一種縮宮素脫醯胺雜質的製備方法與流程

2024-03-27 03:26:05

本發明涉及生物製藥領域。更具體地，本發明涉及一種縮宮素脫醯胺雜質的製備方法。
背景技術：
：縮宮素，又稱催產素，英文名為Oxytocin，結構式：分子式為：C43H66N12O12S2，分子量為1007.2縮宮素用於引產、催產、產後及流產後因宮縮無力或縮腹不良而引起的子宮出血；了解胎盤儲備功能(催產素激怒試驗)；滴鼻可促使排乳。縮宮素能間接刺激子宮平滑肌收縮，模擬正常分娩的子宮收縮作用，導致子宮頸擴張，子宮對縮宮素的反應在妊娠過程中逐漸增加，足月時達高峰。縮宮素也可刺激乳腺的平滑肌收縮，有助於乳汁自乳房排出，但並不增加乳腺的乳汁分泌量。就一個藥品而言，其中所含的少量雜質是引發藥品副作用最重要的原因，因此對其純度的檢查是保證藥品安全有效性的重要基礎之一，而純度檢查的內容，根據各個藥物的性質和特點有些不同，但基本上均要涉及各自的「有關物質」檢查研究。合成多肽的有關物質主要來自合成過程中的工藝雜質和由於多肽不穩定而產生的降解產物、聚合物等雜質，儘管目前合成多肽的純化工藝已經有了很大進步，但工藝雜質仍是合成多肽有關物質的重要來源，這主要是由於合成多肽的一些工藝雜質(如缺失肽、斷裂肽、氧化肽、二硫鍵交換的產物等)與藥物本身的性質可能非常近似，從而給純化造成了一定的難度。研究表明合成多肽中最常見的降解產物是脫醯胺產物、氧化產物、水解產物。在組成多肽的各種胺基酸中，天冬醯胺、谷胺醯胺和肽鏈C段醯胺易於發生脫醯胺反應(尤其是在pH值升高和高溫條件下)。由於合成多肽中有些雜質的性質與目標產品非常接近，因此建立適宜的方法充分檢出這些雜質是合成多肽藥物有關物質研究中面臨的巨大困難。目前國內縮宮素脫醯胺雜質大多先是採用固相合成保護縮宮素樹脂，再經過裂解乾燥得縮宮素脫醯胺雜質前體粗品(Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly的三氟乙酸鹽)，高度稀釋環化，純化，轉鹽等步驟，最終得到縮宮素脫醯胺雜質。高度稀釋環化由於樣品濃度稀，體積龐大，對於後期純化很不利。現在還缺乏一種有效的製備含二硫鍵的多肽原料藥類似物的方法，因此仍然迫切需要開發新的含二硫鍵多肽的製備方法。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題在於為了克服現有技術中縮宮素脫醯胺雜質的製備工藝複雜、收率低、樣品濃度稀、體積龐大的缺陷，而提供了一種縮宮素脫醯胺雜質的製備方法。本發明的縮宮素脫醯胺雜質的製備方法以含一對游離巰基(-SH)的多肽粗品——縮宮素脫醯胺雜質前體粗品為起始原料，經過高壓液相反相色譜環化、純化和脫鹽步驟，製備高純度的縮宮素脫醯胺雜質的方法。本發明的多肽是縮宮素製備過程中的1個關鍵雜質，因此可作為縮宮素檢測過程的標準對照品，對縮宮素以及雜質進行定性和定量分析，對於提高縮宮素的質量標準，控制產品質量具有重要意義。本發明是通過以下技術方案解決上述技術問題的：本發明提供了一種縮宮素脫醯胺雜質的製備方法，其包括下述步驟：採用高效液相反相色譜法將縮宮素脫醯胺雜質前體粗品溶液依次進行反相環化、反相純化、反相脫鹽，即可；高效液相反相色譜法的填料為矽膠C18；所述的縮宮素脫醯胺雜質前體粗品為含兩游離巰基的縮宮素脫醯胺雜質前體粗品；所述的縮宮素脫醯胺雜質為其中，所述的縮宮素脫醯胺雜質前體粗品較佳地為採用固相合成法經過裂解乾燥製得的縮宮素脫醯胺雜質前體粗品，HPLC純度為60～90％；所述的縮宮素脫醯胺雜質前體粗品的結構式為Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly的三氟乙酸鹽。其中，所述的縮宮素脫醯胺雜質前體粗品溶液較佳地為縮宮素脫醯胺雜質前體粗品溶於體積百分比濃度為5％的乙腈水溶液形成的5g/L溶液。本發明中，所述的反相環化、反相純化、反相脫鹽均是在一步的反相洗脫過程中完成。其中，所述的反相環化、反相純化、反相脫鹽的條件優選如下：流動相A1為純水，A2為體積百分比0.01～0.05％(較佳的為0.02～0.03％)的H2O2pH為7.5～9.0的NaOH水溶液，流動相B為乙腈，流動相C為所述的縮宮素脫醯胺雜質前體粗品溶液，流速為80～110mL/min(較佳的為100mL/min)，檢測波長為220nm；按照下表的條件進行在線上樣、洗脫，百分比為體積百分比；洗脫步驟洗脫時間洗脫液10～10min100％C210～25min95％A1+5％B325.1～30min95％A2+5％B430.1～3595％A1+5％B535～50min95％A1+5％B→80％A1+20％B650～65min80％A1+20％B→73％A1+27％B765～75min50％A1+50％B875～80min95％A1+5％B收集保留時間為50～65min的洗脫液得到縮宮素脫醯胺雜質溶液。其中，所述的高效液相反相色譜法的裝填條件優選如下：填料為Kromasil矽膠C18，孔徑10nm，粒徑10μm。縮宮素脫醯胺雜質是一種多肽物質，在鹼性條件下不穩定，易降解，尤其是強鹼環境下，本發明綜合考察了鹼洗脫的濃度和時間，以保證減少脫鹽過程中樣品的破壞及損失。本發明創新點在於將環化、純化和脫鹽一步反相得到多肽純品，縮宮素脫醯胺雜質前體粗品中含有兩游離巰基，傳統工藝環化和純化分步進行，而且環化的體積龐大，增加了純化的難度，為了快速高效的環化和製備工藝，設計出矽膠C18填料的最新應用。本發明創新性運用了反相吸附法環化、純化和脫鹽，一次性解決環化、純化和脫鹽的問題。在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。本發明所用試劑和原料均市售可得。本發明的積極進步效果在於：(1)本發明採用在線環化的方法，先將還原型多肽粗品吸附到固定相上，利用多肽和反相填料的疏水結合，在色譜柱上中性洗脫弱結合的酸根離子，並採用pH偏鹼的含H2O2的流動相衝洗，促使兩巰基成二硫鍵，獲得目標多肽粗品，樣品保留在色譜柱上。(2)本發明採用在線環化，環化的樣品避免洗脫，可直接變換流動相後進行梯度洗脫純化，得到最終的純品，適合連續的生產。(3)本發明創新性地運用了反相吸附環化、純化、脫鹽一步法製得多肽純品，優化了生產工藝，適合工業化連續生產。具體實施方式下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在所述的實施例範圍之中。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。下述實施例中，縮宮素脫醯胺雜質為實施例1(HPLC法檢測縮宮素脫醯胺雜質前體粗品和純化中間體溶液純度及定量)儀器：Agilent1200高效液相色譜儀分離柱：WatersXBridge-C18，4.6×150mm，5μm流動相：A為體積百分比50％乙腈水溶液，B為0.02MKH2PO4pH3.0水溶液，流速為1.0mL/min，檢測波長為220nm，室溫檢測，洗脫梯度見下表所示，百分比為體積百分比。洗脫步驟洗脫時間洗脫液10～15min35％A+65％B215～25min35％A+65％B→100％A325～28min100％A428.0～28.1min100％A→35％A+65％B528.1～32min35％A+65％B實施例2(50mm內徑L&L4002製備柱裝填)運用Load&Lock動態軸向壓縮和靜態鎖緊技術，填料為矽膠C18(KromasilC18)，孔徑10nm，粒徑10μm，裝柱密度0.66g/mL，裝填至柱床壓力133bar，採用Varian色譜裝填系統，325g乾粉填料，650mL異丙醇攪拌勻漿後，倒入內徑50mmL&L4002製備柱，壓縮比為1.5:1，載氣為N2，調節載氣壓力使得油壓表壓力為200bar，動態軸向壓縮至柱床高度25.5cm，作為反相環化、反相純化和反相脫鹽方案所用的製備柱。實施例3縮宮素脫醯胺雜質前體粗品原料的反相環化、反相純化和反相脫鹽儀器：VarianSD-1高壓液相製備系統色譜柱：實施例2自裝的製備柱Load&Lock400250×255mm，C1810μm10nm縮宮素脫醯胺雜質前體粗品為採用固相合成法經過裂解乾燥製得的縮宮素脫醯胺雜質前體粗品，結構式為Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly的三氟乙酸鹽。縮宮素脫醯胺雜質前體粗品溶液為上述縮宮素脫醯胺雜質前體粗品溶於體積百分比濃度為5％的乙腈水溶液形成的5g/L溶液。流動相A1為純化水，A2為體積百分比0.02的H2O2pH為7.5的NaOH水溶液，流動相B為乙腈，流動相C為所述的縮宮素脫醯胺雜質前體粗品溶液，按實施例1的方法測定其HPLC純度為82.25％，保留時間為9.20min。本實施例的反相環化、反相純化和反相脫鹽條件如下：流速100mL/min，220nm檢測，純化洗脫梯度見下表所示，百分比為體積百分比。洗脫步驟洗脫時間洗脫液10～10min100％C210～25min95％A1+5％B325.1～30min95％A2+5％B430.1～3595％A1+5％B535～50min95％A1+5％B→80％A1+20％B650～65min80％A1+20％B→73％A1+27％B765～75min50％A1+50％B875～80min95％A1+5％B收集保留時間為50～65min的洗脫液得到縮宮素脫醯胺雜質溶液，按實施例1的方法測定其HPLC純度為99.52％，保留時間為6.56min。實施例4縮宮素脫醯胺雜質前體粗品原料的反相環化、反相純化和反相脫鹽儀器：VarianSD-1高壓液相製備系統色譜柱：實施例2自裝的製備柱Load&Lock400250×255mm，C1810μm10nm縮宮素脫醯胺雜質前體粗品為採用固相合成法經過裂解乾燥製得的縮宮素脫醯胺雜質前體粗品，結構式為Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly的三氟乙酸鹽。縮宮素脫醯胺雜質前體粗品溶液為上述縮宮素脫醯胺雜質前體粗品溶於體積百分比濃度為5％的乙腈水溶液形成的5g/L溶液。流動相A1為純化水，A2為體積百分比0.03的H2O2pH為9.0的NaOH水溶液，流動相B為乙腈，流動相C1為所述的縮宮素脫醯胺雜質前體粗品溶液，按實施例1的方法測定其HPLC純度為82.25％，保留時間為9.20min。本實施例的反相環化、反相純化和反相脫鹽條件如下：流速100mL/min，220nm檢測，純化洗脫梯度見下表所示，百分比為體積百分比。洗脫步驟洗脫時間洗脫液10～10min100％C210～25min95％A1+5％B325.1～30min95％A2+5％B430.1～3595％A1+5％B535～50min95％A1+5％B→80％A1+20％B650～65min80％A1+20％B→73％A1+27％B765～75min50％A1+50％B875～80min95％A1+5％B收集保留時間為50～65min的洗脫液得到縮宮素脫醯胺雜質溶液，按實施例1的方法測定其HPLC純度為99.50％，保留時間為6.55min。實施例5(縮宮素脫醯胺雜質的質譜檢測)採用watersmicromassZQ單重四級杆電噴霧質譜(ESI-MS)測定實施例3、4得到的縮宮素脫醯胺雜質的分子質量峰[M+1]+測定值1009.31，主要離子碎片峰[M+2]2+測定值505.17，都符合理論值1008.2。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp