一種微生物的固定化方法
2024-03-27 01:38:05
專利名稱：：一種微生物的固定化方法
技術領域：
：本發明涉及微生物的固定化，具體地說是一種以乳化-內部凝膠化體系固定微生物的海藻酸-殼聚糖微膠囊製備方法。
背景技術：
：固定化微生物技術具有很好的優越性，如微生物在一定空間區域內密度高，微生物流失問題被消除，反應速度加快，發酵後處理過程簡便等。即固定化微生物技術構成一種髙效、快速、能連續處理的發酵系統，在很多領域得到廣泛應用。在眾多的固定化方法中，以海藻酸鹽凝膠包埋法使用較多，而且應用的也比較成熟。該方法具有條件溫和、細胞穩定性好、承載細胞數量多、不易洩漏等優點(肖美燕，徐爾尼，陳志文.包埋法固定化細胞技術的研究進展.食品科學，2003,24(4):158~161.)。現有海藻酸鹽固定化細胞主要釆用噴霧乾燥法、銳孔擠出法、滴定法、靜電滴定法製備凝膠珠，但這些方法存在許多問題，如不能製備出粒徑90%，粘均分子量10-150KDa。本發明具有如下優點1.設備簡單，易於操作。本發明採用的固定化微生物的乳化體系，所使用的機械設備只有一種簡單的機械攪拌器，且操作步驟簡單。2.產量可控，能實現規模化。本發明釆用的固定化微生物的乳化體系，製備微膠囊的產量高，易於放大，可規模化生產，適合於微生物細胞的高密度、規模化培養。3.微生物活性高，且微膠囊在培養液中穩定，細胞不易洩漏。本發明採用的固定化微生物的乳化體系，製備條件溫和，製備過程中微生物細胞活性保持良好，細胞洩漏率較低，適合於酵母菌、大腸桿菌、乳酸菌、枯草桿菌、硝化細菌等多種微生物的固定化包埋、培養。4.微膠囊粒徑小，改善溶質擴散。本發明釆用的固定化微生物的乳化體系，製備出微膠囊粒徑較小，更有利於營養物質和代謝產物在微囊內擴散。總之，與傳統的海藻酸鈣凝膠固定化技術相比，本發明方法具有設備簡單、操作方便、細胞活性高、可規模化生產的優點。圖1a為海藻酸鈉液體石蠟體積為2:3時微膠囊的粒徑及粒徑分布圖。圖1b為海藻酸鈉液體石蠟體積為h3時微膠囊的粒徑及粒徑分布圖。圖2a為本發明工藝固定後酵母菌存活率。圖3a為本發明製備的海藻酸-殼聚糖微囊化酵母菌培養初始Oh的顯微照片。圖3b為本發明製備的海藻酸-殼聚糖微囊化酵母菌培養12h的顯微照片。圖3c為本發明製備的海藻酸-殼聚糖微囊化酵母菌生長曲線，其中，固定化的酵母菌為處理組；游離酵母菌為對照組。圖4為本發明製備的海藻酸-殼聚糖微囊化乳酸菌初始顯微鏡照片。圖5為本發明工藝製備的固定化後的乳酸菌存活率。圖6為本發明工藝製備的固定化乳酸菌生長曲線，其中，固定化的乳酸菌為處理組；游離乳酸菌為對照組。圖7為本發明工藝製備的固定化後的大腸桿菌存活率。圖8為本發明製備的海藻酸-殼聚糖微囊化乳酸菌培養14h顯微鏡照片。圖9為本發明工藝製備的固定化大腸桿菌生長曲線，其中，固定化的大腸桿菌為處理組；游離大腸桿菌為對照組。具體實施方式實施例11)室溫下，將均勾混合有啤酒酵母和納米級碳酸鈣的海藻酸鈉溶液作為分散相添加到分散介質中，然後在攪拌器轉速為150轉/分攪拌乳化5分鐘，形成乳液；分散相中海藻酸鈉溶液的重量體積濃度為1.5%，分散相中納米級碳酸鉤的重量體積濃度為0.020%;所述分散介質為含有span85的液體石蠟，分散相與分散介質的體積比為1:3;分散相中微生物種子的濃度為105cfu/ml;分散介質中span85的體積百分含量為0.1%;2)在上述乳液中加入含有體積濃度為5%冰醋酸的液體石蠟調節乳液pH=6，繼續攪拌5-10分鐘，形成包埋有微生物的海藻酸鈣凝膠珠，加入相當於乳液體積2倍的去離子水靜置10分鐘；3)用200目的篩網將上述步驟中得到的混合液進行過濾並用含有tween8G的水溶液進行反覆衝洗，收集凝膠珠；4)將包埋有微生物的海藻酸鈣凝膠珠與分子量為20kDa,脫乙醯度為99%的殼聚糖溶液反應IO分鐘，形成包埋有釀酒酵母的海藻酸-殼聚糖微膠囊，膜厚在20)im;海藻酸鈣凝膠珠與殼聚糖溶液體積比為1:3;殼聚糖溶液的重量體積濃度為0.1%。釆用本發明提出的微生物固定化方法，用雷射粒度儀(美國Beckman-Coulter公司LS-100Q型)檢測微膠囊粒徑結果，力(/油比1:3時，微膠囊平均粒徑為255|am(見附圖1、表1)。表l不同水/油比時微膠囊的粒徑及粒徑分布tableseeoriginaldocumentpage5^:微膠囊平均粒徑，CT:單分散係數以啤酒酵母為模型，用本發明提出的微生物固定化方法，製備的包埋啤酒酵母的海藻酸-殼聚糖微膠囊，在製備過程中，酵母菌活性保持在80%以上(見附圖2)。以啤酒酵母為模型，用本發明提出的微生物固定化方法，製備的包埋啤酒酵母的海藻酸-殼聚糖微膠囊，搖瓶培養12h後，酵母菌聚集成團，生長狀態良好，微膠囊無破碎(見附圖3a,b);酵母菌生長曲線表明，該工藝製備的微囊化酵母菌增殖速度明顯高於游離培養組(見附圖3c)。實施例2除分散相與分散介質的體積比為2:3外，其它條件同具體實施例1。該條件下，微膠囊平均粒徑為372(im(見附圖1、表1)。實施例31)室溫下，將均勻混合有乳酸菌和納米級碳酸鈣的海藻酸鈉溶液作為分散相添加到分散介質中，然後在攪拌器轉速為1000轉/分攪拌乳化10分鐘，形成乳液；分散相中海藻酸鈉溶液的重量體積濃度為2.0%，分散相中納米級碳酸鉤的重量體積濃度為0.010%;所述分散介質為含有span85的植物油，分散相與分散介質的體積比為1:5;分散相中微生物種子的濃度為106cfU/ml;分散介質中span85的體積百分含量為2%;2)在上述乳液中加入含有體積濃度為10%冰醋酸的植物油調節乳液pH=5,繼續攪拌10分鐘，形成包埋有微生物的海藻酸鈣凝膠珠，加入相當於乳液體積5倍的去離子水靜置10分鐘；3)用200目的篩網將上述步驟中得到的混合液進行過濾並用含有tween80的水溶液進行反覆衝洗，收集凝膠珠；4)將包埋有微生物的海藻酸鈣凝膠珠與分子量為20kDa,脫乙醯度為99。/。的殼聚糖溶液反應IO分鐘，形成包埋有釀酒酵母的海藻酸-殼聚糖微膠囊，膜厚在20jam;海藻酸努凝膠珠與殼聚糖溶液體積比為1:5;殼聚糖溶液的重量體積濃度為1.0%。該工藝製備的微膠囊的平均粒徑為168.34jam,C.V值為24.3%。以乳酸菌為模型，用本發明提出的微生物固定化方法，製備的固定乳酸菌的海藻酸-殼聚糖微膠囊，在製備過程中，乳酸菌活性保持在70%以上(見附圖5)。以乳酸菌為模型，用本發明提出的微生物固定化方法，製備的固定乳酸菌的海藻酸-殼聚糖微膠囊，搖瓶培養14h後，乳酸菌聚集成團，生長狀態良好，微膠囊無破碎(見附圖8);乳酸菌生長曲線表明，該工藝製備的微囊化乳酸菌增殖速度明顯高於游離培養組(見附圖6)實施例41)室溫下，將均勾混合有大腸桿菌和納米級碳酸鈣的海藻酸鈉溶液作為分散相添加到分散介質中，然後在攪拌器轉速為400轉/分攪拌攪拌乳化8分鐘，形成乳液；分散相中海藻酸鈉溶液的重量體積濃度為1.8%,分散相中納米級碳酸鉤的重量體積濃度為0.015%;所述分散介質為含有span85的液體石蠟，分散相與分散介質的體積比為1:20;分散相中微生物種子的濃度為10"cfu/ml;分散介質中span85的體積百分含量為1%;2)在上述乳液中加入含有體積濃度為7%冰醋酸的液體石蠟調節乳液pH=4,繼續攪拌18分鐘，形成包埋有微生物的海藻酸鈣凝膠珠，加入過量去離子水靜置10分鐘；3)用200目的篩網將上述步驟中得到的混合液進行過濾並用含有tween80的水溶液進行反覆衝洗，收集凝膠珠；4)將包埋有微生物的海藻酸鈣凝膠珠與分子量為100kDa,脫乙醯度為99%的殼聚糖溶液反應30分鐘，形成包埋有釀酒酵母的海藻酸-殼聚糖微膠囊，膜厚在3Gnm;海藻酸每凝膠珠與殼聚糖溶液體積比為1:4;殼聚糖溶液的重量體積濃度為0.5%。該工藝條件下製備的微膠囊凝膠珠平均粒徑238.22nm，C.V值為28.1%。以大腸桿菌為模型，用本發明提出的微生物固定化方法，製備的包埋大腸桿菌的海藻酸-殼聚糖微膠囊，在製備過程中，大腸桿菌活性保持在80%以上(見附圖7)。大腸桿菌生長曲線表明，該工藝製備的微囊化大腸桿菌增殖速度明顯高於游離培養組(見附圖9)。權利要求1.一種微生物固定化方法，其特徵在於以重懸微生物的海藻酸鈉溶液和納米碳酸鈣為分散相，液體石蠟或植物油為分散介質，Span85為表面活性劑，通過攪拌乳化形成液滴，再以冰醋酸為凝膠引發劑製備包埋有微生物的海藻酸鈣凝膠珠，該凝膠珠與殼聚糖溶液反應交聯，形成聚陽離子-聚陰離子絡合膜，最終形成包埋微生物的海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊。2.按照權利要求l所述的固定化方法，其特徵在於具體操作過程如下，1)室溫下，將均勻混合有微生物和納米級碳酸鈣的海藻酸鈉溶液作為分散相添加到分散介質中，然後攪拌乳化5-10分鐘，形成乳液；分散相中海藻酸鈉溶液的重量體積濃度為1.5-2.0%,分散相中納米級碳酸鉤的重量體積濃度為0.010-0.020%;所述分散介質為含有span85的液體石蠟或植物油，分散相與分散介質的體積比為1:2-20;分散相中微生物種子的濃度為104-10"cfu/ml;分散介質中span85的體積百分含量為0.05-2%;2)在上述乳液中加入含有體積濃度為5-10%冰醋酸的液體石蠟或植物油調節乳液P^4-6,繼續攪拌5-10分鐘，形成包埋有微生物的海藻酸鈣凝膠珠，加入過量去離子水靜置10分鐘；3)用篩網將上述步驟中得到的混合液進行過濾並用含有質量百分含量為1%的tween80的水溶液進行反覆衝洗，收集凝膠珠；4)將包埋有微生物的海藻酸鈣凝膠珠與殼聚糖溶液反應8-30分鐘，形成包埋有微生物的海藻酸-殼聚糖微膠囊，膜厚在5-50jam;海藻酸鈣凝膠珠與殼聚糖溶液體積比為1:2-5;殼聚糖溶液的重量體積濃度為0.1-1%。3.按照權利要求2所述的固定化方法，其特徵在於所述步驟l)中攪拌乳化釆用的攪拌器轉速為100-1000轉/分。4.按照權利要求2所述的固定化方法，其特徵在於所述步驟2)中去離子水與乳液的體積比為1:2-5。5.按照權利要求2所述的固定化方法，其特徵在於所述步驟3)中篩網目數為40-200目。6.按照權利要求2所述的固定化方法，其特徵在於所述步驟4)中殼聚糖脫乙醯度>90%,粘均分子量10-150KDa。全文摘要本發明涉及微生物固定化，其以重懸微生物的海藻酸鈉溶液和納米碳酸鈣為分散相，液體石蠟或植物油為分散介質，Span85為表面活性劑，通過攪拌乳化形成液滴，再以冰醋酸為凝膠引發劑製備包埋有微生物的海藻酸鈣凝膠珠，該凝膠珠與殼聚糖溶液反應交聯，形成聚陽離子-聚陰離子絡合膜，最終形成包埋有微生物的海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊。該方法製備過程條件溫和，儀器設備要求簡單，易規模化，且製備過程中微生物細胞活性保持良好，細胞洩漏率較低。因此，該技術適合酵母菌、大腸桿菌、乳酸菌、硝化細菌等多種微生物的固定化包埋，實現微生物的高密度和規模化培養。文檔編號C12N11/04GK101319210SQ20071001163公開日2008年12月10日申請日期2007年6月8日優先權日2007年6月8日發明者於煒婷,呂國軍,孫志傑,林軍章,馬小軍申請人:中國科學院大連化學物理研究所