用於核磁共振診斷的血池劑的製作方法

2023-07-11 14:11:11 2

專利名稱：用於核磁共振診斷的血池劑的製作方法
本申請是1999年12月16日提交的發明名稱為「用於核磁共振診斷的血池劑」的中國發明專利申請No.99815792.9的分案申請。
本發明涉及膽酸類化合物與具有螯合活性的分子的共軛物的金屬離子絡合物在稱為「磁共振成像」(M.R.I.)的已知診斷技術中作為造影劑，特別是作為血池劑(blood pool agent)的應用。
螯合劑和適當金屬形成的絡合物業已在下列診斷技術中用作造影劑X射線成像，核磁共振成像(M.R.I.)和閃爍成像(scintigraphy)。
特別是，利用磁共振成像(M.R.I.)的醫學診斷是一種在臨床實踐中被公認為非常有效的診斷技術(Stark，D.D.，Bradley，W.G.，Jr.，編輯″磁共振成像″The C.V.Mosby Company，St.Louis，Missouri(USA)，1988)，其主要採用順磁性藥物組合物，優選含有二-三價金屬離子與聚氨基多元羧酸配體的螯合絡合物和/或其衍生物或類似物。
基本上由水質子的NMR信號獲得的成像是不同參數如質子密度和T1和T2弛豫時間之間的相互複合作用。通過給予顯著改變近水質子的共振特性的外源性化學物質可以使對比度增強。(參見Lauffer，R.B.化學評述(Chem.Rev.)1987，87，901)。
N.M.R.成像所採用的順磁造影劑起著改變存在於組織內的水質子的弛豫時間的作用，其中該造影劑被濃縮，因此它們可以提高不同組織之間或健康與病變組織之間的對比度。
因其高度通過偶極相互作用減少近水分子的質子的弛豫時間的能力，釓類順磁絡合物已經成為研究、出版物和專利的目標。
其中一些在臨床中提供用作M.R.I.造影劑Gd-DTPA，釓與二亞乙基三胺五乙酸絡合的N-甲基葡糖胺鹽，MAGNEVIST；Gd-DOTA，釓與1，4，7，10-四氮雜環十二烷1，4，7，10-四乙酸絡合的N-甲基葡糖胺鹽，DOTAREM；Gd-HPDO3A，釓與[10-(2-羥丙基)-1，4，7，10-四氮雜環十二烷-1，4，7-三乙酸的絡合物，PROHANCE；Gd-DTPA-BMA，釓與二亞乙基三胺五乙酸雙(甲基醯胺)的絡合物，OMNISCAN；上述和市售的造影劑適合一般性應用。事實上，給藥後，在被排洩之前所述M.R.I.造影劑擴散到血液內和機體的不同部分的細胞外區域中。因此在這方面，它們類似於X射線醫學診斷中所用的碘代化合物。
目前，醫療業需要以特定器官為目標或用於血液系統成像的造影劑，這樣的造影劑是現有市售產品的方式所無法充分定義的。獲得後者的第一條途徑包括把造影劑和大分子如蛋白質共價連接，或使其位於穩定分子聚集體如脂質體內成為球形，或仍然採用所謂的超順磁性微粒。
譬如，釓與二亞乙基三胺五乙酸的絡合物(Gd-DTPA)和人體白蛋白(HSA)、聚賴氨酸或葡聚糖相連(Oksendal A.N.等人，磁共振成像雜誌(J.Magn.Reson.Imaging)，157，1993；Rocklage S.M.，「造影劑、磁共振成像」，Mosby Year Book，372-437，1992)為的是減少或甚至抑制由血液擴散到細胞外液，由此令試劑在血液系統中的保留更高。雖然可以獲得所需效果，但這種途徑存在不良副作用，因為難以排洩出該試劑。
一種不同的策略是利用用聚乙二醇類化合物或烴類塗層的超順磁性微粒，從而減少被內皮網狀組織或其他系統肝臟攝取(Tilcock C.，生物化學和生物物理學學報(Biochim.Biophys.Acta)，77，1993；Bogdanoy A.A.等人，放射學(Radiology)，701，1993)，由此延長所述試劑在血液中的持久性，但也會出現上述副作用，以及因生產成本高造成的問題。
因此，目前仍然無法滿足對具有低毒性和適當經濟成本的有效血池劑的需求。
本發明涉及特別選擇的、已在國際專利申請WO-A-95/32741中公開的、由膽酸類化合物與螯合劑軛合製得的化合物作為血池劑的新用途，其能夠螯合順磁二-三價金屬，並且涉及新的化合物、其製備方法及其作為血池劑的應用。
所述化合物表現出良好的肝膽排洩作用(參見Anelli P.L.等人，放射學評述(Acta Radiologica)，38，125，1997)，這使它們有希望成為肝膽系統顯象的造影劑。
令人驚奇地發現，特定種類的所述化合物可以在血管系統中保留足夠長的時間從而成為血管系統、特別是冠狀血管成像的造影劑。
在動物(如兔子、猴子)的體內試驗中進行時這種效果非常明顯。事實上，當繪製動物血液樣本的質子弛豫值(1/T1)時可以立刻顯示出在血管系統中的持久性，血樣是在給予造影劑後適當的時間間隔採集。
由於Gd(III)絡合物是順磁性物質，血液中的高1/T1值就是高濃度的造影劑的證據。
根據Lauffer等人在放射學(Radiology)，529，1998中的文章可以很好地澄清普通細胞外造影劑和血池劑之間的區別，其中報導了血液中T1分布圖在造影劑給藥後是所逝時間的函數。
特別是，當以與合理安全指數相容的劑量對例如兔子給藥時，本發明的絡合物能夠在給藥後10分鐘改變弛豫速率(測量為Δ1/T1)使其在血液中高於5s-1，由此有希望用作血管系統成像的造影劑。
目前發現，此類效應不僅僅與膽酸類化合物的存在有關，而且取決於所述絡合物的化學結構。事實上，似乎螯合單位適宜通過膽酸類化合物的3、7或12位與甾族骨架相連。
實際中，已經證實螯合單位和包含24位羧基的膽酸之間的任何連接鍵將生成絡合物，但該絡合物在血管系統中具有無法令人滿意的保留性。

因此，本發明的目的是通式(I)的化合物與選自Fe(2+)、Fe(3+)、Cu(2+)、Cr(3+)、Gd(3+)、Eu(3+)、Dy(3+)、Yb(3+)或Mn(2+)的二-三價金屬離子的絡合物作為血池劑的應用X-L-Y(I)其中X是聚氨基聚羧酸配體或其衍生物的基團，選自組成如下的基團乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、1，4，7，10-四氮雜環十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)、1，4，7，10-四氮雜環十二烷-1，4，7-三乙酸(DO3A)、[10-(2-羥丙基)-1，4，7，10-四氮雜-環十二烷-1，4，7-三乙酸(HPDO3A)、4-羧基-5，8，11-三(羧甲基)-1-苯基-2-氧雜-5，8，11-三氮雜十三烷-13-酸(BOPTA)；Y是選自膽酸、鵝去氧膽酸、脫氧膽酸、熊去氧膽酸、石膽酸基團的膽酸衍生物， 且它們都在具有羥基的位置官能化為反應基團，並具有獨立於終產物的立體化學，所述衍生物也包括24位酸基與牛磺酸和甘氨酸的軛合物；L是與X的任何位置以及Y的C-3、C-7、C-12位相連的鏈，X選擇性地含有一個由此轉化為醯氨基的羧基，並且具有下式(II)
其中m是1-10的整數，其中對於大於1的值，A可以具有不同的含義，A具有下式(III)， n和q可以是0或1，但是它們不能同時為0，p可以介於0至10，Z是氧原子或-NR基，其中R為氫原子，或(C1-C5)烷基，其未取代或被-COOH基取代。
特別優選的化合物是其中間隔鏈L具有以下通式(IIIa)和(IIIb)的那些化合物。
還優選其中Z是氧原子的結構且由此L經3、7、12位存在的羥基形成獨立於終產物的立體化學。
特別優選式(I)的化合物，其中基團X選自EDTA、DTPA、DOTA、DO3A、BOPTA；L選自(IIIa)、(IIIb)組成的基團；
Y優選自膽酸、脫氧膽酸、鵝去氧膽酸、石膽酸的基團，其通過3位氨基與L相連，並且24位的酸基以其本身或以牛磺酸或甘氨酸衍生物存在。
Y也可以被各種不同的官能化，譬如通過轉化使一個或多個羥基成為酮基。
上述特別優選的與順磁性金屬離子的絡合物是與釓或與錳的絡合物。
優選通式(IV)的化合物，其中通式(I)中的基團X是取代在中間鏈上的DTPA，並且其中R1是氫原子或-COOH基， Y選自膽酸、脫氧膽酸、鵝去氧膽酸、石膽酸基並且L具有式(III)的結構。
特別優選通式(IVa)的化合物 其中R1是-COOH基並且Y具有上述通式(IV)定義的含義和L具有結構(IIIa)或(IIIb)。
本發明的另一個目的是下列屬於通式(IVa)類型的新化合物，及其製備方法；[3β(S)，5β]-3-[[4-[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代-丁基](羧甲基)氨基]膽烷-24-酸
[3β(S)，5β]-3-[[4-[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]膽烷-24-酸； [3β(S)，5β，7β]-3-[[4-[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-7-羥基膽烷-24-酸； [3α(S)，5β]-3-[2[-[5-[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-5-羧戊基]-氨基]-2-氧代乙氧基]膽烷-24-酸； [3β(S)，5β]-3-[[4-[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-12-氧代膽烷-24-酸；
[3β(S)，5β，7α]-3-[[4-[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-7-羥基膽烷-24-酸； N2-雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]-N-[(3β，5β，-7α，12α)-7，12-二羥基-24-氧代-24-[(2-磺乙基)氨基]膽烷-3-基]-L-穀氨醯胺； N2-雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]-N-[(3β，5β)-24-氧代-24-[(2-磺乙基)氨基]膽烷-3-基]-L-穀氨醯胺； [3β(S)，5β，12α]-3-[[4-[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-12-羥基膽烷-24-酸； [3β(R)，5β，12α]-3-[[4-[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]-乙基]氨基]-4-羧基-1-氧基丁基]氨基]-12-羥基膽烷-24-酸； [3β(RS)，5β，12α]-3-[[4-[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-12-羥基膽烷-24-酸； [3α(S)，5β，12α]-3-[[4-[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]-乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-12-羥基膽烷-24-酸； [3β(RS)，5β，7α，12α]-3-[[4-[雙[2-[雙(羧甲基)-氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-7，12-二羥基膽烷-24-酸； [3α(S)，5β，7α，12α]-3-[[[[5-[雙[2-[雙(羧甲基)-氨基]乙基]氨基]-5-羧戊基]氨基]羰基]氧基]-7，12-二羥基膽烷-24-酸； -3-[2-[[5-[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-5-羧戊基]氨基]-2-氧代乙氧基]膽烷-24-酸 其他屬於此類的、其與釓的絡合物業已公開在專利申請WO-A-95/32741中的化合物為下列化合物[3β(S)，5β，7α，12α]-3-[[4-[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-7，12-二羥基-膽烷-24-酸； [3β(S)，5β，7α，12α]-3-[[4-[[5-[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-5-羧戊基]氨基]-1，4-二氧代-丁基]氨基]-7，12-二羥基膽烷-24-酸。
另外優選通式(IVb)的化合物，其也是中間位取代的DTPA衍生物，
其中Y具有定義上式(IV)化合物的含義並且L具有結構(IIIa)。
本發明進一步涉及下列屬於通式(IVb)類的新化合物，及其製備方法(3β，5β，7α，12α)-3-[[[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]乙醯基]氨基]-7，12-二羥基膽烷-24-酸 (3β，5β)-3-[[[[[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]-氨基]乙醯基]氨基]乙醯基]氨基]膽烷-24-酸 其他屬於此類的、其與釓的絡合物業已公開在專利申請WO-A-95/32741中的化合物是下列化合物(3β，5β，7α，12α)-3-[[[[[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]乙醯基]氨基]乙醯基]氨基]-7，12-二羥基-膽烷-24-酸；
(3β，5β，7α，12α)-3-[[6-[[[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]乙醯基]氨基]-1-氧代己基]氨基]-7，12-二羥基膽烷-24-酸.
另外特別優選通式(V)的化合物，其中在通式(I)中基團X為DTPA，Y具有上式化合物(IV)所定義的含義並且L具有式(IIIa)的結構。
其他屬於此類的、其與釓的絡合物業已公開在WO-A-95/32741中的化合物為下列化合物(3β，5β，7α，12α)-3-[[N-[N-[2-[[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基](羧甲基)氨基]乙基]-N-(羧甲基)甘氨醯基]甘氨醯基]氨基]-7，12-二羥基膽烷-24-酸； 18-[[(3β，5β，7α，12α)-23-羧基-7，12-羥基-24-降膽烷-3-基]氨基]-3，6，9-三(羧甲基)-11，18-二氧代-3，6，9，12-四氮雜十八烷酸。

另外優選式(VI)的化合物，其中式(I)中基團X為DO3A，Y具有上式(IV)化合物定義的含義和L選自結構(IIIa)和(IIIb)。
在(VI)的化合物中，特別優選10-[3-[[(3α，5β，7α，12α)-23-羧基-7，12-二羥基-24-降膽烷-3-基]氧基]-2-羥丙基]-1，4，7，10-四氮雜環十二烷-1，4，7-三乙酸，其與釓的絡合物業已公開在專利申請WO-A-95/32741中。
類似地，優選通式(VII)的化合物，其中在式(I)中基團X為EDTA，Y具有上式(IV)的化合物所定義的含義和L具有式(III)的結構。
特別優選式(VII)的化合物與錳的絡合物。
在式(VII)的化合物中，特別優選下列化合物[3α(S)，5β，12α]-3-[[[[5-[[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基](羧甲基)氨基]-5-羧戊基]氨基]羰基]氧基]-12-羥基膽烷-24-酸 -3-[[4-[[5-[[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基](羧甲基)氨基]-5-羧戊基]氨基]-1，4-二氧代丁基]氨基]-7，12-二羥基膽烷-24-酸 [3α(S)，5β]-3-[2-[[5-[[2-[雙(羧甲基)氨基]-乙基](羧甲基)氨基]-5-羧戊基]氨基]-2-氧代乙氧基]膽烷-24-酸 [3β(S)，5β，12α]-3-[[4-[[2-[[雙(羧甲基)氨基]乙基](羧甲基)氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-12-羥基膽烷-24-酸 [3β(S)，5β]-3-[[4-[[2-[[雙(羧甲基)氨基]乙基](羧甲基)氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-12-氧代膽烷-24-酸 通式(I)的化合物可以用會聚合成的方法製備，其中包括1)官能化配體的合成，即能夠與一個順磁金屬離子配位並通過適當官能團的方式與膽酸穩定結合的配體的合成；
2)官能化膽酸的合成；3)兩個不同共振物(synton)之間的偶合反應；4)任何保護基的裂解；5)順磁性金屬離子的絡合；在上文引用的專利申請WO-A-95/32741中詳細舉例說明。
某些製備本發明的配體的優選方法包括在兩個共振物之間醯胺鍵的形成，其中之一是螯合體系的順磁離子的前體(共振物A)，另一個是含在最終絡合物中的膽酸基的前體。
下面所述的方法不應該被視為限定本發明化合物的合成。
醯胺鍵可以通過下列方式形成a)通過含有羧基官能的共振物A與含有伯或仲氨基官能的共振物B反應；b)通過含有伯或仲氨基官能的共振物A與含有羧基官能的共振物B反應；c)通過DTPA二酐(市售產品)與含有伯或仲氨基官能的共振物B反應。
適用於本發明的一些共振物A和B如下表所述。
表
顯然，所用共振物在那些在醯胺鍵形成的條件下用產生寄生反應的基團適當保護。在兩個共振物之間的鍵形成之後，考慮採用一個或多個脫保護步驟來恢復原始基團。
另外，對於此類方法，可以通過多步驟反應、由膽酸衍生物起始引入螯合亞基，如同在試驗部分的實施例3中所述的化合物合成情況中，舉例說明下面的合成路線1。
合成路線1 本發明還涉及新的方法，其在下面的合成路線2中具體說明合成路線2 其中
R4是氨基保護基；R5是直鏈或支鏈C1-C10烷基或芳基，R2和R3獨立地是氫，直鏈或支鏈C1-C20烷基，其未取代或被芳基取代，或這兩個基團形成C3-C10環；該方法採用醯胺基轉移反應，並且能夠保持起始吡咯烷酮的氮原子的相鄰手性中心的立體化學和提供仲醯胺。基團R4和R5的聯合選擇在多種條件下進行的裂解中是至關重要的。R4的可行實例是苄氧羰基(Cbz)基和R5的可行實施例為甲基或叔丁基。
該方法通常適用於獲得穀氨酸γ-醯胺，並且它非常有效和適宜製備本發明的化合物，特別是具有如上定義基團Y的3-氨基衍生物的穀氨酸γ-醯胺。事實上，該方法獲得最終的化合物而避免在形成穀氨酸和相應胺之間的γ-醯胺鍵時使用昂貴的縮合劑。
這種全新合成方法的應用實例是[3β(S)，5β，12α]-3-[[4-[雙[2-[雙(羧甲基)-氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-12-羥基膽烷-24-酸的合成，其常規合成在試驗部分的實施例4中描述，而另一種方法報導在實施例5中並且完整的合成路線如下面的合成路線3所示合成路線3
類似地製備業已公開在專利申請WO-A-95/32741中的膽酸類衍生物，[3β(S)，5β，7α，12α]-3-[[4-[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-7，12-二羥基-膽烷-24-酸。
適合與通式(I)的螯合劑形成絡合物鹽的金屬離子是選自Fe(2+)、Fe(3+)、Cu(2+)、Cr(3+)、Gd(3+)、Eu(3+)、Dy(3+)、Yb(3+)或Mn(2+)元素的二價或三價離子。
由於本發明的新螯合絡合物的診斷用途，它們可以在利用磁共振方式的成像診斷技術中用作造影劑，特別是血池劑。
按慣例、根據一種方法進行絡合物的製備，其中氧化物或順磁性金屬的適當鹽溶解在水中或懸浮在水-醇溶液中，將其在攪拌條件下加入到螯合劑的水溶液或水-醇溶液中，並且如果必要，適度加熱或加熱至沸點直至反應完全。如果絡合物不溶於反應溶劑，可將其過濾。如果絡合物可溶，可以通過蒸除溶劑回收殘餘物，例如通過噴霧乾燥。
在所得絡合物仍然含有游離酸基的情況中，通過與在溶液中可以生成生理相容性陽離子的有機或無機鹼反應轉化為中性鹽。
為了製備這些中性鹽，可以把足夠量的鹼加入含有游離酸基的絡合物的水溶液或混懸液中至中性。所得溶液可以按照常規方法蒸發，或加入適宜的溶劑令絡合物鹽結晶。
適宜使本發明螯合絡合物成鹽的優選無機陽離子特別包括鹼金屬或鹼土金屬離子，例如鉀、鈉、鈣、鎂及其混合物。特別優選鈉離子。
適合上述目的的、從有機鹼衍生的優選陽離子特別包括伯、仲和叔胺類化合物的那些，例如乙醇胺、二乙醇胺、嗎啉、葡糖胺、N-甲基葡糖胺、N，N-二甲基葡糖胺，特別優選N-甲基葡糖胺。
由胺基酸衍生的優選陽離子包括，例如牛磺酸、甘氨酸、賴氨酸、精氨酸或鳥氨酸的那些。
另一個這種方法包括製備可注射製劑而無需分離絡合物鹽。在這樣的情況中，終溶液必須不含有游離金屬離子，它們對機體有毒。
這可以通過滴定，例如採用顯色指示劑(如二甲苯酚橙)檢測。也可進行絡合鹽的最終純化步驟。
在此類的方法中，螯合劑、所述鹽或金屬氧化物和任何成鹽鹼在水中以化學計量比反應，反應完全後，濾除焦精並且將產物分散在適當容器內並且熱滅菌。
可注射藥物製劑一般通過把如上製得的活性成分和賦形劑溶解在水中製備，所用水具有藥理學觀點上適宜的純度，提供適合腸胃或腸胃外給藥的藥物製劑，活性成分的濃度為0.01-1.0摩爾。把所得造影劑適當滅菌。
根據診斷的要求，造影劑給藥劑量為0.01-0.3mmol/kg體重。
原則上，腸胃外給藥的劑量範圍是0.001-約1.0mmol/kg體重。腸胃外給藥的優選劑量是0.01-約0.5mmol/kg體重。
腸胃給藥的劑量範圍一般為0.5-約10mmol/kg，優選約1.0-約10mmol/kg體重。
本發明的新製劑表現出良好的耐受性；此外，其水溶性是另一個重要特徵，這使它們特別適用於核磁共振。
本發明的診斷組合物可以按照慣例應用。所述組合物可以全身性和局部地給予患者、通常為溫血動物的通過磁共振顯影的器官或組織內。
分析方案和儀器可以參見著作如Stark，D.D.，Bradley，W.G.，磁共振成像，Mosby Year Book，St.Louis，Mo，1992。
所用試驗條件將在試驗部分中詳細說明。
試驗部分實施例1和1-脫氧-1-(甲基氨基)-D-山梨醇(1∶3)成鹽的[3β(S)，5β]-3-[[4-[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]膽烷-24-酸的釓絡合物
A)[3β(S)，5β]-3-[[5-(1，1-二甲基乙氧基)-4-[雙[2-[雙[2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]氨基]-乙基]氨基]-1，5-二氧代戊基]氨基]膽烷-24-酸甲酯3.6g(3β，5β)-3-氨基膽烷-24-酸甲酯(類似於WO-A-95/32741實施例5所述方法製備)(9.24mmol)、8.5gN，N-雙[2-[雙[2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]氨基]-乙基]-L-穀氨酸叔丁酯(按照類似於WO-A-95/32741實施例15所述方法製備)(11.39mmol)和1.64g氰基膦酸二乙酯(9.39mmol)溶解在160mL的DMF中。把該溶液冷卻至0℃，將1.28mL的Et3N(9.24mmol)滴加其中，將該反應混合物在室溫下放置30分鐘。1小時後，減壓下蒸發該溶液，將殘餘物溶於EtOAc中，依次用5％NaHCO3和鹽水洗滌。分離有機相，用Na2SO4乾燥，隨後減壓下蒸發。粗品通過閃式色譜純化得到9.5g的預期產物(8.50mmol)。
收率92％K.F.3.47％元素分析 C H N％計算值66.639.745.01％實測值a67.4210.08 5.07a在120℃真空下乾燥後TLC固定相矽膠板60F 254 Merck洗脫劑＝4∶6 EtOAc/正己烷檢測0.5％KMnO4在1M NaOH中，Rf＝0.461H-NMR、13C-NMR、IR和MS譜與所示結構吻合。
B)[3β(S)，5β]-3-[[4-羧基-4-[雙[2-[雙(羧乙基)氨基]乙基]氨基]-1-氧代丁基]氨基]膽烷-24-酸甲酯向9.3g步驟A)製得的化合物(8.32mmol)在50mLCH2Cl2中的攪拌溶液內加入5.1mL的CF3COOH(66.6mmol)；0-5℃的溫度下10分鐘後，蒸發該溶液。將殘餘物溶於50mL的CF3COOH中，室溫下24小時後，進-步加入30mL的CF3COOH使反應完全。5小時後，蒸發該反應混合物並且用CH2Cl2處理殘餘物，每次在減壓下蒸發溶劑直至得到粉末。用H2O洗滌該固體，過濾，乾燥，得到預期產物(6.9g；8.24mmol)。
收率99％ m.p.205℃K.F.7.78％元素分析 C HN％計算值 60.27 8.18 6.69％實測值a59.28 8.11 6.68a在120℃真空下乾燥後TLC固定相矽膠板60F 254 Merck洗脫劑＝6∶4∶1 CHCl3/MeOH/25％ NH4OH.
檢測0.5％KMnO4在1MNaOH中Rf＝0.281H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
C)[3β(S)，5β]-3-[[4-[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]膽烷-24-酸向6.14g步驟B)製備的化合物(7.33mmol)在50mL H2O中的混懸液中加入50mL的1M NaOH(50mmol)，利用pH-靜電儀的裝置保持pH13。室溫下2小時後，用12M HCl酸化反應混合物(pH0.5)得到混懸液，將其過濾，用H2O洗滌並且乾燥，得到預期產物(5.64g；6.85mmol)。
收率93％ m.p.205℃K.F.9.02％元素分析CH NCl，Na％計算值 59.84 8.08 6.81％實測值a59.56 8.15 6.80＜0.1a在120℃真空下乾燥後TLC固定相矽膠板60F 254Merck洗脫劑6∶4∶1 CHCl3/MeOH/25％ NH4OH檢測0.5％ KMnO4在1M NaOH中，Rf＝0.25
1H-NMR、12C-NMR、IR和MS波譜與所示結構吻合。
D)與1-脫氧-(甲基氨基)-D-山梨醇(1∶3)成鹽的[3β(S)，5β]-3-[[4-[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]膽烷-24-酸的釓絡合物將4.53g步驟C)製備的化合物(5.5mmol)懸浮在50mL H2O中並且用10mL 2M葡甲胺水溶液(20mmol)溶解得到pH6.8的溶於。此後，在1小時內加入11mL的0.5M GdCl3水溶液(5.5mmol)，通過加入6.5mL的2M葡甲胺水溶液(13mmol)保持pH 6.8。利用毛細管電泳監測該反應的進程。2小時後，經微孔膜過濾該溶液，納米過濾和蒸發。乾燥殘餘物得到預期化合物(6.15g；4.17mmol)。
收率76％ m.p.220℃K.F.8.44％CE試驗100％(面積％)毛細管熔融二氧化矽0.56m×50mm，帶有球形池電壓25kV緩衝液0.05M硼酸鹽pH9.3，0.3mM EDTA溫度40℃停止時間20分鐘檢測(UV)200-210nm注射流體靜力(50mbar，5s)樣品濃度1mg mL-1；儀器Hewlett PacKard 3D HPCE預處理t(分鐘) 處理2用H2O衝洗2用0.1M NaOH衝洗1用H2O衝洗5用緩衝液衝洗9開始分析元素分析 C H Gd N Cl，Na％計算值47.65 7.3510.066.27％實測值a47.83 7.3610.016.24＜0.1a在120℃真空下乾燥後IR和MS光譜與所示結構吻合。
類似地製備下列化合物和有關釓絡合物與1-脫氧-1-(甲基氨基)-D-山梨醇(1∶3)成鹽的[3β(S)，5β，7β]-3-[[4-[雙[2[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-7-羥基膽烷-24-酸的釓絡合物；與1-脫氧-1-(甲基氨基)-D-山梨醇(1∶3)成鹽的[3α(S)，5β]-3-[2[-[5-[雙[2[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-5-羧戊基]-氨基]-2-氧代乙氧基]膽烷-24-酸的釓絡合物；實施例2與1-脫氧-1-(甲基氨基)-D-山梨醇(1∶3)成鹽的[3β(S)，5β]-3-[[4-[雙[2[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-12-氧代膽烷-24-酸的釓絡合物 A)(3β，5β)-3-疊氮基-12-氧代膽烷-24-酸甲酯室溫下90分鐘內，將12.5mL的瓊斯試劑[33.3mmol Cr(VI)]滴加到17.8g(3β，5β，12α)-3-疊氮基-12-羥基膽烷-24-酸甲酯(41.1mmol)(按照類似於WO-A-95/32741實施例5中所述(3β，5β，7α，12α)-3-疊氮基-7，12-二羥基膽烷-24-酸甲酯的方法製備)的丙酮(600mL)溶液中。20分鐘後，過濾該混合物並且蒸發該溶液。將殘餘物溶於CHCl3(400mL)，該溶液依次用飽和NaHCO3水溶液、H2O洗滌。將溶液乾燥和蒸發，得到粗品，由96％EtOH結晶得到14.1g的預期產物(32.9mmol)。
收率84％ m.p.153℃K.F.＜0.1％[α]20D＝+83.25(c2.1，CHCl3)元素分析 C H N％計算值69.909.15 9.78％實測值69.989.32 9.69TLC固定相矽膠板60F 254 Merck洗脫劑8∶2正己烷/EtOAc檢測0.5％ KMnO4in 1M NaOH Rf＝0.431H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
B)(3β，5β)-3-氨基-12-氧代膽烷-24-酸甲酯室溫和40巴(bar)下，於Parr加壓釜中令16.4g的化合物A)(38.2mmol)的THF(130mL)溶液在5％Pd/C(1.6g)存在下氫化。過濾該反應混合物(濾紙和FH0.5pm微孔膜Milliporemenbrane)和蒸發。粗產物通過閃式色譜純化，得到11.8g的預期產物(29.2mmol)。
收率77％ m.p.129-130℃K.F.1.04％[α]20D＝+87.8(c2.02，CHCl3)元素分析 C H N％計算值74.4010.243.47％實測值72.7210.003.35TLC固定相矽膠板 60F 254 Merck洗脫劑95∶5 MeOH/Et3N檢測0.5％KMnO4在1M NaOH中，Rf＝0.311H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
C)[3β(S)，5β]-3-[[4-[雙[2-[雙[2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]氨基]乙基]氨基]-5-(1，1-二甲基乙氧基)-1，5-二氧代戊基]氨基]-12-氧代膽烷-24-酸甲酯
0℃和氮氣下，將DCC(6.24g；30.3mmol)的CH2Cl2(25mL)溶液在30分鐘內滴加到N，N-雙[2[雙[2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]氨基]乙基]-L-穀氨酸1-(1，1-二甲基乙基)酯(按照WO-A-95/32741實施例15所述方法製備)(21.5g；28.9mmol)、化合物B)(11.1g；27.5mmol)和HOBT(1-羥基苯並三唑)(3.72g；27.5mmol)的CH2Cl2(300mL)溶液中。令該混合物升至室溫。21小時後，過濾該反應混合物，溶液用NaHCO3飽和水溶液、隨後用H2O洗滌，進而蒸發。粗產物通過閃式色譜純化得到24.5g預期產物(21.7mmol)。收率79％[α]20D＝+12.17(c2.07，CHCl3)TLC固定相矽膠板60F 254Merck洗脫劑1∶1 EtOAc/正己烷檢測0.5％KMnO4在1M NaOH中，Rf＝0.451H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
D)[3β(S)，5β]-3-[[4-[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-12-氧代膽烷-24-酸0℃下，在1小時內將80mL TFA(1.0mol)滴加到23.8g步驟C)製得的產物(21.0mmol)的CH2Cl2(50mL)溶液中。室溫下攪拌該反應混合物，2小時後，蒸發。將殘餘物溶於TFA(100mL；1.3mol)中，將該溶液進一步攪拌24小時。隨後蒸發該反應混合物，溶於CH2Cl2並且再次蒸發。將粗產物溶於150mL的1M NaOH，用冰浴冷卻，溶液在室溫下攪拌15小時(pH10)。用3.30mL的30％NaOH調節該反應混合物至pH 13，4小時後，經微孔膜(HAS 0.45μm)過濾。濾液用12.5mL的30％HCl和19mL 1MHCl酸化至pH1.60。過濾沉澱，用H2O洗滌並且乾燥，得到15.8g預期產物(18.9mmol)。
收率90％ m.p.172-175℃K.F.1.98％[α]20D＝+43.54(c2.02，1M NaOH)HPLC97％(面積％)
固定相Zorbax ECLIPSE XDB-C83.5m；150×4.6mm.；溫度40℃；流動相梯度洗脫；A＝H2O中0.017M H3PO4，0.3mM EDTA；B＝CH3CN梯度 分鐘 ％A ％B0 8515406535506535流速1.5mL分鐘-1；檢測(UV)210nm；元素分析 C H N ClNa％計算值 58.847.716.69％實測值 56.577.686.370.250.18TLC固定相矽膠板60F 254 Merck洗脫劑5∶4∶2 CHCl3/MeOH/25％NH4OH檢測0.5％KMnO4在1M NaOH中，Rf＝0.281H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
E)與1-脫氧-1-(甲基氨基)-D-山梨醇(1∶3)成鹽的[3β(S)，5β]-3-[[4-[雙[2[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-12-氧代膽烷-24-酸的釓絡合物室溫下，把49.0mL的0.918M葡甲胺水溶液(45.0mmol)滴加到14.0g步驟D)製備的化合物(16.7mmol)的H2O(100mL)溶液中，得到澄清溶液(pH6.5)。將31.6mL的0.503M GdCl3水溶液(15.9mmol)滴加在其中，通過加入55.7mL的0.918M葡甲胺水溶液(51.1mmol)、利用pH-靜電裝置保持pH6.5。加料結束時，混合物經微孔膜(HAWP 0.45/m)過濾，納米過濾，用0.100mL的0.918M葡甲胺水溶液(0.092mmol)調至pH7.0和蒸發。乾燥殘餘物得到22.0g預期產物(14.0mmol)。
收率84％ m.p.100-105℃
K.F.5.06％HPLC分析97％(面積％)固定相HYPURITYTMElite C18 5μm；250×4.6mm柱Hypersil；溫度40℃；流動相梯度洗脫；A＝0.01M KH2PO4在水中；B＝CH3CN梯度分鐘 ％A ％B0 955406535506535流速1mL分鐘-1；檢測(UV)210nm；元素分析 C H N GdNa，Cl％計算值47.237.166.229.97％實測值45.707.326.009.41＜0.1IR和MS光譜與所示結構吻合。
實施例3與1-脫氧-1-(甲基氨基)-D-山梨醇(1∶2)成鹽的(3β，5β，7α，12α)-3-[[[雙[2[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]乙醯基]氨基]-7，12-二羥基膽烷-24-酸的釓絡合物 A)(3β，5β，7α，12α)-3-[[[雙[2-[雙[2-(1，1-二甲基-乙氧基)-2-氧代乙基]氨基]乙基]氨基]乙醯基]氨基]-7，12-二羥基膽烷-24-酸甲酯將24.8g(3β，5β，7α，12α)-3-[(氨基乙醯基)氨基]-7，12-二羥基膽烷-24-酸甲酯(按照WO-A-95/32741實施例5所述方法製備)(51.9mmol)懸浮在38.7g N-(2-溴乙基)-N-[2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]甘氨酸1，1-二甲基乙基酯(按照WO-A-95/32741實施例15所述方法製備)(110mmol)在390mL CH3CN中的攪拌溶液內。加入245mL的2M磷酸鹽緩衝液pH8得到二相溶液，將其在室溫下劇烈攪拌144小時。分離有機相，蒸發，殘餘油溶於250mL的CH2Cl2。溶液用H2O洗滌，乾燥(Na2SO4)並且蒸發。粗產物通過閃式色譜純化(洗脫劑-95∶5 CHCl3/CH3OH)得到預期產物(24.8g；24.3mmol)。
收率47％[α]20D＝+9.45(c1.5，CHCl3)元素分析 C H N％計算值64.68 9.475.49％實測值64.55 9.445.46TLC固定相矽膠板60F 254 Merck洗脫劑88∶12 CHCl3/MeOH檢測0.5％KMnO4在1M NaOH中，Rf＝0.571H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜和所示結構吻合。
B)(3β，5β，7α，12α)-3-[[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]乙醯基]氨基]-7，12-二羥基膽烷-24-酸在15分鐘內，將318mL的2M LiOH水溶液(636mmol)滴加到步驟A)製得化合物(21.6g；21.1mmol)在310mL EtOH中的溶液內。23小時後，蒸發EtOH，反應混合物進一步攪拌2小時。把溶液滴加到255mL的2.6M HCl中，並且用30％NaOH調至pH1.4。1.5小時後，過濾沉澱，用300mL的0.1M HCl洗滌和乾燥，得到預期產物(13.1g；16.7mmol).
收率78％ m.p.129-132℃分解
HPLC分析97.8％(面積％)固定相Lichrosorb RP-Select B 5m；250×4mm柱Merck KGaA；溫度45℃；流動相梯度洗脫；A＝0.01M KH2PO4和0.017M H3PO4在H2O中B＝CH3CN分鐘％A ％B0 9555 208045 2080流速1mL分鐘-1；檢測(UV)210nm；配位滴定度95.5％(0.1M GdCl3)[α]20D＝+13.03(c5，1M NaOH)元素分析 C H N Cl％計算值58.307.987.16％實測值54.638.126.641.82H2O 4.89C)與1-脫氧-1-(甲基氨基)山梨醇(1∶2)成鹽的(3β，5β，7α，12α)-3-[[[雙[2[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]乙醯基]氨基]-7，12-二羥基膽烷-24-酸的釓絡合物將11.3g步驟B)製得的化合物(13.8mmol)懸浮在40mL H2O中並且利用44.7mL的1M葡甲胺水溶液(44.7mmol)至pH6使該化合物溶解。在1小時內把13.7mL的1M GdCl3水溶液(13.7mmol)滴加到該混合物中，同時加入73.5mL 1M葡甲胺水溶液(73.5mmol)保持pH6.5。反應混合物納米過濾且用0.3mL的0.1M葡甲胺調節pH至6.8。蒸發和乾燥後，得到預期產物(17.2g；12.9mmol).
收率93％ m.p.245-249℃C分解.
游離配體＜0.1％(0.001M GdCl3)HPLC分析100％(面積％)
固定相Lichrospher 100 RP-85μm；250×4mm柱Merck KGaA；溫度40℃；流動相用預混相等度洗脫1g的n-辛胺和0.3mmol Na2EDTA加入260mL CH3CN和740mL H2O中。該溶液用H3PO4緩衝至pH7。
流速1mL分鐘-1檢測(UV)210nm；元素分析 C H Gd N％計算值47.057.0611.846.33％實測值45.197.2111.226.07H2O 4.16IR和MS光譜與所示結構吻合。
實施例4與1-脫氧-1-(甲基氨基)-D-山梨醇(1∶3)成鹽的[3β(S)，5β，12α]-3-[[4-[雙[2[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-12-羥基膽烷-24-酸的釓絡合物 A)[3β(S)，5β，12α]-3-[[4-[雙[2-[雙[2-(1，1-二甲基-乙氧基)-2-氧代乙基]氨基]乙基]氨基]-5-(1，1-二甲基乙氧基)-1，5-二氧代戊基]氨基]-12-羥基膽烷-24-酸甲酯0℃下，將三乙胺(2.23g；22mmol)加入8.93g(3β，5β，12α)-3-氨基-12-羥基膽烷-24-酸甲酯(按照WO-A-95/32741實施例5所述膽酸衍生物的方法製備)(22mmol)、16.41g N，N雙[2-[雙[2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]氨基]-乙基]-L-穀氨酸1-(1，1-二甲基乙基)甲酯(按照WO-A-95/32741實施例15所述方法製備)(22mmol)和3.91g羥基膦酸二乙酯(24mmol)在300mL DMF中的溶液內。0℃1.5小時和室溫18小時後，反應混合物蒸發且將殘餘物溶解在EtOAc。溶液用NaHCO3飽和水溶液和H2O洗滌，乾燥(Na2SO4)和蒸發。粗產物通過閃式色譜純化得到預期產物(20.67g；18.2mmol)。
收率83％[α]20D＝-6.75(c2.0，CHCl3)元素分析 C H N％計算值65.699.604.94％實測值66.549.954.99TLC固定相矽膠板60F 254Merck洗脫劑1∶1 正己烷/EtOAc Rf＝0.09檢測Ce(SO4)2·4H2O(0.18％)和(NH4)6Mo7O24·4H2O(3.83％)在10％H2SO4中1H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
B)[3β(S)，5β，12α]-3-[[4-[雙[2-[雙(羧甲基)-氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-12-羥基膽烷-24-酸室溫下，將步驟A)製備的化合物(19.72g；17.4mmol)溶解在105mL CF3CO2H中。26小時後，蒸發該溶液，殘餘物用H2O處理；過濾固體，用H2O洗滌且真空下部分乾燥。所得中間體懸浮在H2O中並利用1M NaOH達到pH 13使中間體溶解。室溫下5小時後，將0.5M HCl滴加在溶液中至pH 1.4。室溫下15小時後過濾沉澱，用H2O洗滌和乾燥，得到的粗產物通過色譜法、利用樹脂Amberlitee XAD 1600色譜純化，得到預期產物(9.92g；11.8mmol)。
收率68％ m.p.184℃(分解)配位滴定度(0.1M GdCl3)99.3％酸性滴定度(0.1N NaOH)99.8％[α]20λ(c2.0；1M NaOH)λ(nm)589578546436405365+23.61+24.59+27.90+46.67+55.61+71.40元素分析 C H N％計算值 58.707.936.68％實測值 58.228.166.59H2O 0.70％TLC固定相矽膠板60F 254 Merck洗脫劑5∶4∶2 CHCl3/MeOH/25％NH4OH Rf＝0.13檢測Ce(SO4)2·4H2O(0.18％)和(NH4)6Mo7O24·4H2O(3.83％)在10％H2SO4中1H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
C)用1-脫氧-1-(甲基氨基)-D-山梨糖醇(1∶3)成鹽的[3β(S)，5β，12α]-3-[[4-[雙[2[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-12-羥基膽烷-24-酸的釓絡合物步驟B)製備的化合物(8.39g；10mmol)懸浮在H2O(30mL)中並且通過加入1M葡甲胺水溶液(36.5mL；36.5mmol)至pH6使化合物溶解。在1小時內加入1.025M GdCl3水溶液(9.85mL；10.1mmol)，同時加入1M葡甲胺水溶液(19.3mL；19.3mmol)使pH保持6。該溶液納米級過濾，用1M葡甲胺水溶液調至pH7.0。蒸發和乾燥後得到預期產物(8.57g；5.4mmol)。
收率54％ m.p.150-166℃(170℃分解.)元素分析 C H N Gd％計算值47.177.286.219.96％實測值43.407.315.689.31H2O 7.14％IR和MS光譜與所示結構吻合。
D)類似於步驟C)製備的化合物，製備與鈉(1∶3)成鹽的[3β(S)，5β，12α]-3-[[4-[雙[2[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基-12-羥基膽烷-24-酸的釓絡合物步驟B)製備的化合物(16.92g；32.08mmol)懸浮在H2O(100mL)中並且通過加入2M NaOH(56mL；112mmo l)至pH 6使其溶解。在3小時內加入0.512M GdCl3水溶液(58.2mL；29.77mmol)，同時加入2MNaOH(28.95mL；57.9mmol)使pH保持在6。該溶液的pH用2M NaOH(4mL；8mmol)調至6.7並且將該溶液納米級過濾。冷凍乾燥後，得到預期產物(29.86g；28.2mmol)。
收率88％m.p.＞300℃元素分析 C H N GdNa％計算值46.495.715.2914.856.51％實測值43.986.344.9213.866.16H2O 4.63％IR和MS光譜與所示結構吻合。
實施例5按照合成路線3製備[3β(S)，5β，12α]-3-[[4-[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-12-羥基膽烷-24-酸的另一種方法A)(S)-5-氧代-1，2-吡咯烷二甲酸2-甲基1-(苯基甲基)二酯7.1g CH3I(50mmol)加入6.58g(S)-5-氧代-1，2-吡咯烷二甲酸1-(苯基甲基)酯(25mmol)和N，N-二異丙基乙胺(3.55g；27.5mmol)在CH2Cl2(33mL)中的溶液內，和反應混合物回流6.5小時。冷卻至室溫並用CH2Cl2(50mL)稀釋後，反應混合物用H2O、2％Na2CO3水溶液、0.2MHCl和H2O洗滌。Na2SO4乾燥和蒸發，得到預期產物(6.8g；24.5mmol)。
收率98％HPLC分析98.5％(面積％)固定相Lichrosorb RP-Select B 5μm；250×4mm柱Merck KGaA；溫度45℃；流動相梯度洗脫；A＝水中0.017M H3PO4B＝CH3CN梯度分鐘 ％A％B0 80 201580 203540 60流速1mL分鐘-1；
檢測(UV)210nm.20λ(c2；CHCl3)λ(nm) 589 578 546 365[α] -42.97 -44.79 -50.09 -100.43元素分析 C H N％計算值60.645.455.05％實測值60.945.545.001H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
B)[3β(S)，5β，12α]-3-[[5-甲氧基-1，5-二氧代-4-[[(苯基-甲氧基)羰基]氨基]戊基]氨基]-12-羥基膽烷-24-酸甲酯8.92g(3β，5β，12α)-3-氨基-12-羥基膽烷-24-酸甲酯(按照類似於WO-A-95/32741實施例5所述膽酸衍生物的方法製備)(22mmol)加入化合物A)(6.1g；22mmol)的二烷(55mL)溶液中，所得混合物在50℃下加熱24小時，隨後在105℃下29小時。減壓下蒸發溶劑，殘餘物通過閃式色譜(用EtOAc/正己烷梯度洗脫)純化，隨後用1∶1 EtOAc/正己烷混合物結晶，得到預期產物(11.2g；16.4mmol)。
收率75％ m.p.140℃HPLC分析99.2％(面積％)固定相Lichrosorb RP-Select B 5um；250×4mm柱Merck KGaA；溫度45℃；流動相梯度洗脫；A＝0.017M H3PO4水溶液B＝CH3CN梯度分鐘％A％B0 65 3525 15 8530 15 85流速1mL分鐘-1；檢測(UV)210nm.20λ(c2.01；CHCl3)λ(nm)589 578 546 365[α]+24.14+25.13+28.51+73.81元素分析 C H N％計算值68.708.434.11％實測值69.368.724.13TLC固定相矽膠板60F 254 Merck洗脫劑EtOAc檢測Ce(SO4)2·4H2O(0.2％)和(NH4)6Mo7O24·4H2O(3.8％)，存在於10％H2SO4Rf＝0.111H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
C)[3β(S)，5β，12α]-3-[[4-[雙[2-[雙[2-(1，1-二甲基-乙氧基)-2-氧代乙基]氨基]乙基]氨基]-5-乙氧基-1，5-二氧代戊基]氨基]-12-羥基膽烷-24-酸甲酯將1g 5％Pd/C加到化合物B)(10.4g；15.3mmol)的MeOH(100mL)溶液中；室溫下，於氫氣氛下將該混懸液攪拌3.5小時(吸收H2348mL；15.5mmol)。經微孔FH濾膜(0.45μm)過濾後，減壓下蒸發該溶液得到殘餘物，將殘餘物溶解在CH3CN(60mL)中。加入2M pH8的磷酸鹽緩衝水溶液(60mL)，隨後室溫下在10分鐘內滴加N-(2-溴乙基)-N-[2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代-乙基]甘氨酸1，1-二甲基乙酯(按照WO-A-95/32741實施例15所述方法製備)(11.86g；33.7mmol)的CH3CN(15mL)溶液。將該混合物攪拌39小時。分離後，減壓下蒸發有機相，把殘餘物溶於AcOEt(200mL)。該溶液用H2O洗滌，乾燥(Na2SO4)和蒸發。粗產物通過閃式色譜(用EtOAc/正己烷梯度洗脫)純化得到預期產物(11.36g；10.4mmol)。
收率68％ m.p.55-58℃HPLC分析100％(面積％)[α]20λ(c2.01；CHCl3)λ(nm)589578546365-6.97-7.41-8.61-32.89元素分析 C H N％計算值64.939.425.13％實測值65.069.365.11TLC固定相矽膠板60F 254 Merck洗脫劑EtOAc檢測Ce(SO4)2·4H2O(0.2％)和(NH4)6Mo7O24·4H2O(3.8％)，在10％H2SO4中，Rf＝0.451H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
D)[3β(S)，5β，12α]-3-[4-[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-12-羥基-膽烷-24-酸化合物C)(8.5g；7.8mmol)的二烷(50mL)溶液加入2M LiOH水溶液(117mL；234mmol)。室溫下將所得混合物攪拌72小時，隨後通過緩慢加入37％HCl酸化至pH6。減壓下通過蒸發使溶液濃縮為50g，用H2O(40mL)稀釋。通過加入37％HCl酸化至pH2.5，加熱至50-55℃，並且在有力攪拌下用2N HCl緩慢酸化至pH1.3。5分鐘後，令該多相混合物緩慢冷卻至室溫，攪拌15小時。過濾沉澱，用H2O洗滌和乾燥，得到預期產物(5.92g；7mmol)。
收率90％ m.p.180-198℃HPLC分析99.9％(面積％)固定相Zorbax ECLIPSE XDB-C8 3.5μm；150×4.6mm柱RocklandTechnologies，Inc.；溫度40℃；流動相梯度洗脫；A＝0.017M H3PO4，0.3mM EDTA，在水中；B＝CH3CN梯度分鐘％A％B0 85 1540 65 35
506535流速1.5mL分鐘-1；檢測(UV)210nm；酸性滴定度(0.1N NaOH)99％[α]20λ(c2.04；1N NaOH)λ(nm)589 578 546 436 405 365[α] +24.80+25.83+29.22+49.02+58.43+75.59元素分析 C H N Cl，Li％計算值58,70 7,93 6,68％實測值57,90 7,97 6,57＜0.1H2O 0.951H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
實施例6與1-脫氧-1-(甲基氨基)-D-山梨醇(1∶2)成鹽的(3β，5β，7α，12α)-3-[[[[[雙[2[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]乙醯基]氨基]乙醯基]氨基]-7，12-二羥基膽烷-24-酸的釓絡合物 A)N-[[雙[2-[雙[2-(1，1-二甲基乙氧基-2-氧代乙基]-氨基]乙基]氨基]乙醯基]甘氨酸6.5g甘氨醯基甘氨酸(49.3mmol)懸浮在100mL的1∶1H2O/EtOH混合物並且在pH10下用10M NaOH(4.8mL)溶解。將存在於40mL EtOH中的N-(2-溴乙基)-N[2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]甘氨酸1，1-二甲基乙酯(42g；110.9mmol)在2小時內滴加其中，用10MNaOH(5.8ml)保持pH10.5。溶液迅速轉化為乳液，2.5小時後通過加入10M NaOH溶解。22小時後，蒸發溶解，混合物用水稀釋和用CH2Cl2提取。有機相用H2O洗滌，乾燥和蒸發。得到殘餘物，利用閃式色譜純化殘餘物。將殘餘物溶解在水中，加入1M HCl調節pH4.5，用氯仿提取該溶液。有機相用H2O洗滌，乾燥和蒸發，得到13g預期產物(19.3mmol)。
收率39％元素分析 C H N％計算值56.958.668.30％實測值56.678.688.30TLC固定相矽膠板60F 254 Merck洗脫劑6∶3∶1 CHCl3/MeOH/25％ NH4OHRf＝0.65檢測1％KMnO4在1M NaOH中1H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
B)(3β，5β，7α，12α)-3-[[[[[雙[2-[雙[2-(1，1-二甲基-乙氧基)-2-氧代乙基]氨基]乙基]氨基]乙醯基]氨基]-乙醯基]氨基]-7，12-二羥基膽烷-24-酸甲酯0℃，攪拌下，在5分鐘內將2.8mL TEA(20.2mmol)加入含有13.6g步驟A)製備的化合物(20.2mmol)、8.52g(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸甲酯(20.2mmol)和DEPC(3.4mL；22.2mmol)的DMF(290mL)溶液中。1小時後，令反應升至室溫，將該溶液攪拌6.5小時，加入0.3mL DEPC(2mmol)，將該溶液進一步攪拌15.5小時。蒸發DMF，將殘餘物溶解在EtOAc中，用NaHCO3水溶液、隨後用水洗滌，最後乾燥。通過閃式色譜純化後，得到13.7g預期產物(12.7mmol)。
收率63％[α]20D＝+5.26(c1.5；CHCl3)元素分析 C H N％計算值63.489.25 6.49
％實測值63.229.406.401H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
C)(3β，5β，7α，12α)-3-[[[[[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]乙醯基]氨基]乙醯基]氨基]-7，12二羥基膽烷-24-酸-5/0℃，攪拌下將12.85g步驟B)製備的化合物(12mmol)溶解在TFA(210mL)中。16小時後，蒸發TFA得到殘餘物，將殘餘物溶解在90mL的0.8M NaOH中至pH13，室溫下攪拌15小時。將溶液濃縮為50mL，滴加到105mL的0.6M HCl中並且攪拌2小時。過濾該固體，用0.1M HCl洗滌和乾燥，得到粗產物，將該粗產物通過色譜法純化。蒸發含有成鹽形式的預期化合物的餾份，得到殘餘物，將該殘餘物溶解在水中，滴加到1M HCl中，保持pH1.45。過濾沉澱，用0.1M HCl洗滌和乾燥，得到2.6g預期產物(3.1mmol)。
收率26％ m.p.120-125℃HPLC分析98％(面積％)1H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
D)與1-脫氧-1-(甲基氨基)-D-山梨醇(1∶2)成鹽的(3β，5β，7α，12α)-3-[[[[[雙[2[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]乙醯基]氨基]乙醯基]氨基]-7，12-二羥基膽烷-24-酸2.59g步驟C)製備的化合物(3.08mmol)懸浮在水(20mL)中並且通過加入1M葡甲胺水溶液(3.08mL；3.08mmol)至pH5使化合物溶解。將Gd2O3(0.501g；2.77mmol)加入加熱至50℃的混合物中。1小時後，加入1M葡甲胺(2.8mL；2.8mmol)溶解沉澱。24小時後過濾該反應混合物並且用1M葡甲胺水溶液(0.4mL)調節pH至6.8。蒸發後和乾燥，得到4.2g(3.00mmol)預期產物。
收率99％ m.p.209-213℃ 分解HPLC分析99.7％(面積％)游離配體＜0.1％(0.001 GdCl3)元素分析 C H N Gd％計算值46.846.99 7.0811.36
％實測值44.017.356.6810.39H2O 4.95IR和MS光譜與所示結構吻合。
實施例7與1-脫氧-1-(甲基氨基)-D-山梨醇(1∶4)成鹽(1∶4)的[3β(S)，5β]-3-[[4-[雙[2-[雙-(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基](羧甲基)氨基]膽烷-24-酸的釓絡合物 A)(3β，5β)-3-[[2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]氨基]-膽烷-24-酸甲酯室溫和氮氣下，將40.0g(3β，5β)-3-氨基膽烷-24-酸甲酯(按照上述實施例1)(103mmol)懸浮在DMF(1.0L)。加入三乙胺(13.0g；129mmol)，隨後在1小時內把溴乙酸1，1-二甲基乙酯(24.0g；123mmol)的DMF(30mL)溶液加入反應混合物中直至溶解。3天後，濃縮該混合物並且用4％NaHCO3水溶液稀釋。過濾所得混懸液，沉澱用H2O洗滌和乾燥，得到33.7g預期產物(66.9mmol)。
收率65％ m.p.62-64℃[α]20D＝+23.55(c1.96，MeOH)元素分析 C H N％計算值73.9110.602.78％實測值74.6710.852.78H2O＜0.1TLC固定相矽膠板60F 254 Merck洗脫劑7∶3 正己烷/EtOAc Rf＝0.311H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
B)[3β(S)，5β]-3-[[4-[雙[-2-[雙[2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]氨基]乙基]氨基]-5-(1，1-二甲基乙氧基)-1，5-二氧代戊基][2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代-乙基]氨基]膽烷-24-酸甲酯室溫攪拌下，氮氣下，將二異丙基乙胺(19.5g；151mmol)在20分鐘內滴加到化合物A)(33.0g；65.5mmol)、N，N-雙[2-[雙[2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]氨基]乙基]-L-穀氨酸1-(1，1-二甲基-乙基)酯(按照WO-A-95/32741實施例15所述製備)(53.8g；72.1mmol)和(苯並三唑-1-基氧基)三(二甲烷基氨基)六氟磷酸鹽(BOP)(40.6g；91.8mmol)的DMF(400mL)溶液中。2天後，濃縮該反應混合物並且溶於EtOAc。用H2O洗滌溶液，乾燥(Na2SO4)和蒸發。利用閃式色譜純化粗產物兩次，得到38.7g預期產物(31.4mmol)。
收率48％.20D＝-54.50(c2.51，CHCl3)TLC固定相矽膠板60F 254 Merck洗脫劑7∶3正己烷/EtOAc Rf＝0.221H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
C)[3β(S)，5β]-3-[[4-[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基](羧甲基)氨基]膽烷-24-酸室溫攪拌下，在1小時內向化合物B)(38.7g；31.4mmol)的EtOH(350mL)溶液內滴加500mL 2M LiOH溶液。16小時後，反應混合物濃縮至500mL，再次加入2M LiOH溶液(350mL)，加熱至50℃。24小時，反應混合物冷卻至室溫，5℃劇烈攪拌下滴入320mL 6M HCl。用55mL的2M NaOH調節所得混懸液的pH至1.0。過濾固體，用0.1M HClO洗滌和乾燥。將粗產物懸浮在H2O中，通過加入1M NaOH溶解，隨後將鹼性溶液滴加到0.5M HCl溶液。過濾沉澱，用0.05M HCl、H2O洗滌並且乾燥，得23.5g預期產物(26.7mmol).
收率85％ m.p.178-182℃[α]40520＝+24.10(c1.49，1M NaOH)HPLC分析100％(面積％)固定相Hypurity Elite C-185μm；柱250×4.6mm；
溫度40℃；流動相梯度洗脫；A＝0.01M KH2PO4，0.3mM EDTA，在水中B＝CH3CN梯度分鐘％A ％B0 95 540 65 3550 65 35流速1mL分鐘-1；檢測(W)210nm.
元素分析 C H N NaCl％計算值58.627.786.36％實測值57.718.076.20 0.130.55H2O＜0.11H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
D)與1-脫氧-1-(甲基氨基)-D-山梨醇(1∶4)成鹽的[3β(S)，5β]-3-[[4-[雙[2[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基](羧甲基)氨基]膽烷-24-酸的釓絡合物室溫下向步驟C)製得的化合物(12.9g；14.6mmol)在H2O(100mL)中的懸浮液內加入1M葡甲胺水溶液(72.0mL；72.0mmol)得到pH6.2的澄清溶液。滴加0.393M GdCl3水溶液(37.2mL；14.6mmol)，通過加入1M葡甲胺(30.0mL；30.0mmol)利用pH-靜電的裝置保持pH6.2。加入完畢後，經濾紙且隨後經微孔膜(HAWP 0.45pm)過濾該反應混合物，納米級過濾，加入1M葡甲胺(0.20mL；0.20mmol)調至pH7.0。乾燥固體得到24.0g預期產物(13.2mmol)。
收率91％ m.p.90-92CHPLC分析100％(面積％)固定相Lichrospher 100 RP-85μm；Merck KGAa 250×4mm柱；溫度40C；流動相用預混流動相等度洗脫1g正辛基胺加入400mL乙腈和600mL水中。該溶液用H3PO4緩衝至pH6；
流速1mL分鐘-1；檢測(UV)210nm.
元素分析 C H N Gd Na，Cl％計算值46.967.386.178.66％實測值44.277.595.768.21 ＜0.1H2O 6.61IR和MS光譜與所示結構吻合。
實施例8與鈉(1∶3)成鹽的[3β(R)，5β，12α]-3-[[4-[雙[2[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-12-羥基膽烷-24-酸的釓絡合物 按照反應路線3實施例5所述的試驗方法，(R)-5-氧代-1，2-吡咯烷二甲酸1-(苯基甲基)酯(市售產品)用碘甲烷在N，N-二異丙基乙胺存在下酯化，由此所得(R)甲酯與(3β，5β，12α)-3-氨基-12-羥基膽烷-24-酸甲酯(按照WO-A-95/32741實施例5所述膽酸衍生物方法製備)反應得到[3β(R)，5β，12α]-3-[[4-雙[雙[2-[雙[2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]氨基]-乙基]氨基]-5-甲氧基-1，5-二氧代戊基]氨基]-12-羥基-膽烷-24-酸甲酯。在脫除(H2/Pd)Cbz保護基後，用N-(2-溴乙基)-N-[2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]-甘氨酸1，1-二甲基乙酯(按照WO-A-95/32741實施例15所述方法製備)在CH3CN/磷酸鹽緩衝液pH8下烷基化，得到六酯，將其轉化為(含水LiOH/二烷)相關六元酸。後者按照實施例4D)點所述方法絡合，得到預期產物，總收率44％。
m.p.＞300元素分析 C H N Gd Na
％計算值46.495.715.2914.856.51％實測值44.026.135.1014.096.17H2O 4.50％IR和MS光譜與所示結構吻合。
實施例9與鈉(1∶3)成鹽的[3β(RS)，5β，12α]-3-[[4-[雙[2[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-12-羥基膽烷-24-酸的釓絡合物 該化合物是由(3β，5β，12α)-3-氨基-12-羥基膽烷-24-酸甲酯(類似於WO-A-95/32741實施例5所述膽酸衍生物方法製備)和N，N-雙[2-[雙[2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]氨基]-乙基]-DL-穀氨酸1-(1，1-二甲基乙基)酯(由DL穀氨酸、按照WO-A-95/32741實施例15中對L異構體所述方法製備)、按照實施例4所述詳細方法合成。
所得產物的總收率為61％。m.p.＞300℃HPLC分析99％(面積％)固定相Zorbax ECLIPSE XDB-C83.5μm；150×4.6mm柱RocklandTechnologies，Inc.；溫度40℃；流動相梯度洗脫；A＝0.005M KH2PO4，0.005M K2HPO4，0.3mM EDTA，水中；B＝CH3CN梯度分鐘 ％A％B090 10590 1020 50 50
流速1.0mL分鐘-1；檢測(W)210nm；色譜法顯示出兩個峰，這兩個峰幾乎等比例，它們與二酯非對映異構體有關，這歸因於DTPA殘基中的RS立體中心。
元素分析 C H N Gd Na％計算值46.495.715.2914.856.51％實測值43.986.344.9813.866.16H2O 4.63％IR和MS光譜與所示結構吻合。
實施例10與鈉(1∶3)成鹽的[3α(S)，5β，12α]-3-[[4-[雙[2[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-12-羥基膽烷-24-酸的釓絡合物 (3α，5β，12α)-3-氨基-12-羥基膽烷-24-酸甲酯-3，12-二羥基膽烷-24-酸甲酯(3α，5β，12α)-3，12-二羥基膽烷-24-酸甲酯在Mitsunobu條件下(Mitsunobu，有機合成(Synthesis)1981，1-28；Denike，J.K.等人.脂質的化學和物理學(Chem.Phys.Lipids)1995，77，261-267)與三苯基膦、偶氮二甲酸二乙基酯和甲酸在THF反應得到(3β，5β，12α)-3-甲醯氧基-12-羥基膽烷-24-酸甲酯。後者脫保護(MeOH/HCl)得到(3β，5β，12α)-3，12-二羥基膽烷-24-酸甲酯，令該化合物進行WO-A-95/32741實施例5對於膽酸衍生物的一系列反應，得到(3a，5β，12α)-3-氨基-12-羥基膽烷-24-酸甲酯，總收率為32％，m.p.90-92℃[α]20D＝+53.46(c1.3，CH3OH)元素分析 CHN
％計算值74.0310.693.44％實測值74.2010.993.26TLC固定相矽膠板60F 254 Merck洗脫劑9∶1∶0.15 CHCl3/CH3OH/25％ NH4OH Rf＝0.211H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
按照反應路線3和實施例5所述的試驗方法，(S)-5-氧代-1，2-吡咯烷二甲酸2-甲基1-(苯基甲基)二酯與化合物A)反應。由此所得3α(S)，5β，12α]-3-[[4-[雙[2-[雙[2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]-氨基]乙基]氨基]-5-甲氧基-1，5-二氧代戊基]氨基-12-羥基膽烷-24-酸甲酯氫化(H2/Pd)以脫除Cbz保護基。隨後用N-(2-溴乙基)-N-[2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]-甘氨酸1，1-二甲基甲酯(按照WO-A-95/32741實施例15所述方法製備)在CH3CN/磷酸鹽緩衝液pH8下烷基化，得到相關六酯。後者(含水LiOH/二烷)轉化為六元酸，該酸按照實施例4D)點所述方法絡合，得到預期產物，總收率33％。
m.p.＞300℃HPLC分析100.0％(面積％)元素分析 C H N Gd Na％計算值46.495.715.2914.856.51％實測值42.046.374.7613.285.91H2O 9.79％IR和MS光譜與所示結構吻合。
實施例11與鈉(1∶3)成鹽的[3β(S)，5β，7α]-3-[[4-[雙[2[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-7-羥基膽烷-24-酸的釓絡合物
該化合物由(3β，5β，7α)-3-氨基-7-羥基膽烷-24-酸甲酯(按照類似於WO-A-95/32741實施例5所述膽酸衍生物的方法製備)和N，N-雙[2-[雙[2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]氨基]-乙基]-L-穀氨酸1-(1，1-二甲基乙基)酯(WOA-95/32741實施例15所述方法製備)、按照實施例4詳細方法製備。得到產物，總收率89％。
m.p.＞300℃元素分析 C H N Gd Na％計算值46.495.715.2914.856.51％實測值43.886.504.9113.626.04H2O 7.11％IR和MS光譜與所示結構吻合。
實施例12[3β(RS)，5β，7α，12α]-3-[[4-[雙[2[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-7，12-二羥基膽烷-24-酸 該化合物由(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸甲酯(WO-A-95/32741實施例5所述方法製備)和N，N-雙[2-[雙[2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]氨基]-乙基]-DL-穀氨酸1-(1，1-二甲基乙基)酯(由DL穀氨酸、按照WO-A95/32741實施例15對於L異構體所述方法製備)、按照實施例4製備化合物B的詳細步驟合成)。所得產物的總收率為65％。
m.p.224℃ 分解.
HPLC分析97％(面積％)固定相Zorbax ECLIPSE XDB-C8 3.5μm；150×4.6mm柱RocklandTechnologies，Inc.；
溫度40℃；流動相梯度洗脫；A＝0.017M H3PO4，0.3mM EDTA水中；B＝CH3CN梯度分鐘％A ％B0 95 540 65 3550 65 35流速1.0mL分鐘-1；檢測(W)210nm；色譜法顯示出兩個峰，這兩個峰幾乎等比例，它們與二酯非對映異構體有關，這歸因於DTPA殘基中的RS立體中心。
元素分析 C H N Li，Cl％計算值57.607.786.55％實測值54.347.816.19＜0.1H2O 5.12％IR、NMR和MS光譜與所示結構吻合。
實施例13與鈉(1∶3)成鹽的[3α(S)，5β，7α，12α]-3-[[[[5-[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-5-羧戊基]氨基]羰基]氧基]-7，12-二羥基膽烷-24-酸的釓絡合物 A)[3α(S)，5β，7α，12α]-3-[[[[6-(1，1-二甲基乙氧基)-5-[雙[2-[雙[2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]氨基]乙基]氨基]-6-氧代己基]氨基]羰基]氧基]-7，12-二羥基膽烷-24-酸甲酯方法1雙(三氯甲基)碳酸酯(2.9g；9.7mmol)在無水CH2Cl2(40mL)溶液在氮氣氛下滴加到(3α，5β，7α，12α)-3，7，12-三羥基膽烷-24-酸甲酯(市售產品)(10.0g；23.7mmol)和吡啶(2.3mL；28.4mmol)在無水CH2Cl2(100mL)中的冷卻至0℃的溶液內。隨後令該混合物升至室溫並且在室溫下1小時後，再次將該溶液冷卻至0℃，向該溶液中加入N，N-二異丙基乙胺(7.9mL；47.3mmol)，隨後滴加N2，N2-雙[2-[雙[2(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]氨基]乙基]-L-賴氨酸(1，1-二甲基乙基)酯(Anelli，P.L.等人生物偶聯化學(Bioconjugate Chem.)1999，10，137)(17.6g；23.7mmol)在無水CH2Cl2(50mL)中的溶液。室溫下攪拌3小時該溶液，隨後用水(2×100mL)洗滌，Na2SO4乾燥和蒸發。粗產物通過閃式色譜純化得到預期產物(14.8g；12.4mmol)。
收率52％.
1H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
方法2氮氣氛下，將[3α，5β，7α，12α]-3-[(氯代羰基)氧基]-7，12-二羥基膽烷-24-酸甲酯(Janout，V.，Lanier，M.；Regen，S.L.美國化學協會會志(J.Am.Chem.Soc.)1997，119，640)(6.1g；12.6mmol)在無水CH2Cl2(150mL)溶液冷卻至0℃，隨後加入N，N-二異丙基乙胺(4.8mL；27.6mmol)。此後滴加N2，N2-雙[2-[雙[2(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]氨基]乙基]-L-賴氨酸(1，1-二甲基乙基)酯(9.3g；12.6mmol)在無水CH2Cl2(20mL)中的溶液。室溫下攪拌3小時，用水(2×100ml)洗滌，Na2SO4乾燥，蒸發。粗產物通過閃式色譜純化得到預期產物(11.9g；9.9mmol)。
收率79％.
1H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
B)[3α(S)，5β，7α，12α]-3-[[[[5-[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-5-羧戊基]氨基]-羰基]氧基]-7，12-二羥基膽烷-24-酸室溫下，將2M LiOH(141mL)的水溶液滴加到化合物A)(11.2g；9.4mmol)在1，4-二烷(141mL)中的溶液內。104小時後，濃縮該溶液(150mL)且滴加2M HCl(175mL)水溶液最終pH達到1.9。過濾沉澱，用H2O(5×50mL)洗滌且真空乾燥。粗產物通過閃式色譜純化。所得固體溶解在10％CH3CN水溶液中，加入濃鹽酸調至pH1，隨後將該溶液填裝在AmberliteXAD 16.00樹脂柱(250mL)上且用CH3CN/H2O梯度洗脫。蒸發含有產物的餾份得到預期產物(4.3g；4.8mmol).
收率51％.m.p.184-191℃K.F.4.36％[α]20D＝+19.5(c1，1M NaOH)HPLC分析97.3％(面積％)固定相Hypurity Elite C 18 5μm；250×4.6mm柱，填裝有Hypersil；溫度40℃；流動相梯度洗脫；A＝0.01M KH2PO4，0.3mM EDTA，在水中；B＝CH3CN梯度分鐘％A％B0 95 520 65 3550 65 35流速1mL分鐘-1；檢測(UV)200nm；元素分析 C H N Cl％計算值57.457.856.23％實測值 55.227.916.08 ＜0.11H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
C)與鈉(1∶3)成鹽的[3α(S)，5β，7α，12α]-3-[[[[5-[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-5-羧戊基]氨基]羰基]氧基]-7，12-二羥基-膽烷-24-酸的釓絡合物步驟B)製備的化合物(4.7g；5.2mmol)懸浮在H2O(100mL)中並且通過加入1M NaOH(10mL)直至pH為6.5溶解該化合物。加入GdCl3(1.9g；5.2mmol)的H2O(17mL)溶液，用1M NaOH(15.6mL)維持pH6.5。室溫下1小時後，將溶液填裝在AmberliteXAD 16.00樹脂柱(250mL)上，其用CH3CN/H2O梯度洗脫。蒸發含有產物的餾份，得到預期產物(4.2g；3.8mmol)。
收率72％.m.p.＞300℃K.F.9.49％[α]20D＝+2.63(c2，H2O)HPLC分析100％(％面積)(與步驟B相同的方法)元素分析 C H N Gd Na Cl％計算值46.155.765.0014.056.17％實測值41.806.284.5412.645.73 ＜0.11H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
實施例14與鈉(1∶3)成鹽的[3β(S)，5β，12α]-3-[[4-[[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基](羧甲基)氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-12-羥基膽烷-24-酸的錳絡合物 A)[3β(S)，5β，12α]-3-[[4-氨基-5-甲氧基-1，5-二氧代戊基]氨基]-12-羥基膽烷-24-酸甲酯將3.4g 5％Pd/C加入[3β(S)，5β，12α]-3-[[5-甲氧基-1，5-二氧代-4-[[(苯基甲氧基)羰基]氨基]戊基]氨基]-12-羥基膽烷-24-酸甲酯(實施例5，產物B)(34.14g；50mmol)的MeOH(340mL)溶液中。室溫下，氫氣氛下，將該混懸液攪拌3.5小時。經Millipore濾膜FH(0.45μm)過濾後，將該溶液蒸發至幹得到預期產物(27.1g；49.3mmol)。
收率98.6％.
失重(50℃；高真空)＜0.1％元素分析 C H N％計算值67.859.555.10％實測值68.589.725.12[α]20D＝+36.61(c2.01，CHCl3)酸滴定度(0.1M HCl)94.6％1H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
B)[3β(S)，5β，12α]-3-[[4-[[2-[雙[2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]氨基]乙基][2-(1，1-二甲基乙氧基)-2氧代乙基]氨基]-5-甲氧基-1，5-二氧代戊基]氨基]-12-羥基膽烷-24-酸甲酯把步驟A)製備的化合物(16.0g；29.1mmol)和N-(2-溴甲基)-N-[2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]-甘氨酸1，1-二甲基乙酯(13.3g；37.8mmol)(按照WO-A95/32741實施例15所述方法製備)溶解在EtOAc(120mL)。加入2M磷酸鹽緩衝液pH8(120mL)後，將該混合物劇烈攪拌2小時，隨後水相用新制的2M磷酸鹽緩衝液pH8(120mL)代替且繼續攪拌70小時。將該混合物在40℃下加熱12小時，冷卻至室溫，分離，蒸發有機相，得到殘餘物，將殘餘物溶於CH2Cl2(150mL)，用水洗滌(2×100mL)，乾燥Na2SO4和蒸發。粗產物通過閃式色譜純化，得到預期產物(12.3g；15.0mmol)。
收率52％.
元素分析 C H N％計算值65.909.465.12％實測值65.999.725.03TLC固定相矽膠板60F 254 Merck洗脫劑1∶1＝EtOAc/正己烷 Rf＝0.40檢測1％KMnO4在1M NaOH中1H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
C)[3β(S)，5β，12α]-3-[[4-[[2-[雙[2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]氨基]乙基][2-(1，1-二甲基乙氧基)-2氧代乙基]氨基]-5-甲氧基-1，5-二氧代戊基]氨基]-12-羥基膽烷-24-酸甲酯把溴乙酸叔丁酯(3.9g；20.1mmol)滴加到步驟B)製備的化合物(11.0g；13.4mmol)和N，N-二異丙基乙胺(3.5mL；20.1mmol)的CH3CN溶液中。室溫下，將該混合物攪拌24小時，隨後加入N，N-二異丙基乙胺(0.9mL；4.0mmol)和溴乙酸叔丁酯(0.8g；4.0mmol)。進一步攪拌該混合物70小時，分離和蒸發有機相，得到殘餘物，將該殘餘物溶於CH2Cl2(150mL)中，用水洗滌(2×100mL)，Na2SO4乾燥並蒸發。粗產物通過閃式色譜純化，得到預期產物(10.7g；11.5mmol)。
收率85％.
元素分析 C H N％計算值65.579.394.50％實測值66.279.624.52TLC固定相矽膠板 60F 254 Merck洗脫劑1∶1＝EtOAc/正己烷 Rf＝0.46檢測1％KMnO4在1M NaOH中1H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
D)[3β(S)，5β，12a]-3-[[4-[[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基](羧甲基)氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]-氨基]-12-羥基膽烷-24-酸室溫下將2M LiOH水溶液(120mL)滴加到步驟C)製備的化合物(9.2g；9.8mmol)的1，4-二烷(120mL)溶液中。24小時後，濃縮該溶液，滴加2M HCl水溶液(135mL)最終pH為1.9。過濾沉澱，用H2O洗滌(5×50mL)和真空乾燥，得到預期產物(7.3g；9.6mmol)。收率98％m.p.163-168℃K.F.1.81％[α]20D＝+29.03(c1，1M NaOH)HPLC分析100％(面積％)固定相Zorbax Eclipse XDB-C8 3.5μm；150×4.6mm柱，填裝有Rockland Technologies Inc.；
溫度40℃；流動相梯度洗脫；A＝0.01M KH2PO4，0.01M K2HPO40.3mM EDTA的水溶液；B＝CH3CN梯度分鐘 ％A％B0 93 75 93 75060 40流速1mL分鐘-1；檢測(UV)200nm；元素分析C H N Li Cl％計算值 60.238.065.69％實測值 58.608.255.49 ＜0.1 ＜0.11H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
E)與鈉(1∶3)成鹽的[3β(S)，5β，12α]-3-([4-[[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基](羧甲基)氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-12-羥基膽烷-24-酸的錳絡合物令步驟D)製備的化合物(5.3g；7.2mmol)懸浮在H2O(250mL)中並且通過加入1M NaOH(36mL)至pH 6.5溶解該化合物。加入MnCl24H2O(1.4g；7.2mmol)的H2O(50mL)溶液，同時用1M NaOH(7.9mL)維持pH 6.5。室溫下1小時後，通過納米級過濾脫鹽，隨後蒸發得到預期產物。
收率98％m.p.＞300℃K.F.13.54％[α]20D＝+2.63(c2，H2O)CE分析100％(面積％)毛細管熔融二氧化矽0.72m×50μm電壓30kV緩衝劑0.07M硼酸鹽，pH9,3，0.3mM EDTA
溫度25C停止時間20分鐘；檢測(W)200nm；注射水壓式(50mbar，4s)；樣本濃度1mgmL-1；儀器Hewlett Packard 3D HPCE預處理時間表t(分鐘)作用2 用H2O洗脫2 用0.1M NaOH洗脫1 用H2O洗脫5 用緩衝液洗脫元素分析C H N MnNa Cl％計算值 51.876.354.906.418.05％實測值 45.506.954.305.286.86 ＜0.1IR和MS光譜與所示結構吻合。
以相同方式由實施例2中的化合物B)製備[3β(S)，5β]-3-[[4-[[2[[雙(羧甲基)氨基]乙基]-(羧甲基)氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-12-氧代膽烷-24-酸。
實施例15與鈉(1∶3)成鹽的[3α(S)，5β，12α]-3-[[[[5-[[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基](羧甲基)氨基]-5羧戊基]氨基]羰基]氧基]-12-羥基膽烷-24-酸的釓絡合物 A)N2-[2-[雙[2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]-氨基]乙基]-N2-[2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]-N6-[(苯基甲氧基)羰基]-L-賴氨酸甲酯將溶解在CH3CN(25mL)中的N-(2-溴乙基)-N-[2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]甘氨酸1，1-二甲基乙酯(25.6g；72.55mmol)(按照WO-A-95/32741實施例15所述方法製備)滴加在N6-[(苯基甲氧基)羰基]-L-賴氨酸甲酯鹽酸鹽(20g；60.46mmol)和N，N二異丙基乙胺(12.64mL；72.55mmol)的CH3CN(250mL)溶液中。室溫下攪拌該反應混合物。5天後，向該溶液中加入更多的N，N-二異丙基乙胺(17.7mL；101.6mmol)和溴乙酸叔丁酯(18.8g；13.5mL；101.6mmol)。24小時後，蒸發溶劑並且殘餘物用Et2O(200mL)處理。過濾該混合物，用0.1MHCl(2×100mL)處理該溶液，乾燥Na2SO4和減壓下蒸發。粗產物通過閃式色譜純化得到預期產物(13.03g；19.2mmol)。
收率32％.
K.F.＜0.1％[α]20D＝-22.47(c1.93，CHCl3)元素分析 C H N％計算值61.838.456.18％實測值61.708.525.84TLC固定相矽膠板60F 254 Merck洗脫劑3∶7＝EtOAc/正己烷 Rf＝0.40檢測Ce(SO4)2，4H2O(0.18％)和(NH4)6Mo7O244H2O(3.83％)，在10％H2SO4中1H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
B)(3α，5β，7α，12α)-3-[(氯代羰基)氧基]-12-羥基-膽烷-24-酸 甲酯注意所有操作必須在很好的通風煙櫥下進行氮氣氛下，將20％光氣的甲苯溶液(100mL；202.2mmol)滴加到(3α，5β，7α，12α)-3，12-二羥基膽烷-24-酸甲酯(14.7g；36mmol)在無水CH2Cl2(350mL)中的、冷卻至0℃的溶液內。室溫下攪拌3小時該溶液，隨後蒸發(注意)得到預期產物(15.2g；32.4mmol)。
收率90％.
1H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
C)[3α(S)，5β，12α]-3-[[[[5-[[2-[雙[2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]氨基]乙基][2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]氨基]-6-甲氧基-6-氧代己基]氨基]羰基]氧基]-12-羥基膽烷-24-酸甲酯把5％Pd/C(1.3g)加入步驟A)製備的化合物(12.3g；18.1mmol)的MeOH(120mL)溶液中，該混懸液在氫氣氛、室溫下攪拌3小時。經Millipore濾膜(FT 0.45μm)過濾後，減壓下蒸發該溶液。將殘餘物溶解在無水CH2Cl2(20mL)，0℃、氮氣氛下滴加步驟B)製備的化合物(8.7g；18.54mmol)和N，N-二異丙基乙胺(DIEA)(6.5mL；37.07mmol)在無水CH2Cl2(200mL)中的溶液內。3小時後，反應混合物用H2O(2×100mL)洗滌，分離有機相，乾燥Na2SO4和減壓下蒸發。粗產物通過閃式色譜純化得到預期產物(8.6g；8.8mmol)。
收率49％.
K.F.＜0.1％元素分析 C H N％計算值65.079.384.30％實測值65.679.524.24TLC固定相矽膠板60F 254 Merck洗脫劑3∶7＝EtOAc/正己烷Rf＝0.30檢測Ce(SO4)2，4H2O(0-18％)和(NH4)6Mo7O244H2O(3.83％)，在10％H2SO4，1H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
D)[3α(S)，5β，12α]-3-[[[[5-[[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基](羧甲基)氨基]-5-羧戊基]氨基]羰基]氧基]-12-羥基膽烷-24-酸將2M LiOH(133mL；266mmol)加入步驟C)製備的化合物(8.5g；10.64mmol)的1，4-二烷(130mL)溶液中。室溫下將所得溶液攪拌24小時，隨後加入2N HCl(120mL)中和至pH7。減壓下蒸發濃縮該溶液至一半體積，在劇烈攪拌下非常緩慢地酸化至pH1.5，得到白色沉澱，將其過濾，用H2O洗滌(2×100mL)和乾燥，得到預期產物(6.45g；8.13mmol)。
收率76％.m.p.188.9℃K.F.1.44％[α]20D＝+35.47(c2.01，1M NaOH)HPLC分析96.8％(面積％)固定相Zorbax Eclipse XDB-C83.5μm；150×4.6mm柱，由RocklandTechnologies Inc.填裝；溫度40℃；流動相梯度洗脫；A＝0.017M H3PO4水溶液；B＝CH3CN梯度分鐘％A％B0 65 3525 15 8530 15 85流速1mL分鐘-1；檢測(UV)210nm；元素分析 C H N Li Cl％計算值59.918.125.37％實測值58.448.045.03＜0.1＜0.11H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
E)與鈉(1∶3)成鹽的[3α(S)，5β，12α]-3-[[[[5-[[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基](羧甲基)氨基]-5-羧戊基]氨基]羰基]氧基]-12-羥基-膽烷-24-酸的錳絡合物將步驟D)製備的化合物(5g；6.3mmol)懸浮在H2O(50mL)中並且通過加入1MNaOH(18mL；18mmol)使該化合物溶解。在3小時內加入0.559M MnCl2水溶液(11.27mL；6.3mmol)，利用1M NaOH(7.8mL)保持pH6.5。用1M NaOH(0.9mL；0.9mmol)調至pH6.8，過濾(HA0.45μm Millipore膜)並且通過納米過濾脫鹽。蒸發該溶液，乾燥得到預期產物(5.45g；6.05mmol)。
收率96％m.p.＞300℃K.F.3.78％[α]20D＝+2.74(c2，H2O)CE分析100％(面積％)毛細管熔融二氧化矽0.72m×50μm電壓30kV緩衝液0.07M硼酸鹽，pH9.3，0.3mM EDTA溫度25C停止時間20分鐘；檢測(UV)200nm；注射水壓式(50mbar，4s)；樣本濃度1mgmL-1；儀器Hewlett Packard 3D HPCE預處理時間表t(分鐘) 作用2用H2O洗脫2用0.1M NaOH洗脫1用H2O洗脫5用緩衝液洗脫元素分析 C H N MnNa Cl％計算值52.006.494.666.107.66％實測值49.547.174.445.657.58 ＜0.1IR和MS光譜與所示結構吻合。
實施例16與鈉(1∶3)成鹽的N2-雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]-N-[(3β，5β，7α，12α)-7，12-二羥基-24-氧代-24-[(2-磺乙基)氨基]膽烷-3-基]-L-穀氨醯胺的釓絡合物
A)[3β(S)，5β，7α，12α]-3-[[4-[雙[2-[雙[2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]氨基]乙基]氨基]-5-(1，1-二甲基乙氧基)-1，5-二氧代戊基]氨基]-7，12-二羥基膽烷-24-酸苯基甲酯N，N-雙[2-[雙[2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]-氨基]乙基]-L-穀氨酸1-(1，1-二甲基乙基)酯(Anelli，P.L.等人.生物偶聯化學(Bioconjugate Chem.)1999，10，137)(37g；50mmol)、(3β，5β，7α，12α)-3-氨基-7，12-二羥基膽烷-24-酸苯基甲酯(Anelli，P.L.；Lattuada，L.；Uggeri，F.Synth.Commun.1998，28，109)(31g；55mmol)和氰基膦酸二乙酯(市售產物)(9.6g；55mmol；9.2mL)溶解在DMF(750mL)中。將所得溶液冷卻至0℃，滴加Et3N(7.3mL)。室溫下1小時後，減壓下蒸發溶液，將殘餘物溶解在EtOAc(300mL)中，用5％NaHCO3水溶液(2×200mL)洗滌，隨用鹽水(2×200mL)洗滌。分離有機相，乾燥Na2SO4和減壓下蒸發。粗產物通過閃式色譜純化，得到預期產物(36g；29mmol)。
Yield 58％.
K.F.0.98％元素分析 C H N％計算值65.649.214.57％實測值66.319.204.51TLC固定相矽膠板60F 254 Merck洗脫劑2∶8＝EtOAc/正己烷 Rf＝0.3檢測AcOH/濃H2SO4/對茴香醛＝100∶2∶11H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
B)[3β(S)，5β，7α，12α]-3-[[4-[雙[2-[雙[2-(1，1-二甲基-乙氧基)-2-氧代乙基]氨基]乙基]氨基]-5-(1，1-二甲基乙氧基)-1，5-二氧代戊基]氨基]-7，12-二羥基膽烷-24-酸三乙胺鹽將5％Pd/C(3.6g)加入步驟A)製備的化合物(36g；29.4mmol)在EtOH(1.5L)中的溶液，在氫氣氛、室溫下將該混懸液攪拌3小時。過濾後(經Millipore過濾器FT 0.45μm)，減壓下蒸發溶液。粗產物通過閃式色譜純化得到預期產物(22g；18mmol)。
收率60％.m.p.58℃K.F.1.34％元素分析 C H N％計算值65.079.865.66％實測值64.3410.07 5.48TLC固定相矽膠板60F 254 Merck洗脫劑1∶5∶95＝Et3N/MeOH/CH2Cl2Rf＝0.33檢測AcOH/濃H2SO4/對茴香醛＝100∶2∶11H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
C)N2-雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]-N-[(3β，5β，7α，12α)-7，12-二羥基-24-氧代-24-[(2-磺乙基)氨基]膽烷-3-基]-L-穀氨醯胺0℃氮氣氛下，將Et3N(1.2g；12mmol；1.7mL)滴加到化合物B)(12.5g；11mmol)、(2-氨基乙磺酸(市售產品)(1.5g；12mmol)和氰基磺酸二乙酯(市售產品)(2.1g；12mmol；2mL)在DMF(400mL)中的溶液內。20分鐘後，令該化合物升至室溫並且攪拌3小時。減壓下蒸發該溶液，將殘餘物溶解在二烷(250mL)中，滴加0.5M H2SO4水溶液(250mL；125mmol)。所得混合物在90℃下加熱2小時。用2N NaOH將溶液的pH調至1.4至7，減壓下蒸發溶劑。粗產物通過閃式色譜純化。將產物溶於H2O(250mL)和2N HCl(12.5mL)中，經AmberliteAD-16.00樹脂柱、用CH3CN/H2O梯度洗脫脫鹽得到預期產物(1.5g；1.6mmol)。
收率14％.m.p.＞200℃
K.F.5.87％元素分析 C H N S％計算值53.687.447.283.33％實測值50.347.716.642.991H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
D)與鈉(1∶3)成鹽的N2-雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]-N-[(3β，5β，7α，12α)-7，12-二羥基-24-氧代-24-[(2-磺乙基)氨基]膽烷-3-基]-L-穀氨醯胺的釓絡合物將產物C)(880mg；0.915mmol)溶於H2O(50mL)中，滴加1N NaOH直至pH 6.8為止。加入Gd2O3(165mg；0.46mmol)，所得混懸液在50℃下加熱6小時。經Millipore裝置(HA 0.45μm濾膜)過濾反應混合物，將濾液填裝在DowexCCR 3LB弱陽離子交換樹脂柱(Na+型，20mL)上。減壓下蒸發洗脫液並且乾燥得到預期產物(1.00g；0.75mmol)。
收率82％.m.p.＞250℃K.F.13.95％HPLC分析100％(面積％)固定相Lichrospher 100RP-85μm；250×4mm柱，由Merck KGaA填裝；溫度40℃；流動相用預混流動相等度洗脫1g正辛胺加入300mL乙腈中，與700mL水混合。用H3PO4將溶液緩衝到pH6；流速1mL分鐘-1；檢測(UV)200nm；元素分析 C H N S Gd Na％計算值43.785.545.922.7113.305.83％實測值36.826.045.112.1810.645.35IR和MS光譜與所示結構吻合。
以相同方式製備N2-雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]-N-[(3β，5β)-24-氧代-24-[(2-磺乙基)氨基]膽烷-3-基]-L-穀氨醯胺的釓絡合物。
實施例17與鈉(1∶3)成鹽的[3α(S)，5β]-3-[2-[[5-[雙[2[雙(羧甲基)氨基]-乙基]氨基]-5-羧戊基]-氨基]-2-氧基乙氧基]膽烷-24-酸的釓絡合物 A)(3α，5β)-3-(羧基甲氧基)膽烷-24-酸甲酯-20℃下，在15分鐘內將甘氨酸苄酯三氟甲磺酸鹽(Williams，M.A.；Rapoport，H.有機化學雜誌(J.Org.Chem.)1994，59，3616)(16.8g；56.3mmol)加入(3α，5β)-3-羥基膽烷-24-酸甲酯(Dayal，B.等人.甾族化合物(Steroids)1981，37，239)(20g；51.2mmol)和N，N-二異丙基乙胺(10mL；57.4mmol)在無水CH3CN(400mL)中的攪拌溶液內。-20℃下4小時後，令該混合物升至室溫並且另外攪拌4小時。蒸發溶劑，令殘餘物在EtOAc(300mL)和飽和NaHCO3(300mL)之間分配。有機相用Na2SO4乾燥和蒸發。將殘餘物溶於EtOH(200mL)中，隨後加入5％Pd/C(3g)，室溫下在5小時內氫氣氛下攪拌該混合物。經Millipore濾器FH(0.45μm)過濾，蒸發溶液，殘餘物通過閃式色譜純化得到預期產物(14.2g；31.7mmol)。
收率62％K.F.＜0.1元素分析 C H％計算值72.289.89％實測值71.979.81
1H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
B)[3a(S)，5β]-3-[2-[[5-[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-5-羧戊基]氨基]-2-氧代乙氧基]膽烷-24-酸把N2，N2-雙[2-[雙[2-(1，1-二甲基乙氧基)-2-氧代乙基]-氨基]乙基]-L-賴氨酸(1，1-二甲基乙基)酯(Anelli，P.L.等人，生物偶聯化學(Bioconjugate Chem.)1999，10，137)(18.6g；25mmol)、化合物A)(11.2g；25mmol)和氰基磷酸二乙酯(市售產品)(4.9g；28mmol)溶於DMF(300mL)中。將所得溶液冷卻至0℃並滴加Et3N(4mL)。室溫下6小時後，減壓下蒸發該溶液，把殘餘物溶於EtOAc(250mL)，用5％NaHCO3水溶液(2×100mL)洗滌，隨後用鹽水(2×100mL)洗滌。分離有機相，用Na2SO4乾燥，減壓下蒸發。殘餘物溶於二烷(300mL)中，滴加0.5M H2SO4水溶液(300mL；150mmol)。所得混合物在90℃下加熱2小時。用2N NaOH將溶液的pH調至7，減壓下蒸發溶劑。粗產物通過閃式色譜純化。將產物溶解在H2O(300mL)和2N HCl(30mL)中，經AmberlitesXAD-16.00樹脂柱、用CH3CN/H2O梯度洗脫脫鹽得到預期產物(9.03g；10.25mmol)。
收率41％.
K.F.2.78％元素分析 C H N％計算值59.988.246.36％實測值58.118.286.141H-NMR、13C-NMR、IR和MS光譜與所示結構吻合。
C)與鈉(1∶3)成鹽的[3α(S)，5β]-3-[2-[[5-[雙[2[雙(羧甲基)氨基]-乙基]氨基]-5-羧戊基]氨基]-2-氧代乙氧基]膽烷-24-酸的釓絡合物通過加入1N NaOH直至pH6.8使產物B)(5g；5.67mmol)溶於H2O(200mL)中。加入Gd2O3(1.03g；2.84mmol)，所得混懸液在50℃下加熱8小時。經Millipore裝置(HA 0.45μm濾膜)過濾該反應混合物，減壓下蒸發濾液，乾燥，得到預期產物(5.74g；5.21mmol)。
收率92％.m.p.＞250℃K.F.5.81％元素分析 C H N Gd Na％計算值47.996.045.0914.286.26％實測值45.096.154.7713.395.81IR和MS光譜與所示結構吻合。
以相同方式、由實施例15的化合物A)開始製備[3α(S)，5β]-3-[2[[5-[[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基](羧甲基)氨基]-5-羧戊基]氨基]-2-氧代乙氧基]膽烷-24-酸的釓絡合物。
以相同方式、由實施例15的化合物A)和(3β，5β，7α，12α)-3-[(3-羧基-1-氧代丙基)氨基]-7，12-二羥基膽烷-24-酸甲酯(按照WO-A-95/32741實施例12所述方法製備)開始，製備[3β(S)，5β，7α，12α]-3-[[4-[[5-[[2-[雙(羧甲基)-氨基]乙基](羧甲基)氨基]-5-羧戊基]氨基]-1，4-二氧代丁基]氨基]-7，12-二羥基膽烷-24-酸的釓絡合物。
實施例18弛豫速率(A1/T1)的測定通過相對於給藥後所逝時間縱向繪製弛豫速率1/T1來評估本發明化合物作為血池劑的有效性。在預定時間採集的血樣的質子弛豫速率1/T1是在39℃下、通過Brucker minispec PC120儀、利用″逆向回收″三種參數序列來測定。
將實施例1製備的化合物，與1-脫氧-1-(甲基氨基)-D-山梨糖醇(1∶3)成鹽的[3β(S)，5β]-3-[[4-[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]膽烷-24-酸的釓絡合物以0.1mmol/kg的劑量對兔子給藥。簡圖(

圖1)表示弛豫速率的分布圖。
專利申請WO 95/32741實施例9中製備的化合物，與1-脫氧-1-(甲基氨基)-D-山梨醇(1∶2)成鹽的(3β，5β，7α，12α)-3-[[N-[N-[2-[[2-[雙(羧甲基)-氨基]乙基](羧甲基)氨基]乙基]-N-(羧甲基)甘氨醯基]甘氨醯基]氨基]-7，12-二羥基-膽烷-24-酸的釓絡合物以0.1mmol/kg的劑量對兔子給藥。簡圖(圖2)表示弛豫速率的分布圖。
專利申請WO 95/32741的實施例15製備的化合物，與1-脫氧-1-(甲基氨基)-D-山梨醇(1∶3)成鹽的[3β(S)，5β，7α，12α]-3-[[4-[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-7，12-二羥基膽烷-24-酸的釓絡合物以0.1mmol/kg的劑量對兔子給藥。簡圖(圖3)表示弛豫速率的分布圖。
實施例4製備的化合物，與1-脫氧-1-(甲基氨基)-D-山梨醇(1∶3)成鹽的[[3β(S)，5β，12α]-3-[[4-[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-12-羥基膽烷-24-酸的釓絡合物以0.1mmol/kg的劑量對兔子給藥。簡圖(圖4)表示弛豫速率的分布圖。
實施例190.3M的與1-脫氧-1-(甲基氨基)-D-山梨糖醇(1∶3)成鹽的[3β(S)，5β，12α]-3-[[4-[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-12-羥基膽烷-24-酸釓絡合物的藥物製劑室溫下，在藥用不鏽鋼反應釜中將31.775kg與1-脫氧-1-(甲基氨基)-D-山梨糖醇(1∶3)成鹽的[3β(S)，5β，12α]-3-[[4-[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-12-羥基膽烷-24-酸釓絡合物(例如實施例4製備)和100g氨丁三醇(trometamol)鹽酸鹽溶解在100L滅菌水中。溶解後，通過加入1M氨丁三醇將溶液的pH調節至7.4。該溶液經0.22mm直徑的濾器過濾滅菌並且分配在20mL的瓶內，瓶子用滷丁基塞封閉，用鋁環密封並且在Fo＝18下蒸氣滅菌。HPLC顯示滴定度為0.294M。
實施例20含有實施例19的製劑的預填充塑料注射器將實施例19製備的20mL份的溶液置於CZ塑料注射器中，該注射器頂部被蓋子密封。減壓下插入活塞，將該預填充注射器在高壓釜中滅菌達到Fo＝18。
權利要求
1.穀氨酸γ-醯胺類化合物的製備方法，按照下列合成路線 其中R4是氨基保護基；R5是直鏈或支鏈C1-C10烷基或芳基，R2和R3獨立地是氫原子、直鏈或支鏈未取代或被芳基取代的C1-C20烷基，或這兩個基團形成C3-C10環。
2.如權利要求1的方法，用於製備式(I)化合物，X-L-Y (I)其中X是聚氨基聚羧酸配體或其衍生物的殘基，選自如下的組乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、1，4，7，10-四氮雜環十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)、1，4，7，10-四氮雜環十二烷-1，4，7-三乙酸(DO3A)、10-(2-羥丙基)-1，4，7，10-四氮雜-環十二烷-1，4，7-三乙酸(HPDO3A)、4-羧基-5，8，11-三(羧甲基)-1-苯基-2-氧雜-5，8，11-三氮雜十三烷-13-酸(BOPTA)；Y是選自膽酸、鵝去氧膽酸、脫氧膽酸、熊去氧膽酸、石膽酸的殘基的膽酸衍生物， 膽酸鵝去氧膽酸脫氧膽酸 熊去氧膽酸 石膽酸為其本身或在具有羥基的位置官能化為反應基團，獨立於終產物的立體化學，所述衍生物也包括24位酸基與牛磺酸和甘氨酸的軛合物；L是與X的任何位置以及Y的C-3、C-7、C-12位相連的鏈，選擇性地含有一個由此轉化為醯氨基的羧基，並且具有下式(III) 其中m是1-10的整數，其中對於大於1的值，各單元相同或不同，n和q是0或1，但是它們不能同時為0，p介於0至10，Z是氧原子或-NR基，其中R為氫原子，或未取代或被-COOH基取代的(C1-C5)烷基，穀氨酸γ-醯胺類化合物具有基團Y的3-氨基衍生物。
3.如權利要求2的方法，用於製備化合物[3β(S)，5β，7α，12α]-3-[[4-[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-12-羥基膽烷-24-酸和[3β(S)，5β，7α，12α]-3-[[4-[雙[2-[雙(羧甲基)氨基]乙基]氨基]-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]-7，12-二羥基膽烷-24-酸。
全文摘要
通式(I)的化合物與選自Fe(
文檔編號C07J9/00GK1854122SQ20061006769
公開日2006年11月1日 申請日期1999年12月16日 優先權日1998年12月23日
發明者P·L·阿奈裡, M·布洛柴塔, C·德漢恩, O·加佐蒂, L·拉圖爾達, G·拉克斯, G·曼弗萊迪, P·莫洛希尼, D·帕拉諾, M·瑟萊提, F·尤吉裡, M·維希加裡 申請人:伯拉考成像股份公司