通過電紡形成綴合蛋白的製作方法
2023-04-27 00:14:11 1
通過電紡形成綴合蛋白的製作方法
【專利摘要】通過製備包含多糖和蛋白質的水溶液、向該溶液施加高電壓、在收集板上收集纖維而製備多糖-蛋白質纖維的方法。
【專利說明】通過電紡形成綴合蛋白
[0001] 相關申請的交叉參考
[0002] 本申請要求2012年4月4日提交的美國臨時申請系列號61/619,996的優先權， 其全部內容特此通過參考引入。
[0003] 背景
[0004] 綴合蛋白，包括蛋白質_多糖綴合物，在許多加工食品的結構和穩定性中起到顯 著作用。在加工食品工業中特別重要的一個反應是美拉德反應。美拉德反應是涉及氨基與 還原基團縮合的非酶促化學相互作用。該反應導致形成中間產物，其可隨後聚合以形成褐 色的稱為蛋白黑素的含氮化合物。
[0005] 美拉德反應有三個主要階段。在第一階段，糖胺形成，然後經歷重排成為糖胺化合 物。在第二階段，失去胺基並形成羰基中間體。所述羰基中間體經歷脫水或裂變以形成高 度反應性的羰基化合物。在最終階段，所述反應性羰基化合物與食品的其它成分反應以形 成蛋白黑素。
[0006] 美拉德反應的產物與正面屬性如芳香、味道和顏色相關。但是，該反應也可導致降 低的營養價值、縮短的保存期以及形成導致變味的不良化合物。
[0007] 因此控制美拉德反應在開發具有改善的營養價值的食品中非常關鍵。先前產生蛋 白質綴合物的方式出於多種原因並不有效。例如，使用凍幹過程聯合加熱的幹溫育法緩慢 且不能提供足夠的產量。因而，需要更有效的方式來控制綴合蛋白的產生。
[0008] 概述
[0009] 本文所述的特徵總體涉及使用電紡（electrospinning)來產生綴合蛋白的方法。 本文所述特徵的一些方面涉及製備葡聚糖綴合乳清蛋白的方法。
[0010] 附圖簡述
[0011] 本文公開內容通過舉例方式加以例示而不限於附圖，在附圖中類似的參考數字表 示相似的要素，其中：
[0012] 圖1例示一例電紡裝置，在其上可實施本文公開內容的多種特徵。
[0013] 圖2例示使用0. 5g/mL溶劑的葡聚糖（70kDa)的纖維上的珠粒。
[0014] 圖3例示從0. 7g/mL溶劑的葡聚糖（70kDa)溶液製備的纖維。
[0015] 圖4例示從0. 8g/mL溶劑的葡聚糖（70kDa)溶液製備的光滑纖維。
[0016] 圖5例示從1. Og/mL的葡聚糖（40kDa)水溶液製備的淨葡聚糖電紡纖維的LM圖 像。
[0017] 圖6例示從0. 6g/mL的葡聚糖（lOOkDa)水溶液製備的淨葡聚糖電紡纖維的LM圖 像。
[0018] 圖7例示用不同葡聚糖以最小可電紡濃度製備的葡聚糖-乳清蛋白分離物混合物 的粘度。
[0019] 圖8A-F。圖8A-8C例示從多種葡聚糖大小製備的葡聚糖-乳清蛋白分離物電紡纖 維的掃描電鏡（SEM)圖像：8A :40kDa，8B :70kDa，和8C :100kDa。圖8A、8B和8C中的纖維的 纖維直徑分別顯示於圖8D、8E和8F。
[0020] 圖9例示不同濃度的葡聚糖水溶液的應力-應變流變曲線。
[0021] 圖10例示混合比對葡聚糖和乳清蛋白混合物的流動特性的影響作用。對於每種 混合物，總固體含量為0. 6g/mL。
[0022] 圖 11A-H。圖 11A-D例示從不同濃度（11A :0? 3g/mL溶劑，11B :0? 45g/mL溶劑，11C : 0. 6g/mL溶劑，和11D :0. 7g/mL溶劑）的葡聚糖溶液製備的電紡纖維的SEM圖像。電紡條 件保持恆定於：電壓=20kV，電紡距離=18cm，和溶液流速=12ii L/min。圖11A-D中的纖 維的纖維直徑分別顯示於圖11E-H。
[0023] 圖12A-J。圖12A-E例示從具有不同混合比（以重量計）的葡聚糖（lOOkDa)與乳 清蛋白分離物（12A:1:0, 12B:0. 8:0. 2, 12C:0. 75:0. 25 ;12D:0. 67:0. 33,和 12E:0. 5:0. 5) 的混合物製備的電紡纖維的SEM圖像。所有混合物的濃度為0. 6g/mL溶劑，且電紡條件保 持恆定於：電壓=20kV，電紡距離=18cm，和溶液流速=12ii L/min。圖12A-E中的纖維的 纖維直徑分別顯示於圖12F-J。
[0024] 圖13A顯示不同混合物比的葡聚糖粉末與乳清蛋白分離物粉末之間的混合物的 IR光譜。圖13B顯示乳清蛋白分離物含量與於1518和KKMenT 1的波數的峰吸光度之間的 比值之間的關係。
[0025] 圖14顯不於60°C和74% RH退火不同時間的電紡膜的外觀。
[0026] 圖15顯示以下的IR光譜：a)粉末形式的WPI-葡聚糖；b)初紡（as-spun)WPI-葡 聚糖電紡膜；c) -f)分別於60°C和74% RH退火2、6、20和48小時後的WPI-葡聚糖電紡膜。
[0027] 圖16例示退火時間對WPI-葡聚糖綴合物在2-巰基乙醇存在下的SDS-PAGE譜的 影響作用。泳道1 :WPI溶液；泳道2-8 :分別於60°C 74% RH退火0、2、4、6、8、16、24和48 小時的電紡WPI-葡聚糖（40kDa)膜。
[0028] 圖17A和17B例示WPI-葡聚糖綴合物在2-巰基乙醇存在下的SDS-PAGE譜。圖 17A是蛋白質染色。圖17B是糖蛋白染色。圖17A和B的泳道均為，泳道1 :WPI溶液；泳道 2-5 :分別於0、8、16和24小時加熱的電紡WPI-葡聚糖（40kDa)膜；泳道6-9 :分別於0、8、 16和24小時加熱的電紡WPI-葡聚糖（lOOkDa)膜。
[0029] 圖18A和18B例示WPI-葡聚糖（70kDa)綴合物的SDS-PAGE譜：圖18A是蛋白質 染色。圖18B是糖蛋白染色。所有電紡膜中葡聚糖與WPI之間的重量比為3:1。泳道1:蛋 白梯；泳道2-5 :分別於0、8、16和24小時於60°C，74% RH退火的電紡膜。
[0030] 圖19例示用於SDS PAGE凝膠的TGX預製凝膠的標準曲線。等式中顯示的變量麗 和d分別為以kDa計的分子量和以％計的移動距離（R2 = 99. 86% )。中心的線和兩條外 側的線分別顯示預測值和95%置信帶。
[0031] 圖20A和20B例示不同溼度和退火時間下形成的WPI-葡聚糖（lOOkDa)綴合物的 SDS-PAGE譜。所有電紡膜中葡聚糖與WPI之間的重量比為3:1。圖20A是蛋白質染色。圖 20B是糖蛋白染色。泳道1 :初紡膜；泳道2-10 :於60°C但不同相對溼度退火的電紡膜：泳 道2-4 = 0% RH ;泳道5-7 = 44% RH ;泳道8-10 = 74% RH。退火時間為8小時：泳道2、 5和8 ;16小時；泳道3、6和9 :16小時；和24小時泳道4、7和10。泳道0為標準蛋白梯。
[0032] 圖21和21B例示在恆定溼度條件下的WPI-葡聚糖（lOOkDa)綴合物的SDS-PAGE 譜。分別以葡聚糖與WPI之間不同摩爾比製備電紡膜：泳道1-4 = 1:2 ;泳道5-8:1:1 ;泳 道9-12:2:1。圖21A是蛋白質染色。圖21B是糖蛋白染色。所有電紡膜於60°C和74%RH 退火。退火時間為：泳道1、5和9 :初紡膜；泳道2、6和10:8小時；泳道3、7和11:16小時； 泳道4、8和12:24小時。泳道0是標準蛋白梯。所用染料是對N-糖苷（其不存在於蛋白 質或麥芽糊精中）特異性的。
[0033] 圖22A顯示從WPI和葡聚糖40kDa混合物製備、以不同退火時間於60°C和74% RH退火的電紡樣品的UV吸收光譜。圖22B顯不電紡樣品於282nm的吸光度峰與退火時間 (WPI和葡聚糖40kDa樣品）之間的關係。
[0034] 圖23A顯示從WPI和葡聚糖70kDa混合物製備、以不同退火時間於60°C和74% RH退火的電紡樣品的UV吸收光譜。圖23B顯不電紡樣品於282nm的吸光度峰與退火時間 (WPI和葡聚糖70kDa樣品）之間的關係。
[0035] 圖24A和24B顯示溶液濃度對從WPI和葡聚糖lOOkDa混合物製備的電紡樣品的 UV吸光度的影響作用。圖24A是5mg/mL，而圖24B是3mg/mL。
[0036] 圖25A和25B顯示從摩爾比為1:1(圖25A)和2:1(圖25B)的WPI與葡聚糖lOOkDa 混合物製備的電紡樣品於282nm的吸光度峰。
[0037] 圖26顯示從摩爾比為2:1的葡聚糖lOOkDa與WPI混合物製備的電紡樣品的UV 吸收光譜。
[0038] 圖27顯示以不同混合比：A) 1:2 ;B) 1:1;和〇2:1 (葡聚糖與WPI之間的摩爾比） 從WPI和葡聚糖lOOkDa製備的電紡樣品。
[0039] 圖28A-C例示於1:2⑷，1:1⑶和2:2 (C)的摩爾比用比色計測量的電紡膜的亮 度（實心圓圈）和黃度（空心圓圈）。
[0040] 圖29A和B例示電紡膜WPI-葡聚糖lOOkDa的NIR光譜。
[0041] 詳細描述
[0042] 在本文公開內容的一方面，提供了使用電紡法產生綴合蛋白的方法。在一些方面， 綴合物是蛋白質-碳水化合物綴合物（即蛋白質與一種或多種碳水化合物共價連接）。在 一些方面，綴合物是蛋白質-多糖綴合物（即蛋白質與一種或多種多糖共價連接）。在特定 方面，所述多糖是葡聚糖且所述蛋白質是乳清蛋白分離物（WPI)。
[0043] 乳清蛋白和糖基化作用
[0044] 乳清蛋白由於其優異功能（例如泡沫和乳液穩定作用）及其高營養含量（例如高 含量的必需胺基酸）是用於眾多食品的關鍵成分[1]。
[0045] 乳清蛋白在食品加工期間由於固有遭遇到的環境條件如高溫、壓力和/或存在多 種酸而容易變性。因此提高乳清蛋白穩定性已成為食品生產商的主要興趣所在以改進其在 食品應用中的用途。已證實乳清蛋白與葡聚糖之間通過形成希夫鹼中間產物的糖基化作用 是改善所述蛋白質的熱穩定性[1]和乳化特性[3, 4]的有效方法。
[0046]蛋白質_多糖綴合物的形成提高乳液的凍融穩定性，甚至在於_18°C 22小時和 +40°C 2小時的三次凍融循環之後[5]。
[0047] 蛋白質與多糖的非化學糖基化可通過將蛋白質粉末與含有還原糖的粉末的混合 物於大約60°C和至少?44%的相對溼度乾熱長達4天來進行[6]。在乾熱法中，並非直接 將熱應用於其最初粉末形式的WPI和葡聚糖，而是先製備液體形式的WPI和葡聚糖溶液，然 後凍幹以獲得固體形式的混合物，其更適於隨後的糖基化反應。
[0048]將WPI糖基化的一種替代方法是將葡聚糖和乳清蛋白分離物溶液於60°C和pH? 6. 5加熱約48小時，即所謂的溼熱法。參見例如美國公開申請20090311407。溼熱法具有 比乾熱法實質上更短的反應時間和高級的美拉德反應產物，其生成的深色色素不如在乾熱 法中容易形成。這兩種方法由於所涉及的費用以及兩種方法均產率低（〈5% )而均未能廣 泛使用。
[0049] 電紡
[0050] 電紡是一種形式的電沉積，且是通過使用高壓電場（例如15_25kV)可從合成和/ 或天然聚合物產生纖維的通用技術。電紡可以有針或者無針。典型的電紡設置由配備有噴 絲頭的溶液容器、用於收集沉積的纖維的收集板和在噴絲頭與收集板之間生成電場的高壓 單元組成。參見圖1。溶液容器可以是配備有導電針的注射器，所述導電針既可用作噴絲頭 還可用作電極。
[0051] 聚合物溶液的流速可使用注射器泵來控制。一旦聚合物溶液經由電極而帶電，在 噴絲頭尖端聚合物溶液小滴的形狀將轉化為泰勒錐體（Taylor cone)形狀。如果電壓高到 足以克服表面張力，則細聚合物射流將從泰勒錐體尖端射出。噴射出的聚合物射流由於射 流尺寸小而迅速乾燥，而乾燥的固體纖維可從收集板收集。電紡纖維的平均直徑通常為數 百納米左右。
[0052] 聚合物鏈纏結是將目標溶液成功電紡成纖維所需的。聚合物鏈纏結防止聚合物射 流由於電紡期間的電拉伸力而破裂。如果聚合物濃度太低，溶液中缺乏聚合物鏈重疊。當 濃度增加到臨界濃度c*，鏈纏結啟動。鏈纏結的程度（^匕^取決於聚合物濃度和分子量兩 者,且可通過等式2. 1確定[12]:
【權利要求】
1. 經由電紡製備碳水化合物-蛋白質纖維或顆粒的方法，包括以下步驟： 製備包含碳水化合物和蛋白質的水溶液， 向所述溶液施加15到25kV的電壓， 在收集板上收集纖維。
2. 權利要求1的方法，其中所述電紡是無針的。
3. 權利要求1的方法，其中所述碳水化合物具有醛基或通過異構形成醛基。
4. 權利要求1的方法，其中所述碳水化合物是葡聚糖。
5. 權利要求4的方法，其中所述葡聚糖分子量在大約lOkDa和大約500kDa之間。
6. 權利要求4的方法，其中所述葡聚糖以0. lg/mL到大約5. Og/mL的濃度存在。
7. 權利要求1的方法，其中所述蛋白質選自微生物、動物、奶製品和植物性的。
8. 權利要求1的方法，其中所述蛋白質是乳清蛋白分離物（WPI)。
9. 權利要求1的方法，其中所述水溶液包含摩爾比（w/w)從50 :1到1 :50的碳水化合 物和蛋白質。
10. 權利要求1的方法，其中所述水溶液包含摩爾比（w/w)從3 :1到1 :10的碳水化合 物和蛋白質。
11. 權利要求1的方法，其中所述水溶液包含葡聚糖和WPI。
12. 權利要求1的方法，還包括將所述纖維於至少45%的相對溼度溫育至多24小時， 從而形成綴合膜的步驟。
13. 權利要求12的方法，其中相對溼度在65%和75%之間。
14. 權利要求12的方法，其中溫度在10-70°C的範圍內。
15. 權利要求1的方法，其中所述纖維直徑為大約100nm到大約500nm。
16. 權利要求15的方法，其中所述纖維直徑為大約150nm到大約250nm。
17. 通過電紡製備多糖-蛋白質纖維的方法，包括以下步驟： 製備包含lOOkDa葡聚糖和乳清蛋白分離物的水溶液，其中所述葡聚糖和乳清蛋白分 離物以在3 :1和10 :1之間的摩爾比（w/w)存在， 向所述溶液施加15到25kV的電壓從而產生纖維， 在收集板上收集所述纖維，和 將所述纖維於至少45%的相對溼度溫育達4和24小時之間的時間，從而形成綴合膜。
18. 權利要求17的方法，其中相對溼度在65%和75%之間。
19. 權利要求17的方法，其中溫育在4和8小時之間。
20. 權利要求17的方法，其中溫度在10-70°C的範圍內。
21. 權利要求17的方法，其中所述電紡是無針的。
【文檔編號】B82B3/00GK104284858SQ201380023823
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年3月13日 優先權日:2012年4月4日
【發明者】S·貝爾, P·吉文, K·坎加納龐庫爾, J·韋斯 申請人:百事可樂公司