定量測量螢光共振能量轉移效率的方法
2024-04-03 05:35:05
專利名稱：定量測量螢光共振能量轉移效率的方法
技術領域：
本發明屬於測量供體一受體的相互作用及其能量共振轉移效率的測量方法。可作為生物、醫學、光學、物理、化學等學科類的科研與檢測。
長期以來有一種需要，即如何定量測量供體受體間的螢光共振能量轉移(FRET)效率，達到定量監測供體受體間的相互作用和構形變化的目的。
目前，國內尚還沒有該方面的研究。
國外已有定量測量螢光共振能量轉移的方法和專利。例如，美國專利No.762245，摩洛哥1991年9月19日申請；No.065585，日本1998年4月24日申請；No.684268，日本1996年7月17日申請。這些方法和專利或者不能完全消除串擾(Cros-talk)和濃度的影響，或者因要使用的濾光片和測量的數據太多，而不能滿足生物醫學研究的需要。利用測量螢光強度研究螢光共振能量轉移效率時的主要問題有(1)供體發射譜與受體發射譜的串擾(Cross-talk)使實際測量時很難或不可能將它們分開；(2)螢光共振能量轉移成分與非螢光共振能量轉移成分混在一起；(3)供體和受體發射的螢光強度與供體和受體的濃度有關，但是其定量關係卻很難確定。
本發明的目的是針對現有技術中存在的問題和不足，提出的一種能快速定量檢測螢光共振能量轉移效率的測量方法。
本發明所說的定量測量螢光共振能量轉移效率的方法，其適用條件為(1)供體和受體的發射譜形狀與螢光共振能量轉移效率無關，即螢光共振能量轉移只改變供體和受體螢光發射譜的強弱而不改變其形狀，或螢光共振能量轉移對供體發射譜形狀的影響很小以致可被忽略；(2)激發光源只選擇性地激發供體而不激發受體或者對受體激發較小以致可被忽略。
本發明所說的定量測量螢光共振能量轉移效率的方法，利用對供體和受體兩個通道的有關參數進行測量，並通過對相關數據的處理後而得出其螢光共振能量轉移效率和供體受體間的距離。兩個通道性質的要求(1)第一個通道(簡稱CH1)必須包括部分或全部供體螢光發射譜；(2)第二個通道(簡稱CH2)必須包括部分或全部受體螢光發射譜；(3)激發光不在兩個通道的光譜範圍；(4)兩個通道的探測譜範圍不能完全相同。
本發明中定量測量螢光共振能量轉移效率的通用公式為AE1-E=RatioKd1-Kd2Ka2-RatioKa1---(a)]]>E=R06r6+R06---(b)]]>式中，E是螢光共振能量轉移螢光共振能量轉移效率，Ratio是兩個探測通道的螢光強度的比值，φA是受體的能量量子產生額，R0是Frster臨界距離，r是供體與受體之間的距離，Kd1和Kd2分別是兩個通道中供體發射螢光強度與供體發射的全部螢光強度的比值，Ka1和Ka2分別是兩個通道中受體發射螢光強度與受體發射的全部螢光強度的比值。Kd1,Kd2,Ka1和Ka2由供體發射譜spd(λ)和受體的發射譜spa(λ)及兩個通道的帶通性質計算得到，而與樣品的構形和動態性質無關。其計算公式為Kd1=CH1spdd-+spdd,Kd2=CH2spdd-+spdd,Ka1=CH1spad-+spad,Ka2=CH2spad-+spad]]>當受體的能量量子產生額φA已知時，只要測量出Ratio，代入(a)式，既可計算得到螢光共振能量轉移效率E。
本發明所說的定量測量螢光共振能量轉移效率方法的步驟為(1)根據供體受體的發射譜選擇適當的濾光片，所說的濾光片應滿足以上所說的兩個通道性質的要求；(2)根據供體和受體的發射譜及選擇的濾光片計算得到係數Kd1,Kd2,Ka1和Ka2；(3)用激發光選擇性地激發供體；(4)測量兩個通道的螢光強度，並由此計算得到第二通道與第一通道的螢光光強比值Ratio；(5)將Ratio代入公式(a)計算得到螢光共振能量轉移效率E；(6)將E代入公式(b)計算得到供體受體間的距離r。
本發明所說的定量測量螢光共振能量轉移效率的方法具有簡單易行特點。只要對兩個通道中的螢光強度進行測量，利用取得的數據即可計算出其螢光共振能量轉移效率和供體、受體間的距離。
本發明的實施實例1．完整供體-受體對的實施實例選擇Cameleon(簡稱「YC2.1」)供體-受體對，它的供體和受體連接在一起的，其供體(Cyan)和受體(Yellow)的發射譜見
圖1所示。Miyawaki用432納米的激發光在體外激發完整的YC2.1，並分別測量了在零鈣(-Ca2+)和飽和鈣(+Ca2+)情況下的螢光發射譜，如圖2所示。在圖2中，實線表示完整YC2.1在飽和鈣時的發射譜，而虛線表示完整YC2.1在零鈣時的發射譜，圖1中480DF30表示第一個通道，535DF25表示第二個通道。根據測量的供體-受體對的螢光發射譜sp(λ)可由下式得到Ratio。Ratio=CH2h1spdCH1h2spd---(c)]]>其中h1(λ)和h2(λ)分別表示第一個通道和第二個通道的帶通性質。
對零鈣有Ratio=2.2358,Kd1=0.3589,Kd2=0.2540,Ka1=0.0027,Ka2=0.7341。Frster臨界距離R0取50，受體能量量子產生額φA取0.71，則由(a)式和(b)式計算得到常量螢光共振能量轉移效率E=51.49％，供體與受體間的距離r=49.5083。
2．分離供體-受體對的實施實例供體和受體是兩個獨立的標記物。分離的Cameleon(YC2.1)的結構見圖3所示，供體ECFP與CaM結合在一起，受體EYFP-V68L/Q69K與M13結合在一起。Miyawaki測量了分離YC2.1在幾種不同CaM濃度時的螢光發射譜(見圖3)。按照本專利所說的方法計算了分離YC2.1的Ratio,E和r。當第一個通道帶通性質是476/40，第二個通道帶通性質是535/60時，計算結果為加入0μM的CaM時，比值Ratio、螢光共振能量轉移效率E及r分別為3.0721,59.01％和47.0537；加入1μM的CaM時，比值Ratio、螢光共振能量轉移效率E及r分別為1.6676,32.37％和56.5333；加入8μM的CaM時，比值Ratio、螢光共振能量轉移效率E及r分別為1.2031,14.02和67.6460；加入100mM的EGTA時，比值Ratio、螢光共振能量轉移效率E及r分別為1.14，10.7％和72.2。
權利要求
1.一種定量測量螢光共振能量轉移效率的方法，利用對供體和受體兩個通道的有關參數進行測量，並通過對相關數據的處理後而得出其螢光共振能量轉移效率和供體受體間的距離；其特徵在於，對兩個通道性質要求(1)第一個通道必須包括部分或全部供體螢光發射譜；(2)第二個通道必須包括部分或全部受體螢光發射譜；(3)激發光不在兩個通道的光譜範圍；(4)兩個通道的探測譜範圍不能完全相同；所說的定量測量螢光共振能量轉移效率方法的步驟為(1)根據供體和受體的發射譜選擇適當的濾光片，所說的濾光片應滿足以上所說的兩個通道性質的要求；(2)根據供體和受體的發射譜以及選擇的濾光片計算得到係數Kd1,Kd2,Ka1和Ka2；(3)用激發光選擇性地激發供體；(4)測量兩個通道的螢光強度，並由此計算得到第二通道與第一通道的螢光光強比值Ratio；(5)將Ratio代入公式(a)計算得到螢光共振能量轉移效率E；(6)將E代入公式(b)計算得到供體受體間的距離r。
2.按照權利要求1所說的定量測量螢光共振能量轉移效率的方法，其特徵在於，所說的計算公式(a)為AE1-E=RatioKd1-Kd2Ka2-RatioKa1]]>。
全文摘要
本發明屬於一種可作為生物、醫學、光學、物理、化學等學科類的科研與檢測,測量供體－受體的相互作用及其能量共振轉移效率的測量方法。1)根據供體受體的發射譜選擇適當的濾光片;2)根據供體受體的發射譜計算得到係數K
文檔編號G01N21/64GK1321883SQ00114550
公開日2001年11月14日 申請日期2000年4月28日 優先權日2000年4月28日
發明者曾紹群, 陳同生, 駱清銘 申請人:華中理工大學