不同抗性水稻品種上褐飛蝨體內類酵母共生菌的檢測方法
2024-03-26 04:59:05 1
不同抗性水稻品種上褐飛蝨體內類酵母共生菌的檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種不同抗性水稻品種上褐飛蝨體內類酵母共生菌的檢測方法。選取不同抗性水稻上的褐飛蝨，以體內的類酵母共生菌為研究對象，結合變性梯度凝膠電泳(DGGE)與螢光定量PCR(qPCR)技術進行定量檢測。三種抗性水稻品種分別為：ASD7(bph2)、RH(Bph3)、Mudgo(Bph1)。檢測的類酵母共生菌為Noda菌(Hypomyceschrysospermus)、季也蒙畢赤酵母(Pichiaguilliermondii)、假絲酵母(Candidaquercitrusa)。本發明利用DGGE和qPCR技術檢測了褐飛蝨體內三種類酵母共生菌在不同抗性水稻品種上的變化規律，為明確褐飛蝨在適應抗性品種過程中其體內共生菌的變化規律提供了新的技術手段，對探明飛蝨防治的新途徑起到了至關重要的作用。
【專利說明】不同抗性水稻品種上褐飛蝨體內類酵母共生菌的檢測方法
【技術領域】[0001]本發明通過結合變性梯度凝膠電泳與螢光定量PCR技術對不同抗性水稻品種上褐飛蝨體內類酵母共生菌的變化規律進行研究，屬於基因工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]褐飛蝨是我國及東南亞水稻上最主要的害蟲之一，該蟲為單食性害蟲，不僅通過產卵或者刺吸水稻韌皮部汁液造成直接傷害，而且通過傳播病毒病造成間接傷害，培育和推廣抗性品種是遏制褐飛蝨肆意繁殖和危害的優先策略；但是長期種植抗性水稻品種導致飛蝨產生新的致害性，而把已經產生新致害性的飛蝨轉移到其他品種的水稻上強迫飼養數代後，飛蝨的致害性即發生變化。
[0003]有研究推測褐飛蝨致害性的轉變可能與飛蝨體內的共生菌有關，褐飛蝨體內存在著類酵母共生菌(Yeast-like Symbiotes, YLS),是飛風體內的優勢菌群。YLS主要聚集在腹部脂肪體和卵中，並隨卵傳遞給下一代。YLS還參與氮素循環，為寄主提供胺基酸、固醇類物質以及蛋白質等多種營養成分，並對稻飛蝨生長、發育、繁殖、致害性變化等方面起到重要作用。
[0004]研究發現，取食抗性水稻品種後飛蝨體內共生菌的數量急劇下降，特別是在適應抗性品種過程中的第二代，是此過程的關鍵世代，體內共生菌的數量達到最低，到第三代時，共生菌的數量開始回升。在正常情況下，取食感蟲品種TN1的生物型1雌成蟲的體重、生長速度和產卵量均顯著高於取食抗性水稻品種的雌成蟲。因此明確褐飛蝨在適應抗性品種過程中其體內共生菌的變化規律對飛蝨致害性的變異至關重要。
[0005]然而，褐飛蝨體內的類酵母共生菌由於生存環境較為特殊，難以進行體外培養。傳統研究褐飛蝨體內類酵母共生菌的變化規律的手段主要是基於顯微觀察法，但這種方法效率低且準確性差。
【發明內容】
[0006]為了克服現有技術的不足，本發明提供了一種不同抗性水稻上褐飛蝨體內類酵母共生菌的檢測方法。
[0007]褐飛蝨是一種重要的農業害蟲。研究發現褐飛蝨對不同品種抗性水稻的適應性與其體內的類酵母共生菌有密切的聯繫，明確褐飛蝨體內類酵母共生菌的變化規律對飛蝨的防治起了至關重要的作用。尚未見有關利用分子生物學技術分析不同抗性水稻品種上褐飛蝨體內類酵母共生菌變化的研究報導。
[0008]一種不同抗性水稻品種上褐飛蝨體內類酵母共生菌的檢測方法，選取不同抗性水稻品種上的最初8個世代的褐飛蝨，針對多種類酵母共生菌，結合變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)與突光定量 PCR(Real_timeQuantification PCR, qPCR)技術進行定量檢測。
[0009]所述的水稻品種中，抗性水稻品種為ASD7(如AJ?) MBph3)、Mudgo (辦力7)，感蟲水稻品種為TN1。
[0010]所述的類酵母共生菌為Abt/a菌{Hypomyces chrysospermus)、季也蒙畢赤酵母{Pichia guilliermondii) >{Candida querci trusa) 0 [0011]所述的方法，過程如下:
1)分別取三種抗性水稻品種及一種感蟲水稻品種上的最初8個世代剛羽化的褐飛蝨，對所述的褐飛蝨的脂肪體中的類酵母共生菌進行分離純化，提取基因組；
2)根據多種菌株的ISSrDNA的特徵序列設計引物，以上述提取的基因組為模板進行PCR擴增；
3)利用變性梯度凝膠電泳與螢光定量PCR技術對多種菌株的變化規律定量分析。
[0012]利用結合DGGE和qPCR技術明確了三種類酵母共生菌在褐飛蝨適應抗性品種上最初8代的變化規律:在適應的過程中三種共生菌的數量急劇下降，在第二代時三種共生菌的數量均達到最低，到第三代時，共生菌的數量開始回升，之後共生菌的數量趨於平緩。三種共生菌的數量在同一世代不同抗性水稻上的變化不盡相同，Pi chi a gui lli ermondi i和Candida querci trusa在同一世代不同抗性水稻之間的差異不顯著，但是Hypomyceschrysospermus在三種抗性水稻上的差異顯著，特別是在抗性水稻品種Mudgo上,與其他兩種抗性水稻品種相比差異顯著。另外對三種菌在三種抗性水稻品種的原始拷貝數分析，發MiHypomyces chrysospermus 在三種共生菌中數量最多，其次是gui lli ermondi i,最後是 Candida querci trusa。
[0013]本發明的有益效果:
本發明利用DGGE和qPCR技術分別檢測了三種類酵母共生菌在褐飛蝨適應三種抗性水稻品種上最初八個世代的變化規律，為今後研究類酵母共生菌與褐飛蝨對不同抗性水稻品種適應以及探索新的防治途徑提供了有效的技術手段。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1是辦菌在三種抗性水稻品種上的褐飛風體內變化規律的 DGGE 圖；A: Mudgo, B: ASD7、C:RH。
[0015]圖2 ^kPichia gui lli ermondi i菌在三種抗性水稻品種上的褐飛風體內變化規律DGGE 圖；A: Mudgo、B: RH、C:ASD7。
[0016]圖3是菌在三種抗性水稻品種上的褐飛風體內變化規律DGGE 圖；A: RH、B: Mudgo、C:ASD7。
[0017]圖4A是Hypomyces chrysospermus菌在抗性水稻品種ASD7上特異序列擴增的標準曲線。
[0018]圖4B是Hypomyces chrysospermus菌在抗性水稻品種RH上特異序列擴增的標準曲線。
[0019]圖4C ^kHypomyces chrysospermus菌在抗性水稻品種Mudgo上特異序列擴增的標準曲線。
[0020]圖5A iPichia gui lli ermondi i菌在抗性水稻品種ASD7上特異序列擴增的標準曲線。
[0021 ] 圖5B ^kPichia gui lli ermondi i菌在抗性水稻品種RH上特異序列擴增的標準曲線。
[0022]圖5C iPichia gui lli ermondi i菌在抗性水稻品種Mudgo上特異序列擴增的標準曲線。
[0023]圖6A是Candida querci trusa菌在抗性水稻品種ASD7上特異序列擴增的標準曲線。
[0024]圖現是Candi da querci trusa菌在抗性水稻品種RH上特異序列擴增的標準曲線。
[0025]圖6C是Candida querci trusa菌在抗性水稻品種Mudgo上特異序列擴增的標準曲線。
[0026]圖7A是Hypomyces chrysospermus菌在抗性水稻品種ASD7上特異序列擴增的熔解曲線。
[0027]圖7B良Hypomyces chrysospermus菌在抗性水稻品種RH上特異序列擴增的熔解曲線。
[0028]圖^kHypomyces菌在抗性水稻品種Mudgo上特異序列擴增的熔解曲線。
[0029]圖8A ^kPichia gui lli ermondi i菌在抗性水稻品種ASD7上特異序列擴增的熔解曲線。
[0030]圖8B ^kPichia guilliermondii菌在抗性水稻品種RH上特異序列擴增的熔解曲線。
[0031]圖8C ^kPichia gui `lli ermondi i菌在抗性水稻品種Mudgo上特異序列擴增的熔解曲線。
[0032]圖9A是Candida querci trusa菌在抗性水稻品種ASD7上特異序列擴增的熔解曲線。
[0033]圖視是Candi da querci trusa菌在抗性水稻品種RH上特異序列擴增的熔解曲線。
[0034]圖9C是Candida querci trusa菌在抗性水稻品種Mudgo上特異序列擴增的熔解曲線。
[0035]具體實施方法
以下結合附圖和【具體實施方式】對本發明做進一步的說明。
[0036]實施例1:用DGGE技術分別對三種抗性水稻品種(ASD7、RH、Mudgo)上褐飛蝨三種舊 Qiypomyces chrysospermus 鬼、Pichia guilliermondii |if> Candida querci trusa 舊、的半定量分析。
[0037]取在感蟲品種TN1，抗性品種ASD7 (8個世代)、RH (8個世代)、Mudgo (8個世代)上剛羽化的雌成蟲各100頭，75%酒精表面消毒3次，每次3min，無菌水漂洗3次，每次3min。對其脂肪體中的類酵母共生菌進行分離純化，並提取基因組。以上述提取的基因組為模板，擴增所用引物為依據利用DGGE實驗中獲得的3種菌18SrDNA序列設計的引物310F/310R(Hypomyces chrysospermus), 305F/305R {Pichia guilliermondii ), 248F/248R {Candidaquerci trusa),為了崔i高DGGE的檢測效率，在三對上遊引物的5』端添加約40個鹼基的GC夾子(表1)。
[0038]表1三種菌的引物序列
【權利要求】
1.一種不同抗性水稻品種上褐飛蝨體內類酵母共生菌的檢測方法，其特徵在於，選取不同抗性水稻品種上的最初8個世代的褐飛蝨，針對多種類酵母共生菌，結合變性梯度凝膠電泳與螢光定量PCR技術進行定量檢測。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的水稻品種中，抗性水稻品種為ASD7 {bph2)、RH {Bph3)、Mudgo {Bphl)，感蟲水稻品種為 TN1。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的類酵母共生菌為艙山菌Qiypomyces chrysospermus)、季也蒙畢赤酵母 ipichia gui Hi ermondi i)、假絲酵母{Candida quercitrusa) 0
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，過程如下: 1)分別取三種抗性水稻品種及一種感蟲水稻品種上的最初8個世代剛羽化的褐飛蝨，對所述的褐飛蝨的脂肪體中的類酵母共生菌進行分離純化，提取基因組； 2)根據多種菌株的ISSrDNA的特徵序列設計引物，以上述提取的基因組為模板進行PCR擴增； 3)利用變性梯度凝`膠電泳與螢光定量PCR技術對多種菌株的變化規律定量分析。
【文檔編號】C12Q1/04GK103555821SQ201310358301
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年8月17日 優先權日:2013年8月17日
【發明者】俞曉平, 馬正, 曹偉, 侯雲, 邊亞琳, 郝培應, 許益鵬, 申屠旭萍 申請人:中國計量學院