含有雙硫鍵的陽離子型聚醯胺、製備方法及其應用與流程
2024-03-27 02:04:05 2
本發明涉及生物醫用聚合物領域，具體涉及含有雙硫鍵的陽離子型聚醯胺、製備方法及其作為轉染試劑轉染細胞株或幹細胞的應用。
背景技術：
基因治療的成功依賴高效、低毒的可將外源基因導入靶細胞內的基因載體。目前基於聚合物的非病毒基因載體（轉染試劑）因其更高的安全性、生產成本低、基因載藥量大等優點，倍受研究關注。基於陽離子型的聚合物基因載體，如可降解的聚賴氨酸、聚乙烯亞胺和聚醯胺等已經被廣泛研究。但它們因不可降解的原因，轉染過程中導致較大的細胞毒性。生物可降解的雙硫鍵是設計可降解聚合物基因載體的重要分子構建。含有雙硫鍵的陽離子型聚合物因其在進入細胞後便會被降解,對細胞產生較弱的毒性。因此將雙硫鍵引入陽離子型聚合物是設計高效、低毒基因載體的重要方法。
聚醯胺是一類在主鏈上含有醯胺鍵(amide linkage)的聚合物。在過去十年裡，聚醯胺在生物醫學領域，特別是藥物緩釋和組織工程方面得到廣泛的應用。目前，含有雙硫鍵的聚醯胺有大量的報導，主要是通過N,N'-雙(丙稀醯)胱胺和伯胺通過麥克加成反應製備的聚（醯胺-胺）。但麥克加成反應原理表明，該類聚（醯胺-胺）分子鏈上介於醯胺鍵（-NH-C=O）和叔胺（N-R）基團之間的碳原子個數不可變，只能是兩個碳原子。如下式所示：
目前報導的陽離子型聚醯胺，其介於醯胺鍵（-NH-C=O）和雙硫鍵（SS）之間的碳原子個數只是兩個。這些因素限制了製備分子結構多樣性的陽離子型聚醯胺，進而影響了後續轉染效率的優化。
參考文獻:
1.Thomas CE, Ehrhardt A, Kay MA. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet 2003;4: 346-358.
2. Li S, Huang L. Non-viral gene therapy: promises and challenges. Gene Ther 2000;7: 31-34.
3. Pack DW, Hoffman AS, Pun S, Stayton PS. Design and development of polymers for gene delivery. Nat Rev Drug Discov 2005;4: 589-593
4. Lin C, Zhiyuan Zhong, Martin C. Lok, Xulin Jiang, Wim E. Hennink, Feijen J, et al. Novel bioreducible poly(amido amine)s for highly efficient gene delivery. Bioconjuate Chem 2007;18: 138-145.
5. Son S, Namgung R, Kim J, Singha K, Kim WJ. Bioreducible polymers for gene silencing and delivery. Acc Chem Res 2012;45: 1100-1112。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種含有雙硫鍵的陽離子型聚醯胺、製備方法及其作為轉染試劑轉染細胞株或幹細胞的應用。
本發明提出的含有雙硫鍵的陽離子型聚醯胺，其結構式如式（1）所示：
（１）
其中，R1基團選自： 或中任一種；
R2基團選自：或；
聚合度n為20-100。
本發明提出的含有雙硫鍵的陽離子型聚醯胺的製備方法，首先合成二對硝基苯基二硫代二丙（丁）酸酯，將其和含有叔胺基團的二伯胺化合物通過逐步縮合，得到含有雙硫鍵和可質子化胺基的聚醯胺；具體步驟如下：
（1）將二硫代二丙酸或二硫代二丁酸與氯化亞碸一起攪拌，進行酯化反應，得到二對硝基苯基二硫代二丙（丁）酸酯；其中：二硫代二丙（丁）酸與氯化亞碸的摩爾比為1:（3~ 5）；
（2）將步驟（１）得到的產物旋轉蒸發，去除未反應的氯化亞碸，殘餘物與對硝基苯酚在有機溶劑中反應；
（3）將步驟（２）得到的產物旋轉蒸發，除去未反應的有機溶劑，殘餘物在冰水中重結晶，得到二對硝基苯基二硫代二丙（丁）酸酯：
（４）製備含有雙硫鍵的聚醯胺
將二對硝基苯基二硫代二丙（丁）酸酯與二伯胺化合物加入到有機溶劑中在室溫下進行反應；二對硝基苯基二硫代二丙（丁）酸酯與二伯胺化合物的摩爾比為1:1；
（５）反應完畢後，向步驟（４）所得產物中加入去離子水稀釋，每1g反應物加入10mL ddH2O（重蒸水）, 用4M 鹽酸調節pH值到5-6，然後用透析袋透析、冷凍乾燥，得到含有雙硫鍵的聚醯胺。
本發明中，步驟（1）中所述酯化反應時間為4小時。
本發明中，步驟（2）中所述有機溶劑為丙酮，殘餘物與對硝基苯酚在有機溶劑中反應時間為24小時。
本發明中，步驟（４）中所述有機溶劑為二甲基亞碸，室溫下反應時間為24-36小時。
本發明中，步驟（４）中所述二伯胺化合物選自胺基酸、1,4-雙(3-氨基丙基)-哌嗪、N-甲基-2,2』-二氨基二乙胺、雙（2 -氨基乙基）2 -（叔丁氧羰基氨基）乙基胺或1,4-哌嗪二乙胺等中任一種。
本發明中，步驟（５）中所述透析袋的截留分子量為1000-3000。
一種含有雙硫鍵的陽離子型聚醯胺作為轉染試劑轉染細胞株和幹細胞的應用，具體步驟如下：
（1）將培養至80-90％融合度的哺乳動物細胞株或幹細胞用胰蛋白酶消化、計數，並以1-2×105/孔接種6孔板，置於培養箱中培養約24 h，至細胞達70％融合度，得到pCMV-GFP質粒；
（2）按N/P比值為20、40、80的不同濃度比例的含有雙硫鍵的陽離子型聚醯胺與pCMV-GFP質粒進行複合，得到複合物，室溫複合半個小時；
轉染前，先用PBS緩衝液衝洗細胞，更換新鮮無血清培養基，培養1h後，隨後向孔板中滴加複合物，充分混勻後，培養1-4 h；
（3）去除培養基，加入含10%胎牛血清和100U/ml雙抗（青黴素和鏈黴素）的培養基，培養24 h，後用倒置螢光顯微鏡觀察細胞綠色螢光表達情況並拍照。
通過上述方法製備的聚醯胺具有很低的細胞毒性和生物相容性。本發明提供的含有雙硫鍵的聚醯胺基因轉染試劑可適用於螢火蟲螢光素酶、綠色螢光蛋白報告基因，以及其它功能基因質粒。
與現有技術相比，本發明有如下優點：1）本發明通過含有雙硫鍵的對二硝基苯基二硫代二丙（丁）酸酯與二伯胺化合物通過逐步縮聚方法製備陽離子型聚醯胺。不同於傳統的陽離子型聚醯胺的製備方法，即麥克加成方法。合成反應條件溫和、副反應少。本方法便於引入雙硫鍵和胺基官能團，可以得到結構多樣性的聚醯胺；該方法得到的聚醯胺碳原子數目可調。2）本發明中製備的含有雙硫鍵的聚醯胺相比普通聚醯胺能夠有效的提高包裹基因的能力以及在胞漿內釋放基因的能力。因此，該類新型的聚醯胺生物相容性好且細胞毒性低。經實驗證明，該系聚醯胺與基因形成的複合物在多種哺乳細胞株（如SKOV3、MCF-7、HepG2和幹細胞）的轉染試驗中，均表現出比商業化轉染試劑（Lipofectamine2000）更高的轉染效率和更低的細胞毒性。因此，本發明製備的含有雙硫鍵聚醯胺在基因轉染試劑領域具有良好的產業化前景。
附圖說明
圖1為二對硝基苯基二硫代二丙酸酯的1H NMR譜圖。
圖2為含有1,4-雙(3-氨基丙基)-哌嗪的二硫代二丙基聚醯胺（DTPA-BAP）的1H NMR譜圖。
圖3為含有N-甲基-2,2』-二氨基二乙胺的二硫代二丙基聚醯胺（DTPA-MDE）的1H NMR譜圖。
圖4為含有雙硫鍵聚醯胺和轉染試劑Lipofectamine2000轉染MCF-7和SKOV-3細胞表達綠色螢光蛋白（GFP）基因，螢光顯微鏡下觀察所拍攝的照片。其中：ａ)為DTPA-BAP轉染MCF-7細胞，ｂ)為DTPA-BAP轉染SKOV-3細胞，ｃ)為Lipofectamine2000轉染MCF-7細胞，ｄ)為Lipofectamine2000轉染SKOV-3細胞。
圖5含有雙硫鍵的聚醯胺在不同濃度下與MCF-7細胞共培養後的細胞存活率。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步的說明
實施例1：合成二對硝基苯基二硫代二丙酸酯 (DTPA-PNC)
（1）先將二硫代二丙酸（5 g）和二氯亞碸 （20 mL）按摩爾比1:5稱取，加入到反應器內，反應４小時；
（2）旋轉蒸發二氯亞碸，並將殘餘固體溶解在丙酮中，加入對硝基苯酚固體（6.7 g），反應24小時；
（3）旋轉蒸發丙酮，殘餘物在水（500 mL）中重結晶，得到針狀晶體 (3.4 g)。
固體產物的核磁數據為：1HNMR(300 MHz, CDCl3, ppm)：δ 7.3 和8.3 (aromatic protons, 8H); δ 3.1 (2×CH2CH2S, 8H)（見圖1）。
實施例2：合成含有1,4-雙(3-氨基丙基)-哌嗪的二硫代二丙基聚醯胺（DTPA-BAP）
（1）稱取實施例１所得的DTPA-PNC（0.5 g）和1,4-雙(3-氨基丙基)-哌嗪（0.22 g）與反應瓶中，加入3 mL二甲基亞碸，混合均勻後，40℃油浴環境下反應5天；
（2）在反應器內加入1,4-雙(3-氨基丙基)-哌嗪（0.02 g）和1 mL的二甲基亞碸終止反應，油浴環境下繼續反應2天；
（3）將反應瓶內的液體全部轉移到透析裝置中，用4 M的鹽酸將pH調至5，用截留分子量為1000的透析袋透析、冷凍乾燥，得到固體產物（0.34 g）。
固體產物的核磁數據為：1HNMR(300 MHz, D2O, ppm)：δ1.95 (4H, 2×N-CH2CH2CH2); 2.66 (4H, 2×N-CH2CH2CH2); 2.92 (4H, 2×N-CH2CH2CH2); 3.28 (8H, CH2CH2SSCH2CH2); 3.3-4.1 (8H, 2×N-CH2CH2-N) (見圖2) 。
實施例3：N-甲基-2,2』-二氨基二乙胺的二硫代二丙基聚醯胺（DTPA-MDE）
（1）將N-甲基-2,2』-二氨基二乙胺（1 g ）和實施例１所得的DTPA-PNC（0.2 g）放入燒瓶中；
（2）用5 mL二甲基亞碸溶解，在室溫下反應5天；
（3）反應結束後，用10 mL去離子水溶解產物，用鹽酸將pH值調到6，
（4）用分子截留量為1000 g/mol的透析袋透析；
（5）冷凍乾燥，得到固體產物（0.3 g）。
固體產物的核磁數據為：1HNMR(300 MHz, D2O, ppm)：δ 2.66 (4H, 2×N-CH2CH2CH2); 2.92 (4H, 2×N-CH2CH2CH2, 3H, CH3); 3.1-3.6 (8H, 2×N-CH2CH2-N) (見圖3)。
實施例4：含有雙硫鍵的聚醯胺轉染MCF-7細胞株
（1）培養至85-90％融合的所需細胞用胰蛋白酶消化、計數，並以6×104細胞/孔的濃度接種24孔板，置於培養箱中培養約24h，至細胞達50-70％融合；
（2）對細胞進行分組，每亞組設平行的3個復孔，並設空白對照組，及以樹枝狀的PEI（25萬分子量）或lipofectamine 2000作為轉染試劑的陽性對照組；
（3）配置不同濃度比例的實施例１或實施例２所得的聚氨酯與pCMV-GFP質粒的混合物。並按PEI或lipofectamine 2000的說明書要求，配置質粒複合物；
（4）將孔板中的細胞培養基吸除，以PBS衝洗細胞，更換新鮮無血清培養基於培養箱中培養0.5 h；
（5）按照不同組別向孔板中滴加質粒複合物，充分混勻後置培養箱培養1 h；（6）吸除孔板中的液體，以PBS衝洗細胞，更換新鮮的含10%胎牛血清和100 U/mL（1%）雙抗的培養基，置培養箱培養，24 h後用倒置螢光顯微鏡觀察細胞綠色螢光表達情況並拍照。(見圖4)。
實施例5：含有雙硫鍵的陽離子型聚醯胺的細胞毒性的評價
（1）配置 10:1的RPMI 1640（無酚紅）與 Alamar Blue混合液，充分混勻，預熱至37 ºC；
（2）吸除孔板中的培養基，PBS衝洗細胞後，每孔加入500 μL上述混液，於培養箱中培養2 h ；
（3） 每孔吸取200μL上清液，按分組順序依次加入一個新的96孔板；（4）將96孔板置於酶標儀上，以630 nm為參考波長，570 nm為試驗波長，測定各孔吸光度；
（4）細胞存活率(%)=各組細胞吸光度/陰性對照組細胞吸光度×100% (見圖5)。
上述的對實施例的描述是為便於該技術領域的普通技術人員能理解和應用本發明。熟悉本領域技術的人員顯然可以容易地對這些實施例做出各種修改，並把在此說明的一般原理應用到其他實施例中而不必經過創造性的勞動。因此，本發明不限於這裡的實施例，本領域技術人員根據本發明的揭示，不脫離本發明範疇所做出的改進和修改都應該在本發明的保護範圍之內。