鑑別新的酶相互作用化合物的方法

2024-04-03 05:16:05 1

專利名稱：：鑑別新的酶相互作用化合物的方法鑑別新的酶相互作用化合物的方法
技術領域：
：本發明涉及使用與固體支持物結合的酶配體表徵酶或酶-化合物複合物的方法。藥物發現的目標是，開發有效且安全的藥物。為了達到該目標，藥物研究的目的是，優選地鑑別指向已知是目標疾病的成因的藥物靶物的小分子藥物。通常，大多數小分子藥物指向受體蛋白(細胞膜受體例如G蛋白偶聯的受體(GPCR)或核激素受體)，離子通道和酶。在酶中，特別感興趣的是例如蛋白酶，磷酸二酯酶和激酶(綜述Drews，2000，"Drugdiscovery:ahistoricalperspective"，Science287，1960-1964)。蛋白酶被視作易掌控的藥物靶物，如HIV蛋白酶抑制劑對AIDS的有效治療或血管緊張素轉化酶抑制劑治療高血壓的應用所證實的。關於癌症的治療，正在開發指向基質金屬蛋白酶和胱天蛋白酶的蛋白酶抑制劑(Docherty等，2003，"Proteasesasdrugtargets"，BiochemicalSocietySymposia70，147-161)。磷酸二酯酶(PDE)包含催化cAMP或cGMP的水解的酶家族，並涉入許多疾病。PDE5抑制劑昔多芬(Viagra)提供對勃起功能障礙的有效治療。目前，用作抗炎治療劑的PDE4抑制劑(例如cilomast和roflumast)正在臨床試驗中。該領域的一項巨大挑戰是，PDE同種型特異性抑制劑的開發，以便避免引起副作用的交叉反應性(Card等，2004，"Structuralbasisfortheactivityofdrugsthatinhibitphosphodiesterases"，Structure12，2233-2247)。激酶會催化蛋白、脂質、糖、核苷和其它細胞代謝產物的磷酸化，並在真核細胞生理學的所有方面起關鍵作用。蛋白磷酸化是常見的蛋白翻譯後修飾，會以許多方式影響蛋白結構和功能。已經成為近期藥物開發焦點的一種激酶類別包含蛋白激酶，因為它們被證實通過信號轉導途徑的失調，在腫瘤的起始和進展中起重要作用(肺癌中的EGF受體；乳腺癌中ErbB2/Her-2受體的過表達；白血病中的BCR-ABL融合蛋白；綜述Blume-Jensen和Hunter,2001，"Oncogenickinasesignaling"，Nature411,355-365)。在人基因組中編碼的蛋白激酶的互補物包含518個家族成員(kinome)，它們根據序列相似性可以分成幾個亞家族(綜述Manning等，2002，TheProteinKinaseComplementoftheHumanGenome,Science298，1912-1934)。在任意給定的細胞或組織中，僅僅表達kinome子集。激酶會將來自ATP的磷酸基轉移給底物分子，從而影響它們的靶物的穩定性、活性和功能。不同激酶的ATP結合袋在結構上是相似的，因此認為難以開發選擇性的ATP-竟爭性抑制劑。激酶家族是一個非常大的酶家族(與作為藥物靶物有關的其它酶類別例如磷酸二酯酶相比)，其會提供藥物開發的許多機會，但是也會提供獨有的挑戰(較大的家族大小；ATP結合袋的結構相似性；高細胞內ATP濃度)(綜述Cohen,P.，2002，Proteinkinases-themajordrugtargetsofthetwenty-firstcenturyNatureReviewsDrugDiscovery,volume1,309-315)。感興趣的另一種激酶類別是脂質激酶。脂質激酶會催化Y-磷酸基從三磷酸核苷向脂質底物的轉移。已知脂質激酶例如磷酸肌醇3-激酶(PI3K)家族成員是對生長因子、激素和神經遞質的細胞應答的調控劑，並參與癌症、糖尿病和其它疾病(Fruman等，1998.Phosphoinositides.AnnualReviewBiochemistry67，481-507;Cantley，L.C.,2002，Science296,1655-1657)。鑑別與蛋白(例如酶)相互作用的化合物的一個前提是，提供含有儘可能多的一種類別的高純度蛋白的蛋白製品。更具體地，提供一種類別(例如激酶)的許多蛋白是重要的，因為這會實現針對該蛋白家族的許多成員篩選潛在地藥學上令人感興趣的化合物(所謂的擊中鑑別)。這樣的蛋白製品的其它可行的用途包括，測試化學上優化的化合物(先導優化)，測定給定化合物的選擇性(選擇性表徵)以及證實給定化合物的作用模式。在本領域，已經提出了評價該問題的幾種策略。從細胞提取物富集ATP-結合蛋白例如激酶和其它核苷酸-結合蛋白的一個方案，依賴於作為親和試劑的固定化的ATP，即依賴於結合潛在地所有ATP-結合酶的配體的應用。在該情況下，通過藉助於連接物將Y-磷酸基偶聯到樹脂上，共價地固定化ATP(Graves等，2002，MolecularPharmacology62，No.61364-1372;US5536822)。該方案進一步擴展成，偶聯組合化合物文庫的單一化合物(WO00/63694)。固定化的ATP的一個缺點是，對激酶的親和力相當低，導致激酶的無效捕獲，或由於高解離速率而迅速洗脫。另一個缺點是，不會優先捕獲激酶，還捕獲可在細胞中以高得多的水平表達的其它類別的ATP-結合蛋白。更豐富的ATP-結合蛋白可以由於竟爭而造成無效捕獲，或可以在對結合的蛋白的質鐠分析過程中導致問題(如果分析深度不足的話)。本領域描述的另一個方案是，使用對單一酶特異性的配體，即高親和力和高選擇性的激酶抑制劑或親近衍生物(例如優化的藥物)。它們用於從細胞裂解物富集激酶，相同的未修飾的化合物用於特異性洗脫，以便鑑別細胞藥物靶物(Godl等，Proc.Natl.Acad.Sci.100，15434-15439;W02004/013633)。僅僅在藥物的化學修飾未破壞結構-親和力-關係(SAR)時，該方案是成功的，但是如果SAR受損，則失敗。另外，難以鑑別介導不希望的副作用的靶物，因為同源藥物靶物和副作用-把物的SAR可能是不同的，後者的SAR通常是未知的。另一個策略是給定類別的酶例如激酶的體外表達。Fabian等人(Fabian等，2005，NatureBiotechnology23(3)，329-336;WO03084981)描述了一種激酶表徵方法，它不依賴於捕獲在細胞裂解物中包含的內源激酶，而是使用在噬菌體T7上展示的激酶。在該測定中使用的激酶(或激酶域)是經標記以便進行表達、純化和檢測的融合蛋白。在竟爭結合測定中，將這些噬菌體標記的激酶結合到固定化的激酶抑制劑上，用未固定化的實驗化合物處理，並使用謹菌體DNA作為模板，通過實時PCR定量結合的標記的激酶。該方法的一個缺點是，需要克隆激酶，僅僅一部分噬菌體-標記的激酶摺疊成正確的天然狀態。此外，這樣的蛋白製品根本不會反映細胞中的天然情形。另一個方案使用活性部位定向探針(所謂的基於活性的探針)，其會與靶酶形成共價連接。該方法用於使用高選擇性的探針表徵絲氨酸水解酶的表達(Liu等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.96，14694-14699，W001/77668)，並使用由羅丹明-和生物素-標記的螢光磺酸酯的非基於定向活性的探針文庫組成的更廣鐠的探針，進一步擴展到其它酶家族(Adam等，2002,NatureBiotechnology20，805-809，WO01/77684，WO03/047509)。但是，仍然不清楚這些磺酸酯乾向酶共有的結構和/或催化性質。該方案的另一個限制是，難以區分與酶的特異性相互作用和由探針的固有反應性造成的非特異性相互作用。最後，嘗試了通過酪氨酸特異性的抗體富集在酪氨酸上磷酸化的蛋白(Blogoev等，2004，NatureBiotechnology9，1139-1145)。Blogoev等人描述了可以用於研究表皮生長因子(EGF)等化合物對磷酸酪氨酸-依賴型信號轉導途徑的影響的方法。裂解EGF-刺激的細胞後，通過用針對磷酸酪氨酸的抗體的免疫沉澱，富集含有磷酸酪氨酸的蛋白。在第二步中，分析這些富集的蛋白，並通過質譜分析進行鑑別。該方案的一個主要限制是，僅能捕獲在酪氨酸上磷酸化的蛋白。鑑於此，需要改進的表徵在細胞中表達的給定類別的酶的方法。此外，需要改進的鑑別作為給定化合物的結合伴侶的酶的方法。本發明滿足了這些需要。在本發明的上下文中，已經令人驚奇地發現，至少一種固定化在固體支持物上的廣譜酶配體的應用，會實現酶從蛋白製品、優選細胞裂解物的有效分離。分離後，可以應用有效的方法來表徵結合到廣鐠酶配體上的酶，或鑑別化合物酶相互作用。優選地通過質鐠法鑑別酶。因此，本發明提供了用於表徵酶或鑑別給定化合物的結合伴侶的有效方法。在第一個方面，本發明提供了表徵至少一種酶的方法，其包括下述步驟a)提供含有該酶的蛋白製品，優選地通過收穫至少一個含有該酶的細胞，和裂解該細胞，b)在允許酶結合廣譜酶配體的條件下，在基本上生理條件下使蛋白製品接觸至少一種固定化在固體支持物上的所述廣鐠酶配體，c)洗脫酶，和d)通過質鐠法表徵洗脫的酶。在第二個方面，本發明提供了表徵至少一種酶的方法，其包括下述步驟a)提供2份等分試樣，其各自包含至少一個含有該酶的細胞，b)將一份等分試樣與給定化合物溫育，c)收穫細胞，d)裂解細胞，e)在允許酶結合廣鐠酶配體的條件下，在基本上生理條件下使蛋白製品接觸至少一種固定化在固體支持物上的所述廣譜酶配體，f)洗脫酶，和g)通過質譜法表徵洗脫的酶。根據本發明的第三個方面，本發明提供了表徵至少一種酶的方法，其包括下述步驟a)提供含有該酶的蛋白製品的2份等分試樣，優選地通過收穫至少一個含有該酶的細胞，和裂解該細胞，b)在允許酶結合廣譜酶配體的條件下，在基本上生理條件下使一份等分試樣接觸至少一種固定化在固體支持物上的所述廣譜酶配體，c)在允許酶結合廣i普酶配體的條件下，在基本上生理條件下使另一份等分試樣接觸至少一種固定化在固體支持物上的所述廣譜酶配體和接觸給定化合物，d)洗脫酶，和e)通過質譜法表徵洗脫的酶。根據本發明的第四個方面，提供了表徵酶-化合物複合物的方法，其包括下述步驟a)提供含有該酶的蛋白製品，優選地通過收穫至少一個含有該酶的細胞，和裂解該細胞，b)在允許酶結合廣i普酶配體的條件下，在基本上生理條件下使蛋白製品接觸至少一種固定化在固體支持物上的所述廣鐠酶配體，c)使結合的酶接觸化合物，以釋放至少一種結合的酶，和d)通過質鐠法表徵釋放的酶，或e)從配體洗脫酶，和通過質i普法表徵酶，從而鑑別該化合物的一種或多種結合伴侶。上述方案，尤其是根據第四個方面的本發明的方法，具有下述優點一不需要酶的體外表達，而是使用來自細胞裂解物的內源酶。-令人驚訝地發現，廣特異性激酶配體會非常有效地捕獲激酶。-不需要連接或固定實驗化合物(無標記的測定方法)。-使用任意的目標化合物(未修飾的，未固定化的)，可以進行竟爭結合或洗脫。-不需要酶底物(如在生化酶測定中需要)。-可以表徵化合物對信號轉導途徑的體內作用(見第二方面)。一可以鑑別直接和間接的靶物。在本發明中，術語"酶"也包括細胞中能結合配體的每一種蛋白或肽，所述配體例如轉運蛋白，離子通道和與酶相互作用的蛋白例如含有肽相互作用域(例如SH2，SH3，和PDZ域)的接頭蛋白。但是，優選地，術語"酶"以它的常用方式解釋為細胞中的生物催化劑。在本發明中，術語"廣譜酶配體，，指，能結合有些(但不是全部)存在於蛋白製品中的酶的配體。本發明優選地涉及表徵酶或鑑別給定化合物的結合伴侶的方法，其中所述酶或結合伴侶包含在細胞裂解物中。但是，本發明的方法也可以用任意蛋白製品作為原料來實現，只要蛋白溶於製品中。實例包括幾種蛋白的液體混合物，含有原始細胞中存在的並非全部蛋白的部分細胞裂解物，或幾種細胞裂解物的組合。通過首先分離細胞器(例如細胞核，線粒體，核糖體，高爾基體等)，然後製備源自這些細胞器的蛋白製品，可以得到部分細胞裂解物。分離細胞器的方法是本領域已知的(Chapter4.2PurificationofOrganellesfromMammalianCells,見"CurrentProtocolsinProteinScience"，編者John.E.Coligan，BenM.Dunn,HiddeL.Ploegh，DavidW.Speicher，PaulT.Wingfield;Wiley,ISBN:0-471-14098-8)。另外，通過分部分離細胞提取物，從而富集特定類型的蛋白，例如胞質或膜蛋白，可以製備蛋白樣品(Chapter4.3SubcellularFractionationofTissueCultureCells見"CurrentProtocolsinProteinScience"，Editors:John.E.Coligan,BenM.Dunn,HiddeL.Ploegh，DavidW.Speicher,PaulT.Wingfield;Wiley,ISBN:0-471-14098-8)。此外，可以使用來自體液(例如血液，腦脊液，腹水和尿)的蛋白製品o在本發明中，術語"固體支持物"指能將所述廣譜酶配體固定化到它的表面上的每種不溶支持物。根據第二個方面的本發明的方法包括下述起始步驟提供各自包含至少一個含有該酶的細胞的2份等分試樣，和將一份等分試樣與給定化合物溫育。在一個優選的實施方案中，所述至少一個細胞是細胞培養系統的一部分，其分成至少2份等分試樣。然後將一份等分試樣的細胞與給定化合物溫育。將細胞培養系統與化合物溫育的方法是本領域已知的(Giuliano等，2004，"High-contentscreeningwithsiRNAoptimizesacellbiologicalapproachtodrugdiscovery:definingtheroleofp53activationinthecellularresponsetoanticancerdrugs"JournalofBiomolecularScreening9(7)，557-568)。但是，本發明也包括，每份等分試樣的至少一個細胞是體內系統(例如小鼠系統或低級脊推動物系統)的一部分。例如，可以使用源自模型生物體(例如美麗線蟲)的限定發育階段的全胚胎裂解物或成年階段。另外，完整器官(例如從小鼠切離的心臟)可以是蛋白製品的來源。這些器官也可以體外灌注，並用實驗化合物或目標藥物處理。在優選的實施方案中，本發明的所有方法至少包括下述步驟收穫至少一個含有該酶的細胞，和裂解該細胞。在一個優選的實施方案中，細胞是細胞培養系統的一部分，從細胞培養系統收穫細胞的方法是本領域已知的(文獻同上)。細胞的選擇主要取決於要分析的酶的類別，因為必須確保該類酶主要存在於選擇的細胞中。為了確定給定的細胞是否是本發明方法的合適起始系統，蛋白印跡、基於PCR的核酸檢測方法、RNA印跡和DNA-微陣列方法("DNA晶片")等方法可能是合適的，以便確定給定類別的酶是否存在於細胞中。細胞的選擇也受研究目的的影響。如果需要鑑別給定藥物的體內靶物，則需要選擇其中發生希望的治療效果的細胞或組織(例如，對於抗癌藥物，是乳腺癌組織)。相比之下，為了闡明介導不希望的副作用的蛋白靶物，需要分析其中觀察到副作用的細胞或組織(例如，對於CNS副作用，是腦組織)。此外，在本發明中預見到，含有酶的細胞可以從生物體得到，例如通過活組織檢查。對應的方法是本領域已知的。例如，活組織檢查是用於得到小量組織的診斷方法，該小量組織然後可以顯微鏡檢查或用生化方法檢查。活組織檢查對於疾病的診斷、分類和分期是重要的，對於評價和監測藥物治療也是重要的。乳腺癌活組織檢查以前作為手術操作進行，但是現在優選針吸活組織檢查(0yama等，20(M，BreastCancer11(4)，339-342)。所述的本發明的方法允許表徵組織樣品中酶類別的存在。例如，可以鑑別造成疾病的突變酶(例如激活致癌激酶的點突變)。另外，可以解釋在治療過程中產生的、且導致治療抗性的突變酶(例如造成對抗癌藥物的抗性的EGF-受體突變)。肝活組織檢查用於例如診斷慢性肝病的原因，所述慢性肝病導致肝大或由升高的肝酶活性造成的異常肝檢驗結果(Rocken等，2001，Liver21(6)，391-396)。本發明包括，通過收穫至少一個細胞，同時進行裂解。但是，同樣優選地，首先收穫細胞，然後單獨裂解。裂解細胞的方法是本領域已知的(Karwa和Mitra:Samplepreparationfortheextraction,isolation,andpurificationofNucleiAcids;chapter8見"SamplePreparationTechniquesinAnalyticalChemistry"，Wiley2003，編者SomenathMitra,printISBN:0471328456;onlineISBN:0471457817"。用勻漿器(例如Potter-勻漿器)，超聲磨碎機，酶裂解，去汙劑(例如NP-40，TritonX-IOO，CHAPS,SDS)，滲透壓休克，重複凍融，或這些方法的組合，可以實現不同細胞類型和組織的裂解。此外，本發明的所有方法包括下述步驟，在允許酶結合廣譜酶配體的條件下，在基本上生理條件下使細胞製品或細胞裂解物接觸至少一種固定化在固體支持物上的所述廣譜酶配體。在基本上生理條件下的接觸具有下述優點，即配體、細胞製品(即要表徵的酶)和任選地化合物之間的相互作用會儘可能多地反映天然條件。"基本上生理條件"尤其是，在原始的、未加工的樣品材料中存在的那些條件。它們包括生理蛋白濃度、pH、鹽濃度、緩衝容量和涉及的蛋白的翻譯後修飾。術語"基本上生理條件"不要求與樣品來源的原始活生物體中的條件相同的條件，但是基本上細胞-樣條件或接近細胞條件的條件。本領域技術人員當然會認識到，由於最終會導致不那麼細胞-樣條件的實驗設置，可能產生某些約束。例如，當從活生物體採取和加工樣品時，最後必需的細胞壁或細胞膜的破碎，可能需要與在生物體中發現的生理條件不完全相同的條件。用於實現本發明方法的生理條件的適當變化，是本領域技術人員顯而易見的，且包含在本文使用的術語"基本上生理條件，，中。總之，應當理解，術語"基本上生理條件"涉及，接近生理條件的條件，例如在天然細胞中發現的條件，但是不一定要求這些條件完全相同。優選地，"基本上生理條件，，可以包含50-200mMNaCl或KC1，pH6.5-8.5，20-45"C，和0.001-10mM二價陽離子(例如Mg++，Ca++，);更優選約150mNaCl或KC1，pH7.2-7.6，5mM二價陽離子，經常包括0.Ol-l.0%非特異性蛋白(例如BSA)。可經常存在非離子型去汙劑(Tween，NP-40，Triton-XlOO)，通常是約0.001-2%,典型地0.05-0.2%(體積/體積)。作為一般指南，下面的緩沖含水條件可能是適用的10-250mMNaCl，5-50mMTrisHC1，pH5-8，任選地加入二價陽離子和/或金屬螯合劑和/或非離子型去汙劑。優選地，"基本上生理條件"指pH6.5-7.5，優選7.0-7.5，和/或緩衝濃度10_50mM，優選25-50mM，和/或單價鹽(例如Na或K)濃度120-170mM，優選150mM。二價鹽(例如Mg或Ca)還可以以1-5mM、優選l-2mM的濃度存在，其中更優選地，緩沖液選自:Tris-HCl或HEPES。在本發明的上下文中，術語"在允許酶結合廣譜酶配體的條件下"包括可能發生這樣的結合的所有條件。這包括在固定化相上具有固體支持物和將裂解物倒於它上面的可能。在另一個優選的實施方案中，也包括固體支持物是顆粒形式，並與細胞裂解物相混合。在一個優選的實施方案中，配體和酶之間的結合是非共價的、可逆的結合，例如通過鹽橋、氫鍵、疏水相互作用或其組合。另外，本發明的方法包括從固定化在固體支持物上的配體洗脫酶的步驟。這樣的方法在原理上是本領域已知的，取決於配體酶相互作用的性質。原則上，離子強度的變化、pH值、溫度或與去汙劑的溫育，是從固定化的配體解離靶酶的合適方法。洗脫緩沖液的應用，可以通過極端的pH值(高或低pH;例如使用0.1M檸檬酸鹽pH2-3降低pH)、離子強度的變化(例如使用Nal，KI，MgCl2，或KCl的高鹽濃度)、破壞疏水相互作用的極性降低劑(例如二噁烷或乙二醇)、或變性劑(離液鹽或去汙劑例如十二烷基石克酸鈉，SDS;綜述SubramanianA.，2002，Immunoaffinitychromatography.Mol.Biotechnol.20(1)，41-47)，解離結合伴侶。使用這些相當非特異性方法，可以釋放大多數或所有結合的蛋白，然後需要通過質鐠法分析(或者，通過用抗體檢測，見下文)。根據本發明第四個方面的方法還包括下述步驟使結合的酶接觸化合物，以釋放至少一種結合的酶。該接觸優選地也在基本上生理條件下進行。使用目標化合物進行洗脫(而不是上述非特異性試劑)的一個優點是，不會釋放出所有結合的蛋白，而只釋放出亞級分，優選目標酶類別。結果，需要通過質i普法鑑別更少的蛋白，導致對目標酶類別更快的分析和更深的分析深度(靈敏度)。熟練的技術人員會明白，在本發明方法的各個步驟之間，洗滌步驟可能是必需的。這樣的洗滌是本領域技術人員知識的一部分。洗滌用於從固體支持物去除細胞裂解物中未結合的組分。通過加入低水平的去汙劑或通過適度調節洗滌緩衝液的鹽濃度，可以使非特異性的(例如單純離子的)結合相互作用最小化。洗脫或接觸後，在有些情況下，優選地將固體支持物與釋放的物質分離。用於該目的的各個方法取決於固體支持物的性質，且是本領域已知的。如果支持物材料包含在柱內，釋放的物質可以收集為柱流出物。在支持物材料與裂解物組分相混合的情況下(所謂的批式操作)，額外的分離步驟(例如輕輕離心)可能是必需的，釋放的物質可以收集為上清液。或者，磁珠可以用作固體支持物，使得珠子可以使用磁力裝置從樣品中消除。根據本發明，優選地通過質譜法表徵根據本發明第四個方面的方法洗脫的酶或共同洗脫的結合伴侶(見下文)以及釋放的酶。或者，在本發明中，也可以用針對各酶或共同洗脫的結合伴侶的特異性抗體進行該表徵。用質譜分析(質譜法)鑑別蛋白，是本領域已知的(Shevchenko等，1996，AnalyticalChemistry68:850-858，(Mann等，2001，Analysisofproteinsandproteomesbymassspectrometry,AnnualReviewofBiochemistry70，437-473)，並在實施例部分進一步解釋。作為質譜分析的替代方案，可以使用針對目標蛋白的特異性抗體檢測洗脫的酶(包括共同洗脫的結合伴侶，例如酶亞基或支架蛋白)。此外，在另一個優選的實施方案中，一旦已經通過質譜分析確認洗脫的酶的身份，可以用針對該酶的特異性抗體檢測每種目標酶。合適的基於抗體的測定包括、但不限於蛋白印跡，ELISA測定，夾心ELISA測定和抗體陣列或其組合。這樣的測定的建立，是本領域已知的(Chapter11，Immunology,pagesll-lto11-30in:ShortProtocolsinMolecularBiology.FourthEdition,EditedbyF.M.A應bel等，Wiley,NewYork,1999)。平行地使用幾種抗體，可以進行多個測定，例如針對酶家族的多個成員(Pelch等，KinetworksProteinKinaseMultiblotanalysis-Chapter8，pages99-112in:CancerCellSignalling.MethodsandProtocols.Editor:DavidM.Terrian.HuraanaPress,Totowa，USA,2002)。這些測定不僅可以以檢測和定量目標酶的方式構建，而且可以以分析翻譯後修飾模式(例如砩酸化)的方式構建。例如，通過用特異性的抗-磷酸酪氨酸、抗-磷酸絲氨酸或抗-磷酸蘇氨酸抗體探測它的磷酸化狀態，可以測定激酶的激活狀態。本領域已知如何選擇和使用這樣的抗-磷酸抗體(Zhang等，2002.JournalofBiologicalChemistry277，43648-43658)。根據第二個方面的本發明方法的一個優選實施方案，通過表徵酶，可以確定化合物的施用是否會導致酶的差異表達或激活狀態。因此，通過施用化合物，可以改變酶的表達，或可以改變酶的激活狀態。在上下文中，酶表達的變化可優選地指，在細胞中產生更多或更少的酶。激活狀態的變化優選地指，施用化合物後酶的活性更高，或施用化合物後酶的活性更低。也可以指，酶對固定化的配體的親和力升高或降低(例如通過上遊激酶對其的磷酸化，激酶激活狀態的變化；或化合物向酶變構調節側的結合，從而改變ATP-結合酶的ATP-結合袋的構象)。根據第一個方面的本發明方法的一個優選實施方案，優選地在基本上生理條件下，將蛋白製品與下面定義的化合物溫育。結果，僅僅不結合化合物的酶隨後結合到配體上，洗脫，並表徵。根據本發明第三個方面的方法的一個優選實施方案，在步驟c)中，優選地在基本上生理條件下，使等分試樣接觸化合物，然後與配體溫育。結果，僅僅不結合化合物的酶隨後結合到配體上，洗脫，並表徵。在根據第三個方面的本發明方法的一個優選實施方案中，檢測到與化合物溫育的等分試樣中酶的減少，表明該酶是該化合物的直接靶物。這源自下述事實，即在本發明方法的步驟c)中，化合物會與配體竟爭向酶的結合。如果在與化合物溫育的等分試樣中檢測到更少的酶，這優選地意味著，化合物與抑制劑竟爭與酶的相互作用，因此是酶的直接靶物，反之亦然。根據第四個方面的本發明方法的一個優選實施方案，該方法作為中或高處理量篩選來實現。這樣的測定是本領域技術人員已知的(Mallari等，2003，Agenerichigh-throughputscreeingassayforkinases:proteinkinaseAasanexample,JournalofBiomolecularScreeing8,198-204;Rodems等，2002，AFRET-basedassayplatformforultra-highdensityscreeningofproteinkinasesandphosphatases,AssayandDrugDevelopmentTechnologies1(IPTI)，9-19)。對根據本發明第二、三和四個方面的方法必要的是，提供認為會與酶相互作用的化合物。原則上，根據本發明，這樣的化合物可以是能與酶相互作用的每種分子。優選地，化合物對酶有作用，例如刺激或抑制作用。優選地，所述化合物選自合成的或天然存在的化合物或有機合成藥物，更優選小分子，有機藥物或天然小分子化合物。優選地，所述化合物從含有這樣化合物的文庫開始鑑別。然後，在本發明的過程中，篩選這樣的文庫。這樣的小分子優選地不是蛋白或核酸。優選地，小分子的分子量小於5000Da，更優選小於2000Da，更優選小於1000Da，最優選小於500Da。根據本發明的"文庫"指以分類方式提供的(許多)不同化學實體的集合(主要是大集合)，其能實現對不同單個實體的快速功能分析(篩選)，並同時提供構成文庫的單個實體的快速鑑別。實例是試管或表面上的孔或點的集合，它們含有化合物，後者可以加入與一種或多種確定的潛在相互作用伴侶的高處理量方式的反應中。鑑別出兩種伴侶的希望的"陽性"相互作用後，由於文庫構建，可以快速鑑別各個化合物。合成和天然起源的文庫可以購買，或由熟練技術人員設計。文庫構建的實例提供在，例如，BreinbauerR，MangerM，ScheckM，WaldmannH.Naturalproductguidedcompoundlibrarydevelopment.CurrMedChem.2002Dec;9(23):2129—45，其中描述了天然產物，它們是生物學上驗證過的設計組合文庫的起點，因為它們具有經證實的生物相關性記錄。參考關於通過結構生物學和生物信息學得到的蛋白的域結構的新知識，可以解釋天然產物在藥物化學和化學生物學中的這種特殊作用。為了滿足域家族內各個結合袋的特殊要求，可能必須通過化學變化來優化天然產物結構。據稱固相化學是該優化過程的有效工具，在該綜述文章中，強調了該領域的最新進展。其它相關文獻包括EdwardsPJ，MorrellAI.Solid-phasecompoundlibrarysynthesisindrugdesignanddevelopment.CurrOpinDrugDiscovDevel.2002Jul;5(4):594—605.;MerlotC，DomineD，ChurchDJ.Fragmentanalysisinsmallmoleculediscovery.CurrOpinDrugDiscovDevel.2002May;5(3):391-9.Review;Good謂RAJr.Currentpracticesingenerationofsmallmoleculenewleads.JCellBiochemSuppl.2001;Suppl37:13-21;它描述說，許多製藥公司的當前藥物開發過程需要巨大的且日益增多的高質量先導結構集合，用於高處理量篩選測定中。在過去，已經通過幾種方式獲得具有不同結構和"藥物-樣"性質的小分子集合通過以前的內部先導物優化工作的記錄，通過從化合物供應商購買，和通過公司合併後單個集合的聯合。儘管高處理量/組合化學被描述成屬於新先導物產生方法中的重要組分，用於合成和隨後設計文庫成員的文庫設計的選擇，已經演化到新水平的挑戰和重要性。針對多種生物學耙物篩選多個小分子化合物文庫設計的潛在益處，會提供大量發現新的先導結構可以在常規酶測定中，測試可以從固定化的配體洗脫靶酶的實驗化合物(本發明的第四方面)。在下面，描述了示例性的測定，其可以用於進一步表徵這些化合物。這些測定的描述無意限制本發明的範圍。蛋白酶測定可以如下進行示例性的蛋白酶測定在適當條件下，使蛋白酶接觸用螢光(例如EDANS)和猝滅劑生色團(例如DABCYL)雙標記的肽底物，和檢測切割後螢光的增加。底物含有接近肽的一端的螢光供體和接近另一端的受體基團。這類底物的螢光最初通過供體和受體之間的分子內螢光共振能轉移(FRET)淬滅。當蛋白酶切割底物時，產物從淬滅釋放出來，供體的螢光變得明顯。螢光信號的增加與水解的底物的量成正比(Taliani，M.etal，1996，Methods240:60-7)。磷酸二酯酶測定可以在合適的緩沖液中製備人白細胞(U937)的細胞裂解物，並用作PDE酶的來源。用[3H]cAMP作為底物，在溫育緩沖液(50mMTris-HCl，ph7，5，5mMMgC12)中在25t:溫育20分鐘後，定量[3H]腺苷(Cortijo的機會。等，1993，BritishJournalofPharmacology108，562-568)。蛋白激酶的體外酶活性測定簡而言之，可以用酪氨酸激酶(例如Lck)、ATP和抗-磷酸酪氨酸抗體溫育螢光素-標記的肽底物。隨著反應的進行，砩酸化的肽會結合抗-磷酸酪氨酸抗體，導致極化信號的增加。抑制激酶的化合物會產生低的極化信號。或者，可以以改進的間接方式構建測定。發螢光的磷酸肽用作與抗-磷酸-酪氨酸抗體形成複合物的示蹤劑，產生較高的極化信號。當未標記的底物被激酶磷酸化時，產物與發螢光的磷酸化的肽竟爭抗體。發螢光的肽然後從抗體釋放進溶液，導致極化信號的喪失。直接和間接測定都可以用於鑑別蛋白酪氨酸激酶活性的抑制劑(Seethala，2000，Methods22，6卜70;Seethala和Menzel，1997，Anal.Biochem.253,210-218;Seethala和Menzel,1998，Anal.Biochem.255，257-262)。通過用抗-磷酸絲氨酸或抗-磷酸蘇氨酸抗體替代抗磷酸酪氨酸抗體，可以將該螢光極化測定修改得適合用於蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶(Turek等，2001，Anal.Biochem.299，45-53，PMID11726183;Wu等，2000，J.Biomol.Screen.5，23-30，PMID10841597)。可以進一步優化在根據本發明第四個方面的方法中鑑別出的化合物(先導物優化)。因為在這些先導物產生文庫中編碼的結構_活性關係(SAR)信息，這樣的化合物的隨後優化經常被加速。由於用於隨後合成的高處理量化學(HTC)方法的適用性，經常會促進先導物優化。優選地，先導物優化得到根據本發明第二個、第三個和第四個方面的方法的支持，更優選地得到根據第四個方面的方法的支持。這些方法的結果，可以為藥物化學家或本領域其它技術人員提供關於如何在例如選擇性方面進一步優化化合物的指導。這樣的文庫的一種用途最終描述在，例如，WakelingAE，BarkerAJ，DaviesDH，BrownDS，GreenLR，CartlidgeSA，WoodburnJR.Specificinhibitionofepidermalgrowthfactorreceptortyrosinekinaseby4-ani1inoquinazolines.BreastCancerResTreat.1996;38(1):67-73。根據本發明可以表徵的酶，優選地選自激酶，磷酸酶，蛋白酶，磷酸二酯酶，氫化酶，脫氫酶，連接酶，異構酶，轉移酶，乙醯化酶，脫乙醯基酶，GTP酶，聚合酶，核酸酶和解旋酶。優選地，蛋白是激酶，更優選蛋白激酶。同樣優選地，蛋白是脂質激酶。如上面已經指出的，本發明的要點是，配體是能結合給定酶類別中的多種不同(但不是所有的)酶的廣鐠配體。優選地，配體會結合給定酶類別中的IO-50%、更優選30-50%的酶。優選地，配體是酶的抑制劑。在一個更優選的實施方案中，酶是激酶，配體是激酶抑制劑。優選地，該激酶抑制劑選自雙巧l咪基馬來醯亞胺VIII，PurvalanolB，CZC0畫7324(可連接的PD173955)，CZC畫08004。其它配體包括吲哚配體91，喹唑啉配體32和修飾的星形孢菌素(見實施例5-7)。在圖3中給出了吲哚配體91(5-[5-氟-2-氧-l，2-二氫-吲哚-(3Z)-亞基曱基]-2，4-二甲基-lH-吡咯-3-甲酸(3-氨基-丙基)-醯胺)的結構。該化合物是在結構上類似於激酶抑制劑Sutent(SU112W;Sun等，2003.J.Med.Chem.46，1116-1119)的分子。吲哚配體91可以通過伯氨基共價偶聯到合適的固體支持物材料上，且可以用於分離結合蛋白。在實施例l中，描述了吲哚配體91的合成。根據本發明，表述"丐l咮配體91"也包括下述化合物，其包含相同的核，但是具有另一種連接物，優選地偶聯到不屬於環狀結構一部分的NH基團上，用於連接固體支持物。通常，連接物具有8，9或10個原子的主鏈。連接物含有羧基-或氨基-活性基團。根據另一個優選的實施方案，通過表徵酶的共同洗脫的結合伴侶、酶亞基或酶的翻譯後修飾，進行酶的表徵。該優選實施方案的基礎是，由於在配體和酶之間結合的過程中使用基本上生理條件，優選地可以保持酶的天然條件，這包括結合伴侶、酶亞基或翻譯後修飾的存在。在質語(MS)幫助下，不僅可以鑑別酶，而且可以鑑別共同洗脫的結合伴侶、酶亞基或所述翻譯後修飾。根據本發明的另一個優選的實施方案，通過鑑別酶或酶結合伴倡的proteotypic肽，進行質鐠(MS)表徵。proteotypic肽的概念在實施例部分詳細描述。其想法是，用蛋白酶消化洗脫的酶或結合伴倡，通過MS測定產生的肽。結果，來自相同來源蛋白的肽的肽頻率有很大程度的差異，最經常觀察到的"通常"促成該蛋白的鑑別的肽稱作"proteotypic肽"。因此，在本發明中使用的proteotypic肽是在實驗中非常容易觀察到的肽，其會獨特地鑑別特定蛋白或蛋白同種型。根據一個優選的實施方案，通過對比對酶或結合伴侶得到的proteotypic肽和已知的proteotypic肽，進行表徵。因為當4吏用蛋白酶消化製備的片段在MS中鑑別蛋白時，通常對於特定酶觀察到相同的proteotypic肽，可以對比對特定才羊品得到的proteotypic肽和特定酶類別中的酶的已知proteotypic肽，並從而鑑別樣品中存在的酶。優選地，以定量方式進行質i普分析，例如通過使用iTRAQ技術(用於相對和絕對定量的同量異序標記)或cICAT(可切割的同位素-編碼的親和標記)(Wu等，2006.J.ProteomeRes.5，651-658)。根據另一個優選的實施方案，固體支持物選自瓊脂糖，改性瓊脂糖(modifiedagarose)，瓊脂糖(sepharose)珠子(例如NHS-活化的瓊脂糖)，膠乳，纖維素，和亞鐵-或鐵磁性顆粒。廣譜酶配體可以共價或非共價地偶聯到固體支持物上。非共價結合包括通過生物素親和配體結合，後者結合到鏈黴抗生物素基質上。優選地，廣鐠配體共價偶聯到固體支持物上。偶聯之前，基質可以含有活性基團，例如NHS,碳化二亞胺等，以實現與化合物的偶聯反應。通過直接偶聯(例如使用官能團例如氨基-，巰基-，羧基-，羥基-，醛-，和酮基)和通過間接偶聯(例如通過生物素，共價結合在化合物上的生物素，和生物素與直接結合在固體支持物上的鏈黴抗生物素的非共價結合)，可以將化合物偶聯到固體支持物上。與固體支持物材料的連接，可以包含可切割的和不可切割的連接物。切割可以通過酶切割或適當化學方法處理來實現。目標化合物結合固體支持物材料的優選結合界面是含有c-原子主鏈的連接物。通常，連接物具有8，9或10個原子的主鏈。根據要偶聯的化合物，連接物含有羧基-或氨基-活性基團。使用廣鐠配體的組合，可以更完全地覆蓋酶類別。優選地，使用1-10、更優選l-6、更優選l-4種不同配體。最優選地，使用3或4種不同配體。在使用超過一種配體的情況下，每種配體優選地在不同支持物上。但是，同樣優選地，當使用超過一種配體時，在一個固體支持物上存在至少2種或所有不同的配體。在使用超過一種配體的情況下，優選地每種單獨配體可以結合的譜範圍是不同的，從而可以達到酶類別的最大覆蓋。優選地，每種配體會結合給定酶類別中的10-50%、更優選30-50%的酶。根據另一個優選的實施方案，通過表徵酶或化合物酶複合物，可以確定細胞中酶類別的全部或幾個成員的身份。這是由於下述事實，即通過將配體與細胞裂解物溫育，可以分離潛在地所有能結合配體的酶，並隨後表徵。根據酶的表達i普，配體能結合酶類別的全部或幾個成員，從而可以鑑別它們。在激酶的情況下，本發明的方法有助於熟練的技術人員鑑別和表徵在給定細胞中表達的kinome。在本發明中，優選地化合物不同於配體，儘管不排除同一性。本發明還涉及生產藥物組合物的方法，其包括下述步驟a)根據本發明第四個方面的方法鑑別酶化合物複合物，和b)將化合物配製成藥物組合物。因此，本發明提供了製備藥物組合物的方法，其可以以有效量施用給受試者。在一個優選方面，治療劑是基本上純化的。待治療的受試者優選地是動物，包括但不限於牛、豬、馬、雞、貓、狗等動物，優選哺乳動物，最優選人。在一個具體的實施方案中，非-人哺乳動物是受試者。總體而言，本發明的藥物組合物包含治療有效量的治療劑和藥學上可接受的載體。在一個具體的實施方案中，術語"藥學上可接受的"指被聯邦或政府機關的管理部門所批准，或列在美國藥典或其它公認的藥典中，用於動物，更特別是用於人。術語"載體"指與治療劑一起施用的稀釋劑，輔劑，賦形劑，或介質。這樣的藥物載體可以是無菌的液體，例如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的那些，包括但不限於花生油，大豆油，礦物油，芝麻油等。當經口施用藥物組合物時，水是優選的載體。當靜脈內地施用藥物組合物時，鹽水和含水右旋糖是優選的載體。鹽水溶液和含水右旋糖和甘油溶液優選地用作可注射溶液的液體栽體。合適的藥物賦形劑包括澱粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明膠，麥芽，稻米，麵粉，白堊，矽膠，硬脂酸鈉，單硬脂酸甘油酯，滑石，氯化鈉，脫脂奶粉，甘油，丙烯，乙二醇，水，乙醇等。如果需要，組合物還可以含有小量的潤溼劑或乳化劑，或pH緩衝劑。這些組合物可以採取溶液、混懸劑、乳劑、片劑、丸劑、膠嚢、粉末、持續釋放製劑等的形式。利用傳統的粘合劑和載體，例如甘油三酯，可以將組合物配製成栓劑。經口製劑可以包括標準的載體例如藥物級甘露醇，乳糖，澱粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，纖維素，碳酸鎂等。合適的藥物載體的實例記載在E.W.Martin的"Remington'sPharmaceuticalSciences",這樣的組合物含有治療有效量的治療劑，優選純化的形式，以及合適量的載體，以便提供適於施用給患者的形式。製劑應當適合施用模式。在一個優選的實施方案中，根據常規方法，將組合物配製成適於靜脈內地施用給人類的藥物組合物。典型地，靜脈內施用的組合物是在無菌等滲水性緩衝液中的溶液。當需要時，組合物也可以包括增溶劑和局部麻醉劑，例如利多卡因，以緩解注射部位的疼痛。通常，單獨分開地或在單位劑型中混合在一起地供應成分，例如，作為在密封容器中的凍乾粉末或無水濃縮物，所述容器例如指示活性劑的量的安瓿或藥囊(sachette)。當要通過輸注施用組合物時，可以用含有無菌藥用級水或鹽水的輸液瓶分配它。當通過注射施用組合物時，可以提供一安瓿的無菌注射用水或鹽水，以便可以在施用前混合各成分。本發明的治療劑可以配製成中性或鹽形式。藥學上可接受的鹽包括與游離羧基形成的那些，例如源自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的羧基；與游離胺基團形成的那些，例如源自異丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇，組氨酸，普魯卡因等的胺基團，和源自鈉、鉀、銨、鈣和鐵氫氧化物等的那些。將有效地治療特定障礙或狀況的本發明的治療劑的量，取決於障礙或狀況的性質，且可以通過標準的臨床技術來確定。另外，可以任選地採用體外測定，以輔助鑑別最佳劑量範圍。在製劑中使用的準確劑量，也依賴於施用途徑，疾病或障礙的嚴重性，且應當根據操作人員的判斷和每位患者的情況來決定。但是，靜脈內施用的合適的劑量範圍通常是約20-500微克活性化合物/千克體重。鼻內施用的合適的劑量範圍通常是約0.01Pg/kg體重至lmg/kg體重。從源自體外或動物模型實驗系統的劑量-效應曲線，可以外推有效劑量。一般而言，栓劑可以含有0.5%-10%(重量)的活性成分；經口製劑優選地含有10°/。-95°/。活性成分。已知多種輸送系統，且可以用於施用本發明的治療劑，例如包封在脂質體，微粒，和微膠嚢中；使用能表達治療劑的重組細胞，使用受體-介導的胞吞作用(例如，Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.262:4429-4432);構建作為逆轉錄病毒或其它栽體的一部分的治療核酸等。導入方法包括但不限於皮內的，肌肉內的，腹膜內的，靜脈內的，皮下的，鼻內的，硬膜外的和經口的途徑。通過任何方便的途徑，例如通過輸注，通過快速推注，通過經上皮或黏膜皮膚內襯(例如，口腔的，直腸的和腸的黏膜等)的吸收，可以施用化合物，且可以與其它生物活性劑一起施用。施用可以是全身的或局部的。另外，可能需要通過任何合適的途徑，包括腦室內的和鞘內的注射，將本發明的藥物組合物導入中樞神經系統；通過腦室內的導管，例如其連接到儲器，例如0mmaya儲器，可以促進腦室內注射。也可以釆用肺施用，例如，通過使用吸入器或或噴霧器，並與霧化劑一起配製。在一個具體的實施方案中，可能需要將本發明的藥物組合物局部地施用到需要治療的區域。這可以通過下述方式實現例如但不限於，在手術過程中局部輸注，局部應用，例如手術後與創傷敷料相聯合，通過注射，藉助導管，藉助栓劑，或藉助植入物，所述植入物是多孔的，無孔的，或凝膠狀的材料，包括膜，例如sialastic膜，或纖維。在一個實施方案中，施用可以是通過在惡性腫瘤或腫瘤組織或腫瘤發生前組織的部位(或先前部位)直接注射。在另一個實施方案中，可以在囊泡、尤其脂質體中輸送治療劑(Langer，1990，Science249:1527-1533;Treat等，1989，見LiposomesintheTherapyofInfectiousDiseaseandCancer,Lopez-Berestein和Fidler編，Liss，NewYork,第353-365頁；Lopez-Berestein，同上，第317-327頁；總見上文)在另一個實施方案中，通過控釋系統，可以輸送治療劑。在一個實施方案中，可以4吏用泵(Langer,同上；Sefton，1987，CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14:201-240;Buchwald等，1980，Surgery88:507-516;Saudek等，1989,N.Engl.J.Med.321:574-579)。在另一個實施方案中，可以使用聚合材料(MedicalApplicationsofControlledRelease,Langer和Wise編，CRCPress,BocaRaton,Florida,1974;ControlledDrugBioavailability,DrugProductDesignandPerformance,Smolen和Ball編,Wiley,NewYork,1984;Ranger和Peppas，1983，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61;Levy等，1985，Science228:190-192;During等，1989，Ann.Neurol.25:351-356;Howard等，1989，J.Neurosurg.71:858-863)。在另一個實施方案中，控釋系統可以置於治療靶物(即腦)附近，從而僅僅需要全身劑量的一小部分(例如，Goodson，1984，見MedicalApplicationsofControlledRelease,同上，Vol.2，第115-138頁)。在Langer(1990，Science249:1527-1533)的綜述中，討論了其它控釋系統。在一個優選的實施方案中，該方法還包括調節化合物對酶的結合親和力的步驟。這可以通過本領域技術人員已知的方法來實現，例如通過化合物多種不同殘基的化學修飾，和隨後分析化合物與酶的結合親和力。本發明還涉及至少一種固定化在固體支持物上的廣鐠酶配體在至少一種酶或酶-化合物複合物的表徵中的應用。關於本發明的該應用，上面為本發明的方法描述的所有實施方案也適用。下面附圖和實施例進一步解釋了本發明，它們不應當視作限制本申請權利要求賦予的保護範圍。附圖簡述圖1:kinobead配體的結構。在實施例1中描述了配體的來源和合成途徑。圖la:Kinobead配體1(雙吲咮基馬來醯亞胺VIII)圖lb:Kinobead配體2(PurvalanolB)圖lc:Kinobead配體3(CZC00007324,(7-(4-氨基甲基-苯基氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-I-曱基-IH-[1，6]萘啶-2-酮))圖Id:Kinobead配體4(CZC00008004，2-(4'-氨基甲基苯基胺)-5-氟-嘧啶-4-基)-苯基-胺)圖2:Signalokinome(見實施例2)。該圖顯示了使用kinobead的藥物pulldowns(左圏)和使用抗-磷酸酪氨酸抗體珠子的常規免疫沉澱(右團)的對比。在Kinobeads實驗中，鑑別了共626種蛋白，其中有100種激酶。在免疫沉澱(IP)實驗中，鑑別了共503種蛋白，其中有12種激酶。在重疊區域，列出了用這兩種實驗鑑別出的激酶(共同激酶)。結果表明，與抗-磷酸酪氨酸抗體珠子(12種激酶)相比，使用kinobeads鑑別出明顯更多的激酶(100種激酶)。圖3:kinobead配體5，6和7的結構。在實施例5，6和7中描述了配體的合成途徑。圖3a:kinobead配體5(丐l咮配體91)的結構。圖3b:kinobead配體6(喹唑啉配體32)的結構。圖3c:kinobead配體7(修飾的星形孢菌素)的結構。圖4:定量蛋白親和力圖鐠(PAP)。該圖顯示了裂解物中與實驗化合物BisVIII的竟爭和用蛋白印跡分析對蛋白的檢測。使用含有10mg蛋白的Jurkat細胞裂解物樣品，如實施例8所述進行pulldown實驗。在SDS-聚丙烯醯胺凝膠上分離輸入裂解物(泳道L;50Mg蛋白)和來自kinobead的SDS-洗脫物(泳道l-7)，轉移到膜上，並用抗體探測。圖4A:首先用針對GSK3P的抗體探測蛋白印跡。用過氧化物酶標記的檢測二抗進行化學發光檢測。作為裝載對照，用抗-ITK抗體探測印跡。泳道L:50iugJurkat裂解物；泳道1:6.0juMBisVIII;泳道2:2.0juMBisVIII;泳道3:0.67jiMBisVIII;泳道4:0.22pMBisVIII;泳道5:0.074inMBisVIII;泳道6:0.025pMBisVIII;泳道7:0.5%DMS0(溶劑對照)。圖4B:BisVIII對GSK3P結合kinobead的濃度依賴性竟爭。定量圖2A所示的蛋白印跡上的GSK3P條帶，並相對於加入裂解物中的BisVIII的濃度繪圖。圖5:激酶的定量蛋白親和力圖譜對4種激酶顯示了實施例8的定量親和力圖譜實驗結果。相對於化合物濃度(BisVin)繪製相對強度(RI)值圖。RI50值代表著相對於DMSO對照給定激酶的MS信號的相對強度是50%時的化合物濃度。圖5A:糖原合酶激酶3oc的曲線(GSKa;RI50-72.7nM)圖5B:糖原合酶激酶3P的曲線(GSKb;RI50-95nM)圖5C:蛋白激酶Ca的曲線(PKCa;RI50-12.2nM)圖5D:蛋白激酶Cp的曲線(PKCb;RI50=21.5nM)實施例實施例1:kinobead的製備本實施例解釋了製備含4種不同配體的kinobead。這些kinobead隨後用於實施例2和實施例3中。使用合適的官能團(例如氨基或羧基等基團)，通過共價連接將廣鐠捕獲配體共價地固定化到固體支持物上。修飾不含有合適官能團的化合物，以便導入這樣的基團。必需的化學方法是藥物化學文獻中已知的，且在下面闡述。1.配體的選擇和合成如下所述，在分開的反應中，將下面4種廣特異性配體(Kinobead配體l-4;圖1)共價偶聯到珠子上，然後混合4種類型的珠子，並用於藥物pulldown實驗。Kinobead配體1:雙吲咮基馬來醯亞胺VIII-乙酸(化學式C24H22N402CH3C00H;分子量398.5;CAS號138516-31-1;AlexisBiochemicals，AXX0RADeutschlandGmbH,Griinberg;Cat-ALX-270-056)。Kinobead配體2:PurvalanolB(化學組成:C2。H25C1N603;分子量441.92;CAS號212844-54-7;TocrisBiochemicalsCat-1581，BI0T薩DChemikalienGmbHK6ln，Germany)。Kinobead配體3:CZC00007324;(7-(4-氨基甲基-苯基氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-l-甲基-lH-[1，6]萘啶-2-酮)。kinobead配體1的合成7-(4-氨基甲基-苯基氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-IH-[1，6]萘啶-2-酮如Klutchko，S.R.等，1998，JournalofMedicinalChemistry41，3276-3292所述，進行CZC00007324合成的前7步。如下所迷進行剩餘的步驟。步驟l-7:按照/.1998，W,3276-3292的操作，從4-氯-2-甲硫基-5-嘧啶曱酸乙基酯合成6-(2，6-二氯苯基)-2-甲烷磺醯基-8-甲基-8f吡啶並[2，3-d嘧啶-7-酮。步驟8:{4-[3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-2-氧-l，2-二氫-[1，6]萘啶-7-基氨基]節基}-氨基甲酸叔丁基酯混合固體狀的6-(2，6-二氯苯基)-2-甲烷磺醯基-8-甲基-吡啶並[2，3-cd嘧啶-7-酮(0.100g，0.2mmol)和3-0V"Boc-曱基氨基)苯胺(0.421g，2.Ommol)，加熱至140X:30分鐘。將粗反應混合物溶於二氯甲烷中，用2NHC1(aq)洗滌x2。用無水硫酸鎂乾燥有機層，過濾，並濃縮。從熱乙酸乙酯重結晶粗產物，得到{4-[3-(2，6-二氯-苯基)-l-甲基-2-氧-l，2-二氫-[1，6]萘啶-7-基氨基]苄基}-氨基甲酸叔丁基酯黃色固體(O.031g-25%)。卞NMR(DMS0-《)510.18(s，1H);8.83(s，1H);7.76(d，2H);7.58(d，2H);7.46(dd,1H);7.32(brt，1H);7.23(d，2H);4.10(d，2H);3.66(s，3H);1.40(s，9H)。LCMS:方法A，RT-5.60min.步驟9:7-(4-氨基甲基-苯基氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-l-甲基-IH-[I，6]萘啶-2-酮將{4-[3-(2，6-二氯-苯基)-l-甲基-2-氧-l，2-二氫-[1，6]萘啶-7-基氨基]苄基}-氨基甲酸叔丁基酯(0.026g，0.05mmol)溶於甲醇(3ml)中，加入氫氯酸(4N，在二噁烷中，1.2ml)。在室溫攪拌反應物1.5小時，此時HPLC顯示沒有剩餘的原料。真空去除溶劑。將殘餘物溶於水，用碳酸氫鈉(飽和的，aq.)鹼化溶液。收集得到的沉澱，並乾燥，得到7-(4-氨基甲基-苯基氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-lH-[l，6]萘啶-2-酮(0.021g-100W黃色固體。力腿(DMS0-《)510.20(brd，1H);8.83(d，1H);7.90(d，1H);7.76(d，1H);7.72(d，1H);7.60(dd，2H);7.47(ddd，1H);7.33(d，1H);7.24(d，1H);4.07(d，2H);3.66(s，3H)。LCMS:方法A，RT-4.44min，[MH+—26]。Kinobead配體4:CZC00008004.2-(4'-氨基甲基苯基胺)-5-氟-嘧啶-4-基)-苯基-胺。化學式C17H16N5F.分子量309.34。這是CZC00004919的類似物。CZC00008004-(2-(4'-氨基甲基苯基胺)-5-氟-嘧啶-4-基)-苯基-胺的合成步驟l:2，4-二氯-5-氟-嘧啶將磷醯氯(2ml)加入5-氟尿嘧啶(lg，7.688m邁o1)，隨後加入五氯化磷(3.28g，15.76mmo1)，加熱混合物，在IIOX:攪拌5小時，然後冷卻。在水/水混合物(10ml)浴中緩慢水解過量的磷醯氯。用二乙醚(3xlOml)萃取含水混合物。合併有機層，用飽和碳酸氫鈉(10ml)、隨後用飽和氯化鈉(10ml)洗塗，用無水硫酸鎂千燥，然後過濾。通過在350mmHg蒸發，去除溶劑，剩下粘稠的油，將其緩慢結晶，得到標題化合物(1.22g-95%)。不經進一步分析，將化合物用於下一步。步驟2:(2-氯-5-氟-嘧啶-4-基)-苯基胺向2，4-二氯-5-氟-嘧啶(0.550g,3.30mmol)於二甲基甲醯胺(13ffll)中的溶液中，加入苯胺(O.301ml，3.30mmol)和A^乙基二異丙基胺(0.602ml，3.63mmo1),在室溫攪拌混合物18小時。用乙酸乙酯(20ml)淬滅混合物，用飽和氯化銨(20ml)洗滌，去除有機層。用乙酸乙酯(20ml)洗滌含水層，用水(20ml)、飽和氯化鈉(10ml)洗滌合併的有機層，經無水硫酸鎂千燥。蒸發去除溶劑，對得到的固體進行柱色鐠(二氧化矽，乙酸乙酯(0-20%)/石油醚)，得到標題化合物(0.532g-72%)。LCMS:方法A，RT-4.67min，[MH+=224].步驟3:[4-(5-氟-4-苯基氨基-嘧啶-2_基氨基)-苄基]-氨基曱酸叔丁基酯將(2-氯-5-氟-嘧啶-4-基)-苯基胺(0.087g，0.39mmol)和4[^Boc氨基甲基]苯胺(0.087g，0.39隨ol)混合到一起。加入攪拌棒，將燒瓶置於110°C油浴中20分鐘。冷卻混合物，將殘餘物溶於3ml二氯甲烷/甲醇(99:5)，裝載到快速色譜柱上，使用在石油醚中的乙酸乙酯(20-60%)純化，產生黃色固體狀的目標化合物(0.051g-32%)。^NMR(400MHz，CDCl3-《)57.85(d，1H);7.50(dd，2H);7.39(d，2H);7.27(t，2H);7.12-7.00(m，3H);6.81(s，1H);6.66(s，1H);4.67(s，1H)，4.17(d，2H)，1.36(s，9H)。LCMS:方法B，RT=9.20min,[MH+-410].步驟4:(2-(4'-氨基甲基苯基胺)-5-氟-嘧啶-4-基)-苯基-胺向[4-(5-氟-4-苯基氨基-嘧啶-2-基氨基)-節基]-氨基甲酸叔丁基酯(0.055g，0.134mmol)於甲醇(5ml)中的溶液加入HCl(4N，在二噁烷中)(2ml)，在室溫攪拌反應物1小時。蒸發去除溶劑。加入水(5ml)，通過加入碳酸氫鈉，使溶液的pH升高至8。過濾得到的沉澱，並千燥，得到標題化合物(0.035g-84%)。力賺(400MHz，DMSO-cO57.90(d，1H);7.70(dd，2H);7.55(dd，2H);7.35(t,2H);7.20(d，2H);7.10(t，1H);3.80(s，2H)。LCMS:方法B，RT=5.022min，[M『=310].在惰性氣氛下進行所有反應。在Brukerdpx400上得到NMR光譜。使用zorbaxSBC-18，4.6mmxl50mm-5jli柱，在Agilent1100上進行LCMS。柱流速是1ml/min，使用的溶劑是水和乙腈(0.1%TFA)，注射體積是10ul。波長是254和210nm。方法如下所述。表1:分析方法tableseeoriginaldocumentpage33表2:化學方法方案中使用的縮寫aq含水的d雙峰DMSO二曱基亞碸g克HC1氫氯酸HPLC高壓液相色語LCMS液相色譜-質譜法m多重峰mins分鐘mmol毫摩爾N當量(Normal)腿核磁共振q四重峰RT保留時間s單峰sat飽和的t三重峰2.含有胺基的配體的固定化用無水DMSO(二甲基亞碸，Fluka，41648，H20<=0.005%)平衡NHS-活化的Sepharose4FastFlow(AmershamBiosciences,17-0906-01)。將1ml沉降的珠子置於15mlFalcon試管中，加入化合物儲備溶液(通常100mM，在DMF或DMSO中)(終濃度0.2-2nmol/ml珠子)以及15jil三乙胺(SIGMA，T-0886,99%純)。在室溫在黑暗中，在反轉搖動器(RotoShakeGenie，ScientificIndustriesInc.)上溫育珠子16-20小時。通過HPLC，測定偶聯效率。通過在反轉搖動器上在室溫與氨基乙醇溫育過夜，封閉不反應的NHS-基團。將洗過的珠子保藏在異丙醇中，或立即用於結合反應。3.含有羧基的配體的固定化如下所述，在鹼性條件下，將化合物偶聯到反轉的(reversed)NHS-瓊脂糖珠子(PyBroPchemistry)上。珠子的洗滌步驟l:使用lml(沉降體積)NHS-瓊脂糖/珠子進行標準的偶聯反應(在異丙醇中提供的NHS-活化的Sepharose4FastFlow,AmershamBiosciences,17-0906-01)。步驟2:用10mlDMSO洗滌珠子3次，用10ml無水DMSO(二甲基亞碸，Fluka，41648,H20<=0.005%)洗滌一次；離心步驟1min:I.200rpm，室溫；將上清液棄入非含卣溶劑廢液中。步驟3:最後的洗滌步驟後，將珠子重懸於1體積的無水DMSO中。反轉NHS珠子該步驟為1mL珠子而設計，相應地為任意其它珠子體積而調節。NHS珠子具有20nmol/mL的容量。因此，20%反轉的珠子應當具有4jimol/mL的容量。製備氨基乙醇和乙二胺的4:1比例混合物，然後向混合物中加入三乙胺。(共200jimol)(10x1mLNHS珠子容量)1:9.6616.56M氨基乙醇(2-氨基乙醇，Aldrich，II.016-7)(共160jimol)2:2.6814.92M乙二胺(Fluka，03350)(共40,1)。3:15jiL7.2M三乙胺(TEA)(SIGMA，T-0886,99%純)混合物將分成兩相，但是這沒有問題。將混合物加入經洗滌的/重懸的NHS珠子，在室溫在反轉搖動器上溫育16小時(過夜)。PyProB偶聯。該操作不需要預活化步驟，激活和偶聯在原位發生。1.將PyBroP(溴-三-吡咯烷基-磷鈸六氟磷酸鹽；供應商NOVABIOCHEM)在無水的二甲基甲醯胺(DMF)中溶解至終濃度100mM(46.62mg/mL)，溶液可以使用最長達l天。2.在1mL無水的DMF中溶解35nL二異丙基乙基胺(DIBA)，終濃度200mM。3.用15mLDMS0洗滌1mL反轉的珠子3次。離心步驟1分鐘，1，200rpm室溫。拋棄上清液。4.用15mL無水的DMF洗滌反轉的珠子3次。離心步驟1分鐘，1，200rpm室溫。拋棄上清液。5.在1mL無水的DMF中懸浮反轉的瓊脂糖珠子。6.加入IOO二異丙基乙基胺(DIEA)溶液。7.向珠子加入需要量的來自DMF-溶液的化合物(1nmol/mL反轉的瓊脂糖珠子；相當於10jiL100mM化合物/mL反轉的瓊脂糖珠子)。8.混合，直到獲得均勻懸浮液。9.在1200rpm、在室溫離心1分鐘，取出20上清液，在30甲醇(MeOH)中稀釋，作為HPLC分析的起始值。10.向懸浮液加入100jiLPyBroP溶液，再次混合。11.在室溫，在反轉混合儀上溫育過夜。12.在1200rpm、在室溫離心1分鐘，取出20上清液，在30jiL甲醇(MeOH)中稀釋，作為HPLC分析的偶聯值。珠子的封閉1.通過加入100jiL100mMNHS-乙酸(封閉試劑的製備見下文)，封閉珠子。2.在室溫，在反轉搖動器上溫育過夜。封閉試劑(NHS激活的乙酸)1.製備200mMDCCD和NHS於乙腈中的溶液(各自約5mL)。2.在20mL透明玻璃瓶中，混合等體積的200mM冊S和DCCD;3.每lmL總體積冊S/DCCD混合物，加入11.4pL17.49M乙酸(2x摩爾過量)(Merck，1.00063.1000)。4.徹底混合。約2分鐘後，形成沉澱(脲衍生物的晶體)。5.使反應物在室溫放置至少過夜，然後再使用。珠子的洗滌1.用14mlDMSO(例如FLUKA，34869或等同物)洗滌珠子2次，然後用2x14mL異丙醇(Merck，1.00983.1000，proanalysis)洗滌。離心步驟1分鐘，1200rpm，室溫。在洗滌之間，去除上清液。2.用1mL異丙醇重懸珠子，製備50°/。料漿，在-20X:保藏，或立即用於與細胞裂解物的結合反應。表3:偶聯方案中使用的縮寫tableseeoriginaldocumentpage37實施例2:signalokinome本實施例解釋了用化合物處理細胞(具體見本發明的第二個方面)。用表皮生長因子(EGF)處理HeLa細胞，製備細胞裂解物，使用Kinobead(實驗方法見第2.1部分)和質譜法進行分析。Kinobead的製備如實施例1所述。平行地，用抗-磷酸酪氨酸抗體對細胞裂解物進行免疫沉澱(實驗37方法見第2.2部分)，並通過質鐠法進行分析。結果(圖"表明，與免疫沉澱方法(表6)相比，kinobead會鑑別出明顯更多的激酶(表8)。1.生物樣品(細胞裂解物)的製備1.1細胞培養和細胞的處理細胞培養。在37t:、5%C02，在MEM培養基(不含有L-精氨酸，不含有L-穀氨醯胺；PromocellC-75280)、10%經透析的胎牛血清(Gibco,26400-044)、1%100x非必需胺基酸(Cambrex，BE13-114E)、lmM丙酮酸鈉(Gibco，11360-039)、2mML-穀氨醯胺(Gibco，25030-032)、40mg/L12C或13CL-精氨酸(12C精氨酸-Sigma,A6969)(13C精氨酸-CambridgeIsotopeLaboratoriesInc.,CLM-2265)中培養HeLa細胞(美國典型培養物中心-NoCCL-2)。細胞繁殖。細胞在15cm培養皿中達到匯合後，將細胞按1-10分盤，進一步生長。如下分開細胞首先去除上清液培養基，然後用15mLPBS緩沖液(Gibco，14190-094)短暫地洗滌細胞。去除PBS後，通過向每個15cm培養皿加入2mL胰蛋白酶-EDTA溶液(Gibco，25300-054)，並在37。C溫育平板10分鐘，使細胞脫離平板。細胞脫離後，向每個15cm培養皿加入8mLMEM生長培養基(見上面)。將1mL該溶液置於新鮮的15cm平板上，加入24mLMEM培養基(見上面)。在5%C02再次溫育平板，直到細胞匯合(約3-4天)。細胞的EGF處理。在用表皮生長因子(EGF)處理細胞前一天，通過抽吸去除細胞生長培養基，加入20niL新鮮的MEM培養基(見上面)，例外是，培養基添加了0.ly。胎牛血清(FBS)來替代l(^FBS。在37匸、5%C02,在該飢餓培養基中溫育細胞過夜。細胞飢餓後，將3pL1mg/mL重組人EGF(Biomol，50349-1)加入每個15cm平板(最終EGF濃度=150ng/mL培養基)。在37C、5%C02，溫育平板10分鐘，然後收穫。細胞收穫。如下收穫細胞傾倒出含有EGF的培養基，用10mL冰冷的PBS緩衝液洗滌每個15cm平板一次，用橡膠刮棒刮擦平板，以便使細胞脫離。將細胞轉移進50mLFalcon試管(BectonDickinson,352070)，在1500rpm、在HeraeusMultifuge3SR中離心10分鐘。抽吸上清液，將細胞沉澱重懸於50mL冰冷的PBS緩衝液中。離心和抽吸上清液後，在液氮中快速冷凍細胞沉澱，然後在-80t:保藏。1.2細胞裂解物的製備通過在維持蛋白的結構和功能的輕柔條件下，在裂解緩沖溶液中機械破碎，製備HeLa細胞裂解物。進行如下的步驟*在室溫或37X:迅速融化組織，然後將組織轉移至含有lx裂解緩衝液的玻璃瓶(使用大小足以配用PolytronPT3100勻漿器的瓶子)*在冷室中，在4匸，在5000-7000rpm、以4xl0秒脈沖裂解器官/組織魯將勻漿轉入預冷的50mlfalcon試管*在水上溫育勻漿30min*在6000g、在4。C旋轉細胞10min(6.000rpm，在SorvallSLA600中，預冷)將上清液轉移至UZ-聚碳酸酯試管(Beckmann，355654)在145，000g、在4。C旋轉上清液1h(40.000rpm，在Ti50.2中，預冷)*保藏上清液(取出和拋棄大部分脂質層(如果可能))，將上清液轉移進玻璃瓶，在冰上保藏。，通過Bradford測定(BioRad)，測定蛋白濃度。典型的蛋白濃度是在5-10mg/ml的範圍內。*在15-50mlFalcon試管內，製備等分試樣。參在液氮中冷凍等分試樣，在-80。C保藏。製備含0.8%NP40的100mllx裂解緩沖液合併下述溶液或試劑，加入蒸餾水至終體積100ml:20ml5x裂解緩沖液(見下文)，100pi1MDTT，5ml0.5MNaF，4ml20%NP40，4片不含EDTA的完全片劑(蛋白酶抑制劑混合物，RocheDiagnostics,1873580)，加入蒸餾7JC至100ml。表4:5x-裂解緩沖液的製備tableseeoriginaldocumentpage40從下述供應商得到這些溶液1MTris/HClpH7.5:Sigma,T-2663;87%甘油Merck,目錄號04091.2500;IMMgCl"Sigma,M—1028;5MNaCl:Sigma,S—5150經O.22jam過濾器，過濾5x濃縮的裂解緩衝液，以40ml等分試樣在-8G。C保藏。在該實驗中使用的儲備溶液的製備100mMNa3V04儲備溶液的製備將9.2gNa3V0,溶於400ml蒸餾水。1)使用1NNaOH或1NHC1,調節pH至10.0。原釩酸鈉溶液的起始pH可能隨批次而變化。在pH10.0，溶液是黃色。2)煮沸溶液，直到它變成無色(約10min)。3)冷卻至室溫。4)再次調節pH至lO.0，重複步驟2和3，直到溶液保持無色，且pH穩定在10.0。5)用蒸餾水調節體積至500ml。6)在-20C冷凍等分試樣。等分試樣可以保藏幾個月。500mMNaF儲備溶液的製備將21.0gNaF(SIGMA,S7920)溶於500ml蒸餾水。經0.22pm過濾器過濾溶液，在4x:保藏。20%NP40-溶液的製備稱量40.0gNP40(SIGMA，Igepal-CA630，目錄號13021)。加入蒸餾水直至200g。徹底混合，在室溫儲存溶液。1MDTT溶液的製備將7.7gDTT(Biomol，目錄號04010)溶於50ml蒸餾水。經0.22pm過濾器過濾溶液，在-20t:冷凍400ji1等分試樣。等分試樣可以保藏幾個月。2.結合反應2.1"kinobead"(固定化的捕獲配體)與細胞裂解物的接觸在允許裂解物中的蛋白結合配體的條件下，使kinobead(固定化的捕獲配體)接觸從HeLa細胞製備的細胞裂解物。通過選擇能維持蛋白功能的合適緩沖條件，結合條件接近於生理條件。通過輕柔洗滌操作，去除未捕獲的蛋白後，使結合的蛋白接觸導致蛋白洗脫的實驗化合物。2.1.1DP-緩衝液的製備表5:5x-DP緩沖液的製備物質儲備溶液在lx裂解緩沖液中的終濃度用於115x裂解緩衝液的加入量tableseeoriginaldocumentpage41經O.22pm過濾器過濾5x-DP緩沖液，在-80。C保藏40ml-等分試樣。從下述供應商得到這些溶液1.0MTris/HClpH7.5(SIGMA,T-2663),87%甘油(Merck，目錄號04091.2500);1.0MMgCl2(SIGMA，M-1028);5.0MNaCl(SIGMA,S-5150)。製備下述的lxDP緩衝液lxDP緩衝液(用於珠子平衡)lxDP緩沖液/O.4%NP40(用於珠子平衡和珠子的第一個洗滌步lxDP緩衝液/O.2%NP40(用於珠子的第二個洗滌步驟和化合物洗脫)lxDP緩沖液/蛋白酶抑制劑(用於第一個裂解物稀釋步驟)；加入1片蛋白酶抑制劑片劑/25ml裂解緩衝液(無EDTA的片劑，蛋白酶抑制劑混合物，RocheDiagnostics,1873580)lxDP緩衝液/0.4WNP40/蛋白酶抑制劑(用於第二個裂解物稀釋步驟)製備lxDP-緩衝液/0.4。/。NP40(100ml)的實例合併下述溶液和試劑，加入蒸餾水直至100ml的終體積20ml5xDP緩衝液，5ml0.5MNaF，2ml20%NP40，100|U11MDTT，加入蒸餾水直至100ml。所有緩沖液舍有1mMDTT終濃度。2.1.2珠子的洗滌和平衡通過用合適的緩沖液洗滌和在緩沖液中平衡，製備用於結合反應的kinobead(實施例1)。進行下述步驟1.使用15mlFalcon試管，進行所有洗滌步驟。2.每個實驗使用100p1Kinobead(沉降的珠子體積)混合相同量的(25pl)與下述4種配體偶聯的每個珠子類型(偶聯密度是1jumol/ml):BisVIII(CZC00001056)，PurvalanolB(CZC00007097)，PD173955衍生物(CZC00007324)，和CZC00008004。3.用3mllxDP緩衝液洗滌珠子2次，用3mllxDP緩沖液/0.4。/。NP40洗滌一次。在每個洗滌步驟過程中，反轉試管3-5次，在1200rpm、在41C、在Heraeus離心機中離心2分鐘。抽吸上清液，並拋棄。最後洗滌步驟後，用lxDP緩衝液/0.4%NP40製備1:1料漿(體積/體積)。2.1.3稀釋的細胞裂解物的製備通過在合適緩衝液中稀釋，並經離心步驟澄清，製備如第(1.2)部分所述的用於結合反應的細胞裂解物。進行下述步驟1.使用相當於每個實驗50mg蛋白的體積的細胞裂解物。2.在371C水浴中迅速融化裂解物，然後在水上保持樣品。3.以下述方式稀釋裂解物1)用lxDP緩沖液/蛋白酶抑制劑稀釋裂解物，使去汙劑濃度從O.8%降低至0.4%NP-40。2)用lxDP緩衝液/0.4%NP40/蛋白酶抑制劑進一步稀釋裂解物，達到5mg/ml的終蛋白濃度。4.將稀釋的裂解物轉入UZ-聚碳酸酯試管(Beckmann，"5654)。5.通過超速離心(20min，4T，100.000g，TI50.2轉子，預冷的超速離心機)，澄清稀釋的裂解物。6.保藏上清液，在水上保藏。2.1.4結合反應和洗滌使來自第(2.1.2)部分的經洗滌和平衡的珠子接觸來自步驟(2.1.3)的稀釋的細胞裂解物，以便使蛋白結合配體。通過輕柔洗滌，去除非特異性結合的蛋白，以便減少背景結合。1.在15ml或50mlFalcon試管中，合併稀釋的澄清的裂解物和IOOp1經洗滌的Kinobead。2.在4t:溫育2小時，在冷室中在ROTOSHAKEGENIE(ScientificIndustries,Inc.)上旋轉。3.溫育後，在4"C、在U00rpm、在Heraeus離心機或等效儀器中離心3分鐘。4.小心地去除上清液，不使珠子鬆開。5.將珠子轉移至帶90jum過濾器的Mobicol-柱(MoBiTec，Goettingen，目錄號M1002-90)。6.用10mllxDP緩衝液/O.4%NP-40和5mllxDP緩衝液/O.2%NP-4Q洗滌珠子。7.使洗滌緩衝液完全流過柱，然後進行下一步。8，將柱置於埃彭道夫試管中，在800rpm、在4r將它們離心1分鐘。用下蓋封閉柱。2.1.5蛋白的洗脫1.加入60|j12xNuPAGESDS樣品緩衝液(Invitrogen，NP0007;在使用前，用蒸餾水l:l稀釋4x緩衝液)。2.在50X:溫育樣品30分鐘。3.打開柱的下蓋，在2000rpm離心MobiTec柱1分鐘，分離洗脫液和珠子。4.加入1/10體積的200mg/ml碟乙醯胺，在室溫溫育30分鐘，避光。該反應導致半胱氨酸的烷基化，用於質譜分析。5.將樣品上樣到凝膠之前，在15.000rpm離心樣品5分鐘，以便去除沉澱。6.為了蛋白分離，將60jiil樣品應用於NuPAGE4-12y。Bis-Tris凝膠(Invitrogen，NP0335)。2.1.6在該實驗中使用的儲備溶液的製備100mMNa3V04儲備溶液的製備1)將9.2gNa3V04溶於400ml蒸餾水。2)使用1NNaOH或1NHC1，調節pH至10.0。原釩酸鈉溶液的起始pH可能隨批次而變化。在pH10.0，溶液是黃色。3)煮沸溶液，直到它變成無色(約IOmin)。4)冷卻至室溫。5)再次調節pH至10.0，重複步驟2和3，直到溶液保持無色，且pH穩定在10.0。6)用蒸餾水調節體積至500ml。7)在-2or;冷凍等分試樣。等分試樣可以保藏幾個月。500mMNaF儲備溶液的製備將21.0gNaF(SIGMA，S7920)溶於500ml蒸餾水。經0.22pm過濾器過濾溶液，在4t;保藏。20%NP40-溶液的製備稱量40.0gNP40(SIGMA,Igepal-CA630,目錄號13021)。加入蒸餾水直至200g。徹底混合，在室溫儲存溶液。1MDTT溶液的製備將7.7gDTT(Biomol，目錄號04010)溶於50ml蒸餾水。經0.22)im過濾器過濾溶液，在-20r冷凍400jil等分試樣。等分試樣可以保藏幾個月。碘乙醯胺儲備溶液(200mg/ml)的製備將2.0g碘乙醯胺(SIGMA,1-6125)溶於10ml蒸餾水。經0.22jam過濾器過濾溶液，在-2GC冷凍400pi等分試樣。等分試樣可以保藏幾個月。2.2使用抗-磷酸酪氨酸抗體珠子的免疫沉澱2.2.1緩衝液和抗磷酸酪氨酸抗體珠子在固定化的抗-磷酸酪氨酸抗體的免疫沉澱實驗中使用的所有緩沖液與在kinobead實驗(見上面)中使用的那些相同，例外是，沒有加入DTT，且加入50pLlmM岡田酸(Biomol，El-181;磷酸酶抑制劑)，以便達到500nM岡田酸的終濃度。從Biomol(目錄號16-199)得到抗磷酸酪氨酸抗體珠子(含有共價偶聯的重組4G10抗-磷酸酪氨酸抗體的瓊脂糖珠子)。2.2.2抗-砩酸酪氨酸珠子的洗滌和平衡通過用合適的緩衝液洗滌和在緩衝液中平衡，製備用於結合反應的抗-磷酸酪氨酸珠子。1，使用15mlFalcon試管，進行所有洗滌步驟。2.每個實驗使用100jil抗-磷酸酪氨酸珠子。3.用3mllxDP緩衝液(-DTT)洗滌珠子2次，用3mllxDP緩衝液/O.4%NP40(-DTT)洗滌一次。在每個洗滌步驟過程中，反轉試管3-5次，在1200rpm、在4"C、在Heraeus離心機中離心2分鐘。抽吸上清液，並拋棄。最後洗滌步驟後，用lxDP緩衝液/0.4%NP40(-DTT)製備1:1料漿(體積/體積)。2.2.3稀釋的細胞裂解物的製備通過在合適緩沖液中稀釋，並經離心步驟澄清，製備用於結合反應的細胞裂解物。1.使用相當於每個實驗50mg蛋白的體積的細胞裂解物。2.在37C水浴中迅速融化裂解物，然後在水上保持樣品。3.以下述方式稀釋裂解物第一個稀釋步驟用lxDP緩沖液/蛋白酶抑制劑/岡田酸/不含DTT稀釋裂解物，使去汙劑濃度從0.8%降低至0.4%NP-40。第二個稀釋步驟用lxDP緩衝液/0.4%NP40/蛋白酶抑制劑/岡田酸/不含DTT進一步稀釋裂解物，達到5mg/ml的終蛋白濃度。(注意只有在第一個稀釋步驟之後裂解物的蛋白濃度高於5mg/ml時，才需要第二個稀釋步驟)。4.將稀釋的裂解物轉入UZ-聚碳酸酯試管(Beckmann，355654)。5.通過超速離心(20min,4t:，100.000g，TI50.2轉子，預冷的超速離心機)，澄清稀釋的裂解物。6.保藏上清液，在冰上保藏。2.2.4結合反應和洗滌步驟使經洗滌和平衡的抗-磷酸酪氛酸珠子接觸來自部分2.2.3的稀釋的細胞裂解物，以便使蛋白結合抗-磷酸酪氨酸珠子。通過輕柔洗滌，去除非特異性結合的蛋白，以便減少背景結合。1.在15ml或50mlFalcon試管中，合併稀釋的澄清的裂解物和100ji1經洗滌的抗-磷酸酪氨酸珠子。2.在4t:溫育4小時，在冷室中在ROTOSHAKEGENIE(ScientificIndustries,Inc.)上旋轉。3.溫育後，在4匸、在1200rpm、在Heraeus離心機或等效儀器中離心3分鐘。4.小心地去除上清液，不使珠子鬆開。5.將珠子轉移至帶90過濾器的Mobicol-柱(MoBiTec，Goettingen，目錄號M1002-90)。6.用10mllxDP緩衝液/0.4XNP-40/不含DTT和5mllxDP緩沖液/O.2%NP-40/不含DTT洗滌珠子。7.使洗滌緩沖液完全流過柱，然後進行下一步。8.將柱置於埃彭道夫試管中，在800rpm、在4匸將它們離心1分鐘。用下蓋封閉柱。2.2.5結合的蛋白的洗脫1.加入60jli12xNuPAGESDS樣品緩衝液(Invitrogen，NP0007;在使用前，用蒸餾水l:l稀釋4x緩衝液)。2.在50"C溫育樣品30分鐘。3.打開柱的下蓋，在2000rpm離心MobiTec柱1分鐘，分離洗脫液和珠子。4.加入1/10體積的200mg/ml碘乙醯胺，在室溫溫育30分鐘，避光。該反應導致半胱氨酸的烷基化，用於質鐠分析。5.將樣品上樣到凝膠之前，在15.000rpm離心樣品5分鐘，以便去除沉澱。6.為了蛋白分離，將60nl樣品應用於NuPAGE4-12。/。Bis-Tris凝膠(Invitrogen，NP0335)。3.洗脫的酶(例如激酶)的質鐠分析proteotypic肽的描述胰蛋白酶消化經SDS-PAGE-分離的蛋白混合物，每種蛋白會產生具有不同物理化學性質的許多不同的肽片段。這些肽的差別在於與用於蛋白鑑別(ID)的基於質譜法的分析平臺的相容性，在這裡是納米毛細管反相-液相色鐠電噴射離子化串聯質譜(RP-LC-MS/MS)。結果，來自相同來源蛋白的肽的肽頻率有很大程度的差異，最經常觀察到的"通常，，促成該蛋白的鑑別的肽稱作"proteotypic"肽。因此，"proteotypic肽"是在實驗中非常容易觀察到的肽，其會獨特地鑑別特定蛋白或蛋白同種型。proteotypic肽的優點proteotypic肽在蛋白鑑別中的應用，允許通過將蛋白鑑別過程聚焦在篩選富含信息的特徵肽的存在上，快速且集中地鑑別和定量多種已知的靶蛋白。proteotypic肽的實驗鑑別建立一列proteotypic肽的一種策略是，經驗為主地收集肽-鑑別數據，和搜索獨特地鑑別蛋白的常見肽的數據集合。對於CZ數據集合中具有至少10個明確鑑別的每個IPI資料庫蛋白條目(多肽ID或手工驗證的單肽ID)，計算貢獻肽的肽頻率。僅僅考慮根據資料庫搜尋引擎Mascot(MatrixScience)特異性的、最好的肽-光鐠匹配。為了定義特定蛋白的proteotypic肽，按照遞減的肽頻率，對肽排序，並計算累積的肽存在該值會給出每種肽的鑑別比例，其中存在該肽或任一種具有更高肽頻率的肽。使用95°/4的累積存在截止值來定義proteotypic肽，即該蛋白的至少95%的鑑別事件是基於至少一種proteotypic肽。3.1質譜分析之前的蛋白消化和樣品製備濃縮蛋白，在4-12%NuPAGENovex凝膠(Invitrogen，Carlsbad,CA)上分離，用膠體考馬斯藍染色。在整個分離範圍內，將凝膠泳道系統地切成<48薄片(條帶和帶間區域)，並基本上如Shevchenko等，1996，AnalyticalChemistry68:850-858所述，進行凝膠內胰蛋白酶消化。簡而言之，在5mMNH4HC03(在50%EtOH中)中使凝膠塞(gelplug)脫色過夜，用12.5ng/jil胰蛋白酶(在5mMNH4HC03中)消化4小時。用U甲酸提取肽，轉入第二個96孔平板，在真空下千燥。將乾燥的肽重懸於10pi0.1%甲酸水溶液中，將5pi注射進LC-MS/MS系統，用於蛋白鑑別。3.2質譜數據獲取將肽才羊品注射進nanoLC系統(CapLC，Waters或Ultimate,Dionex)，後者直接連接到四極飛行時間(QT0F2，QT0FUltima,QT0FMicro,Micromass或QSTARPulsar,Sciex)或離子阱(LCQDecaXP，LTQ，Thermo-Finnigan)質i普儀。使用含水和有機溶劑的梯度，以15-45min的典型梯度時間，在LC系統上分離肽。溶劑A是5y。乙腈於0.1%甲酸中，溶劑B是70。/。乙腈於0.1%甲酸中。3.3蛋白鑑別在LC-MS/MS實驗中產生的肽質量和斷裂數據，用於查詢國際蛋白指數(IPI)蛋白序列資料庫(EBI)的內部副本。通過使用軟體工具Mascot(MatrixScience;Perkins等，1999，Electrophoresis20:3551-3567)，將測量的肽質量和斷裂數據與從資料庫的登錄條目計算出的相同數據相關聯，鑑別蛋白。搜索標準隨用於分析的質鐠儀而異。4.結果在圖2中顯示了signalokinome實驗的結果。該圖顯示了使用kinobead的藥物pu11downs(左圏)和4吏用抗-磷酸酪氨酸抗體珠子的常規免疫沉澱(右圏)的對比。在Kinobead實驗中，鑑別了共626種蛋白，其中有100種激酶。在免疫沉澱(IP)實驗中，鑑別了共503種蛋白，其中有12種激酶。在重疊區域，列出了用這2個實驗鑑別出的激酶(共同激酶)。結果表明，與抗-磷酸酪氨酸抗體珠子(12種激酶)相比，使用kinobead鑑別出明顯更多的激酶(100種激酶)。在下表中，列出了2個實驗方案鑑別出的激酶。另外，在單獨的表中，列出了激酶的proteotypic肽序列。表6:免疫沉澱(IP)後鑑別出的激酶。激酶名稱是根據人激酶命名法(http:〃kinase.com)和Manning等，2002，Science298，1912-1934,如補充材料所述)。tableseeoriginaldocumentpage50表7:免疫沉澱(IP，見表6)後鑑別出的激酶的proteotypic肽序列。激酶名稱是根據人激酶命名法(http:〃kinase.com)和Manning等，2002，Science298，1912-1934，如補充材料所述)。tableseeoriginaldocumentpage51表8:使用kinobead藥物pulldown後鑑別出的激酶。激酶名稱是才艮據人激酶命名法(hup:〃kinase.com)和Manning等，2002，Science298，1912-1934，如補充材料所述)。tableseeoriginaldocumentpage52tableseeoriginaldocumentpage53tableseeoriginaldocumentpage54激酶標識激酶名稱評分鑑別的肽數目可得到的和鑑別的實驗proteotypic肽也在IP(見表1)中鑑別出79PHKg251916X80CaMKK21995X81MAP2K22946X82TGFbR249283Fused42284EphA2209990X85ACK1694IP86NLK46287CDK762320X88CHK2582X89KHS2604IP90MLK3591X91PKCe534X92PKCh534X93PYK21063X94TA02120395CKlgl452X96L皿l271697MAP2K14801498HRI52199SIK361100Erk7671101NEK21454102腿71755103BMPR1B1795X104MAP2K31335105FGFR251417表9:使用kinobead藥物pulldown後鑑別出的激酶(見表8)的proteotypic欣序歹寸。tableseeoriginaldocumentpage56tableseeoriginaldocumentpage57tableseeoriginaldocumentpage58tableseeoriginaldocumentpage59tableseeoriginaldocumentpage60tableseeoriginaldocumentpage61tableseeoriginaldocumentpage62tableseeoriginaldocumentpage63tableseeoriginaldocumentpage64tableseeoriginaldocumentpage65實驗激酶名稱鑑另'J出的proteotypic肽KinobeadDPYESLPQLVDMAAQIADGMAYIERKiiiobeadDPYESSDVWSFGILQTELVTKKinobeadDPYESAANILVGENLVCKKinobeadDPYESEVLEQVERKinobeadDPYESFQIINNTEGDWWEARKinobeadDPYESWTAPEAALYGRKinobeadDPYESLIEDNEYTARKinobeadDPYESGSLLDFLKKinobeadDPYESIADFGLARKinobeadDPZAKCEIEATLERKinobeadDPZAKGLEGLQVAWLVVBKKinobeadDPZAKLTIPSSCPRKinobeadDPZAK譜IAADGVLK實施例3:使用實驗化合物用於蛋白洗脫的篩選測定本實施例解釋了未修飾的實驗化合物對結合到kinobead上的蛋白的竟爭洗脫(具體見本發明的第四個方面)。使kinobead(如實施例1所述)接觸小鼠腦裂解物，用各種不同的實驗化合物洗脫結合的蛋白，通過質鐠法分析釋放的蛋白。1.生物樣品(組織裂解物)的製備1.1裂解物的製備通過在維持蛋白的結構和功能的輕柔條件下，在裂解緩沖溶液(每個小鼠腦5ml緩沖液)中機械破碎，製備小鼠腦裂解物。進行如下的步驟*在室溫或37C迅速融化組織，然後將組織轉移至含有lx裂解緩沖液的玻璃瓶(使用大小足以配用PolytronPT3100勻漿器的瓶子)*在冷室中，在4X:，在5000-7000rpm、以4xl0秒脈沖裂解器官/組織魯將勻漿轉入預冷的50mlfalcon試管*在冰上溫育勻漿30min,在6000g、在4iC旋轉細胞10min(6.000rpm，在SorvallSLA600中，預冷)將上清液轉移至UZ-聚碳酸酯試管(Beckmann，355654)在145.000g、在4C旋轉上清液1h(40.000rpm,在Ti50，2中，預冷)魯保藏上清液(取出和拋棄大部分脂質層(如果可能))，將上清液轉移進玻璃瓶，在冰上保藏。*通過Bradford測定(BioRad),測定蛋白濃度。典型的蛋白濃度是在5-10Dig/ml的範圍內。*在15-50mlFalcon試管內，製備等分試樣。在液氮中冷凍等分試樣，在-80"C保藏。1.2裂解緩衝液和儲備溶液的製備製備含0.8%NP40的100mllx裂解緩沖液合併下述溶液或試劑，加入蒸餾水至終體積100ml:20ml5x裂解緩衝液(見下文)，100jal1MDTT，5ml0.5MNaF，4ml20%NP40，4片不含EDTA的完全片劑(蛋白酶抑制劑混合物，RocheDiagnostics,1873580)，加入蒸餾水至100ml。表10:5x-裂解緩衝液的製備tableseeoriginaldocumentpage67從下述供應商得到這些溶液1MTris/HClpH7.5:Sigma,T-2663;87%甘油Merck，目錄號04091.2500;1MMgCl"Sigma，M-1028;5MNaCl:Sigma,S-5150經O.22ium過濾器，過濾5x濃縮的裂解緩沖液，以40ml等分試樣在-80X:保藏。儲備溶液的製備100mMNa3V04儲備溶液的製備將9.2gNa具溶於400ml蒸餾水。1)使用1NNaOH或1NHC1,調節pH至10.0。原釩酸鈉溶液的起始pH可隨批次而變化。在pH10.0，溶液是黃色。2)煮沸溶液，直到它變成無色(約IOmin)。3)冷卻至室溫。4)再次調節pH至10.0,重複步驟2和3，直到溶液保持無色，且pH穩定在10.0。5)用蒸餾水調節體積至500ml。6)在-20^C冷凍等分試樣。等分試樣可以保藏幾個月。500mMNaF儲備溶液的製備將21.0gNaF(SIGMA，S7920)溶於500ml蒸餾水。經0.22pm過濾器過濾溶液，在4'C保藏。20%NP40-溶液的製備稱量復0gNP40(SIGMA,Igepal-CA630，目錄號13021)。加入蒸餾水直至200g。徹底混合，在室溫儲存溶液。1MDTT溶液的製備將7.7gDTT(Biomol，目錄號04010)溶於50ml蒸餾水。經0.22jim過濾器過濾溶液，在-20X:冷凍40Qp1等分試樣。等分試樣可以保藏幾個月。2.使Hnobead接觸細胞裂解物，和用實驗化合物洗脫結合的蛋白在允許裂解物中的蛋白結合配體的條件下，使kinobead接觸小鼠腦裂解物。通過選擇能維持蛋白功能的合適緩衝條件，結合條件接近於生理條件。通過輕柔洗滌操作，去除未捕獲的蛋白後，使結合的蛋白接觸用於蛋白洗脫的實驗化合物。2.1DP-緩衝液的製備表11:5x-DP緩沖液的製備物質儲備溶液在lx裂解緩衝液中的終濃度用於115x裂解緩衝液的加入量Tris/HClpH7.51M50mM250ml甘油87%5%288mlMgCl21M1.5mM7.5mlNaCl5M150mM150mlNa具100mM1mM50ml經O.22jam過濾器過濾5x-DP緩衝液，在-80。C保藏40ml-等分試樣(注意相同緩衝液也用於製備總細胞裂解物)。從下述供應商得到這些溶液1.0MTris/HClpH7.5(SIGMA，T-2663),87%甘油(Merck,目錄號04091.2500);1.0MMgCl2(SIGMA，M-1028);5.0MNaCl(SIGMA,S-5150)。製備下述的lxDP緩衝液lxDP緩沖液(用於珠子平衡)lxDP緩沖液/0.4%NP40(用於珠子平衡和珠子的第一個洗滌步驟)lxDP緩衝液/0.2%NP40(用於珠子的第二個洗滌步驟和化合物洗脫)lxDP緩衝液/蛋白酶抑制劑(用於第一個裂解物稀釋步驟)；加入l片蛋白酶抑制劑片劑/25ml裂解緩衝液(無EDTA的片劑，蛋白酶抑制劑混合物，RocheDiagnostics,1873580)lxDP緩沖液/0.4。/。NP40/蛋白酶抑制劑(用於第二個裂解物稀釋步驟)製備lxDP-緩沖液/0.4%NP40(100ml)的實例合併下述溶液和試劑，加入蒸餾水直至100ml的終體積20ml5xDP緩沖液，5ml0.5MNaF，2ml20%NP40，100pi1MDTT，加入蒸餾水直至100ml。所有緩沖液含有1mMDTT終濃度。2.2珠子的洗滌和平衡通過用合適的緩沖液洗滌和在緩衝液中平衡，製備用於結合反應的kinobead(實施例1)。1.使用15mlFalcon試管，進行所有洗滌步驟。2.每個實驗4吏用100)i1Kinobead(沉降的珠子體積)混合相同量(25iul)的與下述4種配體偶聯的每個珠子類型(偶聯密度是1nmol/ml):BisVIII(CZC00001056)，PurvalanolB(CZC00007097)，PD173955衍生物(CZC00007324)，和CZC00008004。3.用3mllxDP緩沖液洗滌珠子2次，用3mllxDP緩衝液/0.4XNP40洗滌一次。在每個洗滌步驟過程中，反轉試管3-5次，在1200rpm、在4t:、在Heraeus離心機中離心2分鐘。抽吸上清液，並拋棄。最後洗滌步驟後，用lxDP緩沖液/0.4y。NP40製備1:1料漿(體積/體積)。2.3稀釋的細胞裂解物的製備通過在合適緩衝液中稀釋，並經離心步驟澄清，製備用於結合反應的小鼠腦裂解物。1.使用相當於每個實驗50mg蛋白的體積的細胞裂解物。2.在37C水浴中迅速融化裂解物，然後在水上保持樣品。3.以下述方式稀釋裂解物3)用lxDP緩衝液/蛋白酶抑制劑稀釋裂解物，使去汙劑濃度從O.8°/。降低至0.4%NP-40。4)用lxDP緩衝液/0.4y。NP40/蛋白酶抑制劑進一步稀釋裂解物，達到5mg/ml的終蛋白濃度(注意只有在第一個稀釋步驟之後裂解物的蛋白濃度高於5mg/ml時，才需要第二個稀釋步驟)。4.將稀釋的裂解物轉入UZ-聚碳酸酯試管(Beckmann，355654)。5.通過超速離心(20min，4X:，100.000g，TI50.2轉子，預冷的超速離心機)，澄清稀釋的裂解物。6.保藏上清液，在水上保藏。2.4結合反應和洗滌使洗滌和平衡的珠子(部分2.2)接觸稀釋的細胞裂解物(部分2.3)，以便使蛋白結合配體。通過輕柔洗滌，去除非特異性結合的蛋白，以便減少背景結合。1.在15ml或50mlFalcon試管中，合併稀釋的澄清的裂解物和100ji1洗塗的Kinobead。2.在4。C溫育2小時，在冷室中在ROTOSHAKEGENIE(ScientificIndustries,Inc,)上旋轉。3.溫育後，在41C、在1200rpm、在Heraeus離心機或等效儀器中離心3分鐘。4.小心地去除上清液，不使珠子鬆開。5.將珠子轉移至帶90jam過濾器的Mobicol-柱(MoBiTec，Goettingen,目錄號M1002-90)。6.用10mllxDP緩衝液/0.4%NP-40和5mllxDP緩沖液/0.2%NP-40洗滌珠子。7.使洗滌緩沖液完全流過柱，然後進行下一步。8.將柱置於埃彭道夫試管中，在800rpm、在4^C離心它們1分鐘。用下蓋封閉柱。2.5用實驗化合物洗脫結合的蛋白按照下述步驟，將各種不同的實驗化合物(見部分2.7)用於釋放結合的蛋白1.將含有結合的蛋白的珠子(部分2.4)重懸於lxDP緩沖液/0.2%NP-40，製成1:3料漿(體積/體積)；2.將20jul1:3料漿轉入MoBiTech柱(相當於5ju1珠子)。3.將柱置於埃彭道夫管中，在4X:、在800rpm離心15秒。用下蓋封閉柱。4.加入IOp1含有1.0mM實驗化合物的洗脫緩沖液(合適的濃度範圍是O.1-1.0mM)。根據用於溶解實驗化合物的溶劑，使用含有2%DMS0或2WDMF的洗脫緩沖液作為對照。用上蓋封閉柱。5.在埃彭道夫培養箱中、在70Qrpm，在4X:溫育30分鐘。6.打開柱(首先頂部，然後底部)，將柱放回矽化處理的試管(SafeSealMicrocentrifugeTubes,目錄號11270,SorensonBioscience,Inc.)。為了收穫洗脫物，在2.000rpm、在室溫在臺式離心機中離心2分鐘。洗脫物的典型體積是約15Ml。7.加入5ja1含有100mMDTT(DTT必須在即將使用前加入)的4xNuPAGESDS樣品緩沖液(Invitrogen，NP0007)。8.在50"C溫育30分鐘。9.加入1/10體積的200mg/ml碟乙醯胺，在室溫溫育30min，避光。該反應導致半胱氨酸的烷基化用於質譜法。10.將樣品上樣到凝膠之前，在15.000rpm離心樣品5分鐘，以便去除沉澱。11.為了蛋白分離，將10pl樣品應用於NuPAGE4-12WBis-Tris凝膠(Invitrogen，NP0335),2.6在該實驗中使用的儲備溶液的製備100mMNa3V04儲備溶液的製備1)將9.2gNa3V0,溶於400ml蒸餾水。2)使用1NNaOH或1NHC1，調節pH至10.0。原釩酸鈉溶液的起始pH可隨批次而變化。在pH10.0，溶液是黃色。3)煮沸溶液，直到它變成無色(約10min)。4)冷卻至室溫。5)再次調節pH至10.0，重複步驟2和3，直到溶液保持無色，且pH穩定在10.0。6)用蒸餾水調節體積至500ml。7)在-201C冷凍等分試樣。等分試樣可以保藏幾個月。500mMNaF儲備溶液的製備將21.0gNaF(SIGMA，S7920)溶於500ml蒸餾水。經0.22pm過濾器過濾溶液，在4。C保藏。20%NP40-溶液的製備稱量40.0gNP40(SIGMA，Igepa卜CA630，目錄號13021)。加入蒸餾水直至20Gg。徹底混合，在室溫儲存溶液。1MDTT溶液的製備將7.7gDTT(Biomol,目錄號04010)溶於50ml蒸餾水。經0.22iam過濾器過濾溶液，在-20X:冷凍40Gn1等分試樣。等分試樣可以保藏幾個月。碘乙醯胺儲備溶液(200mg/ml)的製備將2.Og碘乙醯胺(SIGMA，1-6125)溶於10ml蒸餾水。經0.22Mm過濾器過濾溶液，在-20t:冷凍400pl等分試樣。等分試樣可以保藏幾個月。2.7用於洗脫的實驗化合物下面列出的實驗化合物在如下所述的稀釋後用於洗脫實驗。實驗化合物原液的製備典型地，將所有化合物溶於100%DMS0(Fluka，目錄號41647)，濃度為100mM。或者，100%DMF(Fluka，目錄號40228)可以用於不能溶於DMSO的那些化合物。化合物保藏在-20匸。用於洗脫實驗的實驗化合物的稀釋通過用100%DMSO1:1稀釋100mM原液，製備50mM原液。對於洗脫實驗，進一步用洗脫緩沖液(=lxDP-緩衝液/0，2%NP40)1:50稀釋化合物。CZC1038:雙丐l咮基馬來醯亞胺III(供應商AlexisBiochemicals;目錄號270-051-M005;化學式-C23H2。N402;分子量384.4)。CZC7097:PurvalanolB(供應商TocrisBiochemicals，目錄號1581;化學組成C2。H"C1N63;分子量441.92;CAS號212844-54-7)。CZC00007324(PD173955衍生物；合成如實施例l所述)。CZC00008004:它是CZC00004919的類似物(合成如實施例1所述)。CZC00007098:SB202190(供應商:T0CRIS12641A/46297;化學式C2。H14N3OF;分子量331.34)。CZC00009280:星形孢菌素(供應商Sigma-ALDRICH:S4400;寬範圍激酶抑制劑；化學式C28H26N403;分子量466.53)。CZC00007449:SP600125(供應商MerckBiosciences#420119,JNK1/2抑制劑；化學式C14H8N20;分子量220.2)。3.洗脫的酶(例如激酶)的質譜分析proteotypic肽的描述胰蛋白酶消化經SDS-PAGE-分離的蛋白混合物，每種蛋白會產生具有不同物理化學性質的許多不同的肽片段。這些肽的差別在於與用於蛋白鑑別(ID)的基於質語法的分析平臺的相容性，在這裡是納米毛細管反相-液相色鐠電噴射離子化串聯質鐠(RP-LC-MS/MS)。結果，來自相同來源蛋白的肽的肽頻率有很大程度的差異，最經常觀察到的"通常"促成該蛋白的鑑別的肽稱作"proteotypic"肽。因此，"proteotypic肽"是在實驗中非常容易觀察到的肽，其會獨特地鑑別特定蛋白或蛋白同種型。proteotypic肽的優點proteotypic肽在蛋白鑑別中的應用，允許通過將蛋白鑑別過程聚焦在篩選富含信息的特徵肽的存在上，快速且集中地鑑別和定量多種已知的靶蛋白。proteotypic肽的實驗鑑別建立一列proteotypic肽的一種策略是，經驗為主地收集肽-鑑別數據，和搜索獨特地鑑別蛋白的常見肽的數據集合。對於CZ數據集合中具有至少10個明確鑑別的每個IPI資料庫蛋白條目(多肽ID或手工驗證的單肽ID)，計算貢獻肽的肽頻率。僅僅考慮根據資料庫搜尋引擎Mascot(MatrixScience)特異性的、最好的肽-光譜匹配。為了定義特定蛋白的proteotypic肽，按照遞減的肽頻率，對肽排序，並計算累積的肽存在該值會給出每種肽的鑑別比例，其中存在該肽或任一種具有更高肽頻率的肽。使用9W的累積存在截止值來定義proteotypic肽，即該蛋白的至少95%的鑑別事件是基於至少一種proteotypic肽。3.1質譜分析之前的蛋白消化和樣品製備濃縮蛋白，在4-12%NuPAGENovex凝膠(Invitrogen，Carlsbad,CA)上分離，用膠體考馬斯藍染色。在整個分離範圍內，將凝膠泳道系統地切成<48薄片(條帶和帶間區域)，並基本上如Shevchenko等，1996，AnalyticalChemistry68:850-858所述，進行凝膠內胰蛋白酶消化。簡而言之，在5mMNH4HC03(在50%EtOH中)中使凝膠塞(gelplug)脫色過夜，用12.5ng/n1胰蛋白酶(在5mMNH4HC03中)消化4小時。用1%甲酸提取肽，轉入第二個96孔平板，在真空下乾燥。將乾燥的肽重懸於10pl0.1%曱酸水溶液中，將5pl注射進LC-MS/MS系統，用於蛋白鑑別。3.2質鐠數據獲取將肽樣品注射進nanoLC系統(CapLC，Waters或Ultimate,Dionex),後者直接連接到四極飛行時間(QT0F2，QT0FUltima,QT0FMicro,Micromass或QSTARPulsar,Sciex)或離子阱(LCQDecaXP，LTQ，Thermo-Finnigan)質鐠儀。使用含水和有機溶劑的梯度，以15-45min的典型梯度時間，在LC系統上分離肽。溶劑A是5。/。乙腈於0.1%甲酸中，溶劑B是7(^乙腈於0.1%甲酸中。3.3蛋白鑑別在LC-MS/MS實驗中產生的肽質量和斷裂數據，用於查詢國際蛋白指數(IPI)蛋白序列資料庫(EBI)的內部副本。通過使用軟體工具Mascot(MatrixScience;Perkins等，1999，Electrophoresis20:3551-3567)，將測量的肽質量和斷裂數據與從資料庫的登錄條目計算出的相同數據相關聯，鑑別蛋白。搜索標準隨用於分析的質譜儀而異。4.結果該方法允許建立對於任意給定實驗化合物洗脫的激酶的譜，從而允許評估實驗化合物的選擇性。一個限制是，僅僅可以評估在第一個步驟中捕獲在kinobead上的激酶，其可能代表包含在細胞裂解物內的所有激酶的亞級分。tableseeoriginaldocumentpage77tableseeoriginaldocumentpage78小分子(激酶支架化合物)文庫。激酶名稱是根據人激酶命名法(http:〃kinase.com)和Manning等，2002，Science298，1912-1934，如補充材料所述)。tableseeoriginaldocumentpage78tableseeoriginaldocumentpage79實施例4:共同固定化的配體和分開偶聯的配體的對比該實驗的目的是，評估與共同固定化的配體(同時偶聯)相比，含有一類配體的珠子的混合物(分開偶聯的配體)在鑑別的激酶方面是否會產生類似的結果。結果表明，在兩個實驗中，鑑別的激酶存在寬重疊，證實2個方案都是可行的。將2種配體單獨或同時偶聯到瓊脂糖珠子上，然後用於使用HeLa細胞裂解物的pulldown實驗(配體1:BisVIII;配體2:CZC00008004;細節參見實施例1:kinobead的製備)。如實施例1所詳述，進行各個化合物的偶聯。也如實施例1所述進行2種配體的同時偶聯，例外是，將化合物偶聯到相同珠子上，其濃度為0.5pmol/mL，而不是標準的1pmol/mL珠子。通過HPLC分析，控制單獨或同時固定化的化合物的偶聯成功。如實施例l所述，洗滌和保藏珠子。如實施例2所述，進行HeLa細胞裂解物的製備，珠子洗滌，珠子與裂解物的接觸，釋放的蛋白的洗滌和質譖法分析(Signalokinome實驗)。表I4:通過質譜分析鑑別出的激酶。使用2種同時偶聯的配體(左邊部分)和單獨偶聯的化合物(混合的珠子；右邊部分)的實驗對比。激酶名稱是根據人激酶命名法(http:〃kinase.com)和Manning等，2002,Science298，1912-1934，如補充材料所述)。同時m(BisVIII和CZC8004預》^^)^W^S^^K子(BisVIII和CZC8004)鑑別MS粉肽做目中鑑別鰣MS粉肽的數目林預齡中1TBK1153163X1TBK1136557X2GSK3B93252X2鵬111336X3AurA89540X3TNK192144X4TYK284129X4TYK291734X5而77146X5AurA91046X6CDK274134X6G汰3A81447X7NEK973622X7CaMK2g78138X8GSDA70743X8G汰犯74533X9JNK265424X9JAK173127X10腦54823X10CaMK2d64126X11C禮g49424X11AurB63128X12CaMK2d45621X12DNAPK61024X13AAK145017X13J服257823X14AurB42415X14腿49921X15JAK11876X15CDK248519X16CDK91606016卿42317X17YES1085X17鹿36817X18FER1063X18TEC1597019MPSK1803019BIKE1244020D隨724X20YES1086X21|ULK3641021證593o表15:在同時偶聯實驗中鑑別的激酶和proteotypic肽的序列激酶名稱proteotypic肽AAK1AP麗NLYSGKAURKBIYLILEYAPRAURKBLPLAQVSAHP證AURKBSNVQPTAAPGQKCAMK2DDLKPENLLLASKCAMK2DFTDEYQLFEELGKCAMK2DGAILTTMLATRCAMK2DIPTGQEYAAKCAMK2GLTQYIDGQGRPRCDK2ALFPGDSEIDQLFRCDK2簡ASALTGIPLPLIKCDK9IGQGTFGEVFKtableseeoriginaldocumentpage81表16:在混合實驗(偶聯後混合的珠子)中鑑別的激酶和proteotypic肽的序列tableseeoriginaldocumentpage82tableseeoriginaldocumentpage83激酶名稱proteotypic肽STK6SKQPLPSAPENNPEEELASKSTK6VEFTFPDFVTEGARTBK1IASTLLLYQELMRTBK1LFAIEEETTTRTBK1TTEENPIFVVSRTBK1VIGEDGQSVYKTECELGSGLFGVVRTECGQEYLILEKTECHAFGSIPEIIEYHKTNK1AAALSGGLLSDPELQRTNK1ANL冊APPARTNK1MLPEAGSLWLLKTNUVADFGLVRPLGGARTYK2AAALSFVSLVDGYFRTYK2HGIPLEEVAKTYK2LGLAEGTSPFIKTYK2LSDPGVGLGALSRTYK2MVVAQQLASALSYLENKTYK2SLQLVMEYVPLGSLRTYK2SQAPDGMQSLRYES1EVLEQVER實施例5:kinobead配體5(吲咮配體91)的合成合成p引咮配體91:5-[5-氟-2-氧-1，2-二氫-吲哚-(3Z)-亞基曱基]-2，4-二甲基-lH-吡咯-3-甲酸(3-氨基-丙基)-醯胺步驟l:5-氟-l，3-二氫-吲哚-2-酮在110C，加熱5-氟靛紅(lg)於水合肼(55^10ml)中的溶液30分鐘。一旦懸浮液轉變成溶液，在IIO"C加熱反應4小時，然後在01C冷卻。過濾沉澱，用水洗滌。將固體懸浮於水(10ml)中，通過加入濃鹽酸，使pH降低至pH2，在室溫攪拌溶液5小時。收集沉澱，用水(2xl5ml)洗滌固體，在40X:真空烘箱中乾燥(0.26g，30%)。^NMR(400MHz，DMSO-《)510.2(s，1H);6.8-7.0(dd，2H);6.6(m，1H);3.2(s，2H);。LCMS:方法D，RT-l.736min，[MHM52]。步驟2:{3-[(5-甲醯基-2，4-二甲基-lH-吡咯-3-羰基)-氨基]-丙基}-氨基甲酸叔丁基酯向5-甲醯基-2，4-二曱基-lH-吡唑-3-甲酸(0.300g，1.79mmo1)、N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳化二亞胺(0.516g，2.69mmo1)、1-羥基苯並三唑水合物(O.364g，2.69mmo1)、三乙胺(O.502ml，3.56mmo1)於二甲基曱醯胺(3ml)中的溶液中，加入N-Boc-l，3-二氨基丙烷(0.375ml，2.15mmo1)。在室溫攪拌溶液15小時。加入鹽水(l.5ml)、水(l.5ml)和飽和碳酸氬鈉水溶液(1.5ml)的混合物，通過加入10N氬氧化鈉，將溶液的pH調節至12。用二氯甲烷甲醇(9:1)的混合物，萃取溶液3次。用無水硫酸鎂乾燥有機層。去除溶劑，通過快速色鐠(己烷乙酸乙酯(50-100%))純化殘餘物，產生黃色固體狀的希望的化合物(0.30g，52%)。^NMR(400MHz，DMS0-^)511.90(s，1H);9.50(s，1H);7.50(m，1H);6.90(m，1H);3.20(q，2H);3.00(q，2H);2.30(s，3H));2.20(s，3H));1.60(m，2H));1.40(s，9H)。LCMS:方法D,RT=2.103min，[M+Na+-346]，和[M-Boc+Na+=246]。步驟3:[3-((5-[5-氟-2-氧-l，2-二氫-吲哚-(3Z)-亞基甲基]-2，4-二甲基-lH-吡咯-3-羰基}-氨基)-丙基]-氨基甲酸叔丁基酯在78C加熱U-[(5-甲醯基-2，4-二甲基-lH-吡咯-S-羰基)-氨基]-丙基}-氨基甲酸叔丁基酯(0.200g，0.62mmol)和5-氟-l,3-二氫-吲咮-2-酮(0.Ollg，0.62mmo1)、吡咯烷(O.003ml)於乙醇(2ml)中的溶液3小時。使反應冷卻至ox:，過濾得到的沉澱，用冷乙醇洗滌。將產物懸浮於乙醇(4ml)，在72€攪拌30分鐘。過濾反應物，在40X:真空烘箱中千燥沉澱，產生希望的化合物固體(0.2658，"。/。)。^NMR(400MHz，DMS0-《)513.8(s，1H);11.00(s，1H);7.80(m，2H);7.70(m，1H);7.0(m，1H);6.9(m,2H);3.30(q，2H);3.10(q，2H);2,50(dd，6H)1.60(m，2H));1.40(s，9H)。LCMS:方法D，RT=2.86min，[M+Na+=479]，和[M-Boc+Na+=379]。步驟4:5-[5-氟-2-氧-1，2-二氫-吲哚-(3Z)-亞基甲基]-2，4-二甲基-lH-吡咯-3-甲酸(3-氨基-丙基)-醯胺將[3-({5-[5-氟-2-氧-l，2-二氫-吲哚-(3Z)-亞基甲基]-2，4-二曱基-lH-吡咯-3-羰基)-氨基)-丙基]-氨基甲酸叔丁基酯懸浮於甲醇。加入2mlHC1(4N)的二噁烷溶液，在室溫攪拌反應物過夜。去除溶刑，產生希望的化合物(O.098g，91%)。^NMR(400MHz，DMSO-《)513.8(s，1H);11.00(s，1H);7.90-7.70(m，5H);6.9(m，2H);3,30(q，2H);2.80(q，2H);2.50(dd，6H)1.80(m，2H)。LCMS:由於螢光而不確定。在惰性氣氛下進行所有反應。在Brukerdpx400上得到醒R光譜。使用zorbaxSBC-18,4.6mmxl50mm-5jla柱或小柱Z0RBAXSB-C18，4.6x75mm，3.5微米("短柱，，)，在Agilent1100上進行LCMS。柱流速是1ml/min，使用的溶劑是水和乙腈(0.1%TFA)，注射體積是10ul。波長是254和210mn。方法如下所述。表17:分析方法tableseeoriginaldocumentpage86表18:在化學方案中使用的縮寫tableseeoriginaldocumentpage87實施例6:kinobead配體6(奮唑啉配體32)的合成合成眚唑啉配體32:7-(4-氨基)-丁基氧-4-(2-氟-4-溴-苯基)-氨基-6-甲氧基喹唑啉步驟1:7-千氧基-4-(2-氟-4-溴-苯基)-氨基-6-甲氧基喹唑啉向7-苄氧基-4-氯-6-甲氧基喹唑啉(0.250g，0.83mmol)和4-溴-2-氟苯胺(190mg，l咖ol)於異丙醇(10ml)中的溶液中，加入氫氯酸(4M，於二噁烷中，0.230ml，0.92mmo1)。在90匸攪拌混合物2小時。使反應混合物冷卻至室溫。濾出固體，用冷異丙醇和乙醚洗滌，最後在50t:乾燥過夜，得到標題化合物(0.297g-79%)。^NMR(400MHz，CD30D-《)58.65(s，1H);7.96(s，1H);7.55(m，5H);7.40(t，3H);7.30(s，1H);5.37(s，2H);4.89(s，1H);4.08(s，1H)。LCMS:方法C，[M+-454]。步驟2:7-羥基-4-(2-氟-4-溴-苯基)-氨基-6-甲氧基喹唑啉將7-千氧基-4-(2-氟-4-溴-苯基)-氨基-6-曱氧基喹唑啉(297mg，0.654mmol)溶於三氟乙酸(5ml)，回流攪拌溶液l小時。使反應混合物冷卻至室溫，倒到冰上。濾出固體，吸收入甲醇中。使用氨水鹼化溶液(至pHll),並真空還原。通過過濾收集固體，用冷水和乙醚洗滌，最後在50匸真空乾燥過夜，得到標題化合物(0.165g-69。/。)？H腿(400MHz,CD3OD-《)58.55(s，1H);7.89(s，1H);7.52(m，3H);7.13(s，1H);4.08(s，3H)。LCMS:方法C，[M+-364]。步驟3:7-(4-氨基-酞醯亞胺)-丁基氧-4-(2-氟-4-溴-苯基)-氨基-6-甲氧基喹唑啉將N(-4-溴丁基)-酞醯亞胺(0.355g，0.1.187mmol)以一份加入7-羥基-4-(2-氟-4-溴-苯基)-氨基-6-甲氧基喹唑啉(360mg，0.989mmol)和碳酸鉀(410mg，2.967mmo1)於二甲基甲醯胺(7ml)中的混合物。在601C攪拌反應混合物2小時，然後冷卻至室溫。加入水(10ml)，濾出沉澱。用冷水和曱醇洗滌固體，最後在501C真空下乾燥過夜，得到標題化合物(0.317mg-57%)。NMR(400MHz，CD3OD-^)59.49(s，1H);8.29(s，1H);7.82(m,4H);7.71(s，1H);7.61(m，1H);7.47(t，1H，J-8.3Hz);7.413(m，1H);7.11(s，1H);4.09(m，2H);3.87(s，3H);3.62(m，2H);1.75(broads，4H)。LCMS:方法B，RT=9.20min，[MH+=410]。步驟4:7-(4-氨基)-丁基氧-4-(2-氟-4-溴-苯基)-氨基-6-曱氧基奮唑啉用肼一水合物處理7-(4-氨基-酞醯亞胺)-丁基氧_4-(2-氟-4-溴-苯基)-氨基-6-甲氧基喹唑啉a50mg，0.265ramo1)於二甲基甲醯胺(5ml)中的懸浮液。在室溫攪拌反應混合物2天(幾分鐘後發生溶解，觀察到原料的總消耗)，然後真空還原。使用"捕獲和釋放"方法(IsoluteSCX-2柱體，使用優化的釋放方法)，純化粘稠的黃色油，得到標題化合物(63mg，51%)。^NMR(400MHz，CDC1廠《)58.68(s，1H);8.48(t，1H，J-8.5Hz);7.36(m，1H);7.33(m，1H);7.32(broads，1H);7.25(s，1H);7.OO(s，1H);4.19(m，2H);4.02(s,3H);2.80(m，2H);1.98(m，2H);1.67(m，2H);1.49(broads，2H)。HPLC:方法D，RT-3.52min。在惰性氣氛下進行所有反應。在Brukerdpx400上得到麗R光譜。使用zorbaxSBC-18，4.6mmxl50mm-5ja柱或小柱ZORBAXSB-C18，4.6x75mm,3.5微米("短柱")，在Agilent1100上進行LCMS。柱流速是1ffll/邁in，使用的溶劑是水和乙腈(O.1訂FA)，注射體積是lOul。波長是254和210nm。方法如下所述。表19:分析方法tableseeoriginaldocumentpage89表20:在化學方案中使用的縮寫tableseeoriginaldocumentpage89實施例7:kinobead配體7(修飾的星形孢菌素)的合成根據下述方法，合成基於星形孢菌素的Kinobead配體7。步驟1:用二甘醇酸酐(diglycolicacidanhydride)修飾星形孢菌素將星形孢菌素(典型地10mg，IRIS-Biotech,Germany)溶於1ml無水DMF中，加入5mLTEA,冷卻至0C。從該溶液中，取出5pl，與50jilACN相混合，用於使用LC-MS系統(AGILENT,Germany)測定相對起始量。對於LC-MS分析，將5pi反應混合物稀釋進50)Lil100%ACN。徹底混合後，使用自動釆樣器，將5pi應用於HPLC分析。進行分離，流速為450|nl/niin，使用0.1%甲酸水溶液作為溶劑A，使用在100%ACN中的0.1%甲酸作為溶劑B，使用3x50mmC18柱(ZORBAX-延伸的C18，AGILENT,Germany)。使用75分鐘中10%A-95%B的梯度。在254nin觀察紫外吸光度，通過單階段四極MS系統(MSD，AGILENT:Germany),在線測定化合物的分子質量。手工檢查記錄的數據。該第一個分析用作計算反應產物產率的標準。基於純星形孢菌素，將紫外信號的峰面積設定為100%，作為起始量。向冰冷卻的星形孢菌素溶液中，加入IO倍過量的於DMF中的二甘醇酸酐(MerckGermany)。接近100%產率的反應在10分鐘內結束，通過混合5pl反應混合物和50piACN，通過HPLC檢查，並如上所述通過LC-MS進行分析。對於帶單電荷的分子，分子質量從467.5Da(未修飾的星形孢菌素)遷移至545.6Da(修飾的星形孢菌素)。如果反應不完全，再加入10倍過量的二甘醇酸酐，將混合物在室溫保持另外30分鐘。如上所述通過LC-MS分析反應混合物。反應結束後，檢測不到未〗務飾的星形孢菌素。將5mL水加入反應混合物，首先淬滅酸酑，其次稀釋以進行固相提取。通過用10ml甲醇活化和用0.1%TFA水溶液平衡，製備500mgC18固相提取柱(Phenomenex，Germany),《吏用膜真空泵，以約2-3ml/min的流速，將溶劑抽過該柱。將含水反應混合物應用於該柱，以與上面相同的流速，將其抽過。溶液完全通過柱並且修飾的星形孢菌素結合C18材料後，首先用5%ACN0.1%TFA洗滌，然後用10。/。ACN洗滌，最後用20%ACN洗滌，都含有0.1°/。TFA水溶液。然後用70%ACN，0.1%TFA水溶液、隨後用80%ACN，0,1%TFA水溶液洗脫修飾的星形孢菌素。合併洗脫物，並真空乾燥。步驟2:使用PyBroP-化學，將修飾的星形孢菌素偶聯到固相結合的二胺上將修飾的星形孢菌素溶於無水DMF中，加入在DMF中的預溶脹的雙-(氨基乙基)乙二醇-三苯甲基樹脂(IRISBiotech,Germany),加入2-3倍過量的固相結合的二胺。向料漿中，加入IOpl二異丙基乙基胺(DIEA，FLUKA，Germany)和相對於修飾的星形孢菌素5倍過量的PyBroP。在反轉混合儀上，在恆定混合下，在室溫進行反應16小時。使用如上所述的LC-MS系統，通過HPLC檢查上清液中未結合的修飾的星形孢菌素，該步驟不是定量的，僅僅測量未結合的修飾的星形孢菌素的消失。反應結束後(不再能檢測到未結合的修飾的星形孢菌素)，用IO體積的無水DMF洗滌樹脂，用10體積的DCM洗滌2次。步驟3:裂解反應然後將樹脂重懸於5體積DCM,冷卻至0'C，加入1mlTFA。先前的淺黃色樹脂現在應當變成暗紅色，指示反應。在0。C進行裂解20分鐘，在室溫進行20分鐘。收集溶液，用10體積的DCM洗滌樹脂2次。合併所有洗脫物，使用旋轉式蒸發器乾燥。將剩餘的油膜溶於0.5mlDMF，加入5ml水。通過如上所述的固相提取，純化修飾的星形孢菌素，並在真空下千燥。將反應產物溶於lmlDMF後，如上所述，使用HPLC，通過254nm紫外吸光度，相對於未修飾的星形孢菌素溶液，針對原始未修飾的星形孢菌素溶液檢查產率。從該溶液中，取5與50jilACN相混合，通過LC-MS分析5jtl。預期產物的分子質量是727.8Da。將在254nm的峰面積與未修飾的星形孢菌素的峰面積(如所述分析為100%)相關聯。象通常一樣，通過它的氨基，將修飾的星形孢菌素用於偶聯NHS-活化的瓊脂糖。偶聯之前，用12ml無水DMSO洗滌lml珠子3次，然後用1mL無水DMSO重懸。向該懸浮液中，加入20TEA和1一ol修飾的星形孢菌素於DMF中的等價物。加入和混合均勻並在1200rpm短離心1'分鐘後，直接取20nl上清液，通過LC-MS分析5pl。在旋轉混合儀上在連續混合下16小時後，再次離心懸浮液，取20pl，通過如上所述的LC-MS分析5pi,用於測定剩餘的未結合的修飾的星形孢菌素。通常，100%修飾的星形孢菌素會結合。然後，用12mlDMS0洗滌珠子3次，再次用1mlDMS0重懸，加入50jil乙醇胺(MERCK，Germany),以封閉未反應的NHS-激活的基團。在連續混合下，進行反應16h。封閉反應後，用12ml異丙醇(MERCK，Germany)洗滌珠子3次，並在4TC保藏為l:l料漿備用。使用下述試劑DMF:N，N-二甲基曱醯胺(FLUKA，40228);TEA:三乙胺(SIGMA-Aldrich，T0886);ACN:用於HPLC的乙腈(Merck,1.00030);TFA:三氟乙酸(FLuKA，09653);PyBroP:溴-三-p比咯烷基-磷鎮六氟碼酸鹽(Novabiochem，0卜62-0017);DCM:二氯曱烷(FLUKA，66749);DMSO:二甲基亞碸(FLUKA，41648)。實施例8:裂解物中的竟爭結合和定量蛋白親和力圖譜(PAP)本實施例解釋了細胞裂解物中的竟爭結合(具體見本發明的第三個方面)。將實驗化合物雙吲哚基馬來醯亞胺VIII(BisVIII，一種眾所周知的激酶抑制劑；Davies等，2000.Specificityandmechanismofactionofsomecommonlyusedproteinkinaseinhibitors.BiochemicalJournal351(Pt1):95-105)加入細胞裂解物，從而使實驗化合物結合裂解物中的靶蛋白。然後，使裂解物接觸kinobead親和基質，以捕獲剩餘的游離靶蛋白。然後，用含有去汙劑的緩沖液洗脫結合到kinobead基質上的蛋白，在SDS-聚丙烯醯胺凝膠上分離，並通過免疫檢測(蛋白印跡)或質譜檢測進行分析。對於蛋白印跡分析，從親和基質洗脫結合到親和基質上的蛋白，並隨後通過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳分離，轉移到印跡膜上。用針對GSK3oc、GSK30和ITK的特異性抗體，檢測各個激酶(圖4A)。結果表明，細胞裂解物與BisVIII預溫育，以劑量依賴性的方式阻止乾蛋白GSK3a和GSK3p與Hnobead基質的結合。遞增濃度的激酶抑制劑BisVIII，特異性地阻止GSK3oc和GSK3P與kinobead的結合，但不會阻止ITK的結合。對於GSK3P，定量信號，針對加入細胞裂解物中的BisVIII濃度繪圖(圖4B)。為了通過質譜法定量檢測蛋白，從親和基質洗脫蛋白，並隨後通過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳進行分離。切出合適的凝膠區域，用胰蛋白酶進行凝膠內蛋白水解消化。用iTRAQ試劑標記4份胰蛋白酶消化的樣品(對應裂解物中的3個不同的BisVIII濃度和1份DMS0對照)，在單一LC-MS/MS質i普分析中分析合併的樣品，隨後在MS/MS鐠中峰定量(Ross等，2004.MultiplexedProteinquantitationinSaccharomycescerevisiaeusingamine-reactiveisobarictaggingreagents.Mol.Cell.Proteomics3(12):1154-1169)。結果表明，檢測到不同水平的單個蛋白，並計算了相對強度值(表21)。顯示了各個激酶的結合曲線(圖5)。代表激酶-化合物對的親和力的相對強度50(RI50)值類似於激酶酶測定中報告的IC50值(Davies等，2000.Specificityandmechanismofactionofsomecommonlyusedproteinkinaseinhibitors.BiochemicalJournal351(Pt1):95-105)。1.細胞培養在l升旋動燒瓶(IntegraBiosciences,#182101)內的添加了10%胎牛血清(Invitrogen)的RPMI1640培養基(Invitrogen，#21875-034)中，以0.15x106至1.2x106細胞/ml的密度，懸浮培養Jurkat細胞(來自ATCC的克隆E6-1，編號TIB-152)，離心收集。在液氮中冷凍細胞沉澱，隨後保藏在-8ox:。2.細胞裂解物的製備在PotterS勻漿器中，在下述裂解緩衝液中均質化Jurkat細胞50mMTris-HCl，0.8%NP40,5%甘油，150mMNaCl，1.5mMMgC12，25mMNaF，1mM釩酸鈉，1mMDTT，pH7.5。每25ml緩沖液加入1片不含EDTA的完全片劑(蛋白酶抑制劑混合物，RocheDiagnostics,1873580)。使用機械化的POTTERS，研磨物質10次，轉移至50mlfalcon試管，在水上溫育30分鐘，在20，000g、在4X:(10，000rpm,在SorvallSLA600中，預冷)旋轉10分鐘。將上清液轉移至超速離心(UZ)-聚碳酸酯試管(Beckmann，355654)並在100.000g、在4匸(33.500rpm，在Ti50.2中，預冷)旋轉1小時。將上清液再次轉移至新鮮的50mlFalcon試管，通過Bradford測定(BioRad)，測定蛋白濃度，製備每份等分試樣含有50mg蛋白的樣品。將樣品立即用於實驗，或在液氮中冷凍，在-80C冷凍保藏。3.裂解物與實驗化合物預溫育在41c，Jurkat裂解物的等分試樣(10mg蛋白)與不同的BisVIII濃度(0.025mM，0.074jaM，0.22jaM，0.67jliM，2.0和6.0jaM終濃度的BisVIII)溫育1小時。為此，在100。/。DMSO溶劑中製備BisVIII溶液，相當於200倍希望的終BisVIII濃度(BisVIII來自AlexisBiochemicals目錄號ALX270-056)。將5pl這樣的溶液加入1ml裂解物，產生指示的終濃度。關於對照實驗，使用5m1不含BisVIII的DMSO。4.用kinobead進行蛋白捕獲向每份預溫育的裂解物樣品中，加入40"1kinobead(見實施例l),在4C溫育1小時。在溫育過程中，在反轉搖動器(RotoShakeGenie，ScientificIndustriesInc.)上旋轉試管。通過離心收集珠子，轉移至Mobicol-柱(MoBiTech10055)，用含有0.4°/。NP40去汙劑的10mllxDP緩沖液洗滌，然後用含有0.2%NP40的5mllxDP緩衝液洗滌。為了洗脫結合的蛋白，加入IOOpi2xSDS樣品緩衝液，在50。C加熱柱30分鐘，通過離心，將洗脫物轉移至微量離心管。然後，通過SDS-聚丙烯醯胺電泳(SDS-PAGE)分離蛋白。緩衝液的組成和製備如實施例2所述。5.通過蛋白印跡分析進行蛋白檢測根據標準操作，進行蛋白印跡，並根據生產商的說明書(AmershamBiosciences,#RPN2106)，用ECL蛋白印跡檢測系統顯色。來自Amersham的ECL蛋白印跡系統是直接或間接用辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗體檢測特定抗原的光發射非放射性方法。以1:1000的稀釋度，使用抗-糖原合酶激酶3P(GSK3P)抗體(兔多克隆抗-GSK3P，StressgenBioreagents,Victoria,Canada,產品編號KAP-ST002)。該抗體也識別GSK3oc。也以1:1000的稀釋度，使用抗-ITK抗體(兔多克隆抗-ITK抗體，UpstateLakePlacid,NY，目錄號06-546)。6.通過質譜法進行蛋白檢測6.1質譜分析前的蛋白消化還原凝膠分離的蛋白，烷基化，基本上按照Shevchenko等，1996，Anal.Chem.68:850-858所述的操作，在凝膠中消化。簡而言之，使用清潔的解剖刀，從凝膠切離經凝膠分離的蛋白，使用10mMDTT還原(在5mM碳酸氫銨中，54°C，45分鐘)，隨後在室溫用55mM碘乙醯胺(在5mM碳酸氬銨中)在黑暗中烷基化30分鐘。以在SmM三乙基銨碳酸氫鹽(TEAB)中10ng/pl的蛋白酶濃度，用豬胰蛋白酶(Promega)在凝膠中消化經還原和烷基化的蛋白。在37°C進行消化4小時，隨後使用5pi5%曱酸終止反應。6.2質鐠法分析之前的樣品製備用20pi1%甲酸水溶液提取凝膠塞2次，用20卩l0.1%甲酸，60%乙腈水溶液提取1次，與酸化的消化上清液合併。在真空中千燥樣品。6.3肽提取物的iTRAQ標記用同量異序標記試劑的不同異構體(iTRAQReagentsMultiplexKit,partnumber4352135，AppliedBiosystems，FosterCity,CA,USA),處理用不同濃度的實驗化合物(0.074)iM，0.22jaM和0.67pMBisVIII)和溶劑對照(0.5%DMSO)處理過的樣品的肽提取物。iTRAQ試劑是一組多種多樣的、胺-特異性的、穩定的同位素試劑，其可以標記多至4個不同生物樣品中的所有肽，實現肽的同時鑑別和定量。根據生產商提供的說明書，使用iTRAQ試劑。將樣品重懸於10jal50mMTEAB溶液，pH8.5，加入lOpl乙醇。將iTRAQ試劑溶於85pl乙醇，將IOjil試劑溶液加入樣品。在室溫在水平搖動器上進行標記反應1小時，通過加入10y110%甲酸水溶液停止反應。然後合併4份經標記的樣品，在真空離心機中乾燥，重懸於IOnl0.1%甲酸水溶液。6.4質語數據獲取將肽樣品注射進nanoLC系統(CapLC，Waters或Ultimate,Dionex)，後者直接連接到四極TOF(QTOF2,QTOFUlUma，QTOFMicro,Microraass)或離子阱(LTQDecaXP)質鐠儀。使用含水和有機溶劑的梯度(見下文)，在LC系統上分離肽。溶劑A是5W乙腈於0.5%甲酸中，溶劑B是70。/fl乙腈於0.5%甲酸中。表3:從LC系統洗脫的肽在質譜儀內部分測序tableseeoriginaldocumentpage966.5蛋白鑑別在LC-MS/MS實驗中產生的肽質量和斷裂數據，用於查詢在NCBI(對於NCBInr，dbEST以及人和小鼠基因組)和歐洲生物信息學研究所(EBI，對於人，小鼠，黑腹果蠅和美麗線蟲蛋白質組資料庫)維持和定期更新的fasta格式化的蛋白和核苷酸序列資料庫。通過使用軟體工具Mascot(MatrixScience;Perkins等，1999.Probabi1ity-basedproteinidentificationbysearchingsequencedatabasesusingmassspectrometrydata.Electrophoresis20，3551-3567)，將測量的肽質量和斷裂數據與從資料庫中登錄條目計算出的相同數據相關聯，鑑別蛋白。搜索標準隨分析使用的質鐠儀而異。6.6蛋白定量基本上如Ross等人(Ross等，2004.MultiplexedproteinquantitationinSaccharomycescerevisiaeusingamine—reactiveisobarictaggingreagents.Mol.Cell.Proteomics3(12):1154-1169)所述，使用iTRAQ報告離子信號的峰面積，進行相對蛋白定量。6.7結合曲線和RI50值的測定在表21中顯示了鑑別的激酶的相對強度(RI)值。以在細胞裂解物中的3個不同濃度，使用實驗化合物BisVIII，將RI值相對於DMSO對照標準化。對於選擇的激酶，針對BisVIII的濃度繪製RI值，使用雙曲線平衡模型，4吏用Xlfit程序(IDBusiessSolutionsLtd.)進行曲線擬合(圖5)。RI50值對應著激酶的MS信號的相對強度與溶劑(DMS0)對照相比是50%時的實驗化合物(BisVIII)濃度。表21:通過質i普分析鑑別的蛋白以在細胞裂解物中的3個不同濃度，使用實驗化合物BisVIII,將得到的RI值相對於設定為1.0的DMS0對照標準化。列出了相對強度值。代表是指國際蛋白指數(IPI，EuropeanBioinformaticsInstitute)的資料庫登錄號，IPI是源自幾個高質量序列資料庫的蛋白序列的彙編(包括GenBank，EMBL，SwissProt，RefSeq，Ensembl)。激酶名稱是根據人激酶命名法(http:〃kinase.com)和Maiming等，2002，Science298，1912-1934，如補充材料所述)。tableseeoriginaldocumentpage98權利要求1.表徵至少一種酶的方法，其包括下述步驟a)提供含有該酶的蛋白製品，b)在允許酶結合廣譜酶配體的條件下，在基本上生理條件下使該蛋白製品接觸至少一種固定化在固體支持物上的所述廣譜酶配體，c)洗脫酶，和d)通過質譜法表徵洗脫的酶。2.權利要求l的方法，其中步驟a)中蛋白製品的提供包括下述步驟收穫至少一個含有該酶的細胞，和裂解該細胞。3.表徵至少一種酶的方法，其包括下述步驟a)提供2份等分試樣，其各自包含至少一個含有該酶的細胞，b)將一份等分試樣與給定化合物溫育，c)收穫細胞，d)裂解細胞，e)在允許酶結合廣鐠酶配體的條件下，在基本上生理條件下使細胞裂解物接觸至少一種固定化在固體支持物上的所述廣i瞽酶配體，f)洗脫酶，和g)通過質鐠法表徵洗脫的酶。4.權利要求3的方法，其中通過表徵酶，可以確定化合物的施用是否會導致該酶的差異表達或激活狀態。5.表徵至少一種酶的方法，其包括下述步驟a)提供含有該酶的蛋白製品的2份等分試樣，b)在允許酶結合廣諳酶配體的條件下，在基本上生理條件下使一份等分試樣接觸至少一種固定化在固體支持物上的所述廣譜酶配體，c)在允許酶結合廣譜酶配體的條件下，在基本上生理條件下使另一份等分試樣接觸至少一種固定化在固體支持物上的所述廣譜酶配體和接觸給定化合物，d)洗脫酶，和e)通過質謙法表徵洗脫的酶。6.權利要求5的方法，其中步驟a)中蛋白製品的提供包括下述步驟收穫至少一個含有該酶的細胞，和裂解該細胞。7.權利要求5或6中任一項的方法，其中檢測到與化合物溫育的等分試樣中酶的減少，指示著該酶是該化合物的直接乾物。8.表徵至少一種酶-化合物複合物的方法，其包括下述步驟a)提供含有該酶的蛋白製品，b)在允許酶結合廣語酶配體的條件下，在基本上生理條件下使蛋白製品接觸至少一種固定化在固體支持物上的所述廣譜酶配體，c)使結合的酶接觸化合物，以釋放至少一種結合的酶，和d)通過質鐠法表徵釋放的酶，或e)從配體洗脫酶，和通過質鐠法表徵酶，從而鑑別該化合物的一種或多種結合伴侶。9.權利要求8的方法，其中步驟a)中蛋白製品的提供包括下述步驟收穫至少一個含有該酶的細胞，和裂解該細胞。10.權利要求9的方法，作為中或高處理量篩選進行。11.權利要求3-10中任一項的方法，其中所述化合物選自合成的化合物，或有機合成藥物，更優選小分子有機藥物，和天然小分子化合物。12.權利要求1-11中任一項的方法，其中所述酶選自激酶，磷酸酶，蛋白酶，磷酸二酯酶，氫化酶，脫氫酶，連接酶，異構酶，轉移酶，乙醯化酶，脫乙醯基酶，GTP酶，聚合酶，核酸酶，和解旋酶。13.權利要求1-12中任一項的方法，其中所述配體會結合給定酶類別中10%-50%、優選30°/。-50%的酶。14.權利要求l-13中任一項的方法，其中所述配體是抑制劑。15.權利要求14的方法，其中所述酶是激酶，配體選自雙吲哚基馬來醯亞胺VIII，PurvalanolB，CZC00007324(可連接的PD173955),和CZC00008004。16.權利要求l-15中任一項的方法，其中通過表徵酶的共同洗脫的結合伴侶、酶亞基或酶的翻譯後修飾，進行酶的表徵。17.權利要求l-16中任一項的方法，其中通過鑑別酶或酶結合伴侶的proteotypic肽，進行所述表徵。18.權利要求17的方法，其中通過對比為酶或結合伴倡得到的proteotypic肽和已知的proteotypic肽,進行所述表徵。19.權利要求1-18中任一項的方法，其中所述固體支持物選自瓊脂糖，改性瓊脂糖，瓊脂糖珠子(例如NHS-活化的瓊脂糖)，膠乳，纖維素，和亞鐵-或鐵磁性顆粒。20.權利要求l-19中任一項的方法，其中所述廣鐠酶配體共價偶聯到固體支持物上。21.權利要求l-20中任一項的方法，其中使用1-IO種不同配體，優選l-6、更優選l-4種。22.權利要求l-21中任一項的方法，其中當使用超過一種配體時，每種配體存在於不同固體支持物上。23.權利要求l-21中任一項的方法，其中當使用超過一種配體時，至少2種不同配體存在於一個固體支持物上。24.權利要求1-23中任一項的方法，其中通過表徵酶或化合物-酶複合物，確定細胞中酶類別的全部或部分成員的身份。25.權利要求3-24中任一項的方法，其中所述化合物不同於配體。26.權利要求l-25中任一項的方法，其中配體和酶之間的結合是非共價結合。27.生產藥物組合物的方法，其包括下述步驟a)根據權利要求6-17中任一項的方法，鑑別酶-化合物複合物》和b)將化合物配製成藥物組合物。28.權利要求27的方法，還包括調節化合物對酶的結合親和力的步驟。29.至少一種固定化在固體支持物上的廣譜酶配體在表徵至少一種酶或表徵至少一種酶-化合物複合物中的應用。全文摘要本發明涉及表徵酶或酶-化合物複合物的方法，其中所述酶在至少一種固定化在固體支持物上的廣譜配體的輔助下，從蛋白製品得到，且其中通過質譜法表徵酶。這些方法用於篩選未固定化的化合物文庫，先導化合物的選擇性表徵和在活細胞中的作用機制研究。文檔編號G01N33/68GK101223447SQ200680025846公開日2008年7月16日申請日期2006年6月7日優先權日2005年6月14日發明者B·屈斯特,C·霍普夫,D·埃伯哈德,D·米德爾米斯,G·德勒韋斯,M·班舍夫,M·賴達,U·克魯澤,V·雷德爾申請人:塞爾卓姆股份公司