一種優化三萜合酶編碼基因及其應用的製作方法
2024-04-01 11:52:05
專利名稱：一種優化三萜合酶編碼基因及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種優化三萜合酶編碼基因及其應用。
背景技術：
氧化鯊烯環化酶(OSCs)是一類以2，3-氧化鯊烯為底物，環化產生多種結構各異的三萜化合物(環阿屯醇，羽扇豆醇，香樹素，葫蘆二烯醇等)，是植物甾醇和三萜合成途徑的關鍵酶，許多產物具有重要的生理和生物學活性。例如，人參中的三萜化合物就是其重要的藥效成分，具有提高人體免疫力的功能(Shukla etal.，Phytochemistry, 29:239-241)。苦瓜中的葫蘆素C不僅具有提高植物本身抗病蟲害的能力，而且具有抗腫瘤和抗糖尿病的功效(Tianet al.，Chemistry&Biologyl5:263-273)。人們通過酵母異源表達已經了解了許多OSC的功能，例如擬南芥的CAS產生環阿屯醇(Cycloartenol),燕麥的bASl產生β -香樹素(β -Amyrin),葫蘆的CPQ產生葫蘆二烯醇(cucurbitadienol),水稻的ISO生產異山柑子醇(isoarborinol)。但是，由於受到密碼子偏好性的影響，有些OSCs在酵母的表達並不理想，因此影響了其功能的鑑定。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種優化三萜合酶編碼基因。本發明提供的DNA分子，是如下(1)-(3)中任意一種的DNA分子:(I)序列表中序列I所示的DNA分子；
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(2)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼與合成三萜化合物相關蛋白的DNA分子；(3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與合成三萜化合物相關蛋白的DNA分子。含有上述DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也是本發明保護的範圍。上述重組載體為將上述DNA分子插入表達載體得到的載體；所述表達載體具體為酵母表達載體，在本發明的實施例中，酵母表達載體具體為pPICZA載體，重組載體為將序列表中的序列I所示的Sn0s0SC7基因插入pPICZA載體的NotI酶切位點間得到的載體PPICZ-Sn0s0SC7。上述重組菌為將所述重組載體導入目的菌中得到的重組菌，所述目的菌具體為酵母菌，具體為畢赤酵母菌株X-33。上述DNA分子或上述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在製備三萜化合物中的應用也是本發明保護的範圍。上述應用中，所述三萜化合物為α -香樹素和/或β -香樹素。本發明的另一個目的是提供一種製備三萜化合物的方法。
本發明提供的方法，為發酵上述的重組菌，收集發酵產物，即得到三萜化合物。上述方法中，所述三萜化合物為α -香樹素和/或β -香樹素。在上述方法中，在收集所述發酵產物後還包括如下步驟:離心所述發酵產物，收集沉澱，向所述沉澱中加入含20%的KOH和50%乙醇的裂解液，95°C處理15min ;再加入正己烷進行萃取，收集萃取產物，乾燥後溶解於氯仿，即得到α -香樹素和/或β -香樹素。本發明的實驗證明，本發明提供了一條密碼子優化後的水稻Sn0s0SC7基因的序列，將該序列所示的DNA分子在畢赤酵母中成功表達，得到重組畢式酵母，發酵重組畢式酵母，從發酵後的菌體中提取得到三萜化合物，並證明該三萜化合物為α -香樹素和/或β_香樹素。
圖1為重組酵母表達載體2為Sn0s0SC7的酵母細胞表達產物的GC-MS分析圖3為Sn0s0SC7產物的質譜
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、優化密碼子後的Sn0s0SC7基因的獲得根據NCBI 資料庫中已有的 0s06g28820/0s0SC7 的序列信息(GenBank AccessionNumber:KC416147，序列表中序列3，為未優化密碼子的基因序列)，根據畢赤酵母的密碼子偏好性信息，在不改變其推測蛋白序列的前體下，根據酵母高頻率的密碼子，設計了優化後新的Sn0s0SC7基因，其核苷酸序列為序列表中的序列I (優化了密碼子後基因序列)，該基因編碼的蛋白為0s0SC7，其胺基酸序列為序列表中的序列2。人工合成序列表中的序列1，將該序列所示的DNA分子克隆到克隆載體pGEM-T-EASY 的多克隆位點，得到 pGEM_Sn0s0SC7。人工合成序列表中的序列3，將該序列所示的DNA分子克隆到克隆載體pGEM-T-EASY的多克隆位點，得到pGEM_0s0SC7。實施例2、優化密碼子後的Sn0s0SC7基因的應用一、含有Sn0s0SC7的重組酵母的獲得1、酵母表達載體的構建1)用限制性內切酶Not I分別將實施例1得到的pGEM-Sn0s0SC7和pPICZA載體(Invitrogen，V19020)完全酶切。酶切體系為:5 μ g質粒、2.5 μ LlOX酶切緩衝液、I μ LNot I，加ddH20補充反應體系至50 μ L。酶切反應條件為:37°C酶切I小時。2)用瓊脂糖電泳對酶切產物進行分離，分別回收2.2kb左右的包含Sn0s0SC7的片段和3kb左右的pPICZA載體片段，分別溶解於20 μ L ddH20中。3)將步驟2)獲得的兩種片段進行連接反應。連接反應體系為:1 μ L T4DNA連接酶、2 μ LlOX連接酶緩衝液、3 μ L回收的包含Sn0s0SC7基因的DNA片段、I μ L pPICZA載體片段。連接反應條件為:4°C連接12小時。4)將連接反應的產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，用含有Zeocin的LB平板(Zeocin濃度為50ug/ml)進行篩選。5)將陽性克隆進行PCR鑑定，引物如下:5' AOX 引物:5' -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'；Sn0s0SC7 基因特異反向引物:5' -GATGGACCTAGCACCTGTGTA-3'。得到667bp的為陽性克隆，將陽性克隆提取質粒送去測序，該質粒為將序列表中的序列I所示的Sn0s0SC7基因插入pPICZA載體的Not I酶切位點間得到的載體，且Sn0s0SC7基因插入了 pPICZA，且方向正確，將該質粒命名為pPICZ_Sn0s0SC7，為重組酵母表達載體，其物理圖譜如圖1所示。按照上述方法利用pGEM_0s0SC7構建pPICZ_0s0SC7:將序列表中了 3所示的0s0SC7基因插入pPICZA載體的Not I酶切位點間得到的載體。2、含有Sn0s0SC7的重組酵母的獲得將重組酵母表達載體pPICZ_Sn0s0SC7轉入畢赤酵母菌株X-33 (InvitrogenC18000)中，得到重組酵母菌。重組酵母菌進行PCR鑑定，引物如下:5' AOX 引物:5' -GACTGGT TCCAATTGACAAGC-3'；Sn0s0SC7 基因特異反向引物:5' -GATGGACCTAGCACCTGTGTA-3'。得到667bp的為陽性重組酵母菌，命名為X-33/pPICZ_Sn0s0SC7。採用同樣的方法將空載體轉入畢赤酵母菌株X-33 (Invitrogen C18000)中，得到X-33/pPICZ。採用同樣的方法將pPICZ_0s0SC7轉入畢赤酵母菌株X-33 (Invitrogen C18000)中，得至|J X-33/pPICZ-0s0SC7。二、Sn0s0SC7在生產α -香樹素和β -香樹素中的應用1、含有Sn0s0SC7的重組酵母細胞的發酵產物的獲得種子液的獲得:在250ml培養瓶加入25ml的MGY培養基(1.34%酵母氮源，1%甘油，0.00004%生物素)，接種單個X-33/pPICZ-Sn0s0SC7細胞，30°C、250rpm振蕩培養，直到達到對數生長期(0D_=2-6)，大約16小時，得到種子液。發酵產物的獲得:將上述種子液離心(1500g、5min)收集細胞，棄上清液，用MM培養基(1.34%酵母氮源，0.00004%生物素，0.5%甲醇)重懸到OD600=L 0，大約200ml，得到懸浮液。把懸浮液轉到IL的長頸培養瓶，用2層無菌紗布蓋住培養72小時，每24小時添加一次100%的甲醇，使其甲醇的終濃度保持0.5%。培養72小時後，收集25ml的培養物，室溫下3000g離心3min,收集沉澱。向沉澱中加入2ml含20%的KOH和50%乙醇的裂解液(配方如下:0.4g氫氧化鉀、Iml無水乙醇和Iml蒸餾水)，95°C處理15min ;再加入2ml正己烷進行萃取，重複萃取一次，合併2次萃取產物，揮幹後溶解於100 μ I的氯仿，得到X-33/pPICZ-Sn0s0SC7提取產物。試驗設3個重複。以X-33/pPICZ、X-33/pPICZ_0s0SC7 和 X-33 為對照，得到 X-33/pPICZ 提取產物、X-33/pPICZ-0s0SC7提取產物和X-33提取產物。
2、發酵產物的鑑定分別取50 μ I X-33/pPICZ-Sn0s0SC7 提取產物、X-33/pPICZ 提取產物、X-33/pPICZ-0s0SC7提取產物和X-33提取產物，用氮氣吹乾後用25 μ I pyridine溶解，再加
50μ I BSTFA，在 80°C衍生化 I 小時，取 I μ L 用於 GC_MS(Agilent6890Gas Chromatograph)分析，毛細管柱為 DB-5 (Hewlett-Packard HP5, 35m length30.25mm diameter30.25mmthickness)。以 a -香樹素(sigma53017)和 β -香樹素(sigma09236)為標準品。結果見圖2 所示，X-33/pPICZ-Sn0s0SC7 提取產物(Sn0s0SC7)比 X-33/pPICZ 提取產物(pPICZ)在37.5和38.5min多了 2個色譜峰:產物I和產物2。這兩個產物的保留時間和標準品香樹素和α-香樹素一致。證明了 X-33/pPICZ-Sn0s0SC7可以生產β-香樹素和α-香樹素。X-33/pPICZ提取產物、X-33/pPICZ_0s0SC7提取產物(未進行密碼子優化)和X-33提取產物的結果無顯著差異，均沒有產物I和產物2。回收X-33/pPICZ_Sn0s0SC7提取產物中的產物I和產物2，用MS的檢測器在70eV能量下，以30次/秒的速度掃描，掃描區間為50-550U。將MS峰的數據和已知的三萜化合物資料庫比對，結果見圖3，標準品α-香樹素和β-香樹素的MS峰圖和本實驗獲得Sn0s0SC7產物的MS峰圖一致，表明Sn0s0SC7產物I為β -香樹素，產物2為α -香樹素。進一步證明X-33/pPICZ-Sn0s0SC7可以生產β -`香樹素和α -香樹素。
權利要求
1.一種DNA分子,是如下(I)-(3)中任意一種的DNA分子: (1)序列表中序列I所不的DNA分子； (2)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼與合成三萜化合物相關蛋白的DNA分子; (3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與合成三萜化合物相關蛋白的DNA分子。
2.有權利要求1所述DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
3.按權利要求2所述的重組載體，其特徵在於: 所述重組載體為將權利要求1所述DNA分子插入表達載體得到的載體；所述表達載體具體為酵母表達載體。
4.按權利要求2所述的重組菌，其特徵在於: 所述重組菌為將所述重組載體導入目的菌中得到的重組菌，所述目的菌具體為酵母菌；所述酵母菌進一步具體為畢赤酵母。
5.權利要求1所述DNA分子或權利要求2所述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在製備三萜化合物中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用 ，其特徵在於:所述三萜化合物為α-香樹素和/或β_香樹素。
7.一種製備三萜化合物的方法，為發酵權利要求2或4所述的重組菌，收集發酵產物，即得到三萜化合物。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於:所述三萜化合物為α-香樹素和/或β_香樹素。
全文摘要
本發明公開了一種優化三萜合酶編碼基因及其應用。本發明提供了DNA分子，是如下(1)-(3)中任一一種的DNA分子(1)序列表中序列1所示的DNA分子；(2)在嚴格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼合成三萜化合物相關蛋白的DNA分子；(3)與(1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且合成三萜化合物相關蛋白的DNA分子。本發明的實驗證明，本發明提供了一條密碼子優化後的水稻SnOsOSC7基因的序列，能用來製備三萜化合物α-香樹素和/或β-香樹素。
文檔編號C12P33/00GK103088042SQ20131000208
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月5日 優先權日2013年1月5日
發明者薛哲勇, 漆小泉, 孫俊聰, 段禮新 申請人:中國科學院植物研究所