一種白僵菌固體培養基及其製備方法與流程
2024-03-27 21:55:05 1
本發明屬於白僵菌培養技術領域，尤其涉及一種白僵菌固體培養基及其製備方法。
背景技術：
白僵菌是一類對農林害蟲寄主範圍廣且致病性強的昆蟲病原真菌，因其易培養、不寄生天敵、對環境友好、適宜條件下易形成流行病等特點，成為目前國內外研究最多應用最廣的害蟲生防病原真菌，已成功用於大規模防治松毛蟲、玉米螟、蠐螬和大豆食心蟲等多種重要的農林業害蟲。
目前，白僵菌大量培養的主要方式有液體發酵、固體發酵和液固兩相發酵。白僵菌液體發酵時間短，主要產物為芽生孢子和菌絲體，但這兩種產物的存活時間較短，不宜加工為製劑形式；固體發酵和液固兩相發酵時間長，但均可產生貯存期較長的分生孢子。現有研究與生產工藝中，固體發酵和液固兩相發酵所用到的固體培養基通常選用豆粉、玉米粉、蠶蛹粉、麥麩、細米糠或甘蔗渣及其他農副產品為基質，多採用兩種及以上基質混合，各組分比例需嚴格控制，同時還需加入蛭石、稻穀殼等填充料，以在發酵過程中起到排溼、通氣的作用。
技術實現要素：
有鑑於此，本發明的目的在於提供一種白僵菌固體培養基及其製備方法，本發明提供的白僵菌固體培養基價格低廉，來源充足，且用於白僵菌培養時，發酵周期短，產孢量高。
本發明提供了一種白僵菌固體培養基，以玉米顆粒作為基質。
本發明以玉米顆粒作為白僵菌固體培養基基質，原料來源易得，價格較低，多數地區可以就地取材，減少了運輸費用，大大降低了生產成本，適合不同規模企業及研究單位進行白僵菌研究與生產，具有顯著的經濟價值和良好的應用前景。
在本發明中，所述玉米顆粒可以是玉米粉碎後的玉米顆粒，其粒徑為2mm～4mm，含水量為20％～30％。
在本發明中，所述固體培養基還包括氮源；所述氮源選自花生粉、豆粉、魚粉、酵母粉或牛肉膏，添加量為玉米顆粒的0.2～1wt％。
在本發明中，所述固體培養基還包括無機鹽，所述無機鹽包括kh2po4、mgso4·7h2o和kno3。所述無機鹽以水溶液的形式加入到玉米顆粒中，無機鹽水溶液包括0.05wt％的kh2po4、0.01wt％的mgso4·7h2o、0.2wt％的kno3，按玉米顆粒的0.2％～0.6wt％添加。
本發明還提供了一種白僵菌固體培養基的製備方法，包括：
將玉米顆粒浸泡，撈出控水加油攪拌均勻後滅菌，得到固體培養基。
在本發明中，所述玉米顆粒由玉米經過粉碎機粉碎後得到，其粒徑為2mm～4mm，大小顆粒混雜即可。
將玉米顆粒在水中浸泡使其吸水，所述浸泡的溫度為常溫，浸泡至玉米顆粒含水量為20％～30％，優選至25％。將玉米顆粒撈出並控幹多餘水分，添加少量植物油防止後續滅菌過程中玉米顆粒黏成團，所述油可以是色拉油，添加量為玉米顆粒重量的0.5％左右。
將玉米顆粒與油混合均勻後滅菌前還可以加入氮源和/或無機鹽水溶液，混合均勻。其中，所述氮源選自花生粉、豆粉、魚粉、酵母粉或牛肉膏，添加量為玉米顆粒的0.2～1wt％。所述無機鹽水溶液包括0.05wt％的kh2po4、0.01wt％的mgso4·7h2o、0.2wt％的kno3，按玉米顆粒的0.2％～0.6wt％添加。
混合均勻後，將混合物料裝入容器內進行滅菌，所述滅菌的溫度為121～125℃；壓力為0.1～0.15mpa；時間為30～60分鐘。滅菌完畢後即可得到白僵菌固體培養基。
該白僵菌固體培養基既可以用於白僵菌的固體發酵，也可以用於白僵菌的液固兩相發酵。
本發明還提供了一種白僵菌的培養方法，包括：
將白僵菌接種至上述技術方案所述的固體培養基中進行發酵培養。
獲得固體培養基後，將白僵菌接種液接種培養即可。
其中，白僵菌接種液可以孢懸液、菌絲體或芽生孢子的形式接入固體培養基中，濃度為5×106～5×107個/ml，接種量為10～20％(v/w)。
在本發明中，所述發酵培養的溫度為20～26℃，可以採用袋裝或盒裝等密閉式培養，也可採用淺盤、培養池等開放式培養。
在一個實施例中，在發酵培養過程中，首先密閉培養，待長滿菌絲體後，在託盤中採用開放式培養。在菌絲生長階段採用密閉培養，可保證培養料的溼度維持在較高水平，在滿足菌絲生長的需要的同時，還可以降低培養基汙染的概率；產孢階段將培養料倒在託盤中採用開放式培養，此時固料已布滿白僵菌菌絲，不易汙染雜菌，同時可降低培養溼度，有利於分生孢子的形成及成熟脫落。
上述培養完成後，將固體培養基在乾燥通風處晾乾，待培養料含水量低於5％時，可通過分孢器分離獲得分生孢子粉，加工為可溼性粉劑、粉劑或油懸劑等劑型；也可以直接將培養料進行二次粉碎直接施用到田間，既起到殺蟲作用，培養料也可作為土壤肥料。
與現有技術相比，本發明具有以下優點及有益效果：
(1)本發明以玉米為固體培養基，由於玉米顆粒本身具有一定的粒徑，培養基本身形成一定的間隙，因此培養過程中無需額外通氣，無需添加其他填料增加透氣性。
(2)該發明操作過程較為簡單，容易實現規模批量生產，生產條件和生產過程可人為調控，生產質量容易控制。固體發酵基質可經分孢器獲得含量較高的分生孢子粉，進一步加工為可溼性粉劑等多種劑型；也可以直接將玉米培養料直接二次粉碎，通過撒施、溝施或穴施施用到田間，使用更加方便快捷。
(3)本發明固體培養基主要基質為玉米，相對於白僵菌其他固體培養基，原料來源易得，價格較低，多數地區可以就地取材，減少了運輸費用，大大降低了生產成本。適合不同規模企業及研究單位進行白僵菌研究與生產，具有顯著的經濟價值和良好的應用前景。
(4)本發明提供的固體培養基可用於白僵菌固體發酵和液固兩相發酵工藝，培養方法操作方便，發酵周期短，產孢量高。
具體實施方式
實施例1接種白僵菌孢懸液的固體培養方法
1孢懸液製備
1.1菌種活化：將低溫保存的白僵菌菌株jcf(保藏編號為cgmccno.11338)在試管斜面上活化培養，所用活化培養基為通用的sday培養基，培養條件為26±1℃，斜面長滿孢子後即可使用。
1.2孢懸液製備：將1.1中斜面上的分生孢子轉接到sday平板培養基，產孢後用0.1％吐溫-80無菌水漂洗孢子，震蕩懸浮製成孢懸液，調整濃度為1×107孢子/ml。
2固體培養
2.1固體培養基製作：玉米用粉碎機打成碎顆粒，大小為2～4mm左右，加水浸泡4h，平均含水量為25wt％，撈出控去多餘水分，加0.2％魚粉作為氮源，加0.5％色拉油以防粘連，攪拌均勻後分裝到40cm×22cm大小的聚丙烯pp塑膠袋內，每袋裝400g溼料。用直徑4cm、長6cm的聚丙烯pp管扎口，管口依次用三層棉布和封口膜封口，121℃高溫蒸汽滅菌40min，形成固體培養基。
2.2接種及培養：將已滅菌的固體培養基放置在接種室中，待冷卻後在無菌操作臺中按10％(v/w)比例接入白僵菌孢懸液並抖落均勻，去掉最外層封口膜，將固體料平鋪展開放置在培養箱中，24±2℃條件下培養，無需額外增加溼度，24h～48h內，翻動2次固料以增加底部固料通氣量，同時也可避免發酵過程中熱量累積而出現「燒料」現象。4～5d時，待固體培養料長滿白僵菌菌絲後，將固體培養料倒在託盤中進行開放式培養，有利於孢子脫落，固體料厚度以3～4cm為宜，此時培養箱溼度應低於50％。
2.3培養料處理：白僵菌形成分生孢子後，將固料置於通風處或乾燥間內晾乾，固料含水量低於5％時粉碎後即可得粗粉劑。
2.4培養結果：固體發酵周期為8d，固體培養料晾乾後，隨機稱取3g放在裝有玻璃珠的100ml0.1％吐溫-80水中，震蕩，使分生孢子充分洗脫，血球計數板計數，3次測量取平均值，培養物分生孢子含量為1.8×1010個/克料。
實施例2接種白僵菌菌絲體的固體培養方法
1菌絲體種子液製備：
1.1菌種活化：方法同實施例1。
1.2菌懸液製備：方法同實施例1，孢懸液濃度為5×107孢子/ml。
1.3搖瓶培養：在500ml三角瓶中裝入sdy培養基100ml，121℃高溫蒸汽滅菌30min，待冷卻後，在無菌操作臺中，按1％接種量接入孢懸液，26±1℃、200rpm恆溫震蕩培養，培養20h後，形成菌絲體即可作為白僵菌固體培養的種子液。
2固體培養
2.1固體培養基製作：方法同實施例1，氮源為0.8％花生粉。
2.2接種及培養：將接種後混合均勻的固體培養料倒在滅菌消毒的培養盒中培養，其他方法同實施例1。
2.3培養料處理：方法同實施例1。
2.4培養結果：固體發酵周期為6d，血球計數板計數，3次測量取平均值，培養物分生孢子含量為4.5×1010個/克料。
實施例3接種白僵菌芽生孢子的固體培養方法
1芽生孢子種子液製備：
1.1菌種活化：方法同實施例1。
1.2菌懸液製備：方法同實施例1，孢懸液濃度為5×106孢子/ml。
1.3搖瓶培養：在500ml三角瓶中裝入sdy培養基100ml，121℃高溫蒸汽滅菌30min，待冷卻後，在無菌操作臺中，按1％接種量接入孢懸液，26±1℃、200rpm恆溫震蕩培養，培養28h後，形成大量芽生孢子即可作為固相發酵的種子液。
2固體培養
2.1固體培養基製作：同實施例1，氮源為0.5％豆粉。
2.2接種及培養：同實施例1。
2.3培養料處理：同實施例1。
2.4培養結果：固體發酵周期為8d，血球計數板計數，3次測量取平均值，培養物分生孢子含量為3.2×1010/克料。
實施例4在固體培養基中添加無機鹽
1菌絲體種子液製備：
1.1菌種活化：方法同實施例1。
1.2菌懸液製備：方法同實施例1，孢懸液濃度為5×107孢子/ml。
1.3搖瓶培養：方法同實施例2。
2固體培養
2.1固體培養基製作：方法同實施例1，氮源為1％牛肉膏，在固體培養基中按溼料重的0.4％添加無機鹽水溶液(成分為0.05％kh2po4、0.01％mgso4·7h2o、0.2％kno3)。
2.2接種及培養：同實施例1。
2.3培養料處理：同實施例1。
2.4培養結果：固體發酵周期為6d，血球計數板技術，3次測量取平均值，培養物分生孢子含量為6.5×1010/克料。
比較例1
為更進一步說明玉米發酵培養基工藝簡單、發酵周期短，比較了白僵菌jcf(保藏編號為cgmccno.11338)在玉米發酵培養基和大米培養基、玉米粉培養基、常規真菌培養基sday及pda的發酵水平，結果參見表1，表1為本發明比較例提供的白僵菌在不同固體培養基上的生長情況及產孢水平。
表1白僵菌在不同固體培養基上的生長情況及產孢水平
表1中，玉米培養基即為實施例1製備的固體培養基，大米培養基基質為低值粳米，玉米粉培養基成分包括4％玉米粉、1.5％瓊脂和餘量的水。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。