一種禾穀鐮刀菌的分子檢測方法及應用的製作方法
2024-04-05 19:46:05 1
專利名稱：一種禾穀鐮刀菌的分子檢測方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於作物病害診斷及防治技術領域，具體涉及一種禾穀鐮刀菌的分子檢測方法及應用。
二.
背景技術：
由鐮刀菌(Fusarium spp.) (Fusarium head blight,FHB)引起的小麥赤黴病是一種廣泛流行的世界性病害，主要發生於溫暖溼潤地區，是影響小麥高產、穩產和優質的重要因素之一。20世紀90年代以來，北美、歐洲、亞洲等地大麥、小麥赤黴病災情嚴重。我國南方長江中下遊冬麥區發生嚴重，隨著全球性氣候變暖、耕作制度以及耕作方式的改變，小麥赤黴病正向黃淮麥區、北方麥區以及西南和西北麥區擴展(Ma等，2008)，幾乎蔓延到所有小麥種植區。2003年，長江中下遊地區60-80%的麥區感染赤黴病，減產超過20%。2005 年，江蘇省赤黴病的發生面積為1800萬畝左右，佔全省總種植面積的72%。2011年，全國農業技術推廣服務中心預報全國赤黴病流行面積為6500萬畝。小麥赤黴病的發生與流行還帶來巨大的食品安全性隱患。鐮刀菌可以產生單端孢黴烯毒素(trichothecene)，人畜食用受赤黴病真菌毒素汙染的麵粉會發生嘔吐、腹瀉及食欲不振等急、慢性中毒症狀，嚴重者可導致死亡(陸維忠等，2001)。據美國估計，因此類毒素汙染所造成的直接經濟損失僅1991 1996年間就高達三億美元。我國、歐盟和美國、加拿大均要求麵粉、麵包、餅乾等食品中DON毒素的限量標準為1000 μ g/kg(Ippm) (Buerstmayr等，2009 ;GB 163四_1996)。因此，明確我國小麥赤黴病致病菌的種類與產毒類型，對開展小麥赤黴病防治與抗病育種都有重要的實踐意義。自20世紀40年代中國首次報導小麥赤黴病以來，國內外研究認為，禾穀鐮刀菌 (Fusarium graminearum Schwabe)是小麥赤黴病的主要致病菌之一，也是中國小麥赤黴病的優勢致病菌。近年來的研究表明，F. graminearum是一個含有許多特定種系的複合種(Fg Complex)，0』Donnell等(2004,2007)通過系統發生學分析，將Fg Complex劃分成13個特定的正式命名的種。根據該項研究結果，目前中國小麥赤黴病的致病菌，主要為禾穀鐮刀菌 (F. graminearum)和亞細亞鐮刀菌(F. asiaticum)，其中北方麥區如西北麥區和東北麥區， 年平均溫度低於15°C時，麥區赤黴病的優勢致病菌為禾穀鐮刀菌(Qu等，2008)。因此，快速、準確鑑定檢測禾穀鐮刀菌，有利於對北方麥區小麥赤黴病的防治。傳統的鐮刀菌鑑定方法主要通過形態學，如大分子生孢子、小分生孢子、原膜孢子等的形態來鑑定。但形態學鑑定方法繁瑣，沒有統一的規範標準，並且需要豐富的實踐經驗。隨著遺傳與分子生物學技術的迅速發展，分子標記也成為鑑定鐮刀菌的主要技術手段。 與常規的形態鑑定法相比，分子標記能準確、快速地從混合群體中鑑定出不同病菌類型，為準確、快速分析病菌的群體分布、特點和鑑定診斷提供新方法。Nicholson等(1998)找到了一對鑑定禾穀鐮刀菌的標記Fgl6F/R，但在擴增來自不同地區的禾穀鐮刀菌株時得到6種PCR產物，不能有效地區分菌株的種類。011等Q008) 利用該對引物，並結合AFLP標記，鑑定出Fgl6F/R擴增產物為類型1和AFLP擴增產物為類型A的菌株為禾穀鐮刀菌。由於AFLP標記操作繁瑣，且涉及到酶切和兩次PCR擴增等步驟， 難以在實際檢測中推廣應用。Yang等O008)利用氨連接酶基因的單核苷酸多態性(SNP) 設計了 4個引物試圖來區分Fgcomplex中的七個種，其中鑑定禾穀鐮刀菌需要擴增出536bp 和311bp等2條不同大小的條帶，並且還需要通過條帶的強弱進行輔助判斷，並不能真正滿足快速簡易檢測的要求。
三.
發明內容
本發明需要解決的問題是提供有效而容易獲得的方法鑑定禾穀鐮刀菌，使之可以直接從麥穗、種子、飼料中快速、靈敏、準確檢測出赤黴病致病菌禾穀鐮刀菌。本發明的技術方案為1.設計禾穀鐮刀菌檢測的特殊引物。2.禾穀鐮刀菌檢測體
系的建立。1.設計禾穀鐮刀菌檢測的特殊引物。根據禾穀鐮刀菌DNA序列的特性，設計了對禾穀鐮刀菌具有特異擴增作用的一對引物引物 15 『 -GAGTCCAAACCGGATACGTCACGCT-3 『和引物 25 『 -TGCGTACGAATTGCAGAAGATG TCC-3 『。2.禾穀鐮刀菌檢測體系的建立。a)提取病原菌基因組DNA ；b) PCR 反應體系 20 μ L，包括 DNA 10-20ng,2y L 10 X buffer, 1. 6μ L 2. 5mmol/ LdNTP, 1. 2μ L 25mmol/L MgCl2, 2. 5 μ mol/L 引物 1 禾口 2 各 2 μ L，1. OU Taq 酶，ddH20 補齊至 20 μ L ；PCR擴增條件為第一循環95°C預變性5min ；然後95°C變性45sec，6(TC退火30sec， 72°C延伸45sec，共35個循環；最後一個循環為72°C延伸lOmin，完成擴增，擴增產物4°C保存；c)PCR擴增產物在2%瓊脂糖凝膠中用IXTAE緩衝液中電泳分析，電壓為4-5V/ cm,電泳分離30min，經溴化乙錠染色後用凝膠成像系統分析；d)311bp處出現特異條帶，說明該病原菌為禾穀鐮刀菌。本發明的效果是本發明利用一對特異性很高的PCR引物，通過基本的PCR操作，利用PCR擴增產物的有無，鑑定我國北方麥區小麥赤黴病的優勢致病菌禾穀鐮刀菌，提供了一種直接從麥穗、種子、飼料中快速、準確、操作簡易的禾穀鐮刀菌檢測方法。與現有的禾穀鐮刀菌檢測方法相比，本發明的有益效果在於1.採用一對引物進行PCR擴增，操作步驟少，操作方法簡單；2. PCR擴增產物為一個特異性產物，不需要通過幾個產物或者多條條帶來鑑定菌株，利用本方法，能擴增出產物的即為禾穀鐮刀菌，擴增不出的即為其他菌株，測定結果簡單明了 ；3.本方法所需的DNA量較少，10-20ng的DNA即可檢測到結果，以確保從麥穗、種子、飼料中檢測出禾穀鐮刀菌。
四.
附圖1 對已知種型的菌株的PCR擴增鑑定結果M 分子量標準 50bp ； 1-5 泳道，禾穀鐮刀菌株:w316, w346, B156, B592, B755 ；6-10 泳道，禾穀鐮刀菌株:Fg820, M101, M83，M129，G12附圖2 對中國採集菌株的PCR擴增鑑定結果
M 分子量標準 IOObp ；1-12 泳道，亞細亞鐮刀菌株:0901，0914，0919，0920，0922， 0923,0924,0925,0950,0968,0978, 2S11 ；13-24 泳道，禾穀鐮刀菌株:0938,0943,0956, 0966,0822, Kll，2E22，2041，0825，2022，2R51，R82附圖3 對不同小麥產區麥粒的PCR擴增鑑定結果M 分子量標準IOObp ； 1-20泳道，江蘇泰州麥區(1_3)，安徽六安麥區，河南商城麥區(7-10)，湖北武漢麥區(11-13)，福建建陽麥區(14-16)，四川廣漢麥區(17-20) 採集的病麥粒；21-40泳道，江蘇淮安麥區01-23)，安徽合肥麥區0446)，河南桐柏麥區 07-30)，湖北襄樊麥區(31-33)，黑龍江哈爾濱麥區(34-36)，寧夏賀蘭麥區(37-40)採集的病麥粒
五.
具體實施例方式實施例1 已知種型的菌株的PCR擴增鑑定結果1.菌株的DNA提取亞細亞鐮刀菌株由湖北省農業科學院植保土肥研究所喻大昭研究員提供，禾穀鐮刀菌由荷蘭國際植物研究所Lee博士提供。分別挑取各菌株的菌絲在PDA培養基(去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml)上，培養3天，挑取新鮮菌絲用液氮凍幹並研磨粉碎用CTAB法(Siang，2004)提取DNA。取10_20ngDNA加入到PCR反應體系中。2.特異性引物的合成上遊引物5『 -GAGTCCAAACCGGATACGTCACGCT-3 『下遊引物5『 -TGCGTACGAATTGCAGAAGATGTCC-3 『由上海生工公司合成3. PCR擴增反應及擴增程序反應體系20 μ L，包括 DNA 10-20ng, 2 μ LlO Xbuffer, 1. 6 μ L2. 5mmol/L dNTTP, 1. 2μ L 25mmol/L MgCl2, 2. 5 μ mol/L 上遊及下遊引物各 2 μ L，1. OU Taq 酶，ddH20 補齊至 20 μ L ；PCR擴增條件為第一循環95°C預變性5min ；然後95°C變性45sec，6(TC退火30sec， 72°C延伸45sec，共35個循環；最後一個循環為72°C延伸lOmin，完成擴增，擴增產物4°C保存。4. PCR擴增產物的鑑定取8μ L PCR擴增產物在2%瓊脂糖凝膠中用IXTAE緩衝液中電泳分析，電壓為 4-5V/cm,電泳分離30min，經溴化乙錠染色後用凝膠成像系統分析擴增產物的大小判斷結^ ο實施結果禾Ij用本發明的特異性引物，以已知種型的菌株為模板，PCR擴增結果如圖1，1-5泳道擴增不出禾穀鐮刀菌特異性條帶，在6-10泳道擴增出禾穀鐮刀菌特異性條帶311bp，與已知結果相符合。實施例2 對中國採集菌株的PCR擴增鑑定結果1.菌株的DNA提取菌株採集自中國8個省、自治區(表1)。菌株的DNA提取、特異性引物的合成、PCR 擴增反應及擴增程序、PCR產物的鑑定同實施例1。
實施結果利用本發明的特異性引物，以中國採集的菌株為模板，PCR擴增結果如圖2，在 1-12泳道擴增不出禾穀鐮刀菌特異性條帶，13-M泳道擴增出禾穀鐮刀菌特異性條帶 311bp，與用其他鑑定方法獲得的結果相符合。表1本發明所採用的中國採集的鐮刀菌菌株
菌株編號種型來源寄主菌株編號種型來源寄主0901Kasiciticum建陽福建小麥0938F. gr amine arum桐柏河南小麥0914Kasiciticum六安安徽小麥0943Kgraminearum固始河南小麥0919Easiciticum東臺江蘇小麥0956Kgraminearum襄樊湖北小麥0920Kasiciticum鹽城江蘇小麥0966F.gramiriearum合肥安徽小麥0922Fasiaticum揚州江蘇小麥0822F. gr amine arum克山黑龍江小麥0923Kasiciticum泰州江蘇小麥KllF.gramiriearum淮安,江蘇小麥0924Easiciticum通州江蘇小麥2E22F.gramiriearum阜陽,安徽小麥0925Kasiciticum信陽河南小麥2041F.gramiriearum銀川,寧夏小麥0950Easiciticum襄樊湖北小麥0825F.gramiriearum哈爾濱，黑龍江小麥0968Kasiciticum泌陽河南小麥2022F.gramiriearum賀蘭,寧夏小麥0978Kasiaticum潢川河南小麥2R51F.gramiriearum哈爾濱，黑龍江小麥2S11Easiciticum廣漢四川小麥R82F.gramiriearum確山,河南小麥實施例3 對不同小麥產區麥粒的PCR擴增鑑定結果1.麥粒的DNA提取小麥麥粒分別採集自中國的江蘇省泰州和淮安麥區，安徽省六安和合肥麥區，河南省商城和桐柏麥區，湖北省襄樊和武漢麥區，福建建陽麥區，四川廣漢麥區，黑龍江哈爾濱麥區和寧夏賀蘭麥區。取病麥粒，用液氮凍幹並研磨粉碎，用CTAB法GhangJO(M)提取 DNA。取40-50ngDNA加入到PCR反應體系中。特異性引物的合成、PCR擴增反應及擴增程序、PCR產物的鑑定同實施例1。實施結果利用本發明的特異性引物，以中國麥區採集的麥粒為模板，PCR擴增結果如圖3， 在1-20泳道擴增不出禾穀鐮刀菌特異性條帶，21-40泳道擴增出禾穀鐮刀菌特異性條帶 311bp，與用其他鑑定方法獲得的結果相符合。
權利要求
1.一種禾穀鐮刀菌的分子檢測方法，其特徵在於由以下步驟構成(1)禾穀鐮刀菌檢測的特殊引物設計，根據禾穀鐮刀菌DNA序列的特性，設計了對禾穀鐮刀菌具有特異擴增作用的一對引物上遊引物5' -GAGTCCAAACCGGATACGTCACGCT-3『和下遊引物 5 『 -TGCGTACGAATTGCAGAAGATGTCC-3 『；(2)禾穀鐮刀菌檢測體系的建立，提取病原菌基因組DNA;PCR反應體系20 μ L，包括 DNA 10-20ng, 2μ L 10Xbuffer, 1. 6μ L 2. 5mmol/L dNTP, 1. 2μ L 25mmol/L MgCl2， 2. 5μπι01/1上遊及下遊引物各2yL，1.0 U Taq酶，(MH2O補齊至20 μ L ;PCR擴增條件為第一循環95°C預變性5min ；然後95°C變性45sec，60°C退火30sec，72°C延伸45sec，共 35個循環；最後一個循環為72°C延伸10 min，完成擴增，擴增產物4°C保存；PCR擴增產物在洲瓊脂糖凝膠中用Γ TAE緩衝液中電泳30min，電壓為4-5V/cm，電泳結束後用凝膠成像系統分析；311bp處出現特異條帶，說明該病原菌為禾穀鐮刀菌。
2.2.權利要求1所述禾穀鐮刀菌的分子檢測方法在禾穀鐮刀菌的鑑別或禾穀鐮刀菌在農作物或飼料汙染監控中的應用。
全文摘要
本發明屬於作物病害診斷與防治技術領域，具體涉及一種禾穀鐮刀菌的分子檢測方法及應用。該方法利用自行設計的一對PCR特異擴增引物，可從中國和國外採集到的鐮刀菌中檢測分離得到禾穀鐮刀菌的特異片段，該片段全長為311bp。本發明可直接從麥穗、種子、飼料中快速、靈敏、準確檢測出赤黴病致病菌禾穀鐮刀菌。
文檔編號C12R1/77GK102382899SQ201110428400
公開日2012年3月21日 申請日期2011年12月19日 優先權日2011年12月19日
發明者餘桂紅, 周永進, 孫曉波, 張旭, 王磊, 陳健華, 馬鴻翔 申請人:江蘇省農業科學院