適用性，所述結構以在所述方法中使用的示例性的跨膜蛋白為代表；在跨膜蛋白中插入NLS導致該蛋白從細胞表面向細胞核轉位，該作用在具有1個、7個和12個跨膜結構域的膜蛋白中是有效的，所述膜蛋白的序列同源性很低或沒有。
本發明的方法廣泛適用於鑑定與跨膜蛋白相互作用的化合物。
與跨膜蛋白相互作用的化合物能夠以不同方式調節所述蛋白從細胞膜向細胞核的轉運，所述方式包括抑制轉運、加速轉運和幹擾由其他化合物產生的調節作用。由於任何相互作用的化合物均為潛在的候選藥物，因此所述化合物都是人們感興趣的。
通過比較對照細胞和候選化合物處理的細胞中的跨膜蛋白分布情況，能夠確定表達的跨膜蛋白轉運的調節情況。
在一個實施方案中，所述方法提供了一個用於篩選候選化合物的簡便工具，所述候選化合物具有與GPCR相互作用的能力和調節GPCR運輸的能力。與GPCR特異性相互作用的化合物可能抑制或阻止GPCR從細胞表面向細胞核的轉運，該化合物可能是GPCR的拮抗劑；而相對於對照細胞，其他化合物可能加速GPCR向細胞核的轉運，該化合物可能是GPCR的激動劑。
為了在暴露於和非暴露於受試化合物的條件下確定細胞中表達的跨膜蛋白的分布情況，所述跨膜蛋白必需攜帶有可在細胞中被檢測到的可檢測成分。所述可檢測成分可以是任何成分，其能夠在細胞內的表達和運輸過程中持續與跨膜蛋白相關聯，並能夠直接或間接地被檢測到以確定其在細胞內的分布，並可被用於確定由暴露於候選化合物所導致的發生改變的分布情況。
在第一個實施方案中，將編碼包括跨膜蛋白的融合蛋白的一段核苷酸序列轉染入細胞中，該跨膜蛋白含有至少一個NLS，該NLS與含有一段可檢測肽或多肽的可檢測成分偶聯。本文中的肽指2-20個胺基酸殘基的序列，優選為約5-15個胺基酸殘基的序列；多肽指超過20個胺基酸殘基的序列，包括完整的任意長度的蛋白質。所述可檢測肽或多肽是可直接檢測的或是可反應的，從而產生可檢測到的信號。例如，所述可檢測肽可以是一段抗原肽或表位，其例如可以表達在跨膜蛋白的氨基端。使用所述表位的可檢測的特異性抗體來檢測該表位，以確定細胞中所述跨膜蛋白的分布情況。可從商業渠道獲得許多合適的表位抗體系統。例如，HA(Roche Diagnostics)、FLAG(Sigma Chemical公司)、c-myc(Santa Cruz)、組氨酸六聚物(BD Biosciences Clontech)、GST(ABR AffinityBioReagents)、V5(Abcam)和Xpress(Invitrogen)的表位/抗體系統。
編碼所述表位的核苷酸序列及其特異性抗體可以購買到。所述抗體可攜帶一個可檢測標籤(例如，異硫氰酸螢光素(FITC))，或者其自身可被攜帶一個可檢測標籤的二抗檢測到，所述情況為本領域的技術人員所熟知。本發明的所述實施方案尤其適應於自動化或半自動化的方法，例如，通過在自動化的平板讀數器中檢測抗體處理後的細胞平板，可以實現高通量篩選。
所述可檢測多肽可以是一種光學上可檢測到的多肽，例如綠色螢光蛋白(GFP)、紅色螢光蛋白(RFP)、黃色螢光蛋白(YFP)和/或青色螢光蛋白(CFP)，或者所述蛋白的任何修飾後的變異體，上述蛋白均可從商業途徑獲得。所述可檢測多肽也可以是酶，例如螢光素酶或β-半乳糖苷酶，其能夠反應而最終形成可檢測到的終點如發光或顏色改變。編碼所述多肽的核苷酸序列已經可以從例如Clontech公司等處獲得，並被連接到編碼含有NLS的跨膜蛋白的核苷酸序列上，其中優選連接在該跨膜蛋白的C(羧基)末端上。
在一個進一步的實施方案中，所述可檢測成分是抗原肽，其包括跨膜蛋白自身胺基酸序列的一部分，優選跨膜蛋白的胞外區的一部分。如上所述，使用可檢測的表位特異性的抗體可以確定細胞中跨膜蛋白的分布情況。可從商業渠道獲得合適的抗體，例如，抗人D1多巴胺受體氨基端9-21個胺基酸的抗-D1抗體，或者以常規方法製備抗體。
在一個進一步的實施方案中，將已知配體施用於跨膜蛋白，將編碼至少含有一個NLS的跨膜蛋白的一段核苷酸序列轉染細胞。如上文所述，將細胞與候選化合物接觸並溫育。然後收穫所述細胞並分離其細胞膜，將跨膜蛋白的可檢測的標記配體與該細胞膜接觸，所述標記配體是例如放射性標記的配體。相對於結合在未接觸所述候選化合物的對照細胞的細胞膜部分的數量，確定在接觸所述候選化合物的細胞膜上結合的標記配體的含量，能夠定量測定保留在細胞表面上的跨膜蛋白，以及指示所述候選化合物與跨膜蛋白之間的相互作用。
編碼跨膜蛋白的核苷酸序列可從公共資料庫或商業資料庫獲得，所述公共資料庫如GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez)。構建完成的合適序列可以通過常規方法合成獲得，或者從商業渠道獲得，所述常規方法將在本文的實施例中描述。
「一種含有NLS的跨膜蛋白」包括一種在其野生型序列中含有一個NLS的跨膜蛋白，和一種對其胺基酸序列進行修改而含有一個NLS的跨膜蛋白。
常規的NLS是短肽序列，其能夠促進含有它們的蛋白質的核定位(參見例如表1以及Jans等，2000年，表1中列出了NLS)。NLS有3個主要類別；其中2個類別由鹼性胺基酸殘基組成，分別是單部分NLS和兩部分NLS，前者例如SV40大腫瘤抗原PKKKRKV，其由單一一段鹼性胺基酸組成，後者包括兩段鹼性胺基酸，由10-22個胺基酸(有時達數百個胺基酸)隔開。其他類型的NLS例如酵母蛋白Mata2 NLS或者原癌基因c-myc NLS，前者的非極性殘基序列中含有帶電荷/極性殘基，後者的鹼性殘基兩側的脯氨酸和天冬氨酸是核靶向所必需的(PAAKRVKLD)。α-β-importin能夠特異性識別全部類別的NLS。
在本發明的方法中可以使用任何NLS。如本文所述，編碼選定的NLS的核苷酸序列可以來自於NLS的胺基酸序列，且使用常規方法合成所述NLS核苷酸序列，並將其整合入編碼跨膜蛋白的核苷酸序列中。跨膜蛋白上的任何胞內環或胞內末端上的許多不同位置均適於插入NLS。優選在跨膜蛋白的胞內結構域中插入NLS。例如在GPCR中，NLS可被置於任意胞內環或胞內的羧基端尾部上。在12次跨膜的轉運蛋白中，NLS可被置於胞內的氨基端或羧基端，或者任何胞內環上。
當在跨膜蛋白中插入NLS用於本發明的方法中時，以如下方法篩選所述插入的效率確認在24-48小時內含有NLS的跨膜蛋白基本上從細胞膜轉位至細胞核中，且所述跨膜蛋白的配體能夠幹擾所述轉位。
通過常規方法，可以將編碼含有NLS的跨膜蛋白的核苷酸序列與編碼可檢測肽或多肽的序列連接在一起。
用編碼選定的含有NLS的跨膜蛋白的核苷酸序列轉染有核細胞，所述跨膜蛋白含有或偶聯於一種可檢測成分，上述過程通過將所述序列克隆入含有合適啟動子的載體系統而實現，並採用了在科學文獻中描述的常規技術，所述科學文獻例如《最新分子生物學實驗方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(1987年)。合適的載體包括pEGF-N1(Clontech)和pcDNA，前者含有人巨細胞病毒(CMV)啟動子。
可以使用任何能夠表達所轉染的核苷酸序列的細胞，並且在該細胞中，NLS能夠促進跨膜蛋白脫離細胞膜的轉運過程。合適的細胞包括原核細胞和真核細胞，前者包括細菌細胞。合適的真核細胞包括分離得到的哺乳動物細胞、酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞、線蟲細胞和真菌細胞。合適的哺乳動物細胞包括人細胞系、齧齒動物細胞系、倉鼠細胞系和非人靈長類動物細胞系。
在一個實施方案中，用許多核苷酸序列轉染細胞，每個序列編碼一個不同的含有NLS的跨膜蛋白和一個不同的可檢測成分。通過鑑定可檢測成分，其脫離細胞表面的運動被阻斷的現象，可以將受試化合物幹擾跨膜蛋白脫離細胞膜的轉運的現象與所述化合物與特定跨膜蛋白之間的相互作用聯繫起來。
在一個進一步的實施方案中，為了實施高通量的初始篩選，用大量核苷酸序列轉染細胞，每個序列編碼一個不同的含有NLS的跨膜蛋白和一個可檢測成分，其中，一些可檢測成分在不止一個跨膜蛋白中是相同的。如果初始篩選表明一個候選化合物與一個或多個跨膜蛋白相互作用，則使用表達更少一些跨膜蛋白或僅表達一個跨膜蛋白的細胞再次篩選該化合物，直到鑑定出具有特異性相互作用的跨膜蛋白。
如本文所討論的，在轉染有不止一個跨膜蛋白的細胞中，跨膜蛋白對之間可能出現寡聚化現象，該現象可能影響對候選化合物作用的解釋。隨後使用只轉染有一個跨膜蛋白的細胞對所述化合物進行的再篩選，能夠明確所述化合物和特定跨膜蛋白之間的相互作用。
另外，在跨膜蛋白之間沒有顯示出寡聚化現象的多重轉染細胞中，也可以選擇出所述跨膜蛋白。
相互作用的化合物的鑑定在本發明的一個實施方案中，用編碼一個蛋白質的一段核苷酸序列轉染有核細胞，所述蛋白質包括含有一個NLS的跨膜蛋白和一個可檢測成分，然後將所述細胞溫育一段合適的時間，以使NLS-跨膜蛋白表達和開始聚集在細胞膜上。例如，對於GPCR和轉運蛋白而言，所述合適的溫育時間是約6-24小時。通過觀察細胞膜上蛋白質的聚集情況，本領域的技術人員可以容易地確定其他跨膜蛋白的合適溫育時間。當加入候選化合物時，並不需要全部表達的跨膜蛋白均到達細胞膜上。隨後將受試細胞與需要檢測與跨膜蛋白之間相互作用的候選化合物接觸一段時間，該時間是指，相對於未使用化合物處理的對照細胞，足夠大部分NLS-跨膜蛋白轉位脫離細胞膜並進入或朝向細胞核所需的時間，所述大部分NLS-跨膜蛋白的比例優選為至少20％，更優選為至少50％，更進一步優選為至少90％。
根據所用的跨膜蛋白的不同，所述溫育時間可為約6-72小時；對於大部分待檢測的跨膜蛋白，合適的溫育時間是約24-48小時。通過觀察對照細胞，本領域的技術人員可以容易地確定合適的溫育時間。
用於檢測的受試化合物的初始濃度通常為約1-10微摩爾。
然後，通過檢測受試細胞和對照細胞來確定可檢測成分的分布情況，因而進一步確定NLS-跨膜蛋白的分布情況。可以採用各種方法確定可檢測成分的分布情況。例如，當可檢測成分是光學上可檢測到的蛋白質時，可以直接通過顯微鏡來檢測細胞，比較受試細胞和對照細胞核內所述蛋白的含量。在另一個實施方案中，對留在對照細胞和受試細胞膜上的可檢測蛋白或肽的含量進行比較。在每個視野中含有30-100個細胞的數個顯微鏡視野(5-10個)中，確定這些細胞中可檢測成分的位置，並對每個位置進行計數。在受處理的細胞和對照細胞中，計算具有細胞表面標記或核標記的細胞的百分數和全部視野中的細胞總數。
如上文所述，在一個進一步的實施例中，當可檢測成分是一種抗原表位時，將細胞與一種含有針對所述表位的特異性抗體的可檢測抗體系統接觸。例如，可以使用針對表位的特異性一抗，然後使用特異針對一抗的螢光素標記的二抗，所述螢光信號可使用螢光計進行定量。
如果對照細胞中大量跨膜蛋白轉位脫離細胞膜，所述比例優選為至少50％，並且相對於對照細胞，受試細胞中的跨膜蛋白保留在細胞膜上，則表明受試化合物與跨膜蛋白之間存在相互作用。在優選的實施方案中，受試細胞的細胞膜上的蛋白水平比對照細胞膜上的高至少10％，優選至少15％，更優選至少20％時，則表明存在相互作用。
將細胞暴露於與其具有相互作用的化合物後，停留在細胞膜上的可檢測成分的比例與所述化合物的濃度和效能相關。例如，使用微摩爾濃度的一種已知的強效GPCR拮抗劑後，通常導致約50-100％的跨膜蛋白保留在細胞表面，0-15％在細胞核中，而剩餘部分則存在於胞漿中。使用濃度更低的納摩爾級的相同拮抗劑後，導致20-40％的跨膜蛋白保留在細胞表面，剩餘部分存在於胞漿和細胞核中。在未處理的對照細胞中，在細胞表面可檢測到0-15％的跨膜蛋白，剩餘部分在胞漿和細胞核中。
如上文中所討論的，在另一種形式的所述方法中，所用的跨膜蛋白具有已知的配體，表達的含有NLS的跨膜蛋白不含可檢測成分，通過分離細胞膜成分並使用可檢測的標記配體分析膜成分上的跨膜蛋白組分，來確定受試化合物處理後的細胞中的跨膜蛋白的分布情況。
在本發明的一個進一步的實施方案中，一種相似的方法被用於鑑定與NLS-跨膜蛋白相互作用的化合物，所述相互作用促進該跨膜蛋白脫離細胞表面，運向或運入細胞核。轉染細胞並溫育之，使NLS-跨膜蛋白被表達並聚集在細胞表面上。在優選的情況下，對所述細胞進行溫育，直至約70-90％的被表達的跨膜蛋白聚集在細胞表面。對許多跨膜蛋白而言，在轉染後溫育12-24小時是合適的。
然後將受試細胞與候選化合物接觸，並立即對單個檢測和對照細胞進行多至4小時的實時觀察，以觀察可檢測成分的分布情況。與對照細胞相比，受試細胞核中可檢測成分聚集的增加，表明受試化合物能夠促進跨膜蛋白的轉位。在一個優選的實施方案中，受試細胞核中可檢測成分聚集增加的比例至少為5％，優選為至少10％，更優選為至少20％時表明存在相互作用。
在本發明的一個進一步的實施方案中，在一個鑑定化合物的方法中，雖然所述化合物自身並不能阻斷含有NLS的跨膜蛋白脫離細胞膜的轉位過程，但是卻可以幹擾跨膜蛋白和能夠與之相互作用的化合物之間的相互作用。
在上述第一種篩選方法中證明為陰性的化合物，可以在所述進一步的方法中檢測出具有與某種化合物競爭的能力，所述某種化合物已知能夠與跨膜蛋白相互作用。
在所述方法中，以如上文所述的方式轉染細胞，並溫育一段合適的時間，使跨膜蛋白被表達並聚集在細胞表面上，所述合適的時間約為24-48小時。
而後將受試細胞和對照細胞與下列物質接觸約24-48小時已知能夠與跨膜蛋白相互作用的化合物、已知配體或者通過上述方法鑑定得到的相互作用化合物。然後將受試細胞和候選化合物接觸，之後1-24小時內以一個或多個時間點觀察受試細胞和對照細胞，以上文所述的方式確定細胞中NLS-跨膜蛋白的分布情況。在對照細胞中，已知能夠相互作用的化合物使跨膜蛋白保留在細胞膜上。如果所述候選化合物能夠與具有相互作用能力的化合物競爭，則受試細胞中保留在細胞表面上的跨膜蛋白減少，而轉位脫離細胞表面的增加。在優選的實施方案中，表明所述相互作用的受試細胞膜上跨膜蛋白減少的比例至少為10％，優選為至少15％，更優選為至少20％。
在一個進一步的實施方案中，可以使用內源性表達含有NLS的跨膜蛋白的細胞，並將其與第一種化合物共同使用，所述化合物已經證明能夠和所述蛋白相互作用並抑制該蛋白離開細胞膜，從而使之保留在細胞膜上。當所述系統與候選化合物接觸時，如果該化合物能夠與跨膜蛋白相互作用並與第一種化合物競爭，則可以觀察到細胞膜上所述跨膜蛋白離開細胞膜的轉運增強。
使用其他蛋白質鑑定跨膜蛋白的相互作用許多跨膜蛋白都能夠形成同源寡聚體和異源寡聚體，所述跨膜蛋白包括GPCR、轉運蛋白、酪氨酸激酶受體、胰島素和胰島素樣生長因子、表皮生長因子和血管內皮生長的細胞因子受體(例如可參見George等的GPCR綜述，2002年)。本文中所用的蛋白質「寡聚化」一詞指兩個或更多蛋白分子的結合。
對於假設的受體A和B而言，細胞表面可含有二聚體AA、BB和AB，並相信其可代表三種不同的功能複合物，即三種不同的藥物靶點。因此，鑑定哪些跨膜蛋白能通過寡聚化在相互之間或與其他蛋白質之間相互作用是十分重要的。
在進一步的實施方案中，本發明提供了一些方法，這些方法用於確定兩種跨膜蛋白是否能夠寡聚化，或者一種跨膜蛋白和一種非跨膜蛋白是否能夠寡聚化。
在一個實施方案中，將第一種核苷酸序列和第二種核苷酸序列轉染有核細胞，前者編碼含有一個NLS的第一種跨膜蛋白，後者編碼無NLS但攜帶有或偶聯有可檢測成分的第二種跨膜蛋白。製備所述核苷酸序列的方法如上所述。在經過用於表達所述蛋白的一段合適時間間隔後，跨膜蛋白聚集在細胞膜上，而後含有NLS的跨膜蛋白離開細胞膜運入或運向細胞核，細胞中可檢測成分的分布情況得到確定，所述確定方法例如檢測細胞核中可檢測成分的增加或細胞表面可檢測成分的減少。
使用兩種核苷酸序列同時轉染細胞，除了第一種跨膜蛋白含有插入的NLS而另一種不含有NLS之外，所述第一種和第二種跨膜蛋白是相同的，此時發現與只轉染含有NLS的跨膜蛋白的核苷酸序列的細胞相比，所述轉染兩種核苷酸序列的細胞中的含有NLS的跨膜蛋白向細胞核轉位的速度減慢。現已知跨膜蛋白向核轉位的過程可能需要約24-48小時。因此在所述方法中，在溫育細胞大約24-48小時後檢測細胞中跨膜蛋白的分布情況。
可檢測成分從細胞表面的轉位或向細胞核的轉位表明，第一種跨膜蛋白攜帶第二種跨膜蛋白離開細胞表面，這表明第一種和第二種跨膜蛋白發生了寡聚化。可檢測成分保留在細胞表面表明所述兩種跨膜蛋白不存在相互作用。
當第一種和第二種跨膜蛋白相同時，所述方法可用於鑑定所述蛋白形成同源二聚體的能力。當第一種和第二種跨膜蛋白不同時，所述方法可用於鑑定所述兩種不同蛋白形成異源二聚體的能力，也可用於確定所述兩種跨膜蛋白間相互作用的特異性。
在缺乏配體激活或存在兩種蛋白中的任意一種的配體時，可施行所述方法。
使用所述方法可以證明，寡聚化作用存在於不同GPCR類別之間或內部，也存在於跨膜蛋白的其他類別之間或內部。
此外，在GPCR和非GPCR跨膜蛋白之間、跨膜蛋白和非跨膜蛋白之間均檢測到相互作用，前者例如D5多巴胺受體和GABA-A受體。
因此，通過上述方法，本發明大體上提供了用於檢測兩種蛋白質之間寡聚化作用的方法，其中，細胞共轉染了一個含有NLS的蛋白質和另一個攜帶有可檢測信號的蛋白質。
將含有NLS的第一種跨膜蛋白和由可檢測成分標記的第二種蛋白共轉染細胞，該細胞可用於篩選與第一種或第二種跨膜蛋白相互作用的候選化合物，所述第二種跨膜蛋白例如來自不同類別的跨膜蛋白，並由本發明中的方法確定為可以與第一種蛋白寡聚化。與所述兩種蛋白中的任意一種相互作用的化合物將會影響其寡聚化，或影響寡聚化的蛋白離開細胞膜的轉位過程。採用所述方法可以鑑定以下現象與跨膜蛋白對中的一種或寡聚物相互作用的化合物，是導致可檢測蛋白保留在細胞表面上，還是導致可檢測蛋白加速離開細胞表面的轉位過程。
在一個進一步的實施方案中，將編碼第二種跨膜蛋白的核苷酸序列轉染內源性表達含有NLS的跨膜蛋白的細胞，所述第二種跨膜蛋白攜帶有可檢測成分而缺乏NLS。可檢測成分從細胞膜運入或運向細胞核的運輸過程，顯示了所述兩種蛋白的寡聚化作用。
在一個進一步的實施方案中，含有NLS的膜蛋白可用於鑑定新的相互作用蛋白。在該方法中，在細胞中表達含有NLS的跨膜蛋白，並允許其向細胞核轉位。然後收集細胞核，通過考馬斯染色或銀染來確定新出現的蛋白條帶，再用質譜進行鑑定。對照是表達不含NLS的膜蛋白的細胞的核。
採用FRET檢測核轉位在本發明的另一方面，包括了螢光共振能量轉移(FRET)(Hailey等，2002年)，將編碼含有NLS的第一種跨膜蛋白的第一種核苷酸序列和編碼不含NLS的第二種跨膜蛋白的第二種核苷酸序列共轉染有核細胞，所述第一種跨膜蛋白偶聯於第一種光學上可檢測的蛋白質，所述第二種跨膜蛋白偶聯於第二種光學上可檢測的蛋白質，其中，當兩種跨膜蛋白非常接近時，所述第二種光學上可檢測的蛋白質上的螢光素被第一種光學上可檢測的蛋白質的發射光激活。例如，第一種蛋白偶聯的GFP可出現雷射激發的發射光譜，該發射光譜激活了第二種任何其他光學上可檢測的成分。GFP激活所述第二種光學可檢測成分後，該成分以不同的波長發光。當兩種跨膜蛋白之間形成寡聚物時，兩種標籤非常接近，則可以檢測到它們之間的FRET的相互作用。採用FRET方法或其改變的方法，通過供體的選擇性螢光素激活和受體的發光檢測來檢測蛋白間的物理相互作用，所述FRET方法的改變方法例如光漂白FRET、FRAP或FLIM。缺乏FRET相互作用表明不存在寡聚化作用。
在兩個螢光分子的FRET中進行共聚焦顯微鏡觀察(例如，GFP和DsRed2(海葵紅色螢光蛋白2)的光譜對，或者CFP和YFP的光譜對)以獲得可定量的信號，該信號顯示細胞核轉位。FRET需要供體和受體分子的發射和激發光譜之間存在重疊，及距離小於100埃(10-100埃)，這使FRET成為分析細胞中接近的特異性蛋白-蛋白相互作用的非常合適的系統。上文中列出的螢光蛋白是具有上佳光譜範圍的參與反應的分子。當標記有第二種螢光團的跨膜蛋白轉位至細胞核時，核內自有的螢光團將會引起FRET。使用FRET平板讀數器有助於簡便地讀取數據。所述方法對於檢測兩個跨膜蛋白之間或一個跨膜蛋白和另一個蛋白之間的相互作用是有用的，並提供了更易於自動化的信號讀取方式。
所述方法也可用於GPCR激動劑和拮抗劑的篩選過程中。在篩選所述拮抗劑的方法中，與未處理的細胞相比，受處理細胞中運輸至細胞核的GPCR-NLS-GFP蛋白與細胞核中的螢光團之間的FRET信號的減弱，表明拮抗劑效應。在篩選所述激動劑的方法中，與未處理的細胞相比，受處理細胞中運輸至細胞核的GPCR-NLS-GFP蛋白與細胞核中的螢光團之間的FRET信號的增強，表明激動劑效應。在一個進一步的實施方案中，由於用激動劑處理細胞可能增強寡聚化作用，因此在檢測寡聚化作用之前先用激動劑處理經共轉染的細胞。在檢測受體受體相互作用的方法中，GPCR-NLS-GFP蛋白與第二個GPCR-DsRED蛋白共表達。如果所述受體彼此相互作用並共同運輸至細胞核，則可以檢測到核FRET信號。如果所述受體不發生相互作用，則在核中無法檢測到FRET信號。FRET也可用於檢測結合有螢光團的兩種抗體間的相互作用，所述抗體識別GPCR上整合的或天然的表位。
實施例下列實施例起到闡明本發明的目的，而非用於限制本發明的範圍。
本說明書和實施例中提到了化學、分子生物學、蛋白質和肽生物化學及免疫學的方法，但是對所述方法沒有進行詳細描述，這些方法在科學文獻中有報導，這是本領域的技術人員所熟知的。
材料和方法綠色螢光蛋白編碼海洋生物水母綠色螢光蛋白(Prasher等，1992年)的DNA(脫氧核糖核酸)序列來自於美國的Clontech。
紅色螢光蛋白編碼紅色螢光蛋白(Matz等，1999年)pDsRed2和pDsRed2-nuc的DNA序列來自於美國的Clontech。這種構建體編碼源自於海葵的蛋白質。
COS細胞和HEK細胞，來自於哥倫比亞特區華盛頓的美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)。細胞培養基由多倫多大學(University of Toronto)實驗室製備。
拮抗劑和激動劑化合物，來自於各種商業途徑，例如美國Sigma化學公司(Sigma Chemical Company)。
用於表位標籤的免疫檢測的抗體，其來源如下抗HA單克隆抗體來自於美國Roche Diagnostics；抗FLAG單克隆抗體來自於美國SigmaChemical Company；抗c-myc單克隆抗體來自於美國Santa Cruz。
用於受體結合檢測的放射性配體3H-SCH 23390，來自於美國的NENPerkin Elmer。
DNA構建體的製備編碼GPCR或轉運蛋白的核苷酸序列來自於Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez)網站，該網址由美國國家科學圖書館(National Library of Science)建立。將編碼選定的跨膜蛋白的核苷酸序列與編碼選定的可檢測的信號蛋白的核苷酸序列連接在一起。所述構建體克隆入pEGFP(Clontech)或pDsRed2-N1載體或載體pcDNA3的載體系統中。
1a.將含有NLS的人D1多巴胺受體構建在羧基尾部的近端(螺旋8)，並將其與GFP融合(D1-GFP和D1-NLS-GFP)。
使用如下實驗條件的PCR(聚合酶鏈反應)方法，對pcDNA3載體中編碼人D1多巴胺受體的DNA序列進行擴增。PCR反應混合物含有水(32微升)、10×Pfu緩衝液(Stratagene)(5微升)、dNTP(2』-脫氧核苷5』-三磷酸，10mM(毫摩爾每升))、DMSO(5微升)、寡核苷酸引物(100ng(納克))(每種1微升)、DNA模板(100ng)和Pfu酶(5個單位)。總體積為50微升。使用下列PCR反應條件第一個循環以94℃維持2分鐘，之後的30-35個循環中以94℃維持30秒、55℃維持30秒和72℃維持1分鐘為每個循環的條件，最後再以72℃維持5分鐘。
用於擴增編碼D1多巴胺受體DNA的引物對如下HD1-P15』GAGGACTCTGAACACCGAATTCGCCGCCATGGACGGGACTGGGCTGGTG 3』HD1-P25』GTGTGGCAGGATTCATCTGGGTACCGCGGTTGGGTGCTGACCGTT 3』引物HD1-P1上整合有限制性內切酶EcoR1的酶切位點，引物HD1-P2上整合有限制性內切酶Kpn1的酶切位點。不含終止密碼子的PCR產物以單一方向亞克隆入pEGFP載體(來自Clontech)的EcoR1和Kpn1酶切位點上，並符合GFP蛋白起始密碼子的讀框。
以PCR的方法，將來自於人AT1受體的NLS序列KKFKR插入到編碼D1多巴胺受體的TM7(螺旋8)鹼基的DNA中，替代了編碼DFRKA的天然序列。
用於構建編碼D1-NLS的DNA的引物對如下HD1-NLSF5』CCTAAGAGGGTTGAAAATCTTTTAAATTTTTTAGCATTAAAGGCATAAATG 3』HD1-NLSR5』GCCTTTAATGCTAAAAAATTTAAAAGATTTTCAACCCTCTTAGGATGC 3』以編碼D1-GFP的DNA為模板、HD1-P1和HD1-NLSF為引物的PCR反應，可以得到1000bp(鹼基對)的產物(PCR#1)。以編碼D1-GFP的DNA為模板、HD1-P2和HD1-NLSR為引物的PCR反應，可以得到300bp的產物(PCR#2)。隨後進行以PCR#1和PCR#2的產物為模板、HD1-P1和HD1-P2為引物的PCR反應，得到1300bp的產物。將得到的編碼D1-NLS的DNA亞克隆入pEGFP載體中的EcoR1和Kpn1限制性酶切位點處。
除了下文所述的特異性引物之外，使用與上述相同的PCR方法和實驗條件製備下文所述的D1多巴胺受體的全部其他構建體。
1b.構建含有NLS的人多巴胺D1受體，並將其與RFP融合(D1-NLS-RFP)。
使用如下PCR方法，將NLS序列KKFKR插入人D1受體胞內羧基尾部的螺旋8片段。以pcDNA3載體中編碼人D1的DNA為模板、HD1-P1和HD1-NLSR為引物的第一次PCR反應，可以得到1kb(千鹼基對)的產物。以HD1-P2和HD1-NLSF為引物的第二次PCR反應得到了300bp的產物。以PCR#1和PCR#2的產物為模板、HD1-P1和HD1-P2為引物的最終PCR反應，得到了1.3kb的產物。
得到的D1NLS亞克隆入pDsRed載體(Clontech)的EcoR1和Kpn1酶切位點處，並與RFP融合。
引物序列如下HD1-P15』GAGGACTCTGAACACCGAATTCGCCGCCATGGACGGGACTGGGCTGGTG 3』HD1-P25』GTGTGGCAGGATTCATCTGGGTACCGCGGTTGGGTGCTGACCGTT 3』HD1-NLSF5』GCCTTTAATGCTAAAA TTTAAAAGATTTTCAACCCTCTTAGGATGC 3』HD1-NLSR5』CCTAAGAGGGTTGAAAATCTTTTAAATTTTTTAGCATTAAAGGCATAAATG 3』D1-野生型NPIIYAFNADFRKAFSTLLD1NLS-螺旋8NPIIYAFNAKKFKRFSTLL1c.將具有紅細胞凝集素(HA)表位標籤的多巴胺D1受體構建在氨基末端。
HA標籤如下核苷酸序列TACCCTTACGACGTGCCGGATTACGCC，胺基酸序列YPYDVPDYA。
將HA表位標籤插入人D1受體氨基末端時，使用D1-pcDNA3為模板和以下序列為引物P1HA-BamH5』ggatccactagtaacggccgccagaccaccATGGGATACCCGTACGACGTCCCCGACTACGCAAGGACTCTGAACACCTCTGCC 3』P2-Not15』ggccgccagctgcgagTTCAGGTTGGGTGCTGACCG 3』擴增得到的cDNA(互補DNA)(1.3kb)亞克隆入pcDNA3載體中BamH1和Not1酶切位點處。
D1野生型MRTLNTSAMDGTGLVVD1-HA標籤MGYPYDVPDYARTLNTSAMDGTGLVV1d.將含有HA表位和NLS的人多巴胺D1受體(D1HA-NLS)構建在羧基尾部(螺旋8)的近端。
使用引物對和編碼D1-HA的DNA為模板擴增編碼D1-NLS(螺旋8)的DNA。以DNA D1-HA為模板、T7和HD1-NLSR為引物擴增出1000bp的DNA產物(PCR#1)。以DNA D1-HA為模板、Sp6和HD1-NLSR為引物擴增出300bp的DNA產物(PCR#2)。以T7和Sp6為引物、PCR#1和PCR#2的產物為模板擴增出1300bp的產物(PCR#3)。
HD1-NLSR5』CCTAAGAGGGTTGAAAATCTTTTAAATTTTTTAGCATTAAAGGCATAAATG 3』HD1-NLSF5』GCCTTTAATGCTAAAAAATTTAAAAGATTTTCAACCCTCTTAGGATGC 3』D1HA-NLS(螺旋8)的PCR產物為平末端，插入pcDNA3中的EcorV酶切位點處。對插入方向正確的克隆測序。
D1-HA野生型NPIIYAFNADFRKAFSTLLD1HA-NLS(螺旋8)NPIIYAFNAKKFKRFSTLL1e.將具有NLS的多巴胺D1受體構建在胞內環3上，並將其與GFP融合(D1-NLS-IC3-GFP)。
用於構建D1-NLS-IC3-GFP的引物對如下D1NLSF-IC35』GGAAAGTTCTTTTAAGAAGAAGTTCAAAAGAGAAAC 3』D1-NLSR-IC35』GTTTCTCTTTTGAACTTCTTCTTAAAAGAACTTTCC 3』使用D1 pcDNA3作為模板PCR#1引物HD1-P1和D1NLSR-IC3；PCR#2引物HD1-P2和D1NLSF-IC3(500bp)PCR#3引物HD1-P1和HD1-P2，使用PCR#1和PCR#2為模板(1.3kb)。
將得到的編碼D1-NLS-IC3的DNA片段亞克隆入pEGFP載體的EcoR1和Kpn1酶切位點處。
D1野生型QPESSFKMSFKRETKVLD1-NLS-IC3QPESSFKKKFKRETKVL以D1 pcDNA3為模板，將NLS序列KKFKR插入D1受體胞內環3的片段上，替代了序列MFSKR。
以pcDNA3上編碼D1的DNA為模板、HD1-P1和D1-NLSR-IC3為引物的PCR反應，得到800bp的產物(PCR#1)。以pcDNA3上編碼D1的DNA為模板、HD1-P2和HD1-NLSF-IC3為引物的PCR反應，得到500bp的產物(PCR#2)。以PCR#1和PCR#2的產物為模板、HD1-P1和HD1-P2為引物進行的後續PCR反應，得到1300bp的產物(PCR#1)。將得到的編碼D1-NLS的構建體亞克隆入pEGFP載體中的EcoR1和Kpn1限制性位點處。
1f.在胞內環2上構建具有NLS的人D1多巴胺受體，並將其與GFP融合(D1-NLS-IC2-GFP)。
用於構建編碼D1NLS-IC2的引物對如下D1NLSF-IC25』CCGGTATGAGAAAAAGTTTAAACGCAAGGCAGCCTTC 3』D1-NLSR-IC25』GGCTGCCTTGCGTTTAAACTTTTTCTCATACCGGAAAGG 3』以pcDNA3上編碼D1多巴胺受體的DNA為模板、HD1-P1和D1NLSR-IC2為引物進行PCR擴增(PCR#1)，得到500bp的產物。以pcDNA3上編碼D1多巴胺受體的DNA為模板、HD1-P2和D1NLSF-IC2為引物進行PCR擴增(PCR#2)，得到800bp的產物。以HD1-P1和HD1-P2為引物、PCR#1和PCR#2為模板進行後續PCR擴增，得到1300bp的產物。
將PCR得到的編碼D1NLS-IC2的DNA亞克隆入pEGFP載體中的EcoR1和Kpn1酶切位點處。
D1-野生型NPFRYERKMTPKAAFILID1-NLS-IC2NPFRYEKKFKRKAAFILI
1g.在胞內環1上構建具有NLS的人D1多巴胺受體，並將其與GFP融合(D1-NLS-IC1-GFP)。
用於構建編碼D1-NLS-IC1的DNA的引物對如下D1-NLSF-IC15』GTGCTGCCGTTAAAAAGTTCAAACGCCTGCGGTCCAAGG 3』D1-NLSR-IC15』GGACCGCAGGCGTTTGAACTTTTTAACGGCAGCACAGACC 3』以pcDNA3上編碼D1多巴胺受體的DNA為模板、HD1-P1和D1-NLSR-IC1為引物進行PCR擴增(PCR#1)，得到300bp的產物。以pcDNA3上編碼D1多巴胺受體的DNA為模板、HD1-P2和D1NLSF-IC1為引物進行PCR擴增(PCR#2)，得到1000bp的產物。以HD1-P1和HD1-P2為引物、PCR#1和PCR#2為模板進行後續PCR擴增，得到1300bp的產物。
將PCR得到的編碼D1-NLS-IC1的DNA亞克隆入pEGFP載體中的EcoR1和Kpn1酶切位點處。
D1-野生型LVCAAVIRFRHLRSKVTND1-NLS-IC1LVCAAVKKFKRLRSKVTN1h.在羧基尾部的近端構建具有另外的NLS的人多巴胺D1受體，並將其與GFP融合(D1-NLS2-GFP)。
使用PCR方法用NLS序列PKKKRKV替代D1受體中的天然序列ADFRKAF。以pcDNA3上編碼D1多巴胺受體的DNA為模板、HD1-P1和HD1-NLS2R為引物進行PCR擴增，得到1kb的產物(PCR#1)。以pcDNA3上的D1為模板、HD1-P2和HD1-NLS2F為引物進行另一個PCR擴增，得到300bp的產物(PCR#2)。以HD1-P1和HD1-P2為引物、PCR#1和PCR#2為模板進行第三次PCR擴增，得到1.3kb的產物，並將此產物亞克隆入pEGFP載體中的EcoR1和Kpn1酶切位點處。
HD1-NLS2F5』GCCTTTAATCCTAAAAAAAAAAGAAAGGTTTCAACCCTCTTAGG 3』HD1-NLS2R5』CCTAAGAGGGTTGAAACCTTTCTTTTTTTTTTAGGATTAAAGGC 3』
D1-野生型NPIIYAFNADFRKAFSTLLD1-NLS2NPIIYAFNPKKKRKVSTLL2.構建與GFP融合的多巴胺D2受體和與GFP融合的D2-NLS多巴胺受體(D2-GFP和D2-NLS-GFP)。
用於擴增pcDNA3上編碼D2-多巴胺受體的DNA的引物對如下HD2-P15』GGCCGTGGCTCCACCGAATTCGCCGCCATGGATCCACTGAATCTG 3』HD2-P25』CTGTGCGGGCAGGCAGGGTACCGCGCAGTGGAGGATCTTCAGG 3』引物HD2-P1上整合有限制性位點EcoR1，引物HD2-P2上整合有限制性位點Kpn1。將不含有終止密碼子的D2-PCR產物單方向地亞克隆入pEGFP載體(Clontech)中的限制性位點EcoR1和Kpn1處，且符合GFP蛋白起始密碼子的讀碼框。
用於構建D2-NLS-GFP的引物對如下HD2-NLSF5』CACCACCTTCAACAAAAAATTCAAAAGAGCCTTCCTGAAGATCC 3』HD2-NLSR5』GGATCTTCAGGAAGGCTCTTTTGAATTTTTTGTTGAAGGTGGTG 3』使用D2-GFP DNA構建體為模板，將NLS序列KKFKR插入到D2受體TM7片段的鹼基中，替代序列IEFRK。
以編碼D2-GFP的DNA為模板、HD2-P1和HD2-NLSR為引物進行PCR擴增，得到1300bp的產物(PCR#1)。以編碼D2-GFP的DNA為模板、HD2-P2和HD1-NLSF為引物進行PCR擴增，得到100bp的產物(PCR#2)。以HD2-P1和HD2-P2為引物、PCR#1和PCR#2的產物為模板進行後續PCR擴增，得到1400bp的產物。將得到的編碼D2-NLS的構建體亞克隆入pEGFP載體中的EcoR1和Kpn1酶切位點處。
3.構建編碼與GFP融合的D3和D5多巴胺受體的DNA(D3-GFP和D5-GFP)。
用於擴增pcDNA3上編碼D3-多巴胺受體的DNA的引物對如下
HD3-Hind5』GGCATCACGCACCTCAAGCTTGCCGCCATGGCATCTCTGAGTCAGC 3』HD3-Kpn5』GAGTGTTCCCTCTTCTGCGGTACCGCGCAAGACAGGATCTTGAGG3』引物HD3-Hind上整合有限制性位點HindIII，引物HD3-Kpn上整合有限制性位點Kpn1。將不含終止密碼子的D3-PCR產物單方向亞克隆入pEGFP載體中的限制性位點HindIII和Kpn1處，並符合GFP蛋白起始密碼子的讀碼框。
用於擴增pcDNA3上編碼D5多巴胺受體的DNA的引物對如下T75』AATACGACTCACTATAG 3』HD5-Kpn5』CGCCAGTGTGATGGATAATGGTACCGCATGGAATCCATTCGGGGTG 3』引物HD5-Kpn上整合有限制性位點Kpn1。將不含終止密碼子的D5-PCR產物單方向亞克隆入pEGFP載體中的限制性位點EcoR1和Kpn1處，並符合GFP蛋白起始密碼子的讀碼框。
4.構建與GFP融合的組胺1受體和與GFP融合的組胺1-NLS受體(H1-GFP和H1-NLS-GFP)。
用於從人基因組DNA中擴增編碼H1組胺受體的DNA的引物對如下H1-MET5』GCGCCAATGAGCCTCCCCAATTCC 3』H1-STOP5』GAGCCTCCCTTAGGAGCGAATATGC 3』所述的H1-PCR產物在後續PCR實驗中用作模板。
用於擴增編碼H1-GFP構建體的DNA的引物對如下H1-PST5』CGCCTGCAGGCCGCCATGAGCCTCCCCAATTCCTC C 3』H1-APA5』CCGGTGGATCCCGGGCCCCGGAGCGAATATGCAG 3』引物H1-PST上整合有限制性位點PstI，引物H1-APA上整合有限制性位點ApaI。將不含終止密碼子的H1-PCR產物單方向亞克隆入pEGFP載體中的限制性位點PstI和ApaI處，並符合GFP蛋白起始密碼子的讀碼框。
用於擴增編碼H1-NLS-GFP的DNA的引物H1-NLSR為5』GGGCCCCGGAGCGAATATGCAGAATTCTCTTGAATGTCCTCTTGAATTTTTTATTGCACAAGG 3』。
使用以H1-GFP為模板的PCR方法，將NLS序列KKFKR插入到編碼H1受體的TM7片段的DNA中，替代序列ENFKK。以H1-PST和H1-NLSR為引物的PCR反應的產物長1500bp。將得到的編碼H1-NLS的片段亞克隆入pEGFP載體中的限制性位點PstI和ApaI處。
5.構建融合有GFP的半胱氨醯白三烯受體1和融合有GFP的CysLT1-NLS(CysLT1-GFP和CysLT1-NLS-GFP)。
用於擴增pcDNA3上編碼CysLT1受體的DNA的引物對如下LT1-EcoR15』AAGAATTCGCCACCATGGATGAAACAGGAAATCT G 3』LT1-Kpn15』GGGTACCGCTACTTTACATATTTCTTCTCC 3』引物LT1-EcoR1上整合有限制性位點EcoR1，引物LT1-Kpn1上整合有限制性位點Kpn1。將不含終止密碼子的CysLT1-PCR DNA產物定向亞克隆入pEGFP載體中的限制性位點EcoR1和Kpn1處，並符合GFP蛋白起始密碼子的讀碼框。
用於擴增編碼CysLT1-NLS-GFP的DNA的引物對如下LT1-NLSF5』TTCTTTTCTGGGAAAAAATTTAAGAGAAGGCTGTCTAC 3』LT1-NLSR5』TGTAGACAGCCTTCTCTTAAATTTTTTCCCAGAAAAG 3』使用以編碼CysLT1-GFP的DNA為模板的PCR方法，將NLS序列KKFKR插入到編碼CysLT1的TM7片段的DNA中，代替序列GNFRK。以編碼CysLT1-GFP的DNA為模板、LT1-EcoR1和LT1-NLSR為引物進行PCR擴增，得到900bp的產物(PCR#1)。以編碼CysLT1-GFP的DNA為模板、LT1-Kpn1和LT1-NLSF為引物進行PCR擴增，得到100bp的產物(PCR#2)。以LT1-EcoR1和LT1-Kpn1為引物、PCR#1和PCR#2的產物為模板進行後續PCR擴增，得到1000bp的產物。將得到的編碼CysLT1-NLS的DNA亞克隆入pEGFP載體中的EcoR1和Kpn1酶切位點處。
6.構建融合有GFP的半胱氨醯白三烯受體2和融合有GFP的CysLT2-NLS(CysLT2-GFP和CysLT2-NLS-GFP)。
用於擴增pcDNA上編碼CysLT2的DNA的引物對如下LT2-EcoR15』CTTTTTGTGTCTGTTTCTGAATTCGCCACCATGGAGAGAAAATTTATG 3』LT2-Kpn15』GAACAGGTCTCATCTAAGAGGTACCGCTACTCTTGTTTCCTTTCTC 3』引物LT2-EcoR1上整合有限制性位點EcoR1，引物LT2-Kpn1上整合有限制性位點Kpn1。將不含終止密碼子的CysLT2產物定向亞克隆入pEGFP載體中的限制性位點EcoR1和Kpn1處，並符合GFP蛋白起始密碼子的讀碼框。
用於擴增CysLT2-NLS-GFP的引物對如下LT2-NLSF5』GCTGGGAAAAAATTTAAAAGAAGACTAAAGTCTGCAC 3』LT2-NLSR5』GTCTTCTTTTAAATTTTTTCCCAGCAAAGTAATAGAGC 3』使用PCR方法，將NLS序列KKFKR插入到CysLT2的TM7片段中，代替序列ENFKD。以編碼CysLT2-EGFP的DNA為模板、LT2-EcoR1和LT2-NLSR為引物進行PCR擴增，得到900bp的產物(PCR#1)。以編碼引物LT2-Kpn1和LT2-NLSF的DNA進行PCR擴增，得到200bp的片段(PCR#2)。以LT2-EcoR1和LT2-Kpn1為引物、PCR#1和PCR#2的產物為模板進行後續PCR擴增，得到1100bp的產物。將得到的編碼CysLT2-NLS的DNA亞克隆入pEGFP載體中的EcoR1和Kpn1酶切位點處。
7.構建融合有GFP的M1毒蕈鹼受體和融合有GFP的M1毒蕈鹼NLS受體(M1-GFP和M1-NLS-GFP)。
用於從人基因組DNA上擴增編碼毒蕈鹼受體(M1)的DNA的引物對如下M1-MET5』CCCCACCTAGCCACCATGAACACTTC 3』M1-STOP5』GGGGACTATCAGCATTGGCGGGAGG 3』用於MR1-EGFP的引物對如下M1-PST5』CCCCACCTGCAGCCACCATGAACACTTCAGCC 3』
M1-BAMH5』GGGGAGGATCCGCGCATTGGCGGGAGGGAGT GC3』引物M1-PST上整合有限制性位點PstI，引物M1-BAMH上整合有限制性位點BamHI。將不含終止密碼子的M1 PCR產物定向亞克隆入pEGFP載體中的限制性位點PstI和BamHI處，並符合EGFP蛋白起始密碼子的讀碼框。
用於M1-NLS EGFP的引物對如下M1-NLSF5』CGCACTCTGCAACAAAAAATTCAAACGCACCTTTCGCC 3』M1-NLSR5』GGCGAAAGGTGCGTTTGAATTTTTTGTTGCAGAGTGCG 3』使用MR1為模板的PCR方法，將NLS序列KKFKR插入到M1的TM7片段中，代替序列KAFRD。以編碼MR1的DNA為模板、M1-PST和M1-NLSR為引物進行PCR擴增，得到1200bp的產物(PCR#1)。以編碼MR1的DNA為模板、M1-BAMH和M1-NLSF為引物進行PCR擴增，得到100bp的產物(PCR#2)。以M1-PST和M1-BAMH為引物、PCR#1和PCR#2的產物為模板進行後續PCR擴增，得到1300bp的產物。將得到的編碼MR1-NLS的片段亞克隆入pEGFP載體中的PstI和BamHI酶切位點處。
8.構建融合有GFP的5-羥色胺受體(5HT1B)和融合有GFP的5-羥色胺NLS受體(5HT1B-GFP和5HT1B-NLS-GFP)。
用於從編碼5HT1B受體的質粒pcDNA3上擴增編碼5HT1B受體的DNA的引物對如下5HT1B-E15』GGGGCGAATTCGCCGCCATGGAGGAACCGGGTGC 3』5HT1B-KPN5』GCAAACGGTACCGCACTTGTGCACTTAAAACGTA 3』引物5HT1B-E1上整合有限制性位點EcoR1，引物5HT1B-KPN上整合有限制性位點Kpn1。將不含終止密碼子的5HT1B PCR產物定向亞克隆入pEGFP載體中的限制性位點EcoR1和Kpn1處，並符合GFP蛋白起始密碼子的讀碼框。
用於5HT1B-NLS EGFP的引物對如下5HT1B-NLSE5』ATGTCCAATAAAAAATTTAAAAGAGCATTCCATAAACTG 3』5HT1B-NLSR5』GGAATGCTCTTTTAAATTTTTFATTGGACATGGTATAG 3』使用以5HT1B-EGFP為模板的PCR方法，將NLS序列KKFKR插入到5HT1B的TM7片段中，代替序列EDFKQ。以編碼5HT1B-EGFP的DNA為模板、5HT1B-E1和HD1-NLSF為引物進行PCR擴增，得到1100bp的產物(PCR#1)。以編碼5HT1B-EGFP的DNA為模板、5HT1B-KPN和HD1-NLSR為引物進行PCR擴增，得到100bp的產物(PCR#2)。以5HT1B-E1和5HT1B-KPN為引物、PCR#1和PCR#2的產物為模板進行後續PCR擴增，得到1200bp的產物。將得到的編碼5HT1B-NLS的DNA亞克隆入pEGFP載體中的EcoR1和Kpn1酶切位點處。
9.構建融合有GFP的β2-腎上腺素能受體(β2-AR)和融合有GFP的β2-AR-NLS1受體(β2-AR-GFP和β2AR-NLS1-GFP)。
用於從pcDNA3上擴增編碼β2-AR受體的DNA的引物對如下T75』AATACGACTCACTATAG 3』β2-Kpn5』GCCGCCAGTGTGATGGATACTGGTACCGCTAGCAGTGAGTCATTTGTAC 3』引物β2-Kpn上整合有限制性位點Kpn1。將不含終止密碼子的β2-AR產物定向亞克隆入pEGFP載體中的限制性位點EcoR1和Kpn1處，並符合GFP蛋白起始密碼子的讀碼框。
使用以β2-AR-EGFP為模板的PCR方法，將NLS序列KKFKR插入到β2-AR的TM7片段中，代替序列PDFRI。以編碼β2-AR-EGFP的DNA為模板、T7和B2-NLSR為引物進行PCR擴增，得到1100bp的產物(PCR#1)。以編碼β2-AR-EGFP的DNA為模板、β2-Kpn和B2-NLSF為引物進行PCR擴增，得到300bp的產物(PCR#2)。以T7和β2-Kpn為引物、PCR#1和PCR#2的產物為模板進行後續PCR擴增，得到1300bp的產物。將得到的編碼β2-NLS的DNA亞克隆入pEGFP載體中的EcoR1和Kpn1酶切位點處。
10.構建融合有GFP的、具有另外一個NLS的β2-腎上腺素能受體(β2-NLS2-GFP)。
用於從pcDNA3上擴增編碼β2-NLS2受體的DNA的引物對如下B2D1NLSF5』CCCCTTATCTACGCCTTTAGCGCAAAGAAGTTCAAGCGC 3』B2D1NLSR5』GCGCTTGAACTTCTTTGCGCTAAAGGCGTAGATAAGGGG 3』以編碼β2-AR-GFP的DNA為模板、T7和B2D1NLSR為引物進行PCR擴增，得到1000bp的產物(PCR#1)。以編碼β2-AR-GFP的DNA為模板、β2-Kpn和B2D1NLSF為引物進行PCR擴增，得到300bp的產物(PCR#2)。以T7和β2-Kpn為引物、PCR#1和PCR#2為模板進行後續PCR擴增，得到1300bp的產物。將得到的編碼β2-NLS2的DNA亞克隆入pEGFP載體中的EcoR1和Kpn1酶切位點處。
使用以β2-GFP為模板的PCR方法，將NLS序列AFSAKKFKR插入到β2-AR的TM7片段中，代替序列CRSPDFRIA。
將得到的編碼β2-NLS2的DNA亞克隆入pEGFP載體中的EcoR1和Kpn1酶切位點處。
11.構建融合有GFP的、具有一個另外的NLS的β2-腎上腺素能受體(β2-NLS3-GFP)。
將NLS序列KKFKR插入到β2-AR羧基尾部的近端片段的另一個位置上。以編碼pcDNA3上的β2AR的DNA為模板、T7和rB2-NLS3R為引物進行PCR擴增，得到1000bp的產物。以β2-Kpn和B2-NLS3F為引物進行PCR擴增，得到300bp的產物。以T7和β2-Kpn為引物、PCR#1和PCR#2的產物為模板進行PCR擴增，得到1300bp的產物(β2AR-NLS3)，並將該產物亞克隆入pEGFP載體中的EcoR1和Kpn1酶切位點處。
用於β2-NLS3-GFP的引物對如下B2-NLS3F5』CTGCCGGAGCAAAAAATTCAAAAGAGCCTTCCAGGAGC 3』B2-NLS3R5』CCTGGAAGGCTCTTTTGAATTTTTTGCTCCGGCAGTAG 3』野生型β2NPLIYCRSPDFIRAFQELLβ2AR-NLS3NPLIYCRSKKFKRAFQELL12.構建融合有GFP的多巴胺轉運蛋白(DAT-GFP)。
採用PCR方法擴增編碼人多巴胺轉運蛋白(hDAT)的全長cDNA，該PCR方法以pcDNA3上的DAT為模板，使用引物T7和DT-1(5』CGTCTCTGCTCCCTGGTACCGCCACCTTGAGCCAGTGG 3』)。將不含終止密碼子的所述PCR產物定向亞克隆入pEGFP載體(來自於Clontech)中的限制性位點EcoR1和Kpn1處，並符合GFP蛋白起始密碼子的讀碼框。
13a.構建融合有RFP的、含有NLS的人多巴胺轉運蛋白(DAT-NLS-RFP)。
以1718和hDAT-NLSF為引物，用PCR擴增編碼人多巴胺轉運蛋白(hDAT)的cDNA，得到100bp的片段。以T7和hDAT-NLSR為引物再次PCR擴增編碼人多巴胺轉運蛋白(hDAT)的cDNA，得到1.7kb的片段。以所述兩個PCR片段為模板、T7和1718為引物進行PCR擴增，得到1.8kb的片段。
引物T75』TAATACGACTCACTATAGGG 3』引物17185』CGTCTCTGCTCCCTGGTACCGCCACCTTGAGCCAGTGG 3』hDAT-NLSF5』CTATGCGGCCAAAAAGTTCAAAAGACTGCCTGGGTCC 3』hDAT-NLSR5』CAGGCAGTCTTTTGAACTTTTTGGCCGCATAGATGGGC 3』將所述PCR產物定向亞克隆入pRFP載體中的限制性位點EcoR1和Kpn1處，並符合RFP蛋白起始密碼子的讀碼框。
得到的編碼TM12後的NLS序列KKFKR的PCR片段如下DAT野生型SSMAMVPIYAAYKFCSLPGSFREKDAT-NLSSSMAMVPIYAAKKFKRLPGSFREK
13b.構建融合有GFP的、含有NLS的人多巴胺轉運蛋白(DAT-NLS-GFP)。
將NLS序列KKFKR插入到人DAT的跨膜12片段後的近端羧基尾部中。以pcDNA3上編碼人DAT-cDNA的DNA為模板、T7和hDAT-NLSR為引物進行第一次PCR擴增，得到1.7kb的產物。以1718和hDAT-NLSF為引物進行第二次PCR擴增，得到100bp的產物，然後以T7和1718為引物、PCR#1和PCR#2的產物為模板進行最終的PCR擴增，得到1.8kb的產物(DAT-NLS)，並將該產物亞克隆入pEGFP載體(Clontech)中的EcoR1和Kpn1酶切位點處，且與GFP融合。
引物序列如下hDAT-NLSF5』CTATGCGGCCAAAAAGTTCAAAAGACTGCCTGGGTCC 3』hDAT-NLSR5』CAGGCAGTCTTTTGAACTTTTTGGCCGCATAGATGGGC 3』人DAT野生型SSMAMVPIYAAYKFCSLPGSFREK人DAT-NLSSSMAMVPIYAAKKFKRLPGSFREK14.構建融合有GFP的人5-羥色胺轉運蛋白(SERT-GFP)。
採用PCR方法從含有SERT cDNA的pcDNA3中得到全長的人SERTcDNA，該PCR方法中使用的兩條引物如下SERT-HIND5』GTCATTTACTAAGCTTGCCACCATGGAGACGACGCCCTTG 3』SERT-KPN5』CCTCTCGGTGAGTGGTACCGCCACAGCATTCAAGCGG 3』將不含終止密碼子的所述PCR產物定向亞克隆入pEGFP載體(Clontech)中的限制性位點HindIII和Kpn1處，並符合GFP蛋白起始密碼子的讀碼框。
15.構建融合有GFP的人低密度脂蛋白受體(LDL-R-GFP)。
採用PCR方法擴增編碼LDL(低密度脂蛋白)的全長cDNA，該PCR方法中所用的LDLR-HIND和LDLR-KPN引物序列如下
LDLR-HIND5』GGACACTGCCTGGCAAAGCTTGCGAGCATGGGGCCCTGG 3』LDLR-KPN5』GGCGGGACTCCAGGCAGGTACCGCCGCCACGTCATCCTCC 3』將不含終止密碼子的所述PCR產物(2600bp)定向亞克隆入pEGFP載體(Clontech)中的限制性位點HindIII和Kpn1處，並符合GFP蛋白起始密碼子的讀碼框。
16.構建融合有GFP的、含有NLS的人低密度脂蛋白受體(LDLR-NLS-GFP)。
採用PCR方法將NLS序列KKFKR插入到編碼LDL受體的DNA中，替代編碼RLKNI的天然序列。
用於構建編碼LDL-NLS的DNA的引物對如下LDL-NLSF5』CTATGGAAGAACTGGAAAAAATTTAAAAGAAACAGCATCAAC 3』LDL-NLSR5』CAAAGTTGATGCTGTTTCTTTTAAATTTTTTCCAGTTCTTCC 3』以pcDV1上的編碼LDL cDNA的人DNA為模板、LDLR-HIND和LDL-NLSR為引物進行PCR擴增，得到2450bp的產物(PCR#1)。以編碼LDL的DNA為模板、LDLR-KPN和LDL-NLSF為引物進行PCR擴增，得到150bp的產物(PCR#2)。以LDLR-HIND和LDLR-KPN為引物、PCR#1和PCR#2的產物為模板進行後續PCR擴增，得到2600bp的產物。
得到的含有NLS序列KKFKR突變的PCR產物如下人LDL-R野生型FLLWKNWRLKNINSINFDNP人LDL-RFLLWKNWKKFKRNSINFDNP將不含終止密碼子的所述PCR產物定向亞克隆入pEGFP載體(Clontech)中的限制性位點HindIII和Kpn1處，並符合GFP蛋白起始密碼子的讀碼框。
17.構建融合有GFP的表皮生長因子受體(EGFR-GFP)。
採用PCR方法得到Prkf載體上的全長人EGFR cDNA，在所述PCR方法中使用以下兩條引物HER-XHO5』GCTCTTCGGGCTCGAGCAGCGATGCGACCCTCCGGGACGG 3』HER-KPN5』CTATCCTCCGTGGTACCGCTGCTCCAATAAATTCACTGC 3』將不含終止密碼子的所述PCR產物(3600bp)定向亞克隆入pEGFP載體(Clontech)中的限制性位點XhoI和Kpn1處，並符合GFP蛋白起始密碼子的讀碼框。
18.構建融合有GFP的、含有NLS的人5-羥色胺轉運蛋白(SERT-NLS-GFP)。
採用PCR方法將NLS序列KKFKR插入編碼SERT的DNA中，替代編碼GTFKE的天然序列。
用於擴增編碼SERT-NLS的DNA的引物對如下SERT-NLSF5』GATCATCACTCCAAAGAAATTTAAAAGACGTATTATT 3』SERT-NLSR5』TAATACGTCTTTTAAATTTCTTTGGAGTGATGATCAACCG 3』以pcDNA3上的人SERT-cDNA為模板、SERT-HIND和SERT-NLSR為引物進行PCR擴增，得到1800bp的產物(PCR#1)。以編碼SERT(5-羥色胺)的DNA為模板、SERT-KPN和SERT-NLSF為引物進行PCR擴增，得到100bp的產物(PCR#2)。以SERT-HIND和SERT-KPN為引物、PCR#1和PCR#2的產物為模板進行後續PCR擴增，得到1900bp的產物。
得到的SERT的TM12後的編碼NLS序列KKFKR突變的PCR產物如下人SERT野生型RLIITPGTFKERIIKSIT人SERTRLIITPKKFKRRIIKSIT將不含終止密碼子的所述PCR產物定向亞克隆入pEGFP載體(Clontech)中的限制性位點HindIII和Kpn1處，並符合GFP蛋白起始密碼子的讀碼框。
19.構建融合有GFP的、含有和不含有NLS的促代謝型穀氨酸-4-受體(mGluR4-GFP和mGluR4-NLS-GFP)。
從大鼠cDNA中得到編碼mGluR4(促代謝型穀氨酸-4-受體)的DNA時所用的引物對如下GLUR4-HIND5』GGGTCTCTAAGCTTGCCGCCATGTCCGGGAAGGG 3』GLUR4-ECOR15』CCGCGGCCCGGAATTCGGATGGCATGGTTGGTG 3』引物GLUR4-HIND上整合有限制性位點HindIII，引物GLUR4-ECOR1上整合有限制性位點EcoR1。將不含終止密碼子的mGluR4的PCR產物定向亞克隆入pEGFP載體(Clontech)中的限制性位點HindIII和EcoR1處，並符合GFP蛋白起始密碼子的讀碼框。
將NLS序列KKFKR引入編碼mGluR4的DNA中，替代天然序列KRKRS。
用於擴增將NLS引入大鼠mGluR4-EGFP中的DNA的引物對如下GLUR4-NLSF5』CGTGCCCAAGAAATTCAAGCGCCTCAAAGCCGTGGTC 3』GLUR4-NLSR5』CGGCTTTGAGGCGCTTGAATTTCTTGGGCACGTTCTGC 3』以編碼GluR4(穀氨酸-4-受體)的大鼠DNA為模板、GLUR4-HIND和GLUR4-NLSR為引物進行PCR擴增，得到2600bp的產物(PCR#1)。以編碼GluR4的DNA為模板、GLUR4-ECOR1和GLUR4-NLSF為引物進行PCR擴增，得到160bp的產物(PCR#2)。以GLUR4-HIND和GLUR4-ECOR1為引物、PCR#1和PCR#2的產物為模板進行後續PCR擴增，得到2760bp的產物。
得到的含有NLS序列KKFKR突變的PCR產物如下大鼠mGluR4野生型FHPEQNVPKRKRSLKAVVTAAT大鼠mGluR4FHPEQNVPKKFKRLKAVVTAAT將所述PCR產物定向亞克隆入pEGFP載體(Clontech)中的限制性位點HindIII和EcoR1處，並符合GFP蛋白起始密碼子的讀碼框。
20.構建融合有GFP的人胰島素受體(IR-GFP)。
從質粒pRK5中獲得全長IR(胰島素受體)cDNA時所用的兩條PCR引物如下HIR-HIND5』GGAGACCCCAAGCTTCCGCAGCCATGGGCACCGGGGGCC 3』HIR-APA5』CCCCGCCACGGGCCCCGGAAGGATTGGACCGAGGCAAGG 3』將不含終止密碼子的所述PCR產物(4.2kb)定向亞克隆入pEGFP載體(Clontech)中的限制性位點HindIII和ApaI處，並與GFP蛋白融合。
21.構建融合有GFP的、含有NLS的人胰島素受體(IR-NLS-GFP)。
將NLS序列KKFKR引入人胰島素受體中，以替代序列LYASS。
以pRK5載體中的人胰島素受體cDNA為模板、HIR-HIND和HIR-NLSR為引物進行第一次PCR擴增(PCR#1)，得到2.9kb的產物；然後以HIR-APA和HIR-NLSF為引物進行第二次PCR擴增(PCR#2)，得到1.3kb的產物；再以HIR-HIND和HIR-APA為引物、PCR#1和PCR#2的產物為模板進行第三次PCR擴增(PCR#3)，得到4.2kb的片段。將不含終止密碼子的所述PCR產物定向亞克隆入pEGFP載體中的限制性位點HindIII和ApaI處，並由此與GFP蛋白融合。
用於HIR-NLS的引物如下HIR-NLSF5』CCGCTGGGACCGAAAAAATTTAAGAGAAACCCTGAGTATCTC 3』HIR-NLSR5』GATACTCAGGGTTTCTCTTAAATTTTTTCGGTCCCAGCGGCCC 3』22.構建融合有GFP的人紅細胞生成素受體(EPO-GFP)。
以pc3.1載體上的編碼人紅細胞生成素(EPO)受體的cDNA為模板的PCR方法來獲得全長cDNA，該方法中採用如下引物T75』TAATACGACTCACTATAGGG 3』EPO-KPN5』GACTGCAGCCTGGTGGTACCGCAGAGCAAGCCACATAGCTGGGG 3』將不含終止密碼子的所述PCR產物(1.6kb)定向亞克隆入pEGFP載體中的限制性位點HindIII和Kpn1處，並與GFP蛋白融合。
23.構建融合有GFP的、含有NLS的人紅細胞生成素受體(EPO-NLS-GFP)。
採用PCR方法將NLS序列KKFKR插入編碼EPO受體的DNA中，替代天然序列RRALK。
以pc3.1中的人EPO-cDNA為模板、T7和EPO-NLSR為引物進行第一次PCR擴增(PCR#1)，得到900bp的產物；以EPO-KPN和EPO-NLSF為引物進行第二次PCR擴增(PCR#2)，得到700bp的產物；然後以T7和EPO-KPN為引物、PCR#1和PCR#2的產物為模板進行第三次PCR擴增，得到1.6kb的片段。將不含終止密碼子的所述PCR產物(1.6kb)定向亞克隆入pEGFP載體中的限制性位點HindIII和Kpn1處，並由此與GFP蛋白融合。
引物序列如下T75』TAATACGACTCACTATAGGG 3』EPO-KPN5』GACTGCAGCCTGGTGGTACCGCAGAGCAAGCCACATAGCTGGGG 3』EPO-NLSF5』GCTGCTCTCCCACAAAAAGTTTAAGCGGCAGAAGATCTGG 3』EPO-NLSR5』CCAGATCTTCTGCCGCTTAAACTTTTTGTGGGAGAGCAGC 3』人EPO野生型TVLALLSHRRALKOKIWPGIP人EPO NLSTVLALLSHKKFKROKIWPGIP24.構建融合有GFP的人表皮生長因子受體(EGFR-GFP)。
採用PCR方法以Prk5載體上的人表皮生長因子受體的cDNA為模板，擴增其全長cDNA，該PCR方法中使用以下引物HER-XHO(5』GCTCTTCGGGCTCGAGCAGCGATGCGACCCTCCGGGACGG 3』)和
HER-KPN(5』CTATCCTCCGTGGTACCGCTGCFCCAATAAATTCACTGC 3』)。
將不含終止密碼子的所述PCR產物(3.6kb)定向亞克隆入pEGFP載體(Clontech)中的限制性位點XhoI和Kpn1處，並與GFP蛋白融合。
25.構建融合有GFP的、含有NLS的人表皮生長因子受體(EGFR-NLS-GFP)。
使用如下PCR方法將NLS序列KKFKR插入到人表皮生長因子受體的序列中。以Prk5載體上的人EGFR(表皮生長因子受體)cDNA為模板、HER-XHO和EGF-NLSR為引物進行第一次PCR擴增，得到2.1kb的產物。以HER-KPN和EGF-NLSF為引物進行第二次PCR擴增，得到1.5kb的產物；再以HER-XHO和HER-KPN為引物、PCR#1和PCR#2的產物為模板進行最終的PCR擴增，將得到的不含終止密碼子的3.6kb的PCR產物(EGFR-NLS)亞克隆入pEGFP載體(Clontech)中的限制性位點XhoI和Kpn1處，並與GFP蛋白融合。
引物下列如下EGF-NLSF5』CACATCGTTCGGAAGAAGTTTAAGCGGAGGCTGCTGC 3』EGF-NLSR5』CCTGCAGCAGCCTCCGCTTAAACTTCTTCCGAACGATGTG 3』人EGFR野生型RRRHIVRKRTLRRLLQERE人EGFR-NLSRRRHIVRKKFKRRLLQERE26.構建融合有RFP的、含有2個NLS的人D1多巴胺受體(D1-NLS(螺旋8和羧基尾部)-RFP)。
使用如下PCR方法將第二個NLS序列KKKRK插入到人D1-NLS-Helix 8(螺旋8)的羧基尾部片段中。以pDsRed載體中的編碼人D1-NLS-Helix 8的DNA為模板、HD1-P1和HD1-NLSCR為引物進行第一次PCR擴增，得到1.2kb的產物；以HD1-P2和HD1-NLSCF為引物進行第二次PCR擴增，得到100bp的產物。然後以HD1-P1和HD1-P2為引物、PCR#1和PCR#2的產物為模板進行最終的PCR擴增，將得到的1.3kb的PCR產物(D1-NLS-Helix 8和羧基尾部)亞克隆入pDsRed載體中的限制性位點EcoR1和Kpn1處，並與DsRed蛋白融合。
引物下列如下HD1-P15』GAGGACTCTGAACACCGAATTCGCCGCCATGGACGGGACTGGGCTGGTG 3』HD1-P25』GTGTGGCAGGATTCATCTGGGTACCGCGGTTGGGTGCTGACCGTT 3』HD1-NLSCF5』CCTCTGAGGACCTGAAAAAGAAGAGAAAGGCTGGCATCGCC 3』HD1-NLSCR5』GGCGATGCCAGCCTTTCTCTTCTTTTTCAGGTCCTCAGAGG 3』D1-野生型NPIIYAFNADFRKAFSTLL…………SSEDLKKEEAAGIAD1-NLS(螺旋8和羧基尾部)NPIIYAFNAKKFKRFSTLL…………SSEDLKKKRKAGIA27.構建融合有GFP的μ阿片受體(Mu-GFP)使用PCR以pcDNA3上編碼μ阿片受體的DNA為模板的PCR方法，該方法中使用以下引物RATMU15』CCTAGTCCGCAGCAGGCCGAATTCGCCACCATGGACAGCAGCACC 3』RATMU-25』GATGGTGTGAGACCGGTACCGCGGGCAATGGAGCAGTTTCTGCC 3』引物RATMU-1上整合有限制性位點EcoR1。引物RATMU-2上整合有限制性位點Kpn1。
將不含終止密碼子的PCR產物(1.2kb)定向亞克隆入pEGFP載體(Clontech)中的限制性位點EcoR1和Kpn1處，並由此與GFP蛋白融合。
28.構建融合有GFP的、含有NLS的μ阿片受體(Mu-NLS-GFP)。
使用如下PCR方法將NLS序列KKFKR插入到μ阿片受體的近端羧基尾部片段(螺旋8)中。以pcDNA3載體中編碼大鼠μ阿片受體的DNA為模板、RATMU1和MU-NLSR為引物進行第一次PCR擴增，得到1000bp的產物；以RATMU-2和MU-NLSF為引物進行第二次PCR擴增，得到200bp的產物。然後以RATMU1和RATMU2為引物、PCR#1和PCR#2的產物為模板進行最終的PCR擴增，將得到的1200bp的PCR產物(Mu-NLS)亞克隆入pEGFP載體中的限制性位點EcoR1和Kpn1處，並與GFP蛋白融合。
引物序列如下RATMU-15』CCTAGTCCGCAGCAGGCCGAATTCGCCACCATGGACAGCAGCACC 3』RATMU-25』GGATGGTGTGAGACCGGTACCGCGGGCAATGGAGCAGTTTCTGCC 3』MU-NLSF5』GCCTTCCTGGATAAAAAATTCAAGCGATGC 3』MU-NLSR5』GCATCGCTTGAATTTTTTATCCAGGAAGGCG 3』細胞培養和轉染在37℃和5％CO2的條件下、以單層培養的方式培養COS-7猴腎細胞和HEK293T人胚胎腎細胞(美國典型培養物保藏中心(American TypeCulture Collection)，Manassa，VA)，使用加有10％胎牛血清和抗生素的最低必需培養基。為了收集細胞膜，使用lipofectamine試劑(LifeTechnologies，Rockville，MD)在70-80％融合時瞬時轉染100mm(毫米)平板中的細胞。為了進行雷射共聚焦顯微鏡研究，使用lipofectamine試劑在10-20％融合時瞬時轉染60mm平板中的細胞。轉染後6個小時，棄除溶液並加入新鮮培養基，轉染後24小時再次用新鮮培養基替換原有溶液。
通過在14ml(毫升)的管子裡混合120微升不含抗生素和/或胎牛血清(FBS)的培養基和15微升lipofectamine來製備轉染培養基。將2微克編碼所需融合蛋白的DNA構建體和120微升培養基混合後加入上述14ml管中，並將所述混合物輕柔混勻，在室溫下溫育25分鐘。再加入4ml培養基並混勻。如果轉染多種跨膜蛋白，則將其cDNA混合併一同轉染。棄除細胞平板中的生長培養基，用從14ml管子中來的轉染混合物代替。細胞在轉染混合物中溫育細胞5-6小時後，棄除所述混合物並以常規的含有FBS和抗生素的培養基代替。繼續培養細胞，並在第二天使用常規培養基換液一次。
使用受試化合物進行處理確定離開細胞表面延遲轉位發生的試驗方法受試化合物存儲液的濃度為1毫摩爾每升，當加入細胞平板時，使用生長培養基將其稀釋成10納摩爾每升至10微摩爾每升的最終濃度。在轉染後6小時、22小時、30小時和42小時，加入所述新鮮製備的、含有受試化合物的培養基。
確定離開細胞表面的促進轉位發生的試驗方法受試化合物存儲液的濃度為1毫摩爾每升，當加入細胞時，在37℃的條件下使用生長培養基將其稀釋成10微摩爾每升的最終濃度。以聚焦於單個細胞的形式對細胞培養物進行顯微鏡觀察，檢測細胞表面表達的可檢測的標記蛋白。為了觀察可檢測成分分布情況的改變，在加入受試化合物5、10、15、20、30和35分鐘後，用含有受試化合物的培養基替換生長培養基，並實時進行顯微鏡觀察細胞。
顯微鏡觀察使用LSM510蔡司(Zeiss)共聚焦雷射顯微鏡觀察細胞。使用488nm(納米)激發波長的氬雷射激發後，能觀察到GFP；使用543nm激發波長的氦氖雷射激發後，能觀察到DsRed。獲取的共聚焦圖象存儲在磁碟上，用於後續分析。在每個實驗中，計數多個視野中的細胞(n＝6-8，每個視野中有30-90個細胞)，並分析細胞表面、細胞質和細胞核中的信號蛋白定位情況。
流式細胞術用多聚-L-鳥氨酸(1/10溶於PBS(磷酸鹽緩衝液)中)包被96孔板，並溫育1小時。在每個孔裡加入50,000個細胞，使用Lipofectamine(Invitrogen，U.S.A.)轉染編碼有表位標記的受體的cDNA。每12小時更換培養基(MEM(最低必需培養液))，該培養基中含有不同濃度的受試藥物或賦形劑。48小時後，清洗細胞並用4％多聚甲醛固定，然後冰浴30分鐘。再將細胞與針對所述表位的一抗溫育，隨後與偶聯有FITC(異硫氰酸螢光素)的二抗溫育，並避免光照。清洗去除多餘抗體，在Cytofluor4000(PerSpective Biosystems，U.S.A.)中讀數檢測96孔板上的信號。以488nm波長的光激發FITC，在其530nm的發射波長處讀取信號。
放射性配體結合將轉染了編碼D1-NLS的DNA的細胞用不同濃度的拮抗劑處理或不處理。48小時後，對所述細胞進行清洗、收集、裂解，並用Polytron勻漿。通過離心收集細胞膜成分，然後將其置於35％蔗糖溶液上，以30,000rpm(轉每分鐘)、4℃的條件下離心90分鐘，以收集重的膜成分。將上述離心後的上清以35,000rpm和4℃的條件再次離心60分鐘，以收集輕的膜成分。使用[3H]-SCH23390和用於確定特異性結合的10微摩爾的(+)丁克嗎對所述膜成分進行放射性配體結合實驗。在室溫下溫育2小時，隨後通過閃爍計數進行快速過濾和定量。
從培養的細胞中分離細胞核用PBS漂洗細胞三次，然後在存在10ml液體的條件下將所述細胞從培養皿上輕柔地刮下。匯集細胞，並在4℃將其以500g(相對離心力)離心5分鐘。以每毫升液體5千萬個細胞的濃度將成團塊的細胞重懸在裂解緩衝液(Tris HCl(三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩衝液)10mM(毫摩爾每升)pH7.4，NaCl(氯化鈉)10mM，MgCl2(氯化鎂)3mM)和抑制物混合物(0.5％亮抑蛋白酶肽、1％大豆胰蛋白酶、1％苄脒)中。使用無菌的玻璃Teflon杵B(密封間距為20-50mm；Bellco Glass)進行上下100次的勻漿。
將上述產物以4℃、700g的條件離心10分鐘，然後將得到的上清按順序以4℃、10,000g的條件離心15分鐘(去除線粒體)和以4℃、120,000g的條件離心60分鐘(去除質膜)。
將得到的細胞核沉澱物用裂解緩衝液(含有抑制物)和0.1％ NP-40重懸，冰浴5分鐘，然後以4℃、700g離心10分鐘。棄上清，每次用15ml裂解緩衝液清洗三次沉澱物。細胞核沉澱物用2ml裂解緩衝液重懸後上樣至不連續蔗糖梯度的頂部，以4℃、100,000g的條件離心60分鐘，所述不連續蔗糖梯度由含有1mM MgCl2的4.5ml的2.0M和1.6M蔗糖連續平鋪而成。收集管底部的沉澱物，其含有純的細胞核。
實施例1融合有紅色螢光蛋白的多巴胺D1受體(D1-RFP)或融合有紅色螢光蛋白的、含有NLS的多巴胺D1受體(D1-NLS-RFP)。
如上述方法中所描述的(見圖1)，將不含有NLS的多巴胺D1受體的序列進行修改，用NLS序列KKFKR(其相應於人AT1受體的NLS)替代TM7結構域的近膜部分的胺基酸DFRKA。構建了編碼D1多巴胺受體融合蛋白D1-RFP和D1-NLS-RFP的DNA。用編碼D1-NLS-RFP或D1-RFP的DNA(2微克)轉染COS細胞，並溫育24和48小時。用共聚焦顯微鏡以100倍放大係數檢查所述細胞。在8-10個顯微鏡視野中人工計數細胞，並計算不同亞細胞腔室中標記物的比例。
在24和48小時，轉染了D1-RFP的細胞中的大部分在細胞表面表達所述受體，而轉染了D1-NLS-RFP的細胞幾乎沒有在細胞表面表達所述受體，但是在24和48小時，所述受體在轉染了D1-NLS-RFP的細胞中核定位的比例分別為60％和80％。
實施例2使用拮抗劑處理含有NLS的多巴胺D1受體融合蛋白(D1-NLS-RFP)。
用編碼D1-NLS-RFP和野生型D1的構建體(2微克)轉染COS細胞48小時。在轉染後6、22、30和42小時，用多巴胺D1受體拮抗劑SCH23390(終濃度為10μM)處理所述細胞。也在轉染後6、22、30和42小時，用拮抗劑(+)丁克嗎(終濃度為10μM)處理細胞。對照細胞不用拮抗劑處理。
在48小時，大部分對照細胞的細胞核中可檢測到D1-NLS-RFP。與此形成對比的是，大部分拮抗劑處理的細胞僅在細胞表面存在螢光，而其中42％的細胞在細胞表面和細胞核均存在螢光。
實施例3多巴胺D1受體(D1-GFP)和含有NLS的D1受體(D1-NLS)共表達。
使用編碼D1-NLS(3微克)和/或D1-GFP(1.5微克)的DNA構建體轉染HEK細胞，並溫育48小時。所述細胞也轉染了編碼DsRed-NUC的質粒(1微克)，以確認核定位。
也使用編碼D1-GFP的DNA(2微克)轉染細胞，溫育48小時並用共聚焦顯微鏡檢測。
僅表達D1-GFP的細胞中的90％出現細胞表面標記，10％同時出現細胞核與細胞表面標記。在轉染了編碼GPCR的任何DNA的細胞中，多至10％的細胞可觀察到核定位。
在表達D1-GFP和D1-NLS的細胞中，35％的細胞同時具有細胞核與細胞表面標記，70％的細胞僅在細胞表面有所述受體表達。該實驗顯示，D1-NLS和D1-GFP的寡聚化作用導致D1-GFP與D1-NLS的共轉位。
實施例4在劑量反應研究中，用拮抗劑處理含有NLS的多巴胺D1受體(D1-NLS-GFP)。
使用編碼D1-NLS-GFP(2微克)和D1-WT(野生型)(6微克)的DNA轉染HEK細胞48小時。在轉染後6小時，用SCH-23390(10μM)或(+)丁克嗎(10μM)處理所述細胞。在轉染後6、22、30和42小時，更換含有拮抗劑的培養基。對照細胞不用拮抗劑處理。
在SCH-23390處理48小時後，58％細胞的細胞表面表達D1-NLS-GFP，不到10％細胞的細胞核中表達所述受體，32％細胞的細胞表面和細胞核中同時有所述受體表達。
在(+)丁克嗎處理48小時後，62％細胞的細胞表面表達D1-NLS-GFP受體，10％細胞的細胞核中表達所述受體，28％細胞的細胞表面和細胞核中同時有所述受體表達。
在48小時，對照細胞中的大約65％在細胞核表達D1-NLS-GFP受體，35％在胞漿包括所述受體。未發現在對照細胞的細胞表面有D1-NLS-GFP受體的表達。
在所述受體序列中整合入NLS，能夠非常有效地將D1-NLS-GFP受體從細胞表面移去並定位於細胞核。
以各種劑量的SCH-23390或(+)丁克嗎進行了類似研究。所述研究的結果顯示在表2和表3中。其中，32-35％對照細胞的胞漿中存在所述受體。
表2

表3

在所述受體序列中整合NLS，能使D1多巴胺受體非常有效地從細胞表面移去，而定位至細胞核。D1選擇性的拮抗劑能以劑量反應的方式阻止所述轉位過程。
實施例4a表達並用激動劑處理含有插入的NLS的多巴胺D1受體(D1-NLS-GFP)。
使用編碼D1-NLS-GFP的DNA構建體(1.5微克)轉染HEK細胞，並與D1激動劑SKF-81297(10微摩爾)溫育48小時。在轉染6、22、30和42小時後，用含有SKF-81297(終濃度為10μM)的新鮮培養基處理細胞。使用共聚焦顯微鏡檢查所述細胞。
使用編碼D1-NLS-GFP的DNA構建體(1.5微克DNA)轉染HEK細胞，並與D1激動劑培高利特(pergolide)(10微摩爾)溫育48小時。在轉染6、22、30和42小時後，用含有SKF-81297(終濃度為10μM)的新鮮培養基處理細胞。使用共聚焦顯微鏡檢查所述細胞。
對照HEK細胞用編碼D1-NLS-GFP的DNA構建體(1.5微克DNA)轉染，但不作處理。
48小時後，在未處理細胞的表面沒有檢測到所述受體。在用SKF-81297處理的細胞中，59％的細胞表面有所述受體表達。在用培高利特處理的細胞中，59％的細胞表面有所述受體表達。因此，長時間的激動劑處理能夠阻止修改後的D1受體向細胞核的運送。
實施例5含有整合的NLS的多巴胺D1受體(D1-NLS-RFP)與野生型D1受體共表達。
用編碼D1-NLS-RFP的DNA構建體(1微克)和編碼天然多巴胺D1受體的DNA序列(D1-WT，7微克)共轉染COS細胞，並溫育24或48小時。
在24小時，僅在細胞表面能夠檢測到D1-NLS-RFP，而在48小時，80％細胞中的D1-NLS-RFP在細胞核中。由於同源寡聚化作用，野生型受體延緩了D1-NLS-RFP向細胞核的移動。
實施例6含有整合的NLS的D1多巴胺受體(D1-NLS-RFP)與D1-GFP共表達。
將編碼D1-NLS-RFP(4微克)和多巴胺D1-GFP(4微克)的構建體轉染COS細胞，並溫育48小時。使用共聚焦顯微鏡檢查所述細胞。
在細胞表面上檢測到D1-GFP，而在細胞核內檢測到黃色螢光，後者表明D1-NLS-RFP和D1-GFP共定位在細胞核內，並確認D1-NLS-RFP和D1-GFP的寡聚化，從而導致D1-GFP轉運入細胞核。
實施例6a在第三個胞內胞漿環中插入NLS的D1多巴胺受體(D1-IC3-NLS-GFP)的表達。
用編碼D1-IC3-NLS-GFP的DNA構建體(2微克)轉染HEK細胞，並溫育48小時。用DsRED-NUC(2微克)顯示細胞核。使用共聚焦顯微鏡檢查所述細胞。
在轉染了D1-IC3-NLS-GFP的細胞中，85％細胞的細胞核中可以檢測到所述受體。因此，在所述受體第三個胞內環插入NLS，能夠使其轉位至細胞核。
實施例6b在第一個胞內胞漿環中插入NLS的D1多巴胺受體(D1-IC1-NLS-GFP)的表達。
用編碼D1-IC1-NLS-GFP的DNA構建體(2微克)轉染HEK細胞，並溫育48小時。用DsRED-NUC(2微克)顯示細胞核。使用共聚焦顯微鏡檢查所述細胞。
在轉染了D1-IC1-NLS-GFP的細胞中，85％細胞的細胞核中可以檢測到所述受體。因此，在所述受體第一個胞內環插入NLS，能夠使其轉位至細胞核。
實施例6c拮抗劑丁克嗎或SCH-23390對在第一個胞漿環中插入NLS的D1多巴胺受體(D1-IC1-NLS-GFP)轉運的影響。
將編碼D1-IC1-NLS-GFP的DNA構建體(2微克)轉染HEK細胞，並用丁克嗎(終濃度為1μM)或SCH-23390(1μM)處理所述細胞48小時。用DsRED-NUC(2微克)顯示細胞核。使用共聚焦顯微鏡檢查所述細胞。
在丁克嗎處理的細胞中，82％細胞中的所述受體在細胞表面上或胞漿裡，18％細胞中的所述受體在細胞核裡。因此，用丁克嗎處理細胞能減少D1-IC1-NLS-GFP向細胞核的轉運。
在SCH-23390處理的細胞中，77％細胞中的所述受體在細胞表面上或胞漿裡，23％細胞中的所述受體在細胞核裡。因此，用SCH-23390處理細胞能減少所述受體向細胞核的轉運。
在未處理的細胞中，76％細胞中的所述受體表達在細胞核與胞漿中。
實施例6d拮抗劑SCH-23390對在第三個胞漿環中插入NLS的D1多巴胺受體(D1-IC3-NLS-GFP)轉運的影響。
用編碼D1-IC3-NLS-GFP的DNA構建體(2微克)轉染HEK細胞，並用4種不同濃度的SCH-23390(10μM、1μM、500nM和100nM)處理48小時。用DsRED-NUC(2微克)顯示細胞核。使用共聚焦顯微鏡檢查所述細胞。
在轉染了D1-IC3-NLS-GFP的細胞中，86％細胞中的所述受體在細胞核裡，0％細胞中的所述受體在細胞表面上。在SCH-23390處理的細胞中，84％細胞中的所述受體在細胞核裡，15％細胞中的所述受體在細胞表面上。在GPCR的所述位點中插入NLS能夠有效地使所述受體轉位至細胞核，而對所述藥物沒有反應。
實施例6e在第二個胞內胞漿環中插入NLS的D1多巴胺受體(D1-IC2-NLS-GFP)的表達。
用編碼D1-IC2-NLS-GFP的DNA構建體(2微克)轉染HEK細胞，並溫育48小時。用DsRED-NUC(2微克)顯示細胞核。使用共聚焦顯微鏡檢查所述細胞。
在轉染了D1-IC2-NLS-GFP的細胞中，51％細胞的細胞核中可以檢測到所述受體。
實施例6f當先後轉染細胞時，多巴胺D1受體形成同源二聚體的能力。
用編碼D1-RFP的DNA構建體(2微克)轉染HEK細胞並溫育24小時，然後用另一種編碼D1-NLS-GFP的DNA構建體(2微克)再次轉染所述細胞。對照細胞僅轉染D1-RFP構建體(2微克)。第二次轉染後溫育48小時，用共聚焦顯微鏡檢查所述細胞。
90％僅轉染了D1-RFP的細胞在細胞表面表達所述受體，而6％細胞在細胞核表達所述受體。與此形成對比的是，97％轉染了兩種形式所述受體的細胞在細胞核中同時表達所述兩種受體(紅色和綠色螢光之和等於黃色螢光)。因此，不含NLS的D1受體能夠與含有NLS的D1受體相互作用，並轉運至細胞核。
實施例7多巴胺D5受體(D5-GFP)製備編碼多巴胺D5受體(D5-GFP)的構建體，並用其轉染COS細胞(4微克)。
用多巴胺D5-GFP轉染細胞48小時後，所述受體主要定位於胞漿，僅一小部分定位於細胞表面，無一定位於細胞核。
實施例8整合有NLS的多巴胺D1(D1-NLS)與D5多巴胺受體(D5-GFP)的共表達。
用兩種DNA構建體轉染HEK細胞，一種編碼D1-NLS(7微克)而另一種編碼D5-GFP(1.5微克)，並溫育48小時。
在轉染了D1-NLS和D5-GFP的細胞中，大約70％在細胞表面表達D5-GFP，20％在細胞表面和胞漿中均有D5-GFP表達，10％在細胞核有D5-GFP表達。與D1-NLS共表達的D5多巴胺受體沒有出現核定位，該現象表明D1和D5受體沒有發生寡聚化。
實施例9含有2個NLS基序的D1多巴胺受體(D1-2NLS-RFP)，並以拮抗劑處理該受體。
通過更改編碼D1-NLS-RFP的構建體，製備了在多巴胺D1受體羧基尾部引入第二個NLS的DNA構建體(D1-2NLS-RFP)，其中，野生型D1多巴胺受體的KKEEA序列被NLS序列KKKRK代替。
如上所述，用編碼所述構建體(D1-2NLS-RFP)的DNA轉染HEK細胞，並用拮抗劑SCH-23390(10μM)以一定時間間隔處理該細胞。在轉染後6、22、30和42小時，更換含有拮抗劑的培養基。對照細胞未用拮抗劑處理。
在轉染了D1-2NLS-RFP的COS細胞和HEK細胞中，100％的細胞中所述受體均在轉染後24小時定位於細胞核，該現象表明當存在第二個NLS時，核轉位作用得到加強。
在48小時，90％未用拮抗劑處理的細胞顯示出核內螢光，0％細胞顯示出細胞表面螢光。在拮抗劑處理的細胞中，51％具有細胞表面標記而49％具有核標記。
整合第二個NLS導致所述受體更為有效地轉運至細胞核，且該轉運事件仍然被拮抗劑處理所延遲。
實施例10D2多巴胺受體(D2-GFP)用編碼D2-GFP(2微克)和DsRed-NUC(1微克)的DNA構建體轉染HEK細胞，並溫育48小時。通共聚焦顯微鏡檢查所述細胞。
大約90％表達D2-GFP的細胞為細胞表面表達，10％為細胞核或胞漿表達。不含內源性NLS的D2多巴胺受體主要表達在細胞表面。
實施例11a整合了NLS的多巴胺D1受體(D1-NLS)和多巴胺D2(D2-GFP)。
用編碼D1-NLS(7微克)和D2-GFP(1.5微克)的DNA構建體轉染HEK細胞，並溫育48小時。所述細胞也用Ds-Red-NUC(1微克)轉染，以檢測核定位。用共聚焦顯微鏡檢查所述細胞。
在轉染了D1-NLS和D2-GFP的細胞中，33％細胞的細胞核中有D2-GFP表達，該現象表明由於D1和D2受體的寡聚化，D1-NLS和D2-GFP均轉運至細胞核，67％細胞僅在細胞表面或在細胞表面和胞漿中有D2-GFP表達。
實施例11b短的D2多巴胺受體(D2S)和長的D2多巴胺受體(D2L)二聚化的能力。
用編碼D2S-GFP(2微克)和D2L-NLS(2微克)的DNA構建體轉染HEK細胞，並溫育48小時。用DsRED-NUC(2微克)顯示細胞核。使用共聚焦顯微鏡檢查所述細胞。
在29％細胞中，D2S-GFP受體顯示於細胞核中。該現象表明D2S與D2L二聚化，並轉運至細胞核中。
實施例11c多巴胺受體D2S和多巴胺受體D2L二聚化的能力。
用編碼D2S-RFP(2微克)和D2L-NLS-GFP(2微克)的DNA構建體轉染HEK細胞，並溫育48小時。使用共聚焦顯微鏡檢查所述細胞。
40％所述細胞的細胞核內顯示黃色(紅色和綠色疊加的結果)，表明D2L-NLS與D2S-RFP二聚化，並轉運至細胞核內。
實施例12用拮抗劑處理含有整合的NLS的D2多巴胺受體(D2-NLS-GFP)。
用編碼D2-NLS-GFP的DNA轉染HEK細胞，並用D2多巴胺受體拮抗劑(+)丁克嗎(10μM)或奎丙靈(raclopride)(10μM)處理所述細胞。在轉染後6、22、30和42小時，用所述拮抗劑處理所述細胞。藥物處理後溫育48小時，再用共聚焦顯微鏡檢查。
在未用拮抗劑處理時，表達D2-NLS-GFP的細胞中70％顯示出細胞核標記，20％顯示出胞漿標記，10％顯示出胞漿和細胞表面標記。在(+)丁克嗎處理後，細胞核標記只出現在5％細胞中，5％細胞具有胞漿標記，而90％細胞具有細胞表面標記。在奎丙靈處理後，細胞核標記出現在5％細胞中，15％細胞具有胞漿標記，而80％細胞具有細胞表面標記。兩種D2受體的拮抗劑均能夠阻止D2受體離開細胞表面向細胞核轉位。
實施例13β2-腎上腺素能受體-GFP(β2-AR-GFP)。
製備編碼包括人β2-腎上腺素能受體和GFP的融合蛋白的DNA構建體(β2-AR-GFP)。用編碼β2-AR-GFP(2微克)的DNA構建體轉染細胞，並溫育24小時，以共聚焦顯微鏡檢查之。
在表達β2-AR-GFP的細胞中，42％細胞僅在胞漿中表達所述受體，58％細胞在胞漿和細胞表面具有所述受體的表達。未觀察到所述受體定位在細胞核中。
實施例14整合有NLS的β2-腎上腺素能受體(β2-AR-NLS3-GFP)製備編碼包括人β2-AR-NLS3-GFP的融合蛋白的DNA構建體。用編碼β2-AR-NLS3-GFP(2微克)的DNA構建體和Ds-Red-NUC(1微克)轉染HEK細胞，並溫育48小時。
在表達β2-AR-NLS3-GFP的細胞中，45％細胞的所述受體定位在細胞核中，55％細胞的所述受體在胞漿中和細胞表面表達。在β2-AR中整合NLS，能誘導所述受體向細胞核轉位。
實施例15用拮抗劑處理整合有NLS的β2-腎上腺素能受體(β2-AR-NLS3-GFP)。
用編碼β2-AR-NLS3-GFP(1微克)的DNA構建體和Ds-Red-NUC(1微克)轉染HEK細胞，並溫育48小時。用一種腎上腺素能受體拮抗劑阿替洛爾(10μM)以一定時間間隔處理細胞。在轉染後6、22、30和42小時，更換含有所述拮抗劑的培養基。
對照細胞不用拮抗劑處理。在對照細胞中，60％細胞的所述受體表達在細胞核內，21％細胞的所述受體表達在細胞表面，19％細胞的所述受體表達在胞漿中。
在拮抗劑阿替洛爾處理的細胞中，70％細胞的所述受體表達在細胞表面，14％細胞的所述受體表達在細胞核內，16％細胞的所述受體表達在胞漿中。用拮抗劑阿替洛爾處理能夠阻止β2-AR-NLS3-GFP向細胞核轉位，並將所述受體保留在細胞表面。
實施例16β2腎上腺素能受體(β2-AR-GFP)與整合有NLS的多巴胺D1受體(D1-NLS)的共表達。
用編碼β2-AR-GFP(1.5微克)的DNA構建體和D1-NLS(3微克)轉染HEK細胞48小時。
大約40％所述細胞的β2-AR-GFP受體在細胞核中表達，該現象證明不含NLS的β2-AR轉運至細胞核。所述現象表明β2-AR受體和含有NLS的D1多巴胺受體之間存在寡聚化作用，45％所述細胞的β2-AR-GFP存在於胞漿中，15％存在於胞漿中和細胞表面。
實施例17用拮抗劑處理β2腎上腺素能受體(β2-AR-GFP)和整合有NLS的多巴胺D1受體(D1-NLS)。
用編碼β2-AR-GFP的DNA構建體(1.5微克)和編碼D1-NLS的DNA構建體(3微克)轉染HEK細胞，並溫育48小時。用腎上腺素能拮抗劑普萘洛爾(5μM)處理所述細胞。在轉染後6、22、30和42小時，更換含有所述拮抗劑的培養基。對照細胞不用拮抗劑處理。使用共聚焦顯微鏡檢查所述細胞。
25％對照細胞的β2-AR-GFP在細胞核內表達，75％對照細胞在胞漿和細胞表面顯示出標記。
在普萘洛爾處理的細胞中，10％細胞的β2-AR-GFP表達在細胞核中，90％細胞在胞漿和細胞表面顯示出標記。β2-AR-GFP和D1-NLS之間異源寡聚物的形成導致β2-AR-GFP向細胞核運輸。所述腎上腺素能受體的拮抗劑的存在能夠減弱所述運輸。
實施例18含有整合的NLS的β2-腎上腺素能受體(β2-AR-NLS3-GFP)。
用編碼含有NLS的β2-AR-NLS3-GFP(8微克)的DNA構建體轉染HEK細胞48小時。所述細胞也轉染了Ds-Red-NUC(1微克)，以鑑定細胞核定位。
80％所述細胞的β2-AR-NLS3-GFP受體在細胞核中。由於NLS的效能被加強，導致所述受體更為顯著的細胞核定位。
實施例19用拮抗劑處理整合有NLS的5-羥色胺1B受體(5HT1B-NLS-GFP)。
用編碼5-羥色胺5HT1B-NLS-GFP(2微克)的DNA構建體轉染HEK細胞。也用Ds-Red-NUC(1微克)轉染所述細胞，以鑑定細胞核定位。用5-羥色胺受體拮抗劑二甲麥角新鹼(10μM)處理所述細胞。在轉染後6、22、30和42小時，更換含有拮抗劑的培養基。對照細胞不用拮抗劑處理。使用共聚焦顯微鏡檢查所述細胞。
在未用拮抗劑處理的對照細胞中，55％細胞的所述受體定位在細胞核內，20％細胞的所述受體定位在細胞表面。在48小時，在二甲麥角新鹼處理的細胞中，25％細胞的所述受體在細胞核內，62％細胞的所述受體定位在細胞表面。
通過插入NLS，5-羥色胺5HT1B受體能夠有效地從細胞表面向細胞核轉位。用5-羥色胺受體拮抗劑二甲麥角新鹼處理能夠阻止所述受體的轉位。
實施例20整合有NLS的半胱氨醯白三烯受體2(CysLT2-NLS-GFP)。
用編碼CysLT2-NLS-GFP(8微克)的DNA構建體轉染HEK細胞48小時。所述細胞也轉染了Ds-RED-NUC(1微克)，以鑑定細胞核定位。使用共聚焦顯微鏡檢查所述細胞。
在表達CysLT2-NLS-GFP的細胞中，83％細胞的所述受體表達在細胞核內，0％細胞的所述受體表達在細胞表面，該現象表明CysLT2-NLS-GFP受體定位在細胞核內。
實施例21用拮抗劑處理整合有NLS的半胱氨醯白三烯受體2(Cys-LT2-NLS-GFP)。
用編碼Cys-LT2-NLS-GFP的DNA(3微克)轉染HEK細胞。用半胱氨醯白三烯受體拮抗劑montelukast(10μM)處理所述細胞。在轉染後6、22、30和42小時，更換含有拮抗劑的培養基。對照細胞不用拮抗劑處理。使用共聚焦顯微鏡檢查所述細胞。
在未用拮抗劑處理的、表達Cys-LT2-NLS-GFP的細胞中，70％細胞的所述受體定位在細胞核內，30％定位在胞漿，0％定位在細胞表面。在拮抗劑處理的細胞中，只有10％細胞的所述受體定位在細胞核內，而90％細胞的所述受體在細胞表面表達。因此，所述半胱氨醯白三烯受體拮抗劑montelukast能夠阻止Cys-LT2-NLS-GFP受體離開細胞表面向細胞核的轉運。
實施例22整合有NLS的μ阿片受體(μ阿片-NLS-GFP)。
用編碼μ阿片-NLS-GFP的DNA構建體(2微克)轉染HEK細胞48小時。所述細胞也轉染了Ds-Red-NUC(1微克)，以檢測細胞核定位。使用共聚焦顯微鏡檢查所述細胞。
在轉染了μ阿片-NLS-GFP的細胞中，65％細胞的所述受體表達在細胞核內，15％細胞的所述受體定位在細胞表面，20％細胞的所述受體具有胞漿標記。因此，插入NLS允許μ阿片受體向細胞核轉運。
實施例23用拮抗劑處理整合有NLS的μ阿片受體(μ-NLS-GFP)。
用編碼μ阿片-NLS-GFP的DNA構建體(2微克)轉染HEK細胞。用μ阿片拮抗劑鈉洛酮(10μM)或納曲酮(10μM)處理所述細胞。在轉染後6、22、30和42小時，更換含有拮抗劑的培養基。對照細胞不用拮抗劑處理。使用共聚焦顯微鏡檢查所述細胞。
在未處理的細胞中，62％細胞的μ-NLS-GFP在細胞核內，20％細胞的所述受體可在細胞表面上檢測到。在鈉洛酮處理的細胞中，21％細胞的所述受體表達在細胞核內，66％細胞的所述受體在細胞表面。在納曲酮處理的細胞中，22％細胞的所述受體表達在細胞核內，58％細胞的所述受體在細胞表面。因此，μ阿片拮抗劑鈉洛酮和納曲酮能夠減弱所述受體離開細胞表面向細胞核的轉運。
實施例24用拮抗劑處理整合有NLS的毒蕈鹼M1受體(M1-NLS-GFP)。
用編碼M1-NLS-GFP的DNA(1微克)和Ds-Red-NUC(1微克)轉染HEK細胞48小時。用異丙託溴銨(ipratropium bromide)(10μM)處理所述細胞。在轉染後6、22、30和42小時，更換含有拮抗劑的培養基。對照細胞不用拮抗劑處理。使用共聚焦顯微鏡檢查所述細胞。
在異丙託溴銨處理的細胞中，72％細胞的所述受體表達在細胞表面，17％細胞的所述受體僅表達在胞漿中，11％細胞的所述受體表達在細胞核內。
在對照細胞中，64％細胞的所述受體表達在細胞核內，23％細胞的所述受體表達在細胞表面，13％細胞的所述受體表達在胞漿中。
用毒蕈鹼拮抗劑處理能夠阻止M1-NLS-GFP離開細胞表面向細胞核的轉運。
實施例25整合有NLS的組胺H1受體(H1-NLS-GFP)。
用編碼組胺H1-NLS-GFP受體的DNA構建體(2微克)和編碼Ds-Red-NUC的構建體(1微克)轉染HEK細胞，並溫育48小時。
大約65％所述細胞的所述受體表達在細胞核內，35％同時表達在細胞表面和胞漿中。在H1組胺受體中插入NLS導致所述受體離開細胞表面向細胞核的轉位。
實施例26拮抗劑異丙嗪對插入NLS的組胺H1受體(H1-NLS-GFP)的運輸的影響。
用H1-NLS-GFP(2微克)和DsRED-Nuc(2微克)轉染HEK細胞，並溫育48小時。用異丙嗪(10μM)處理所述細胞48小時。用DsRED-Nuc顯示細胞核。使用共聚焦顯微鏡檢查所述細胞。
在異丙嗪處理的細胞中，88％細胞的所述受體在細胞表面，10％細胞的所述受體在細胞核內。在未處理的細胞中，85％細胞的所述受體表達在細胞核內與胞漿中。因此，用異丙嗪處理能夠減少H1-NLS-GFP向細胞核的運輸。
實施例26血管緊張素AT1受體(AT1R)。
構建編碼融合蛋白的DNA構建體(AT1R-RFP)，所述融合蛋白包括含有NLS的人血管緊張素AT1受體和DsREd2(RFP)。
用DNA構建體AT1R-RFP(4微克)轉染COS細胞，並在37℃溫育48小時。
使用共聚焦顯微鏡檢查所述細胞，發現所述受體完全定位於所述細胞的細胞核內，該現象表明AT1R向細胞核的轉位是基礎性的激動劑非依賴性轉位。
實施例27用激動劑短時間處理多巴胺受體(D1-NLS-GFP)。
用編碼D1-NLS-GFP(2微克)和D1-WT(4微克)的DNA構建體轉染HEK細胞，並溫育所述細胞24小時。用多巴胺D1激動劑SKF81297(10μM)處理所述細胞35分鐘。用共聚焦顯微鏡實時觀察單組細胞。
結果證明了細胞核內所述受體的表達量增加，且所述增加在20分鐘時達到最大，該現象表明短時間激動劑效應。
實施例28融合有GFP和RFP的、含有NLS的多巴胺轉運蛋白(DAT-NLS-GFP和DAT-NLS-RFP)。
用編碼DAT-GFP的DNA構建體(2微克)轉染HEK細胞48小時。使用共聚焦顯微鏡以DsRED-nuc(2微克)觀察細胞核。
在48小時，在86％細胞中的細胞表面或胞漿中檢測到DAT-GFP。在14％所述細胞中，所述轉運蛋白在細胞核內。
用編碼DAT-NLS-RFP的構建體(2微克)轉染HEK細胞，並在48小時用共聚焦顯微鏡觀察。85％細胞的DAT-NLS-RFP在細胞核內檢測到，18％細胞的所述轉運蛋白在細胞表面或在胞漿中。
然後用編碼DAT-NLS-GFP的DNA(2微克)轉染HEK細胞，並在48小時用共聚焦顯微鏡觀察。用DsRED-nuc(2微克)顯示細胞核。在77％細胞的細胞核內檢測到DAT-NLS-GFP。
實施例29DAT-GFP與DAT-NLS-RFP的共運輸。
用編碼DAT-NLS-RFP(2微克)和DAT-GFP(2微克)的DNA構建體轉染HEK細胞，並溫育48小時。使用共聚焦顯微鏡檢查所述細胞。
在56％所述細胞中的細胞核內檢測到黃色螢光，該現象表明DAT-NLS-RFP和DAT-GFP共定位在細胞核內，確證了DAT-NLS-RFP和DAT-GFP之間的寡聚化作用。
實施例30古柯鹼對DAT-NLS-RFP向細胞核運輸的影響。
用編碼DAT-NLS-RFP的DNA構建體(2微克)轉染HEK細胞，並溫育48小時。在轉染後6、22、30和42小時，所述細胞用古柯鹼或苯丙胺(終濃度為10μM)處理，或不處理。使用共聚焦顯微鏡檢查所述細胞。
在未處理的HEK細胞中，77％細胞中的DAT-NLS-RFP在細胞核內表達。
古柯鹼處理後，75％細胞的細胞表面或胞漿中表達DAT-NLS-RFP，而25％細胞的細胞核內與胞漿中表達所述轉運蛋白。古柯鹼處理能夠減少DAT-NLS-RFP向細胞核的運輸。
苯丙胺處理後，34％細胞的細胞表面/胞漿有表達，而66％細胞的細胞核/胞漿有所述轉運蛋白表達。苯丙胺(該物質並不靶向DAT，而靶向囊泡單胺轉運蛋白即VMAT)處理對DAT-NLS-RFP向細胞核運輸沒有抑制作用。
實施例31表達並用拮抗劑處理含有NLS的多巴胺轉運蛋白(DAT-NLS-GFP)。
用編碼DAT-NLS-GFP的DNA構建體(2微克)轉染HEK細胞，並溫育48小時。在轉染後6、22、30和42小時，用GBR-12909(終濃度1μM)處理所述細胞。使用共聚焦顯微鏡檢查所述細胞。
用編碼DAT-NLS-GFP的構建體(2微克)轉染HEK細胞，並溫育48小時。在轉染後6、22、30和42小時，用嗎吲哚(mazindol)(終濃度1μM)處理所述細胞。使用共聚焦顯微鏡檢查所述細胞。
對照HEK細胞用DAT-NLS-GFP轉染並溫育48小時，不用藥物處理。
在轉染有DAT-NLS-GFP的未處理HEK細胞中，77％細胞的所述轉運蛋白表達在細胞核內與胞漿中，23％僅在胞漿中，0％在細胞表面。
在GBR-12909處理後，62％細胞的細胞表面和胞漿中有所述轉運蛋白表達，38％細胞的細胞核內與胞漿中有所述轉運蛋白表達。GBR-12909處理能減少DAT-NLS-GFP離開細胞表面向細胞核的運輸。
在嗎吲哚處理後，61％細胞的細胞表面和胞漿中有所述轉運蛋白表達，39％細胞的細胞核內與胞漿中有所述轉運蛋白表達。嗎吲哚處理能減少DAT-NLS-GFP離開細胞表面向細胞核的轉位。實施例32交錯表達DAT-GFP和DAT-NLS-RFP時，多巴胺轉運蛋白形成同源寡聚體的能力。
用編碼DAT-GFP的DNA構建體(2微克)轉染HEK細胞，24小時後用編碼DAT-NLS-RFP的DNA構建體(0.5、1和2微克)再次轉染所述細胞，並溫育48小時。用DAT-GFP單獨轉染的細胞作為對照。在第二次轉染後溫育細胞48小時。總的溫育時間為72小時。
在僅轉染了DAT-GFP的細胞中，85％細胞的所述轉運蛋白在胞漿中，7％在細胞核內。在交錯轉染實驗(比例為1∶0.5)中，97％細胞的黃色螢光(是紅色和綠色螢光疊加的結果)在細胞核內。在交錯轉染實驗(比例為1∶1)中，94％細胞的黃色螢光在細胞核內。在交錯轉染實驗(比例為1∶2)中，94％細胞的黃色螢光在細胞核內。因此，DAT-GFP能夠與DAT-NLs-GFP相互作用並形成二聚體，以運輸至細胞核。
實施例33促代謝型穀氨酸-4-受體(mGluR4-GFP)的表達。
用編碼mGluR4-GFP的DNA構建體(2微克)轉染HEK細胞，並溫育48小時。用DsRED-NUC(2微克)顯示細胞核。使用共聚焦顯微鏡檢查所述細胞。
89％所述受體表達在細胞表面。因此，mGluR4受體大部分定位在細胞表面。
實施例34插入NLS的促代謝型穀氨酸-4-受體(mGluR4-NLS-GFP)的表達。
用編碼mGluR4-NLS-GFP的DNA構建體(2微克)轉染HEK細胞，並溫育48小時。所述細胞也轉染了Ds-RED-NUC(2微克)，以檢測細胞核定位。使用共聚焦顯微鏡檢查所述細胞。
60％表達mGluR4-NLS-GFP的細胞在其細胞核內表達所述受體。
因此，在mGluR4受體中插入NLS能夠增加所述受體在細胞核內的定位。
實施例35含有或不含有整合的NLS的毒蕈鹼M1受體(M1-GFP和M1-NLS-GFP)的表達。
用編碼M1-GFP的DNA構建體(2微克)或者編碼M1-NLS-GFP的構建體(2微克)轉染HEK細胞，並溫育48小時。用DsRED-NUC(2微克)顯示細胞核。使用共聚焦顯微鏡檢查所述細胞。
在轉染了M1-GFP後，67％所述細胞的細胞表面或胞漿內有所述受體表達。
轉染M1-NLS-GFP細胞中的92％顯示其細胞核內有所述受體表達，該現象表明NLS指導所述受體向細胞核轉位。
實施例36H1組胺受體(H1-GFP)的表達。
用編碼H1-GFP的DNA構建體(1.5微克)轉染HEK細胞，並溫育48小時。用DsRED-NUC(2微克)顯示細胞核。使用共聚焦顯微鏡檢查所述細胞。
97％所述細胞在其細胞表面表達所述受體。因此，未修改的受體不會被轉運至細胞核內。
實施例37插入了NLS的半胱氨醯白三烯受體(CysLT1-NLS-GFP)的表達。
用編碼CysLT1-NLS-GFP的DNA構建體(2微克)轉染HEK細胞，並溫育48小時。用DsRED-NUC(2微克)顯示細胞核。使用共聚焦顯微鏡檢查所述細胞。
在作為對照的未處理細胞中，0％細胞的所述受體表達在細胞表面，100％細胞具有細胞核內表達，該現象表明所述受體從細胞表面被完全清除。
實施例38表達融合有GFP的5-羥色胺轉運蛋白(SERT-GFP)。
用編碼SERT-GFP的DNA構建體(2微克)轉染HEK細胞，並溫育48小時。91％所述細胞在細胞表面和胞漿中表達所述轉運蛋白。
實施例39表達並用氟西汀處理插入NLS的5-羥色胺轉運蛋白(SERT-NLS-GFP)。
用編碼SERT-NLS-GFP的DNA(2微克DNA)轉染HEK細胞，並用氟西汀(終濃度為1μM)處理48小時。在轉染6、22、30和42小時後，用氟西汀(終濃度為1μM)處理所述細胞。使用共聚焦顯微鏡檢查所述細胞。
在表達SERT-NLS-GFP的未處理細胞中，0％細胞的所述轉運蛋白表達在細胞表面，26％細胞的所述轉運蛋白表達在胞漿中，60％細胞的所述轉運蛋白表達在細胞核內與胞漿中。
在氟西汀處理後，68％細胞的SERT-NLS-GFP轉運蛋白表達在細胞表面和胞漿中，27％細胞的所述轉運蛋白表達在細胞核內與胞漿中。因此，用氟西汀處理能夠抑制SERT-NLS-GFP離開細胞表面向細胞核的運輸。
實施例40對兩種不同細胞表面膜蛋白(D2-GFP和DAT-NLS-RFP)相互作用能力的評價。
用編碼D2-GFP(2微克)和DAT-NLS-RFP(2微克)的DNA構建體共轉染HEK細胞，並溫育48小時。將分別單獨轉染D2-GFP和DAT-NLS-RFP的細胞作為對照。使用共聚焦顯微鏡檢查所述細胞。
在轉染有DAT-NLS-RFP的細胞中，85％細胞的所述轉運蛋白在細胞核內。在轉染有D2-GFP的細胞中，97％細胞的所述受體在細胞表面，4％細胞的所述受體在細胞核內。在共轉染的細胞中，86％細胞的細胞核內有黃色螢光(紅色和綠色螢光的疊加)，該現象顯示D2和DAT蛋白均在細胞核內存在，確證共轉染的所述蛋白能夠二聚化。
實施例41對膜蛋白和另一非膜蛋白形成複合物(D1-NLS和β-視紫紅質抑制蛋白1-GFP)並相互作用的能力的評價。
用編碼D1-NLS(2微克)和β-視紫紅質抑制蛋白1-GFP(2微克)的DNA構建體轉染HEK細胞，並溫育48小時。也用β-視紫紅質抑制蛋白1-GFP單獨轉染細胞。使用共聚焦顯微鏡檢測所述細胞。
在單獨轉染β-視紫紅質抑制蛋白1-GFP的細胞中，100％細胞的胞漿中表達螢光蛋白。在所述細胞中，15％細胞的細胞核內也有螢光素。在用兩種蛋白共轉染的細胞中，89％細胞的細胞核內有螢光蛋白表達，16％細胞的胞漿中有螢光蛋白表達。因此，GPCR與非膜蛋白之間的相互作用能使不含NLS的β-視紫紅質抑制蛋白蛋白轉運至細胞核內。
實施例42表達並用拮抗劑處理插入NLS的多巴胺D1受體(HA-D1-NLS)，用螢光計進行檢測。
用多聚-L-鳥氨酸包被多孔板中的孔，然後在每個孔裡放入50,000個細胞。用編碼HA表位標記的D1-NLS受體的DNA轉染所述細胞，並用(+)丁克嗎(10nM-10μM)處理超過48小時。之後用多聚甲醛固定所述細胞，用大鼠抗HA抗體檢測細胞表面的所述受體，然後用結合有FITC的山羊抗大鼠抗體與上述抗體結合。使用螢光計(Cytofluor)檢測螢光信號。實驗結果是每個實驗條件的5個孔的平均值，並顯示在圖2中。丁克嗎對所述受體保留在細胞表面具有劑量依賴效應，該現象表明所述拮抗劑減少所述受體離開細胞表面的轉位。因此，螢光計可用於檢測留在細胞表面的受體。
實施例43表達插入NLS的多巴胺D1受體(HA-D1-NLS)，使用激動劑阻斷拮抗劑的劑量反應效應並用螢光計檢測。
用多聚-L-鳥氨酸包被多孔板中的孔，然後在每個孔裡放入50,000個細胞。用編碼HA表位標記的D1-NLS受體的DNA轉染所述細胞，並用合用或不合用激動劑SKF81297(1μM)的拮抗劑SCH23390(1nM-1μM)處理超過48小時。之後用多聚甲醛固定所述細胞，用大鼠抗HA抗體檢測細胞表面的所述受體，然後用結合有FITC的山羊抗大鼠抗體與上述抗體結合。使用螢光計(Cytofluor)檢測螢光信號。實驗結果是每個實驗條件的5個孔的平均值。SCH23390對所述受體保留在細胞表面具有劑量依賴效應，該現象表明所述拮抗劑減少所述受體離開細胞表面的轉位。伴隨加入的激動劑減少了拮抗劑效應(圖3)。因此，可以通過阻斷拮抗劑效應來檢測激動劑作用，且螢光計可用於定量測定激動劑效應。
實施例43b表達插入NLS的多巴胺D1受體(HA-D1-NLS)，使用激動劑的劑量反應來阻斷拮抗劑效應並用螢光計檢測。
用HA-D1-NLS轉染用多聚-L-鳥氨酸包被的多孔板中的HEK細胞，每個孔裡的細胞的濃度為50,000個。用拮抗劑SCH23390(0.5μM)處理所述細胞48小時。在溫育的最後一個小時，將激動劑SKF81297(100nM-1μM)與SCH23390一起加入到所述細胞中。之後用多聚甲醛固定所述細胞，用大鼠抗HA抗體檢測細胞表面的所述受體，然後用結合有FITC的山羊抗大鼠抗體與上述抗體結合。使用螢光計(Cytofluor)檢測螢光信號。實驗結果是每個實驗條件的5個孔的平均值。
用SCH23390處理將使HA-D1-NLS留在細胞表面(圖4，條1和條6相比)。短時間加入激動劑導致劑量依賴性的阻斷SCH23390的效用。在溫育的最後一個小時從細胞中移去SCH23390(且無激動劑)，導致33％的HA-D1-NLS受體從細胞表面上消失(圖4，條5和條6相比)，而在持續存在SCH23390的細胞中加入100nM激動劑SKF81297，導致66％所述受體從細胞表面上消失(圖4，條4和條6相比)，在加入1μM SKF81297後導致多達78％的所述受體從細胞表面消失(圖4，條2和條6相比)。
拮抗劑SCH23390的效應導致所述受體保留在細胞表面上，這表明所述拮抗劑減少了受體從細胞表面的運輸。伴隨加入的激動劑降低了拮抗劑效應，並以劑量反應方式加速了受體從細胞表面移去的過程。因此，通過阻斷將含有NLS的受體保留在細胞表面的化合物的效應，可以檢測相互作用的化合物，且螢光計可用於定量分析所述效應。
實施例44表達插入一個NLS的多巴胺D1受體(D1-NLS)，用10μM(+)丁克嗎處理並檢測放射性配體結合。
用編碼D1-NLS的DNA轉染HEK細胞，然後所述細胞用(+)丁克嗎(10μM)處理，或者不處理。48小時後，對所述細胞進行漂洗、收集、裂解，並用Polytron勻漿。通過離心收集膜成分，並將其置於35％蔗糖溶液之上，以4℃、30,000rpm的條件離心90分鐘，從而收集重膜成分。
將[3H]-SCH23390和(+)丁克嗎(10μM)用於所述膜成分的放射性配體結合分析，該方法用於確定特異性結合。在室溫下溫育2小時，然後通過閃爍計數進行快速過濾和定量。
D1-NLS的拮抗劑處理防止了其離開細胞表面向細胞核的轉位，且通過放射性配體結合分析來定量保留在細胞表面上的所述受體(圖5)。
實施例45表達插入有一個NLS的多巴胺D1受體(D1-NLS)，用500nM(+)丁克嗎處理並檢測放射性配體結合。
用編碼D1-NLS的DNA轉染HEK細胞，然後所述細胞用500nM(+)丁克嗎處理，或者不處理。48小時後，對所述細胞進行漂洗、收集、裂解，並用Polytron勻漿。通過離心收集膜成分，並將其置於35％蔗糖溶液之上，以4℃、30,000rpm的條件離心90分鐘，從而收集重膜成分。
將[3H]-SCH23390和(+)丁克嗎(10μM)用於所述膜成分的放射性配體結合分析，該方法用於確定特異性結合。在室溫下溫育2小時，然後通過閃爍計數進行快速過濾和定量。結果顯示在表4和表5中。
表4.對照質膜成分

表5.丁克嗎處理的質膜成分

NSB非特異性結合 SB特異性結合用D1-NLS的拮抗劑(+)丁克嗎處理能夠防止其轉位至細胞核，且通過放射性配體結合分析來定量保留在細胞表面上的所述受體。
實施例46表達插入有一個NLS的多巴胺D1受體(D1-NLS)，用100nM(+)丁克嗎處理並用放射性配體結合分析進行檢測。
用編碼D1-NLS的DNA轉染HEK細胞，然後所述細胞用100nM(+)丁克嗎處理，或者不處理。48小時後，對所述細胞進行漂洗、收集、裂解，並用Polytron勻漿。通過離心收集膜成分，並將其置於35％蔗糖溶液之上，以4℃、30,000rpm的條件離心90分鐘，從而收集重膜成分。
將[3H]-SCH23390和(+)丁克嗎(10μM)用於所述膜成分的放射性配體結合分析，該方法用於確定特異性結合。在室溫下溫育2小時，然後通過閃爍計數進行快速過濾和定量。
用拮抗劑(+)丁克嗎(100nM)處理能夠防止D1-NLS轉位至細胞核，且通過放射性配體結合分析來定量保留在細胞表面上的所述受體。在未用(+)丁克嗎處理的情況下，在細胞表面的膜上檢測到0.03pmol/mg(皮摩爾每毫克)受體蛋白；但在丁克嗎處理的情況下，在細胞表面的膜上檢測到0.09pmol/mg受體蛋白。
實施例47表達表皮生長因子受體(酪氨酸激酶受體)EGFR-GFP和EGFR-NLS-GFP。
用編碼EGFR-NLS-GFP的DNA(2微克)轉染HEK細胞。HEK細胞也轉染了編碼EGFR-GFP的DNA(2微克)，並溫育24小時。
EGFR-GFP表達在73％所述細胞的細胞表面上和12％所述細胞的細胞核內。EGFR-NLS-GFP表達在91％所述細胞的細胞核內和0％所述細胞的細胞表面上。將NLS整合入EGF受體的序列誘導了離開細胞表面向細胞核的顯著轉位效應。
實施例48表達低密度脂蛋白受體(LDL-GFP)。
用編碼LDL-GFP的DNA(2微克)轉染HEK細胞，並溫育24小時。所述受體表達在67％所述細胞的細胞表面上和8％所述細胞的細胞核內。
LDL受體表達在大部分細胞的細胞表面上，而只在不多的細胞中表達在細胞核內。
實施例49表達含有一個NLS的LDL受體(LDL-NLS-GFP)。
用編碼LDL-NLS-GFP的DNA(2微克)和DsRED-NUC(2微克)轉染HEK細胞，並溫育48小時。使用共聚焦顯微鏡檢測所述細胞。
LDL-NLS-GFP表達在22％所述細胞的細胞核內和67％所述細胞的所述細胞的細胞表面上。在LDL受體中整合入一個NLS能夠誘導所述受體轉位至細胞核。
實施例50表達紅細胞生成素受體(細胞因子受體)EPO-GFP和EPO-NLS-GFP。
用編碼EPO-NLS-GFP的DNA(2微克)轉染HEK。用EPO-GFP(2微克)轉染HEK細胞。所述細胞也轉染了DsRED-NUC(2微克)。所述細胞溫育48小時，並用共聚焦顯微鏡檢測之。
EPO-NLS-GFP定位在72％所述細胞的細胞核內和0％所述細胞的細胞表面上。EPO-GFP定位在79％所述細胞的細胞表面上和28％所述細胞的細胞核內。在EPO受體序列中整合一NLS，能夠誘導受體離開細胞表面向細胞核的轉位。
實施例51表達含有一個NLS的5-羥色胺轉運蛋白(SERT-NLS-GFP)並用曲舍林處理之。
用編碼SERT-NLS-GFP的DNA(2微克DNA)轉染HEK細胞，並用曲舍林(終濃度未500nM)處理48小時。在轉染後6、22、30和42小時，用曲舍林處理所述細胞。使用共聚焦顯微鏡檢測所述細胞。
在表達SERT-NLS-GFP的未處理細胞中，0％細胞的所述轉運蛋白表達在細胞表面上，75％細胞的所述轉運蛋白表達在細胞核內與胞漿中。
在曲舍林處理後，69％受處理細胞的SERT-NLS-GFP轉運蛋白表達在細胞表面上和胞漿中，21％受處理細胞的所述轉運蛋白表達在細胞核內與胞漿中。因此，用曲舍林處理能夠抑制SERT-NLS-GFP離開細胞表面向細胞核的運輸。
實施例52表達含有一個替代NLS的D1多巴胺受體(D1-NLS2-GFP)，並用拮抗劑處理之。
用編碼D1-NLS2-GFP的DNA(2微克)轉染HEK細胞，並用(+)丁克嗎或SCH23390(1μM)處理48小時。用DsRED-NUC(2微克)顯示細胞核。使用共聚焦顯微鏡檢測所述細胞。
在丁克嗎處理的細胞中，81％細胞的所述受體位於細胞表面上或胞漿中，19％細胞的所述受體表達在細胞核內。在SCH23390處理的細胞中，78％細胞的所述受體位於細胞表面上或胞漿中，22％細胞的所述受體表達在細胞核內。
在未處理的細胞中，89％細胞的所述受體表達在細胞核內與胞漿中。
因此，用多巴胺D1拮抗劑處理能夠防止D1-NLS2-GFP受體離開細胞表面向細胞核的運輸。
本發明並不限於本文描述的上述實施方案的特徵，並包括權利要求範圍中的全部變化和修改。
參考文獻Bailey等，(2001)，專家的治療學觀點(Expert Opinion inTherapeutics)，11卷，1861-1887頁；Barak等，(1997)，生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)，272卷，27497-27500頁；Chen等，(2000)，美國生理學和腎生理學雜誌(Am.J.Physiol.RenalPhysiol.)，279卷，F440-F448頁；George等，(2000)，生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)，275卷，26128-26135頁；George等，(2002)，自然綜述(Nature Reviews)(2002)，1卷，808-820頁；Gorlich等，(1996)，科學(Science)，271卷，1513-1518頁；Grotzinger等，(2002)，生物化學與生物物理學報(Biochim.Biophys.Acta)，1592卷，215-223頁；Hailey等，(2002)，酶學方法(Methods in Enzymology)，351卷，34-41頁；Hanahan等，(1996)，細胞(Cell)，86卷，353-364頁；Howard等，(2001)，藥理學科學進展(Trends in Pharmacol.Sci.)，22卷，132-140頁；Jans等，(2000)，生物分析(Bioessays)，22卷，532-544頁；Lee等，(2002)，專家的治療學靶點方面的觀點(Expert Opinion inTherapeutic Targets)，6卷，185-202頁；Lu等，(1998)，內分泌學(Endocrinol.)，139卷，365-375頁；Masson等，(1999)，藥理學綜述(Pharmacol Reviews)，51卷，439-464頁；Matz等，(1999)，自然生物技術(Nature Biotech)，17卷，969-973頁；Nakae等，(2001)，內分泌學綜述(Endo.Reviews)，22卷，818-835頁；Nicholson等，(2001)，歐洲癌症雜誌(Eur.J.Cancer)，37卷，副刊4，S9-S15頁；Prasher等，(1992)，基因(Gene)，111卷，129頁；Schlenstedt等，(1996)，歐洲生物化學家協會通訊(FEBS Lett.)，389卷，75-79頁；Shawver等，(2002)，癌細胞(Caner Cell)，1卷，117-123頁；Smith等，(2002)，自然(Nature)，418卷，453-459頁；Strickland等，(2002)，內分泌學和代謝進展(Trends Endo.Metab.)，13卷，66-74頁；Watson等，(2000)，骨骼(Bone)，26卷，221-225頁；Weis等，(1998)，生物化學進展(Trends in Biochem.)，23卷，185-189頁；White等，(1998)，自然(Nature)，396卷，679-682頁；表1.核定位序列示例(根據Jans等2002年的數據改編)蛋白 核定位序列人a1 T-ag PKKKRKVCBP80 RRR-(11個胺基酸)-KRRKDNA解螺旋酶Q1 KK-(15個胺基酸)-KKRKBRCA1 KRKRRP，PKKNRLRRK分裂激素 KRQR-(20個胺基酸)-KKSKKMycPAAKRVKLDNF-κB p50 QRKRQKNF-κB p65 HRIEEKRKRTYETFKSIHIV1422KKKYKLKHIV1423KSKKKAQ人a2 T-ag PKKKRKVNF-κB p50 QRKRQK
DNA解螺旋酶Q1 KK-(15個胺基酸)-KKRKLEF-1 KKKKRKREKEBNA1 LKRPRSPSSHIV-1 IN KRK-(22個胺基酸)-KELQKQITKHIV-1 MA GKKKYKLKHHIV 1422 KKKYKLKHIV 1423 KSKKKAQRCP 4.1R EED-(350個胺基酸)-KKKRERLD人a3 T-ag PKKKRKVDNA解螺旋酶Q1 CYFQKKAANMLQQSGSKNTGAKKRKtTSDILRR-(323個胺基酸)-PKQKRK人a4 T-ag PKKKRKV小鼠a1 LEF-1 KKKKRKREK小鼠a2 T-agáCK2位點SSDDEATADSQHSTPPKKKRKVImpa-P1)T-ag PKKKRKVN1N2 RKKRK-(9個胺基酸)-KAKKSKRB KR-(11個胺基酸)-KKLRDorsal áPK A位點 RRPS-(22個胺基酸)-RRKRQKCBP80 RRR-(11個胺基酸)-KRRKDNA解螺旋酶Q1 KK-(15個胺基酸)-KKRKLEF-1 KKKKRKREK小鼠a2 T-agáCK2SSDDEATADSQHSTPPKKKRKVImpa-P1)T-ag PKKKRKVN1N2 RKKRK-(9個胺基酸)-KAKKSKRB KR-(11個胺基酸)-KKLRDorsal áPK A RRPS-(22個胺基酸)-RRKRQKCBP80 RRR-(11個胺基酸)-KRRKDNA解螺旋酶Q1 KK-(15個胺基酸)-KKRK
LEF-1 KKKKRKREK非洲蟾蜍a1 T-ag PKKKRKV核質蛋白KR-(10個胺基酸)-KKKL酵母a1 T-ag PKKKRKV(SRP1，Kap60)T-agáCK2 SSDDEATADSQHSTPPKKKRKVN1N2RKKRK-(9個胺基酸)-KAKKSKHIV-1IN KRK-(22個胺基酸)-KELQKQITK植物a1 T-ag PKKKRKVT-agáCK2SSDDEATADSQHSTPPKKKRKV不透明二號 RKRK-(7個胺基酸)-RRSRYRKR蛋白(玉米) MISEALRKAN1N2RKKRK-(9個胺基酸)-KAKKSKRAG-1，重組激活蛋白1；RCP，紅細胞蛋白；RB，成視網膜細胞瘤蛋白；STAT，轉錄(TF)的信號傳導物與激活物；CBP80，帽結合蛋白；LEF，淋巴細胞增強子因子；EBNA，Epstein-Barr病毒核抗原；IN，HIV-1整合酶；tTG，組織型穀氨醯胺轉移酶；ICP，感染細胞蛋白。
序列表110布賴恩·F·奧當德蘇珊·R·喬治120鑑定與跨膜蛋白相互作用的化合物的方法130P04CA094470140PCT/CA03/005421412003-04-1115060/371,7041512002-04-1215060/442,5561512003-01-2715060/422,8911512002-11-0115060/387,5701512002-06-1215060/379,4191512002-05-13160158170PatentIn version 3.1210121149212DNA213人工序列220
223引物4001gaggactctg aacaccgaat tcgccgccat ggacgggact gggctggtg 49210221145
212DNA213人工序列220
223引物4002gtgtggcagg attcatctgg gtaccgcggt tgggtgctga ccgtt 45210321151212DNA213人工序列220
223引物4003cctaagaggg ttgaaaatct tttaaatttt ttagcattaa aggcataaat g 51210421148212DNA213人工序列220
223引物4004gcctttaatg ctaaaaaatt taaaagattt tcaaccctct taggatgc 48210521119212PRT213人工序列220
223肽4005Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Asn Ala Asp Phe Arg Lys Ala Phe Ser1 5 10 15
Thr Leu Leu210621119212PRT213人工序列220
223肽4006Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Asn Ala Lys Lys Phe Lys Arg Phe Ser1 5 10 15Thr Leu Leu210721127212DNA213人工序列220
223引物4007tacccttacg acgtgccgga ttacgcc 2721082119212PRT213人工序列220
223肽4008Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala1 5
210921184212DNA213人工序列220
223引物4009ggatccacta gtaacggccg ccagaccacc atgggatacc cgtacgacgt ccccgactac 60gcaaggactc tgaacacctc tgcc842101021136212DNA213人工序列220
223引物40010ggccgccagc tgcgagttca ggttgggtgc tgaccg 362101121116212PRT213人工序列220
223肽40011Met Arg Thr Leu Asn Thr Ser Ala Met Asp Gly Thr Gly Leu Val Val1 5 10 152101221126212PRT213人工序列220
223肽40012Met Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Arg Thr Leu Asn Thr1 5 10 15Ser Ala Met Asp Gly Thr Gly Leu Val Val20 252101321136212DNA213人工序列220
223引物40013ggaaagttct tttaagaaga agttcaaaag agaaac 362101421136212DNA213人工序列220
223引物40014gtttctcttt tgaacttctt cttaaaagaa ctttcc 362101521117212PRT213人工序列220
223肽40015
Gln Pro Glu Ser Ser Phe Lys Met Ser Phe Lys Arg Glu Thr Lys Val1 5 10 15Leu2101621117212PRT213人工序列220
223肽40016Gln Pro Glu Ser Ser Phe Lys Lys Lys Phe Lys Arg Glu Thr Lys Val1 5 10 15Leu2101721137212DNA213人工序列220
223引物40017ccggtatgag aaaaagttta aacgcaaggc agccttc 372101821139212DNA213人工序列220
223引物40018ggctgccttg cgtttaaact ttttctcata ccggaaagg39
2101921118212PRT213人工序列220
223肽40019Asn Pro Phe Arg Tyr Glu Arg Lys Met Thr Pro Lys Ala Ala Phe Ile1 5 10 15Leu Ile2102021118212PRT213人工序列220
223肽40020Asn Pro Phe Arg Tyr Glu Lys Lys Phe Lys Arg Lys Ala Ala Phe Ile1 5 10 15Leu Ile2102121139212DNA213人工序列220
223引物40021gtgctgccgt taaaaagttc aaacgcctgc ggtccaagg39
2102221140212DNA213人工序列220
223引物40022ggaccgcagg cgtttgaact ttttaacggc agcacagacc 402102321118212PRT213人工序列220
223肽40023Leu Val Cys Ala Ala Val Ile Arg Phe Arg His Leu Arg Ser Lys Val1 5 10 15Thr Asn2102421118212PRT213人工序列220
223肽40024Leu Val Cys Ala Ala Val Lys Lys Phe Lys Arg Leu Arg Ser Lys Val1 5 10 15Thr Asn21025
21144212DNA213人工序列220
223引物40025gcctttaatc ctaaaaaaaa aagaaaggtt tcaaccctct tagg 442102621144212DNA213人工序列220
223引物40026cctaagaggg ttgaaacctt tctttttttt ttaggattaa aggc 442102721119212PRT213人工序列220
223肽40027Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Asn Ala Asp Phe Arg Lys Ala Phe Ser1 5 10 15Thr Leu Leu2102821119212PRT213人工序列220
223肽40028Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Asn Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ser1 5 10 15Thr Leu Leu2102921145212DNA213人工序列220
223引物40029ggccgtggct ccaccgaatt cgccgccatg gatccactga atctg 452103021143212DNA213人工序列220
223引物40030ctgtgcgggc aggcagggta ccgcgcagtg gaggatcttc agg 432103121144212DNA213人工序列220
223引物40031caccaccttc aacaaaaaat tcaaaagagc cttcctgaag atcc 44
2103221144212DNA213人工序列220
223引物40032ggatcttcag gaaggctctt ttgaattttt tgttgaaggt ggtg 442103321146212DNA213人工序列220
223引物40033ggcatcacgc acctcaagct tgccgccatg gcatctctga gtcagc462103421145212DNA213人工序列220
223引物40034gagtgttccc tcttctgcgg taccgcgcaa gacaggatct tgagg 452103521117212DNA213人工序列220
223引物
40035aatacgactc actatag172103621146212DNA213人工序列220
223引物40036cgccagtgtg atggataatg gtaccgcatg gaatccattc ggggtg462103721124212DNA213人工序列220
223引物40037gcgccaatga gcctccccaa ttcc242103821125212DNA213人工序列220
223引物40038gagcctccct taggagcgaa tatgc 252103921136212DNA213人工序列
220
223引物40039cgcctgcagg ccgccatgag cctccccaat tcctcc 362104021134212DNA213人工序列220
223引物40040ccggtggatc ccgggccccg gagcgaatat gcag 342104121163212DNA213人工序列220
223引物40041gggccccgga gcgaatatgc agaattctct tgaatgtcct cttgaatttt ttattgcaca 60agg 632104221135212DNA213人工序列220
223引物40042aagaattcgc caccatggat gaaacaggaa atctg35
2104321130212DNA213人工序列220
223引物40043gggtaccgct actttacata tttcttctcc 302104421138212DNA213人工序列220
223引物40044ttcttttctg ggaaaaaatt taagagaagg ctgtctac 382104521137212DNA213人工序列220
223引物40045tgtagacagc cttctcttaa attttttccc agaaaag 372104621148212DNA213人工序列220
223引物40046
ctttttgtgt ctgtttctga attcgccacc atggagagaa aatttatg 482104721146212DNA213人工序列220
223引物40047gaacaggtct catctaagag gtaccgctac tcttgtttcc tttctc462104821137212DNA213人工序列220
223引物40048gctgggaaaa aatttaaaag aagactaaag tctgcac 372104921138212DNA213人工序列220
223引物40049gtcttctttt aaattttttc ccagcaaagt aatagagc 382105021126212DNA213人工序列220
223引物40050ccccacctag ccaccatgaa cacttc 262105121125212DNA213人工序列220
223引物40051ggggactatc agcattggcg ggagg 252105221132212DNA213人工序列220
223引物40052ccccacctgc agccaccatg aacacttcag cc 322105321133212DNA213人工序列220
223引物40053ggggaggatc cgcgcattgg cgggagggag tgc 332105421138
212DNA213人工序列220
223引物40054cgcactctgc aacaaaaaat tcaaacgcac ctttcgcc 382105521138212DNA213人工序列220
223引物40055ggcgaaaggt gcgtttgaat tttttgttgc agagtgcg 382105621134212DNA213人工序列220
223引物40056ggggcgaatt cgccgccatg gaggaaccgg gtgc 342105721134212DNA213人工序列220
223引物40057gcaaacggta ccgcacttgt gcacttaaaa cgta 34
2105821139212DNA213人工序列220
223引物40058atgtccaata aaaaatttaa aagagcattc cataaactg392105921138212DNA213人工序列220
223引物40059ggaatgctct tttaaatttt ttattggaca tggtatag 382106021117212DNA213人工序列220
223引物40060aatacgactc actatag172106121149212DNA213人工序列220
223引物
40061gccgccagtg tgatggatac tggtaccgct agcagtgagt catttgtac 492106221139212DNA213人工序列220
223引物40062ccccttatct acgcctttag cgcaaagaag ttcaagcgc392106321139212DNA213人工序列220
223引物40063gcgcttgaac ttctttgcgc taaaggcgta gataagggg392106421138212DNA213人工序列220
223引物40064ctgccggagc aaaaaattca aaagagcctt ccaggagc 382106521138212DNA213人工序列
220
223引物40065cctggaaggc tcttttgaat tttttgctcc ggcagtag 382106621119212PRT213人工序列220
223肽40066Asn Pro Leu Ile Tyr Cys Arg Ser Pro Asp Phe Ile Arg Ala Phe Gln1 5 10 15Glu Leu Leu2106721119212PRT213人工序列220
223肽40067Asn Pro Leu Ile Tyr Cys Arg Ser Lys Lys Phe Lys Arg Ala Phe Gln1 5 10 15Glu Leu Leu2106821138212DNA213人工序列220
223引物40068cgtctctgct ccctggtacc gccaccttga gccagtgg 382106921120212DNA213人工序列220
223引物40069taatacgact cactataggg 202107021138212DNA213人工序列220
223引物40070cgtctctgct ccctggtacc gccaccttga gccagtgg 382107121137212DNA213人工序列220
223引物40071ctatgcggcc aaaaagttca aaagactgcc tgggtcc 372107221138212DNA
213人工序列220
223引物40072caggcagtct tttgaacttt ttggccgcat agatgggc 382107321124212PRT213人工序列220
223肽40073Ser Ser Met Ala Met Val Pro Ile Tyr Ala Ala Tyr Lys Phe Cys Ser1 5 10 15Leu Pro Gly Ser Phe Arg Glu Lys202107421124212PRT213人工序列220
223肽40074Ser Ser Met Ala Met Val Pro Ile Tyr Ala Ala Lys Lys Phe Lys Arg1 5 10 15Leu Pro Gly Ser Phe Arg Glu Lys202107521137
212DNA213人工序列220
223引物40075ctatgcggcc aaaaagttca aaagactgcc tgggtcc 372107621138212DNA213人工序列220
223引物40076caggcagtct tttgaacttt ttggccgcat agatgggc 382107721124212PRT213人工序列220
223肽40077Ser Ser Met Ala Met Val Pro Ile Tyr Ala Ala Tyr Lys Phe Cys Ser1 5 10 15Leu Pro Gly Ser Phe Arg Glu Lys202107821124212PRT213人工序列220
223肽40078Ser Ser Met Ala Met Val Pro Ile Tyr Ala Ala Lys Lys Phe Lys Arg1 5 10 15Leu Pro Gly Ser Phe Arg Glu Lys202107921140212DNA213人工序列220
223引物40079gtcatttact aagcttgcca ccatggagac gacgcccttg 402108021137212DNA213人工序列220
223引物40080cctctcggtg agtggtaccg ccacagcatt caagcgg 372108121139212DNA213人工序列220
223引物40081ggacactgcc tggcaaagct tgcgagcatg gggccctgg39
2108221140212DNA213人工序列220
223引物40082ggcgggactc caggcaggta ccgccgccac gtcatcctcc 402108321142212DNA213人工序列220
223引物40083ctatggaaga actggaaaaa atttaaaaga aacagcatca ac422108421142212DNA213人工序列220
223引物40084caaagttgat gctgtttctt ttaaattttt tccagttctt cc422108521120212PRT213人工序列220
223肽
40085Phe Leu Leu Trp Lys Asn Trp Arg Leu Lys Asn Ile Asn Ser Ile Asn1 5 10 15Phe Asp Asn Pro202108621120212PRT213人工序列220
223肽40086Phe Leu Leu Trp Lys Asn Trp Lys Lys Phe Lys Arg Asn Ser Ile Asn1 5 10 15Phe Asp Asn Pro202108721140212DNA213人工序列220
223引物40087gctcttcggg ctcgagcagc gatgcgaccc tccgggacgg 402108821139212DNA213人工序列220
223引物40088ctatcctccg tggtaccgct gctccaataa attcactgc392108921137212DNA213人工序列220
223引物40089gatcatcact ccaaagaaat ttaaaagacg tattatt 372109021140212DNA213人工序列220
223引物40090taatacgtct tttaaatttc tttggagtga tgatcaaccg 402109121118212PRT213人工序列220
223肽40091Arg Leu Ile Ile Thr Pro Gly Thr Phe Lys Glu Arg Ile Ile Lys Ser1 5 10 15Ile Thr
2109221118212PRT213人工序列220
223肽40092Arg Leu Ile Ile Thr Pro Lys Lys Phe Lys Arg Arg Ile Ile Lys Ser1 5 10 15Ile Thr2109321134212DNA213人工序列220
223引物40093gggtctctaa gcttgccgcc atgtccggga aggg 342109421133212DNA213人工序列220
223引物40094ccgcggcccg gaattcggat ggcatggttg gtg 332109521137212DNA213人工序列
220
223引物40095cgtgcccaag aaattcaagc gcctcaaagc cgtggtc 372109621138212DNA213人工序列220
223引物40096cggctttgag gcgcttgaat ttcttgggca cgttctgc 382109721122212PRT213人工序列220
223肽40097Phe His Pro Glu Gln Asn Val Pro Lys Arg Lys Arg Ser Leu Lys Ala1 5 10 15Val Val Thr Ala Ala Thr202109821122212PRT213人工序列220
223肽
40098Phe His Pro Glu Gln Asn Val Pro Lys Lys Phe Lys Arg Leu Lys Ala1 5 10 15Val Val Thr Ala Ala Thr202109921139212DNA213人工序列220
223引物40099ggagacccca agcttccgca gccatgggca ccgggggcc3921010021139212DNA213人工序列220
223引物400100ccccgccacg ggccccggaa ggattggacc gaggcaagg3921010121142212DNA213人工序列220
223引物400101ccgctgggac cgaaaaaatt taagagaaac cctgagtatc tc42
21010221143212DNA213人工序列220
223引物400102gatactcagg gtttctctta aattttttcg gtcccagcgg ccc 4321010321120212DNA213人工序列220
223引物400103taatacgact cactataggg 2021010421144212DNA213人工序列220
223引物400104gactgcagcc tggtggtacc gcagagcaag ccacatagct gggg 4421010521120212DNA213人工序列220
223引物400105
taatacgact cactataggg 2021010621144212DNA213人工序列220
223引物400106gactgcagcc tggtggtacc gcagagcaag ccacatagct gggg 4421010721140212DNA213人工序列220
223引物400107gctgctctcc cacaaaaagt ttaagcggca gaagatctgg 4021010821140212DNA213人工序列220
223引物400108ccagatcttc tgccgcttaa actttttgtg ggagagcagc 4021010921121212PRT213人工序列220
223肽220
221MISC_FEATURE222(14)..(14)223Xaa＝鳥氨酸400109Thr Val Leu Ala Leu Leu Ser His Arg Arg Ala Leu Lys Xaa Lys Ile1 5 10 15Trp Pro Gly Ile Pro2021011021121212PRT213人工序列220
223肽220
221MISC_FEATURE222(14)..(14)223Xaa＝鳥氨酸400110Thr Val Leu Ala Leu Leu Ser His Lys Lys Phe Lys Arg Xaa Lys Ile1 5 10 15Trp Pro Gly Ile Pro2021011121140212DNA213人工序列220
223引物400111gctcttcggg ctcgagcagc gatgcgaccc tccgggacgg 4021011221139212DNA213人工序列220
223引物400112ctatcctccg tggtaccgct gctccaataa attcactgc3921011321137212DNA213人工序列220
223引物400113cacatcgttc ggaagaagtt taagcggagg ctgctgc 3721011421140212DNA213人工序列220
223引物400114cctgcagcag cctccgctta aacttcttcc gaacgatgtg 4021011521119212PRT
213人工序列220
223肽400115Arg Arg Arg His Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln1 5 10 15Glu Arg Glu21011621119212PRT213人工序列220
223肽400116Arg Arg Arg His Ile Val Arg Lys Lys Phe Lys Arg Arg Leu Leu Gln1 5 10 15Glu Arg Glu21011721149212DNA213人工序列220
223引物400117gaggactctg aacaccgaat tcgccgccat ggacgggact gggctggtg 4921011821145212DNA213人工序列
220
223引物400118gtgtggcagg attcatctgg gtaccgcggt tgggtgctga ccgtt 4521011921141212DNA213人工序列220
223引物400119cctctgagga cctgaaaaag aagagaaagg ctggcatcgc c 4121012021141212DNA213人工序列220
223引物400120ggcgatgcca gcctttctct tctttttcag gtcctcagag g 4121012121133212PRT213人工序列220
223肽400121Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Asn Ala Asp Phe Arg Lys Ala Phe Ser1 5 10 15
Thr Leu Leu Ser Ser Glu Asp Leu Lys Lys Glu Glu Ala Ala Gly Ile20 25 30Ala21012221133212PRT213人工序列220
223肽400122Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Asn Ala Lys Lys Phe Lys Arg Phe Ser1 5 10 15Thr Leu Leu Ser Ser Glu Asp Leu Lys Lys Lys Arg Lys Ala Gly Ile20 25 30Ala21012321145212DNA213人工序列220
223引物400123cctagtccgc agcaggccga attcgccacc atggacagca gcacc 4521012421144212DNA213人工序列220
223引物
400124gatggtgtga gaccggtacc gcgggcaatg gagcagtttc tgcc 4421012521145212DNA213人工序列220
223引物400125cctagtccgc agcaggccga attcgccacc atggacagca gcacc 4521012621145212DNA213人工序列220
223引物400126ggatggtgtg agaccggtac cgcgggcaat ggagcagttt ctgcc 4521012721130212DNA213人工序列220
223引物400127gccttcctgg ataaaaaatt caagcgatgc 3021012821131212DNA213人工序列
220
223引物400128gcatcgcttg aattttttat ccaggaaggc g 312101292117212PRT213人工序列220
223肽400129Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val1 52101302118212PRT213人工序列220
223肽220
221MISC_FEATURE222(4)..(14)223Xaa為任何11個胺基酸的序列400130Arg Arg Arg Xaa Lys Arg Arg Lys1 52101312117212PRT213人工序列
220
223肽220
221MISC_FEATURE222(3)..(17)223Xaa為任何15個胺基酸的序列400131Lys Lys Xaa Lys Lys Arg Lys1 52101322116212PRT213人工序列220
223肽400132Lys Arg Lys Arg Arg Pro1 52101332119212PRT213人工序列220
223肽400133Pro Lys Lys Asn Arg Leu Arg Arg Lys1 521013421110212PRT
213人工序列220
223肽220
221MISC_FEATURE222(5)..(24)223Xaa為任何20個胺基酸的序列400134Lys Arg Gln Arg Xaa Lys Lys Ser Lys Lys1 5 102101352119212PRT213人工序列220
223肽400135Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp1 52101362116212PRT213人工序列220
223肽400136Gln Arg Lys Arg Gln Lys1 5210137
21117212PRT213人工序列220
223肽400137His Arg Ile Glu Glu Lys Arg Lys Arg Thr Tyr Glu Thr Phe Lys Ser1 5 10 15Ile2101382117212PRT213人工序列220
223肽400138Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys1 52101392117212PRT213人工序列220
223肽400139Lys Ser Lys Lys Lys Ala Gln1 5210140
2119212PRT213人工序列220
223肽400140Lys Lys Lys Lys Arg Lys Arg Glu Lys1 52101412119212PRT213人工序列220
223肽400141Leu Lys Arg Pro Arg Ser Pro Ser Ser1 521014221113212PRT213人工序列220
223肽220
221MISC_FEATURE222(4)..(25)223Xaa為任何22個胺基酸的序列400142Lys Arg Lys Xaa Lys Glu Leu Gln Lys Gln Ile Thr Lys1 5 10
2101432119212PRT213人工序列220
223肽400143Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys His1 52101442117212PRT213人工序列220
223肽400144Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys1 52101452117212PRT213人工序列220
223肽400145Lys Ser Lys Lys Lys Ala Gln1 521014621112
212PRT213人工序列220
223肽220
221MISC_FEATURE222(4)..(353)223Xaa任何350個胺基酸的序列400146Glu Glu Asp Xaa Lys Lys Lys Arg Glu Arg Leu Asp1 5 1021014721125212PRT213人工序列220
223肽400147Cys Tyr Phe Gln Lys Lys Ala Ala Asn Met Leu Gln Gln Ser Gly Ser1 5 10 15Lys Asn Thr Gly Ala Lys Lys Arg Lys20 2521014821112212PRT213人工序列220
223肽220
221MISC_FEATURE222(6)..(328)
223Xaa為任何323個胺基酸的序列400148Asp Ile Leu Arg Arg Xaa Pro Lys Gln Lys Arg Lys1 5 1021014921122212PRT213人工序列220
223肽400149Ser Ser Asp Asp Glu Ala Thr Ala Asp Ser Gln His Ser Thr Pro Pro1 5 10 15Lys Lys Lys Arg Lys Val2021015021112212PRT213人工序列220
223肽220
221MISC_FEATURE222(6)..(14)223Xaa為任何9個胺基酸的序列400150Arg Lys Lys Arg Lys Xaa Lys Ala Lys Lys Ser Lys1 5 10210151
2117212PRT213人工序列220
223肽220
221MISC_FEATURE222(3)..(13)223Xaa為任何11個胺基酸的序列400151Lys Arg Xaa Lys Lys Leu Arg1 521015221111212PRT213人工序列220
223肽220
221MISC_FEATURE222(5)..(27)223Xaa為任何22個胺基酸的序列220
221MISC_FEATURE222(5)..(26)223Xaa為任何胺基酸400152Arg Arg Pro Ser Xaa Arg Arg Lys Arg Gln Lys1 5 102101532118212PRT
213人工序列220
223肽220
221MISC_FEATURE222(4)..(14)223Xaa為任何11個胺基酸的序列400153Arg Arg Arg Xaa Lys Arg Arg Lys1 52101542117212PRT213人工序列220
223肽220
221MISC_FEATURE222(3)..(12)223Xaa為任何10個胺基酸的序列400154Lys Arg Xaa Lys Lys Lys Leu1 521015521112212PRT213人工序列220
223肽220
221MISC_FEATURE
222(5)..(11)223Xaa為任何7個胺基酸的序列400155Arg Lys Arg Lys Xaa Arg Arg Ser Arg Tyr Arg Lys1 5 102101562119212PRT213人工序列220
223肽400156Met Ile Ser Glu Ala Leu Arg Lys Ala1 52101572115212PRT213人工序列220
223肽400157Lys Lys Phe Lys Arg1 52101582119212PRT213人工序列220
223肽
400158Ala Phe Ser Ala Lys Lys Phe Lys Arg1 權利要求
1.一種篩選能夠與至少一種跨膜蛋白相互作用的候選化合物的方法，該方法包括用至少一段編碼蛋白質的核苷酸序列轉染細胞，並允許在該細胞中表達編碼的蛋白質，所述蛋白質包含有跨膜蛋白，該跨膜蛋白包含至少一個核定位序列和可檢測成分；將所述細胞與候選化合物接觸；和通過檢測細胞中可檢測成分的分布情況，來確定該細胞中所述表達蛋白質的分布情況；其中，如果檢測發現，相對於未接觸候選化合物的對照細胞中的可檢測成分的分布情況，所述細胞中可檢測成分的分布情況發生改變，則表明所述化合物與跨膜蛋白發生相互作用。
2.如權利要求1所述的方法，其中，所述可檢測成分是可檢測肽，該肽包含所述跨膜蛋白胺基酸序列的抗原部分。
3.如權利要求1所述的方法，其中，所述核苷酸序列編碼包含有跨膜蛋白的融合蛋白，該跨膜蛋白含有至少一個核定位序列和可檢測成分。
4.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其中，野生型跨膜蛋白含有核定位序列。
5.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其中，野生型跨膜蛋白不含核定位序列，並且編碼所述跨膜蛋白的核苷酸序列經修改而編碼核定位序列。
6.如權利要求5所述的方法，其中，修改所述核苷酸序列，以編碼選自表1的核定位序列。
7.如權利要求5所述的方法，其中，修改所述核苷酸序列，以編碼選自KKFKR、PKKKRKV或AFSAKKFKR的胺基酸序列。
8.如權利要求1-7中任一項所述的方法，其中，所述細胞是真核細胞或原核細胞。
9.如權利要求8所述的方法，其中，所述細胞選自下列真核細胞哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、線蟲細胞、植物細胞或真菌細胞。
10.如權利要求9所述的方法，其中，有核細胞是選自HEK、COS或CHO細胞的哺乳動物細胞。
11.如權利要求3所述的方法，其中，所述可檢測成分是抗原肽，且通過使其與基於抗體的檢測體系結合來確定所述抗原肽在細胞中的分布情況，所述檢測體系包含對所述抗原肽具有特異性的抗體。
12.如權利要求11所述的方法，其中，所述基於抗體的檢測體系包含對所述抗原肽具有特異性的一抗，和攜帶有可檢測標記並對一抗具有特異性的二抗。
13.如權利要求11所述的方法，其中，所述基於抗體的檢測體系包含對所述抗原肽具有特異性並攜帶有可檢測標記的一抗。
14.如權利要求12或13所述的方法，其中，所述可檢測標記是光學上可檢測的標記。
15.如權利要求14所述的方法，其中，所述可檢測標記是發光標記或螢光標記。
16.如權利要求3所述的方法，其中，所述可檢測成分是多肽，該多肽選自綠色螢光蛋白、紅色螢光蛋白或它們的經修飾的變異體。
17.如權利要求1-16中任一項所述的方法，其中，所述跨膜蛋白選自G蛋白偶聯受體、轉運蛋白、細胞因子受體、酪氨酸激酶受體或低密度脂蛋白受體。
18.如權利要求17所述的方法，其中，所述跨膜蛋白是G蛋白偶聯受體。
19.如權利要求18所述的方法，其中，所述G蛋白偶聯受體選自多巴胺D1受體、多巴胺D2受體、多巴胺D3受體、多巴胺D5受體、組胺1受體、半胱氨醯白三烯受體1、半胱氨醯白三烯受體2、阿片受體、蕈毒鹼受體、5-羥色胺受體、β2-腎上腺素能受體或促代謝型穀氨酸4受體。
20.如權利要求17所述的方法，其中，所述跨膜蛋白是轉運蛋白。
21.如權利要求20所述的方法，其中，所述轉運蛋白選自多巴胺轉運蛋白或5-羥色胺轉運蛋白。
22.如權利要求17所述的方法，其中，所述跨膜蛋白是細胞因子受體。
23.如權利要求22所述的方法，其中，所述細胞因子受體選自紅細胞生成素受體或胰島素受體。
24.如權利要求17所述的方法，其中，所述跨膜蛋白是酪氨酸激酶受體。
25.如權利要求24所述的方法，其中，所述酪氨酸激酶受體選自表皮生長因子受體或胰島素受體。
26.如權利要求17所述的方法，其中，所述跨膜蛋白是低密度脂蛋白受體。
27.如權利要求1-26中任一項所述的方法，其中，用多種核苷酸序列轉染所述細胞，每種所述序列編碼包含有不同跨膜蛋白的蛋白質，所述跨膜蛋白含有至少一個核定位序列。
28.如權利要求27所述的方法，其中，每個所述核苷酸序列編碼含有不同可檢測成分的蛋白質。
29.如權利要求27所述的方法，其中，至少一種可檢測成分在至少兩種編碼的蛋白質中是相同的。
30.如權利要求1所述的方法，其中，在所述細胞與候選化合物接觸前，將所述細胞與已知能夠與至少一種跨膜蛋白相互作用的化合物接觸，以及其中，相對於對照細胞中所述可檢測成分的分布情況，如果所述細胞中的所述可檢測成分分布情況發生改變，則表明所述候選化合物與所述跨膜蛋白相互作用，所述對照細胞與已知能夠與跨膜蛋白相互作用的化合物接觸，但不與所述候選化合物接觸。
31.如權利要求1-30中任一項所述的方法，其中，細胞中可檢測成分分布情況改變的檢測包括檢測與細胞膜相關的可檢測成分的改變水平。
32.如權利要求31所述的方法，其中，可檢測成分分布情況改變的檢測包括檢測與細胞膜相關的可檢測成分的降低水平。
33.如權利要求32所述的方法，其中，可檢測成分分布情況改變的檢測包括檢測與細胞膜相關的可檢測成分的升高水平。
34.如權利要求1-30中任一項所述的方法，其中，細胞中可檢測成分分布情況改變的檢測包括檢測細胞核中的可檢測成分的改變水平。
35.如權利要求34所述的方法，其中，可檢測成分分布情況改變的檢測包括檢測細胞核中的可檢測成分的降低水平。
36.如權利要求31所述的方法，其中，可檢測成分分布情況改變的檢測包括檢測細胞核中的可檢測成分的升高水平。
37.一種篩選能夠與至少一種跨膜蛋白相互作用的候選化合物的方法，該方法包括用至少一段編碼含有核定位序列的跨膜蛋白的核苷酸序列轉染細胞，並允許在該細胞中表達編碼的蛋白質；將所述細胞與候選化合物接觸；和通過分離所述細胞的細胞膜成分、將該細胞膜成分與跨膜蛋白的標記配體接觸並檢測與該細胞膜成分結合的配體的水平，來確定在該細胞膜上的含有核定位序列的跨膜蛋白水平；其中，如果檢測發現，相對於未接觸候選化合物的對照細胞的細胞膜中跨膜蛋白的水平，所述細胞膜中跨膜蛋白的水平發生改變，則表明所述化合物與跨膜蛋白相互作用。
38.如權利要求37所述的方法，其中，所述標記配體是經放射性標記的配體。
39.如權利要求37或38所述的方法，其中，野生型跨膜蛋白含有核定位序列。
40.如權利要求37或38所述的方法，其中，野生型跨膜蛋白不含核定位序列，並且編碼所述跨膜蛋白的核苷酸序列經修改而編碼核定位序列。
41.如權利要求40所述的方法，其中，修改所述核苷酸序列，以編碼選自表1的核定位序列。
42.如權利要求40所述的方法，其中，修改所述核苷酸序列，以編碼選自KKFKR、PKKKRKV或AFSAKKFKR的胺基酸序列。
43.如權利要求37-42中任一項所述方法，其中，所述細胞是真核細胞或原核細胞。
44.如權利要求43所述的方法，其中，所述細胞選自下列真核細胞哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、線蟲細胞、植物細胞或真菌細胞。
45.如權利要求44所述的方法，其中，所述細胞是選自HEK、COS或CHO細胞的哺乳動物細胞。
46.如權利要求37-45中任一項所述的方法，其中，所述跨膜蛋白選自G蛋白偶聯受體、轉運蛋白、細胞因子受體、酪氨酸激酶受體或低密度脂蛋白受體。
47.如權利要求46所述的方法，其中，所述跨膜蛋白是G蛋白偶聯受體。
48.如權利要求47所述的方法，其中，所述G蛋白偶聯受體選自多巴胺D1受體、多巴胺D2受體、多巴胺D3受體、多巴胺D5受體、組胺1受體、半胱氨醯白三烯受體1、半胱氨醯白三烯受體2、阿片受體、蕈毒鹼受體、5-羥色胺受體、β2-腎上腺素能受體或促代謝型穀氨酸4受體。
49.如權利要求46所述的方法，其中，所述跨膜蛋白是轉運蛋白。
50.如權利要求49所述的方法，其中，所述轉運蛋白選自多巴胺轉運蛋白或5-羥色胺轉運蛋白。
51.如權利要求46所述的方法，其中，所述跨膜蛋白是細胞因子受體。
52.如權利要求51所述的方法，其中，所述細胞因子受體選自紅細胞生成素受體或胰島素受體。
53.如權利要求46所述的方法，其中，所述跨膜蛋白是酪氨酸激酶受體。
54.如權利要求53所述的方法，其中，所述酪氨酸激酶受體選自表皮生長因子受體或胰島素受體。
55.如權利要求46所述的方法，其中，所述跨膜蛋白是低密度脂蛋白受體。
56.如權利要求37-55中任一項所述的方法，其中，用多種核苷酸序列轉染所述細胞，每種所述序列編碼包含有不同跨膜蛋白的蛋白質，所述跨膜蛋白含有至少一個核定位序列。
57.如權利要求56所述的方法，其中，每個所述核苷酸序列編碼包含不同的可檢測成分的蛋白質。
58.如權利要求56所述的方法，其中，至少一種可檢測成分在至少兩種編碼的蛋白質中是相同的。
59.如權利要求37-58中任一項所述的方法，其中，可檢測成分分布情況改變的檢測包括檢測與細胞膜相關的可檢測成分的降低水平。
60.如權利要求37-58中任一項所述的方法，其中，可檢測成分分布情況改變的檢測包括檢測與細胞膜相關的可檢測成分的升高水平。
61.轉染有至少一種核苷酸序列的分離的細胞，所述核苷酸序列編碼包含有跨膜蛋白的蛋白質，所述跨膜蛋白含有至少一個核定位序列和可檢測成分。
62.如權利要求61所述的細胞，其中，所述可檢測成分是可檢測的肽，該肽包含所述跨膜蛋白胺基酸序列的抗原部分。
63.如權利要求61所述的細胞，其中，所述核苷酸序列編碼包含有跨膜蛋白的融合蛋白，所述跨膜蛋白含有至少一個核定位序列和可檢測成分。
64.如權利要求61-63中任一項所述的細胞，其中，野生型跨膜蛋白含有核定位序列。
65.如權利要求61-63中任一項所述的細胞，其中，野生型跨膜蛋白不含核定位序列，並且編碼所述跨膜蛋白的核苷酸序列經修改而編碼核定位序列。
66.如權利要求65所述的方法，其中，修改所述核苷酸序列以編碼選自表1的核定位序列。
67.如權利要求65所述的細胞，其中，修改所述核苷酸序列以編碼選自KKFKR、PKKKRKV或AFSAKKFKR的胺基酸序列。
68.如權利要求63所述的細胞，其中，所述可檢測成分是抗原肽，且通過使其與基於抗體的檢測體系結合的方法來確定所述抗原肽在細胞中的分布情況，所述檢測體系包含對所述抗原肽具有特異性的抗體。
69.如權利要求68所述的細胞，其中，所述基於抗體的檢測體系包含對所述抗原肽具有特異性的一抗，和攜帶有可檢測標記並對一抗具有特異性的二抗。
70.如權利要求68所述的細胞，其中，所述基於抗體的檢測體系包含對所述抗原肽具有特異性並攜帶有可檢測標記的一抗。
71.如權利要求68或69所述的細胞，其中，所述可檢測標記是光學上可檢測的標記。
72.如權利要求68或69所述的細胞，其中，所述可檢測標記是發光標記或螢光標記。
73.如權利要求63所述的細胞，其中，所述可檢測成分是多肽，該多肽選自綠色螢光蛋白、紅色螢光蛋白或它們的經修飾的變異體。
74.如權利要求61-73中任一項所述的細胞，其中，所述跨膜蛋白選自G蛋白偶聯受體、轉運蛋白、細胞因子受體、酪氨酸激酶受體或低密度脂蛋白受體。
75.如權利要求74所述的細胞，其中，所述跨膜蛋白是G蛋白偶聯受體。
76.如權利要求75所述的細胞，其中，所述G蛋白偶聯受體選自多巴胺D1受體、多巴胺D2受體、多巴胺D3受體、多巴胺D5受體、組胺1受體、半胱氨醯白三烯受體1、半胱氨醯白三烯受體2、阿片受體、蕈毒鹼受體、5-羥色胺受體、β2-腎上腺素能受體或促代謝型穀氨酸4受體。
77.如權利要求74所述的細胞，其中，所述跨膜蛋白是轉運蛋白。
78.如權利要求77所述的細胞，其中，所述轉運蛋白選自多巴胺轉運蛋白或5-羥色胺轉運蛋白。
79.如權利要求74所述的細胞，其中，所述跨膜蛋白是細胞因子受體。
80.如權利要求79所述的細胞，其中，所述細胞因子受體選自紅細胞生成素受體或胰島素受體。
81.如權利要求74所述的細胞，其中，所述跨膜蛋白是酪氨酸激酶受體。
82.如權利要求81所述的細胞，其中，所述酪氨酸激酶受體選自表皮生長因子受體或胰島素受體。
83.如權利要求74所述的細胞，其中，所述跨膜蛋白是低密度脂蛋白受體。
84.如權利要求61-83中任一項所述的細胞，該細胞轉染有多種核苷酸序列，每種所述序列編碼包含有不同跨膜蛋白的蛋白質，所述跨膜蛋白含有至少一個核定位序列。
85.如權利要求84所述的細胞，其中，每個所述核苷酸序列編碼包含有不同可檢測成分的蛋白質。
86.如權利要求84所述的細胞，其中，至少一種可檢測成分在至少兩種編碼的蛋白質中是相同的。
87.如權利要求61-86中任一項所述的細胞，該細胞是真核細胞或原核細胞。
88.如權利要求87所述的細胞，該細胞是選自下列真核細胞哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、線蟲細胞、植物細胞或真菌細胞。
89.如權利要求88所述的細胞，其中，有核細胞是選自HEK、COS或CHO細胞的哺乳動物細胞。
90.如權利要求88所述的細胞，該細胞是神經元細胞。
91.一種化合物，通過使用權利要求1-60中任一項所述的方法，將所述化合物鑑定為能夠與跨膜蛋白相互作用的化合物。
92.一種確定第一種蛋白質和第二種蛋白質能否寡聚化的方法，該方法包括用第一種核苷酸序列和第二種核苷酸序列轉染細胞，並在該細胞中表達所述編碼的第一種蛋白質和第二種蛋白質，所述第一種核苷酸序列編碼含有核定位序列的第一種蛋白質，所述第二種核苷酸序列編碼包含可檢測成分的第二種蛋白質；和確定該細胞中所述可檢測成分的分布情況；其中，如果檢測發現，相對於對照細胞，所述可檢測成分位於或鄰近於細胞核，或者細胞表面所述可檢測成分的水平降低，則表明第一種和第二種蛋白質發生相互作用。
93.如權利要求92所述的方法，其中，所述第一種蛋白質和第二種蛋白質是不同的跨膜蛋白。
94.如權利要求92所述的方法，其中，所述第一種蛋白質和第二種蛋白質是相同的跨膜蛋白。
95.如權利要求92所述的方法，其中，所述第一種蛋白質和第二種蛋白質中的一種是跨膜蛋白，而另一種是非跨膜蛋白。
96.如權利要求92-94中任一項所述的方法，其中，所述第一種蛋白質和第二種蛋白質是G蛋白偶聯受體。
97.如權利要求92-96中任一項所述的方法，其中，所述可檢測成分為可檢測的肽，該肽包含第二種蛋白質的胺基酸序列的抗原部分。
98.如權利要求92所述的方法，其中，所述第二種核苷酸序列編碼融合蛋白，該融合蛋白包含第二種蛋白質和可檢測成分。
99.如權利要求92-94中任一項所述的方法，其中，野生型的第一種蛋白質含有核定位序列。
100.如權利要求92-94中任一項所述的方法，其中，野生型第一種蛋白質不含核定位序列，並且編碼所述第一種蛋白質的第一種核苷酸序列經修改以編碼核定位序列。
101.如權利要求100所述的方法，其中，修改第一種核苷酸序列以編碼選自表1的核定位序列。
102.如權利要求100所述的方法，其中，修改第一種核苷酸序列以編碼選自KKFKR、PKKKRKV或AFSAKKFKR的胺基酸序列。
103.如權利要求92-102中任一項所述方法，其中，所述細胞是真核細胞或原核細胞。
104.如權利要求103所述的方法，其中，所述細胞選自下列真核細胞哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、線蟲細胞、植物細胞或真菌細胞。
105.如權利要求104所述的方法，其中，所述細胞是選自HEK、COS或CHO細胞的哺乳動物細胞。
106.如權利要求92所述的方法，其中，所述可檢測成分是抗原肽，且通過使其與基於抗體的檢測體系結合來確定所述抗原肽在細胞中的分布情況，所述檢測體系包含對所述抗原肽具有特異性的抗體。
107.如權利要求106所述的方法，其中，所述基於抗體的檢測體系包含對所述抗原肽具有特異性的一抗，和攜帶有可檢測標記並對一抗具有特異性的二抗。
108.如權利要求106所述的方法，其中，所述基於抗體的檢測體系包含對所述抗原肽具有特異性並攜帶有可檢測標記的一抗。
109.如權利要求108所述的方法，其中，所述基於抗體的檢測體系包含對所述抗原肽具有特異性並攜帶有可檢測標記的一抗。
110.如權利要求109所述的方法，其中，所述可檢測標記是光學上可檢測的標記。
111.如權利要求110所述的方法，其中，所述可檢測標記是發光標記或螢光標記。
112.如權利要求92所述的方法，其中，所述可檢測成分是多肽，該多肽選自綠色螢光蛋白、紅色螢光蛋白或它們的經修飾的變異體。
113.如權利要求93-112中任一項所述的方法，其中，所述第一種蛋白質和第二種蛋白質是跨膜蛋白，該跨膜蛋白選自G蛋白偶聯受體、轉運蛋白、細胞因子受體、酪氨酸激酶受體或低密度脂蛋白受體。
114.如權利要求113所述的方法，其中，至少一種跨膜蛋白是G蛋白偶聯受體，該G蛋白偶聯受體選自多巴胺D1受體、多巴胺D2受體、多巴胺D3受體、多巴胺D5受體、組胺1受體、半胱氨醯白三烯受體1、半胱氨醯白三烯受體2、阿片受體、蕈毒鹼受體、5-羥色胺受體、β2-腎上腺素能受體或促代謝型穀氨酸4受體。
115.如權利要求113所述的方法，其中，至少一種跨膜蛋白是轉運蛋白。
116.如權利要求115所述的方法，其中，至少一種跨膜蛋白是轉運蛋白，所述轉運蛋白選自多巴胺轉運蛋白或5-羥色胺轉運蛋白。
117.如權利要求113所述的方法，其中，至少一種跨膜蛋白是細胞因子受體。
118.如權利要求117所述的方法，其中，至少一種跨膜蛋白是細胞因子受體，該細胞因子受體選自紅細胞生成素受體或胰島素受體。
119.如權利要求113所述的方法，其中，至少一種跨膜蛋白是酪氨酸激酶受體。
120.如權利要求119所述的方法，其中，至少一種跨膜蛋白是酪氨酸激酶受體，該酪氨酸激酶受體選自表皮生長因子受體或胰島素受體。
121.如權利要求113所述的方法，其中，至少一種跨膜蛋白是低密度脂蛋白受體。
122.如權利要求92所述的方法，其中，所述第一種核苷酸序列編碼的第一種蛋白質還包含可檢測成分，該可檢測成分不同於第二種蛋白質中的可檢測成分，其中，在第一種蛋白質的可檢測成分和第二種蛋白的可檢測成分之間檢測到能量轉移相互作用，則表明所述第一種蛋白質和第二種蛋白質發生寡聚化作用。
全文摘要
本發明提供了一種篩選能與跨膜蛋白相互作用的化合物的方法，還提供了一種確定例如跨膜蛋白等蛋白質之間是否能夠寡聚化的方法。
文檔編號G01N33/68GK1646917SQ03808297
公開日2005年7月27日 申請日期2003年4月11日 優先權日2002年4月12日
發明者布賴恩·F·奧當德, 蘇珊·R·喬治 申請人:布賴恩·F·奧當德, 蘇珊·R·喬治