應用畢赤酵母的pGAP調控表達轉酮醇酶的方法
2024-03-02 13:32:15
專利名稱：應用畢赤酵母的pGAP調控表達轉酮醇酶的方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及一種應用畢赤酵母的pGAP啟動子調控生產生物 蛋白的方法，具體是一種應用畢赤酵母的PGAP調控表達轉酮醇酶的方法。
背景技術：
轉酮醇酶(transketolase EC 2. 2. 1. 1)，亦稱轉羥乙醛酶或酮基移換酶。轉酮醇 酶廣泛存在於微生物界，現已知產轉酮醇酶的微生物有某些細菌、真菌和弧菌等。木糖是半 纖維素的主要組成成分，在植物纖維材料水解液中佔30%左右，是僅次於葡萄糖的自然界 最豐富的糖分。利用微生物發酵轉化木糖生產乙醇是當前的研究熱點之一。能夠高效釀酒 的微生物(例如釀酒酵母和運動發酵單孢菌)都不具備直接利用木糖生成酒精的能力，必 須經過系列酶的作用才能將木糖轉化成為能被釀酒微生物能夠利用生成酒精的物質，而轉 酮醇酶是這一系列的轉換木糖作用途徑中的關鍵酶。因此，轉酮醇酶在利用植物半纖維素 生成乙醇方面有意義。目前所應用的轉酮醇酶主要是以天然的含轉酮醇菌株進行發酵生產 的。但是，由於天然的轉酮醇酶菌株的生長緩慢，生產周期長，調控基因的啟動子的強度低 致使產物量少，使生產成本較高，不利於轉酮醇酶的規模化生產和利用。
畢赤酵母(Pichia pastoris)是最近迅速發展的一種真核表達宿主，營養要求不 高，適合於高密度發酵的大規模生產方式，由於Pichi即astoris分泌自身的蛋白很少，有 利於表達產物的純化。pGAP(三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子)是Pichia pastoris的組成型 強啟動子，與Pichia pastoris的pA0Xl (醇氧化酶1啟動子)相比其優越性主要是不需要 有毒性的甲醇作為碳源。
發明內容
本發明的目的是為解決應用天然的轉酮醇酶菌株的生長緩慢，營養要求較高，使 轉酮醇酶生產成本較高的問題，而提供一種應用畢赤酵母的PGAP(三磷酸甘油醛脫氫酶啟 動子)調控表達轉酮醇酶的方法。
本發明所採用的技術方案是 —種應用畢赤酵母的pGAP調控表達轉酮醇酶的方法，其步驟是
1、首先從畢赤酵母中擴增pGAP啟動子； 2、在轉酮醇酶序列的3'末端融合His6標籤，構建由pGAP調控轉酮醇酶基因的畢
赤酵母表達載體，並將這一載體轉化畢赤酵母基因組； 3、根據載體上所帶的抗性基因篩選高拷貝重組子作為工程菌株； 4、將工程菌株接種於含碳源的液體培養基中，於28 3(TC在生物反應器中發酵
工程菌1 2d分泌表達轉酮醇酶。所述液體培養基是由以下組分組成85%磷酸25
28ml/L，CaS04 *2H20 0. 8 1. 2g/L，K2S04 17 19g/L，MgS04 *7H20 13 16g/L，K0H 3. 5
4. 5g/L，碳源15 45g/L，蛋白腖18 22g/L，Yeast extract 8 12g/L，PTM43 5ml/L。
所述PTM4是由以下組分組成:CuS04 5H20 2. 0g/L， Nal 2H200. lg/L， MnS04 H20 3. 0g/L，Na2Mo04 2H20 0. 2g/L， H3B03 0. 02g/L， CoCl2 6H20 1. 05g/L， ZnCl2 7. 0g/L， Fe2 (S04) 3 7H20 22g/L，生物素0. 2g/L，硫酸lml/L。 所述碳源是甘油、油酸、山梨醇、葡萄糖、乳酸、甘氨酸、丙氨酸、海藻糖或甘露醇。 本發明採用了畢赤酵母的pGAP調控表達的轉酮醇酶，具有下列優點 1、生產成本低，只需使用普通的無機鹽、碳源和氮源作為發酵培養基。 2、可在生物反應器中發酵畢赤酵母，其細胞能生長至細胞密度達200A以上，能以
足夠多的細胞數量表達轉酮醇酶，有利於轉酮醇酶的大規模生產。 3、發酵周期短，整個發酵周期只需1 2d。 4、使用無毒性的碳源，不需要使用有毒性的甲醇作為碳源，無毒副作用。 5、由於pGAP是畢赤酵母的強啟動子，由pGAP調控表達的轉酮醇酶約佔總分泌蛋
白的比例較高，並且由於在轉酮醇酶的C端融合了His標籤，有利於產物的純化。
具體實施例方式
下面採用非限定性實施例對本發明作進一步說明。
實施例一 1、首先從Pichia pastoris中擴增pGAP啟動子； 2、在轉酮醇酶序列的3'末端融合His6標籤，構建由pGAP調控轉酮醇酶基因的 Pichia pastoris表達載體，並將這一載體轉化Pichiapastoris基因組；
3、根據載體上所帶的抗性基因篩選高拷貝重組子作為工程菌株；
4、將工程菌株菌液接種於液體培養基中液體培養基的配方(每升)85%磷酸 26. Oml， CaS04 2H20 0. 85g， K2S04 17. 5g， MgS04 7H20 13. 9g， KOH 3. 83g，甘油40g，蛋白 腖19g， Yeast extract 9g， PTM4微量元素3mlPTM4配方(每升)CuS04 5H20 2. Og， Nal 2H20 0. lg， MnS04 H20 3. Og， Na2Mo04 2H20 0. 2g， H萬O. 02g， CoCl2 6H20 1. 05g， ZnCl2 7. Og， Fe2 (S04) 3 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml，在生物反應器中進行發酵表達轉 酮醇酶。其發酵參數為溫度28t:，pH5.0，攪拌轉速300r/min。發酵2d後離心收穫上清進 行純化轉酮醇酶。通過蛋白電泳和酶活性測定對表達的轉酮醇酶進行鑑定(蛋白電泳證明 發酵表達的目標蛋白符合轉酮醇酶蛋白分子量，並且轉酮醇酶活性> ly/yg目標蛋白) 而證明本實施所獲得的產品是轉酮醇酶。
實施例二 1、首先從Pichia pastoris中擴增pGAP啟動子； 2、在轉酮醇酶基因序列的3'末端融合His6標籤，構建由pGAP調控轉酮醇酶基因 的Pichia pastoris表達載體，並將這一載體轉化Pichia pastoris基因組；
3、根據載體上所帶的抗性基因篩選高拷貝重組子作為工程菌株；
4、將工程菌株菌液接種於液體培養基中液體培養基的配方(每升)85%磷酸 26. 7ml， CaS04 2H20 0. 93g， K2S04 18. 2g， MgS04 7H20 14. 9g， KOH 4. 13g，油酸20g，蛋白 腖20g， Yeast extract 10g， PTM4微量元素4ml(PTM4配方(每升):CuS04 5H20 2. Og， Nal 2H20 0. lg， MnS04 H20 3. Og， Na2Mo04 2H20 0. 2g， H萬O. 02g， CoCl2 6H20 1. 05g， ZnCl2 7. Og， Fe2 (S04) 3 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml)，在生物反應器中進行發酵表達轉 酮醇酶。其發酵參數為溫度3(TC，pH5.0，攪拌轉速500r/min。發酵ld後離心收穫上清進行純化轉酮醇酶。通過蛋白電泳和酶活性測定對表達的轉酮醇酶進行鑑定(蛋白電泳證明 發酵表達的目標蛋白符合轉酮醇酶蛋白分子量，並且轉酮醇酶活性> lp/yg目標蛋白) 而證明本實施所獲得的產品是轉酮醇酶。
實施例三 1、首先從Pichia pastoris中擴增pGAP啟動子； 2、在轉酮醇酶基因序列的3'末端融合His6標籤，構建由pGAP調控轉酮醇酶基因 的Pichia pastoris表達載體，並將這一載體轉化Pichia pastoris基因組；
3、根據載體上所帶的抗性基因篩選高拷貝重組子作為工程菌株；
4、將工程菌株菌液接種於液體培養基中液體培養基的配方(每升)85%磷酸 27. 7ml， CaS04 2H20 1. 05g， K2S04 18. 2g， MgS04 7H20 15. 3g， K0H 4. 33g，山梨醇35g，蛋白 腖21g， Yeast extract 12g， PTM4微量元素4mlPTM4配方(每升)CuS04 5H20 2. 0g， Nal 2H20 0. lg， MnS04 H20 3. 0g， Na2Mo04 2H20 0. 2g， H萬O. 02g， CoCl2 6H20 1. 05g， ZnCl2 7. 0g， Fe2 (S04) 3 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml，在生物反應器中進行發酵表達轉 酮醇酶。其發酵參數為溫度28t:，pH5.0，攪拌轉速600r/min。發酵2d後離心收穫上清進 行純化轉酮醇酶。通過蛋白電泳和酶活性測定對表達的轉酮醇酶進行鑑定(蛋白電泳證明 發酵表達的目標蛋白符合轉酮醇酶蛋白分子量，並且轉酮醇酶活性> ly/yg目標蛋白) 而證明本實施所獲得的產品是轉酮醇酶。
實施例四 1、首先從Pichia pastoris中擴增pGAP啟動子； 2、在轉酮醇酶基因序列的3'末端融合His6標籤，構建由pGAP調控轉酮醇酶基因
的Pichia pastoris表達載體，並將這一載體轉化Pichia pastoris基因組； 3、根據載體上所帶的抗性基因篩選高拷貝重組子作為工程菌株； 4、將工程菌株菌液接種於液體培養基中液體培養基的配方(每升)85%磷酸
26. 5ml ， CaS04 2H20 0. 93g， K2S04 18. 5g， MgS04 7H20 15. 5g， K0H 4. 13g，葡萄糖40g，蛋白 腖22g， Yeast extract 12g， PTM4微量元素5mlPTM4配方(每升)CuS04 5H20 2. Og， Nal 2H20 0. lg， MnS04 H20 3. Og， Na2Mo04 2H20 0. 2g， H萬O. 02g， CoCl2 6H20 1. 05g， ZnCl2 7. Og， Fe2 (S04) 3 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml，在生物反應器中進行發酵表達轉 酮醇酶。其發酵參數為溫度28t:，pH5.0，攪拌轉速700r/min。發酵ld後離心收穫上清進 行純化轉酮醇酶。通過蛋白電泳和酶活性測定對表達的轉酮醇酶進行鑑定(蛋白電泳證明 發酵表達的目標蛋白符合轉酮醇酶蛋白分子量，並且轉酮醇酶活性> ly/yg目標蛋白) 而證明本實施所獲得的產品是轉酮醇酶。 實施例五 1、首先從Pichia pastoris中擴增pGAP啟動子； 2、在轉酮醇酶基因序列的3'末端融合His6標籤，構建由pGAP調控轉酮醇酶基因
的Pichia pastoris表達載體，並將這一載體轉化Pichia pastoris基因組； 3、根據載體上所帶的抗性基因篩選高拷貝重組子作為工程菌株； 4、將工程菌株菌液接種於液體培養基中液體培養基的配方(每升)85%磷酸
27. 5ml ， CaS04 2H20 1. 17g， K2S04 18. 7g， MgS04 7H20 15. 5g， KOH 4. 33g，乳酸30g，蛋白 腖20g， Yeast extract 10g， PTM4微量元素4mlPTM4配方(每升)CuS04 5H20 2. Og，Nal 2H20 0. lg， MnS04 H20 3. 0g， Na2Mo04 2H20 0. 2g， H萬O. 02g， CoCl2 6H20 1. 05g， ZnCl2 7. 0g， Fe2 (S04) 3 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml，在生物反應器中進行發酵表達轉 酮醇酶。其發酵參數為溫度3(TC，pH5.0，攪拌轉速800r/min。發酵ld後離心收穫上清進 行純化轉酮醇酶。通過蛋白電泳和酶活性測定對表達的轉酮醇酶進行鑑定(蛋白電泳證明 發酵表達的目標蛋白符合轉酮醇酶蛋白分子量，並且轉酮醇酶活性> ly/yg目標蛋白) 而證明本實施所獲得的產品是轉酮醇酶。
權利要求
一種應用畢赤酵母的pGAP調控表達轉酮醇酶的方法，其特徵在於，其步驟如下1)、首先從畢赤酵母中擴增pGAP啟動子；2)、在轉酮醇酶序列的3』末端融合His6標籤，構建由pGAP調控轉酮醇酶基因的畢赤酵母表達載體，並將這一載體轉化畢赤酵母基因組；3)、根據載體上所帶的抗性基因篩選高拷貝重組子作為工程菌株；4)、將工程菌株接種於含碳源的液體培養基中，於28～30℃在生物反應器中發酵工程菌1～2d分泌表達轉酮醇酶；所述液體培養基是由以下組分組成85％磷酸25～28ml/L，CaSO4·2H2O 0.8～1.2g/L，K2SO4 17～19g/L，MgSO4·7H2O 13～16g/L，KOH 3.5～4.5g/L，碳源15～45g/L，蛋白腖18～22g/L，Yeast extract 8～12g/L，PTM4 3～5ml/L；所述PTM4是由以下組分組成CuSO4·5H2O 2.0g/L，NaI·2H2O0.1g/L，MnSO4·H2O 3.0g/L，Na2MoO4·2H2O 0.2g/L，H3BO3 0.02g/L，CoCl2·6H2O 1.05g/L，ZnCl2 7.0g/L，Fe2(SO4)3·7H2O 22g/L，生物素0.2g/L，硫酸1ml/L。
2. 根據權利要求1所述的應用畢赤酵母的pGAP調控表達轉酮醇酶的方法，其特徵在 於所述碳源是甘油、油酸、山梨醇、葡萄糖、乳酸、甘氨酸、丙氨酸、海藻糖或甘露醇。
全文摘要
本發明屬生物技術領域，是一種應用畢赤酵母的pGAP調控表達轉酮醇酶的方法，首先從畢赤酵母中擴增pGAP啟動子；構建由pGAP調控轉酮醇酶基因的畢赤酵母表達載體，並將這一載體轉化畢赤酵母基因組；根據載體上所帶的抗性基因篩選高拷貝重組子作為工程菌株；將工程菌株接種於含碳源的液體培養基中發酵工程菌分泌表達轉酮醇酶。本發明生產成本低，發酵周期短，利用畢赤酵母的pGAP調控表達的轉酮醇酶有利於產物的純化，解決應用天然產轉酮醇酶的菌株生產異澱粉酶的成本較高、產物難於純化等的問題，有利於轉酮醇酶的大規模生產。
文檔編號C12N9/10GK101698835SQ20091020977
公開日2010年4月28日 申請日期2009年10月25日 優先權日2009年10月25日
發明者尹慧祥, 屈直, 張添元, 張愛聯, 羅進賢 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所