一種用於檢測血吸蟲的納米抗體組合物、免疫傳感器及其製備方法和應用與流程
2023-12-02 06:37:41 1
本發明涉及生物醫學或生物技術檢測
技術領域：
，特別是涉及一種用於檢測血吸蟲的納米抗體組合物、免疫傳感器及其製備方法和應用。
背景技術：
：血吸蟲病是一種嚴重危害人體健康的人畜共患寄生蟲病，血吸蟲病防治工作仍然是一個重要的任務。血吸蟲循環抗原(Circulatingantigen，CAg)可作為現症感染與療效考核的的重要指標，常規免疫學方法較難檢測出體液中含量較低的CAg，尤其對於低感染度或血吸蟲病輕度流行區的人群。因此，建立一種靈敏、特異的CAg檢測技術，對於血吸蟲病的防治具有重要意義。生物傳感器藉助固化的生物識別分子和換能器將生化信號轉化為電信號達到直接檢測的目的，相較於傳統方法其準確度和靈敏度高，測定過程簡單，便於推廣普及。隨著納米材料的加入，傳感器在在檢測診斷方面的靈敏度和特異性有了進一步的提升，並已成功檢測到細菌、病毒、寄生蟲、蛋白質。近年來，抗體技術已被廣泛地應用於疾病的診治領域，新型基因工程抗體不斷出現，抗體小型化是抗體基因工程的主要研究方向之一。最新的單域抗體(Singledomainantibody，SdAb)是指保留了較好的抗原結合能力和專一性的VH小分子抗體片段，結構簡單，容易進行體外規模化合成表達。SdAb體積較小，具有較強的組織穿透能力，利於它們進入緻密的組織以及穿透血腦屏障。這使它容易接近靶目標表面的溝、縫或被隱藏的抗原表位，識別許多傳統抗體無法識別的抗原。然而，SdAb暴露了表面疏水基團，非特異性吸附增加，易凝結和黏附，須經結構改造後才能使用。駱駝體內存在一種天然輕鏈缺失的功能性重鏈抗體(Heavychainantibodies，HCAb)，克隆該重鏈抗體的可變區得到最小的抗原結合片段，即納米抗體(Nanobody，Nb)。納米抗體的最大優勢在於它的體積小。其分子量只有15kDa，不足傳統抗體(160KDa)的十分之一，也遠小於單域抗體(55KDa)。Nb較普通抗體還具有高度水溶性和構象穩定性，較強的抗原親合力和優良的組織穿透能力，容易體外表達和人源化改造修飾等優點，Nb的以上特性使其在診斷檢測領域展現出廣闊的應用前景。石墨烯是一種新型的碳納米材料，具有較大的比表面積和高效的電子傳導能力，其獨特的二維層狀結構又賦予石墨烯大量的電活性分布位點，可以負載大量的生物大分子物質對自身進行修飾且不改變自身活性具有良好的生物相容性，同時石墨烯具有直接感知和放大界面物質變化的能力，這些特性都有利於生物物質的識別和信號的轉化。因此，石墨烯也成為生物傳感器的理想材料。本研究建立了一種基於新型納米材料石墨烯與Nb的微納免疫傳感器，並初步應用於日本血吸蟲病患者血清中CAg的檢測。技術實現要素：本發明針對現有技術的不足，提供了一種用於檢測血吸蟲的納米抗體組合物，利用該組合物製備的免疫傳感器用於檢測血吸蟲具有靈敏度高、特異性好。一種用於檢測血吸蟲的納米抗體組合物，包括兩種納米抗體，其胺基酸序列分別如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。所述的納米抗體組合物，編碼所述兩種納米抗體的核苷酸序列分別如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。所述兩種納米抗體的比例為：按摩爾比計1∶0.5～2。本發明又提供了所述的納米抗體組合物在製備血吸蟲檢測試劑盒中的應用。本發明還提供了一種用於檢測血吸蟲的免疫傳感器，包含所述的納米抗體組合物。本發明還提供了所述的免疫傳感器在非疾病診斷為目的的血吸蟲檢測中的應用。本發明還提供了所述免疫傳感器的製備方法，包括以下步驟：(1)以還原後的氧化石墨烯薄膜作為工作電極，在電極反應區域沉積一層金納米顆粒獲得金納米顆粒修飾的氧化石墨烯電極；(2)將所述納米抗體組合物通過金氨健結合到金納米顆粒修飾的氧化石墨烯電極上獲得所述免疫傳感器。所述的製備方法，金納米顆粒通過電化學沉積法沉積到工作電極反應區域，電鍍液使用1％的HAuCl4溶液，電鍍電壓為-0.66V，反應時間100s。所述的製備方法，納米抗體組合物結合後，使用BSA進行封閉。納米抗體結合後，仍會存在沒有結合抗體的裸露的金納米顆粒，需要使用其他蛋白進行封閉。當然，除了使用BSA，也可以使用其他蛋白進行封閉，比如奶粉也是常用的封閉液。本發明用於檢測血吸蟲的納米抗體組合物為由日本血吸蟲的可溶性蟲卵抗原免疫駱駝所得，納米抗體親水性好、分子量小，使用本發明納米抗體組合物製備的免疫傳感器用於檢測血吸蟲時，靈敏度高，靈敏度可以達到0.01ng/mL，遠遠高於常規的ELISA方法；特異性好，在不同物種的蟲體之間不易發生誤測。附圖說明圖1為免疫後駱駝血樣提取的總RNA的膠檢測結果圖，其中M為DNAMarkerDL2000泳道1為總RNA。圖2為巢式PCR產物膠檢測結果圖，其中，M為DNAMarkerDL2000。圖3為初始文庫的菌落PCR鑑定結果圖，其中，M為DNAMarkerDL2000，泳道1-18為隨機挑取的18個單菌落PCR產物，PC為陽性對照。圖4為間接噬菌體ELISA鑑定結果圖，其中1-48為隨機挑取的噬菌體克隆，PC為陽性對照，NC為陰性對照。圖5為純化所得Nb重組表達的檢測結果圖，其中，圖A為SDS-PAGE檢測結果圖，圖B為WesternBlot結果的DAB顯色圖。圖6為石墨烯薄膜的原子力顯微鏡表徵圖。圖7為石墨烯薄膜的掃描電子顯微鏡表徵圖，其中圖A為橫截面結構，圖B為表面形貌圖8為鍍金後的石墨烯薄膜電極表面的掃描電子顯微鏡表徵圖。圖9為氧化石墨烯薄膜和石墨烯薄膜的拉曼光譜圖。圖10為實施例6中阻抗測試圖，其中，a：石墨烯裸電極；b：金納米顆粒修飾後的電極；c：納米抗體固定後的電極；d：BSA封閉後的電極；e：SEA結合後的電極。圖11為實施例2製備的免疫傳感器特異性檢測結果圖，其中，圖A為納米抗體修飾電極檢測不同寄生蟲抗原的阻抗圖；圖B為納米抗體修飾電極檢測不同寄生蟲抗原的阻抗變化值柱狀圖，*代表顯著性差異；圖C為抗血清修飾電極檢測不同寄生蟲抗原的阻抗圖；圖D為抗血清修飾電極檢測不同寄生蟲抗原的的阻抗變化值柱狀圖。圖12為實施例2製備的免疫傳感器靈敏度檢測時不同SEA濃度下的檢測曲線圖，其中，曲線a～h濃度分別為10-8mg/mL、10-7mg/mL、10-6mg/mL、10-5mg/mL、10-4mg/mL、10-3mg/mL、10-2mg/mL、10-1mg/mL。圖13為實施例2製備的免疫傳感器靈敏度檢測時電子轉移電阻與SEA濃度的線性曲線圖。具體實施方式主要試劑：0.1％氯金酸溶液、石墨(光譜純)購自中國製藥化學試劑有限公司；HI溶液、95％乙醇購自生工生物上海有限公司；氧化石墨烯溶液由氧化石墨(Hummers法製備)通過JY92-II超聲波細胞粉碎機(購自寧波新芝生物科技股份有限公司)降解製備；0.45μm硝酸纖維素膜購自Bio-Rad公司；Ag/Agcl參比電極、對電極、電化學反應池購自上海辰華儀器有限公司；1％BSA；PBS溶液(pH＝7.4，含0.01％吐溫20)；含有0.1MKCl的5.0mMK3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6(1∶1)混合溶液；雙蒸水；其他化學試劑均為分析純。主要儀器：真空泵(GM-0.33A，天津津騰)；1000mL真空抽濾瓶(sartorius，德國)；電化學工作站(CHI660E，上海辰華)；1260型阻抗分析儀(SolartronAnalytical，法恩伯勒，英國)；1287型輸力強電化學工作站(SolartronAnalytical，法恩伯勒，英國)；Ultra-55型場發射掃描電子顯微鏡(Zeiss，德國)；顯微拉曼光譜儀(JobinYvonLabRamHRUV，法國)。樣本來源：正常人血清與日本血吸蟲糞檢陽性的患者血清由浙江省血吸蟲病防治中心提供。實施例1(1)駱駝免疫每次以600μg日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(solubleeggantigen，SEA)免疫駱駝，首次免疫為完全弗氏佐劑，加強免疫用不完全弗氏佐劑，共加強免疫3次，末次免疫2周後檢測血清抗體的效價水平。各次免疫時間間隔為3周。(2)抗體效價檢測效價檢測：10μg/mL的SEA包板，4％脫脂奶粉封閉，抗血清稀釋比為1∶51200時，測得OD490nm為0.188(P/N≧2)，符合建庫要求。(3)建庫將符合建庫標準的駱駝血樣收集在50mL離心管中，加入等體積PBS後分裝並提取RNA，由圖1可知，泳道1中有兩條非常清晰的條帶，分別為28SrRNA和18SrRNA，表明提取的總RNA質量良好，沒有發生顯著的降解，可用於接下來納米抗體文庫的構建。以總RNA為模板，採用反轉錄PCR經兩步反應合成cDNA。而後以此cDNA為模板，進行巢式PCR(NestPCR)，擴增得到了約500bp的重鏈可變區基因VHH(圖2)。採用限制性內切酶對NestPCR的擴增產物和噬菌粒載體pHEN4進行雙酶切，將純化後的酶切產物按優化後的VHH插入子片段與載體分子摩爾比3∶1進行連接、電轉化，經平板計數測得所構建的文庫菌落數達2.8×108個。從文庫菌落計數的平板上隨機挑取18個單菌落，進行菌落PCR鑑定VHH基因的插入率。菌落PCR結果如圖3所示，陽性對照有明顯條帶，結果可信，實驗組中15個單菌落擴增出了500-750bp的條帶，陽性率83.3％，由此可知，初始文庫實際的庫容為2.3×108cfu。(4)抗體篩選以日本血吸蟲SEA抗原作為靶標，結合Gly-HCl洗脫和標品競爭洗脫兩種噬菌體洗脫方式，對納米抗體噬菌體展示免疫文庫進行三輪親和淘選。由表1可知，在前兩輪Gly-HCl洗脫淘選中，陽性噬菌體得到了有效的富集。而在第三輪競爭洗脫淘選中，噬菌體產出量較第一輪升高了兩個數量級，表明特異性噬菌體得到了有效的富集，為隨後的篩選特異性噬菌體提供了保障。表1淘選輪數SEA濃度(μg/mL)起始數量(cfu)淘選數量(cfu)富集度15002.80×10111.06×1062.64×1052503.11×10115.04×1076.17×1033202.84×10116.14×1084.63×102從第三輪淘選的洗脫物滴度測定平板上隨機挑取48個噬菌體單克隆，採用間接噬菌體ELISA(phageELISA)對48個噬菌體克隆進行陽性篩選，結果如圖4所示，48個噬菌體克隆均與檢測抗原有很強的結合，初步表明48個噬菌體克隆陽性率達100％。提取27個特異性噬菌體克隆的DNA並送生物測序公司進行測序。對測序結果進行分析，納米抗體在大腸桿菌等表達菌體內具有易可溶性表達、產量高等特點，本研究將陽性噬菌體克隆的DNA序列翻譯為胺基酸，根據同源性差異以及噬菌體陽性強度兩個指標，選取VHH2(核苷酸序列如SEQIDNO.3所示)和VHH48(核苷酸序列如SEQIDNO.4所示)基因亞克隆至原核表達載體pALTER(購自Addgene)，載體上帶有用於純化的His標籤，命名為pALTER-VHH2與pALTER-VHH48。(5)納米抗體重組表達重組載體分別轉化至大腸桿菌細胞E.coliBL21(DE3)pLysS，經0.3mM的IPTG，30℃誘導12h後，離心收集菌體並分離可溶性納米抗體，經鎳柱純化後，獲得大小約為17kDa的2種納米抗體，將純化後的表達產物進行SDS-PAGE與免疫印跡分析，免疫印跡結果使用DAB進行顯色，結果如圖5所示，得到約為15kD大小的納米抗體。實施例2免疫傳感器製備過程如下：氧化石墨烯薄膜(GO薄膜，GOP)是利用硝酸纖維素膜(直徑47mm，孔徑0.45μm)和GO溶液通過真空抽濾法抽濾而成，自然乾燥後利用純酒精從硝酸纖維素膜上剝離，GOP的厚度可通過控制一定濃度的GO溶液的體積而定。在室溫條件下，利用HI溶液將獲取的GOP還原6h，還原完成後，利用95％乙醇浸泡漂洗數次至不再有HI殘留，自然晾乾，成功製備還原後的氧化石墨烯薄膜(rGOP)。將rGOP剪裁出長寬尺寸規格為20mm×5mm的電極(可根據要求確定合適的大小)，將所獲電極固定到塑料底板上並確定電極的反應面積為5mm×5mm，使用絕緣膠帶標記固定，獲得氧化石墨烯電極(rGOPE)。隨後將電極反應區域置於1％的HAuCl4溶液中利用電化學沉積法將金納米顆粒沉積到電極反應區域表面從而獲得金納米顆粒修飾的氧化石墨烯電極(rGOPE/AuNPs)，使用雙蒸水衝洗並用氮氣乾燥，電鍍時電壓選為-0.66V，反應時間100s。之後將納米抗體VHH2和VHH48等比例混合(摩爾比1∶1)的溶液6μL(抗體的濃度均為1mg/mL，效價均為1∶51200)滴定到電極反應區域，4℃條件下孵育過夜，過夜後使用1mMPBS溶液衝洗並使用氮氣乾燥。然後滴加1％BSA室溫孵育30min，之後使用1mMPBS溶液衝洗並使用氮氣乾燥，以用來封閉金納米顆粒表面沒有結合抗體的位點，減少非特異性幹擾。最後在電極表面滴加待測樣本，室溫孵育30min後並再次使用PBS溶液清洗並乾燥。對孵育好的免疫電極進行電化學阻抗值的檢測，通過阻抗值與樣本濃度的線性關係，實現對待測樣本定量檢測目的。實施例3和4免疫傳感器製備，納米抗體VHH2和VHH48混合的比例如表2所示，納米抗體濃度和效價以及其餘步驟均同實施例2。表2VHH2∶VHH48(摩爾比)實施例31∶0.5實施例41∶2實施例5使用原子力顯微鏡、掃描電鏡、拉曼光譜儀等儀器對實施例2中的石墨烯薄膜的內外部結構、氫碘酸還原前後的石墨烯薄膜以及鍍金後的電極表面等進行了表徵。原子力顯微鏡表徵結果如圖6所示，石墨烯片層厚度大約為1nm，說明氧化石墨完全剝離成單層石墨烯。圖7A顯示：所製備的石墨烯薄膜是由石墨烯單片層組裝堆積而成，它內部的片層結構間的電子傳遞對石墨烯本身的導電性能關係密切。從圖7B可以看出，有許多無規則的褶皺結構分布於石墨烯薄膜表面這種特殊結構有利於Nb高密度地固相結合在表面。石墨烯的彎曲特性是薄膜表面不規則褶皺形成的重要原因。鍍金後的石墨烯薄膜電極表面可以看到大小不一的金顆粒沉積(圖8)，通過金原子和蛋白質氨基之間形成的金氨鍵實現日本血吸蟲納米抗體與石墨烯薄膜的固相結合。氫碘酸能夠去除石墨烯薄膜內部的含氧基團使其導電性增加，隨著石墨烯薄膜厚度增加，還原會變得不充分，進而影響其導電性能。對氫碘酸(HI)還原前、後的石墨烯薄膜進行拉曼分析得知(圖9)，氧化石墨烯薄膜的ID/IG的比值是1.34，HI還原後的氧化石墨烯ID/IG比值變為1.86，說明氫碘酸已經對氧化石墨烯進行了充分還原。實施例6使用電化學阻抗來表示實施例2中免疫傳感器製備過程中電極表面阻抗的變化情況。一個完整的阻抗曲線由兩部分構成，即一段半圓部分和一段直線部，它們分別代表著反應過程中電極表面電子的轉移與擴散過程。其中，半圓的直徑大小代表著電極表面的電子轉移電阻的大小。實驗測量選用傳統的三電極測試系統，製備好的免疫傳感器作為工作電極，輔助電極和參考電極分別連接鉑絲電極和Ag/AgCl參比電極，反應緩衝液為含有5mMK3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6(1∶1)和0.1mMKCl的混合溶液。測試儀器為1260型阻抗分析儀(SolartronAnalytical，法恩伯勒，英國)及1287型輸力強電化學工作站(SolartronAnalytical，法恩伯勒，英國)，測試分析軟體為Zview和Zplot，測量頻率範圍和交流擾動電壓分別設置為1Hz～100kHz和5mV。結果如圖10所示，其中，曲線a～e分別為石墨烯裸電極(a)，石墨烯/金納米顆粒修飾的電極(b)，抗體固定後電極(c)，封閉非特異性位點後電極(d)，與抗原結合後電極(e)的電極的阻抗測試曲線圖譜。從圖中可以看出，裸電極的阻抗圖譜電子轉移電阻比較大(曲線a)，表明裸電極的電阻比較大，電子傳遞的速率比較慢；當把金顆粒電沉積到石墨烯電極之後(曲線b)，半圓直徑顯著減小，表明修飾在電極上的Au顆粒具有良好的電子傳遞效應，使得電極的電子的傳遞阻抗顯著減小；繼續在電極上修飾抗體(曲線c)、通過牛血清蛋白來封閉非特異性位點(曲線d)、與特異性抗原結合進行檢測後(曲線e)，電極的阻抗圖譜結果顯示，免疫電極的阻抗隨著對電極的逐步修飾而逐步增大，這是因為當把抗體、牛血清蛋白和抗原這類生物大分子物質修飾在電極表面後，電極表面的電子傳遞速率會逐步隨之降低，電極傳遞電子的能力受到抑制之後，電子轉移電阻就會增大。通過對免疫電極逐步的修飾反應，其各步反應中的組分物質成功逐層組裝於電極表面，使電極的阻抗發生明顯變化，這一結果表明免疫傳感器的成功製備實施例7對實施例2中製備的免疫傳感器的特異性進行檢測。選取日本血吸蟲(S.japonicum)抗原和其它六種蟲體：弓形蟲(T.gondii)、曼氏血吸蟲(S.mansoni)、人棘顎口線蟲(G.spinigerum)、簡單異尖線蟲(A.simplex)、華支睪吸蟲(C.sinensis)、衛氏並殖吸蟲(P.westermani)的抗原作為檢測對象，待測抗原的濃度均為0.1mg/mL。具體的檢測過程，與實施例6中方法相同。結果如圖11所示，由圖11A和圖11B可以看出，孵育日本血吸蟲納米抗體的免疫傳感器結合抗原後，結合日本血吸蟲SEA的免疫電極阻抗增幅高達646.88Ω，遠高於空白對照值和非特異性抗原的變化值。同時以普通的日本血吸蟲抗血清(製備方法：在注射前從耳緣靜脈取血約3ml用於製備陰性對照血清。將2ml用弗氏完全佐劑乳化的抗原溶液，約含500μg日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原，通過皮下結合肌肉多點注射的方法注入發育良好的純種紐西蘭大白兔體內。基礎免疫後14天進行加強免疫。注射間隔周期為14天，加強注射所用的抗原溶液用弗氏不完全佐劑進行乳化，加強免疫3次，從兔耳中央靜脈採血並分離血清，採用間接ELISA方法測定抗血清效價高達1∶16000。)代替本發明納米抗體，以與實施例2相同的方法製備普通的血吸蟲抗血清修飾的免疫傳感器作為對照。檢測結果如圖11C和圖11D所示，雖然阻抗增值的檢測結果高於空白對照值，但是對血吸蟲SEA和其它六種非靶性抗原的測量結果沒有顯著差別，阻抗譜的變化沒有明顯的區分度，且華支睪吸蟲和衛氏並殖吸蟲這兩者的測量增幅高於日本血吸蟲。由以上結果表明：本發明納米抗體在與特異性抗原的結合能力上要遠遠高於普通的血清抗體，基於納米抗體和石墨烯複合材料的免疫傳感器具有良好的特異性。實施例8對實施例2中製備的免疫傳感器的靈敏度進行檢測。使用該傳感器對不同濃度日本血吸蟲SEA(10-8～10-1mg/mL)進行檢測。具體的檢測過程，與實施例6中方法相同。結果如圖12和圖13所示，在最低的血吸蟲抗原濃度10-8mg/mL(曲線a)測試中，納米抗體的檢測增幅達到了87.092Ω；在最高濃度的10-1mg/mL(曲線h)檢測結果中，納米抗體修飾的免疫傳感器的測試增值則為139.93Ω，表明隨著測試抗原濃度的依次增加，免疫傳感器的阻抗值也依次增加，在不同抗原稀釋度中阻抗值與空白對照具有明顯的區分度(圖12)。並且在該檢測濃度範圍內，免疫傳感器具有較好的線性關係，相關係數為0.9868(圖13)。2002年，毛亞飛等(毛亞飛,張悟澄&潘勁草.磁珠-ELISA檢測日本血吸蟲循環蟲卵抗原的研究.中國寄生蟲學與寄生蟲病雜誌20,372-373(2002).)報導MB-ELISA檢測法對血吸蟲SEA的最低檢測濃度為2.9ng/mL，常規的夾心法ELISA對SEA的最低檢測濃度是5.8ng/mL。而本發明免疫傳感器檢測出的最低濃度為0.01ng/mL。以上結果表明，該傳感器具有較好的靈敏性。實施例9使用實施例2中製備的免疫傳感器對糞檢陽性及陰性人血清樣品進行日本血吸蟲循環抗原的檢測。具體的檢測過程，與實施例6中方法相同。結果如表3所示，本發明免疫傳感器的檢測結果和糞檢結果一致。另外，在同一條件下，對樣本進行了三次重複檢測，具有較好的重現性。表3樣本糞檢結果免疫傳感器結果1陽性陽性2陽性陽性3陽性陽性4陰性陰性5陰性陰性SEQUENCELISTING浙江省醫學科學院一種用於檢測血吸蟲的納米抗體組合物、免疫傳感器及其製備方法和應用4PatentInversion3.31124PRT雙峰駝（Camelusbactrianus）1HisValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlySerValGlnAlaGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyLeuThrAlaIleAsnLys202530ArgMetAlaTrpPheArgGlnAlaProGlyLysGluArgGluGlyVal354045AlaGlyThrTyrArgLeuThrGlyAspThrAlaTyrAlaHisSerVal505560LysGlyArgPheThrLeuSerGlnAspThrAlaLysThrThrLeuTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuLysProGluAspThrAlaMetTyrTyrCys859095AlaAlaValTrpThrGlyGlyValTrpTyrAspAlaArgPheTyrLys100105110SerTrpGlyGlnGlyThrGlnValThrValSerSer1151202124PRT雙峰駝（Camelusbactrianus）2GlnValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlySerValGlnAlaGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyLeuThrAlaArgAsnLys202530ArgMetAlaTrpPheArgGlnAlaProGlyLysGluArgGluAlaVal354045AlaGlyIleTyrArgLeuThrGlyAspThrAlaTyrAlaAsnSerVal505560LysGlyArgPheThrLeuSerGlnAspThrAlaLysThrThrLeuTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuLysProGluAspThrAlaSerTyrTyrCys859095AlaAlaValTrpThrGlyGlyValTrpTyrAspAlaArgMetTyrLys100105110SerTrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSer1151203372DNA雙峰駝(Camelusbactrianus)3catgtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactc60tcctgtgcagcctctggacttaccgccattaacaagcgcatggcctggttccgccaggct120ccagggaaggagcgcgagggagtcgcaggtacttatcggcttactggtgacacagcctat180gcccactccgtgaagggccgattcaccctctcccaagataccgccaagactacgctatat240ctgcagatgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcggcagtctgg300actggcggtgtctggtatgatgcgcgtttctataagtcctggggccaggggacccaggtc360accgtctcctca3724372DNA雙峰駝(Camelusbactrianus)4caggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactc60tcctgtgcagcctctggacttaccgcccgtaacaagcgcatggcctggttccgccaggct120ccagggaaggagcgcgaggcagtcgcaggtatttatcggcttactggtgacacagcctat180gccaactccgtgaagggccgattcaccctctcccaagacaccgccaagactacgctatat240ctgcagatgaacagcctgaagcctgaggacactgcctcgtactactgtgcggcagtctgg300actggcggtgtttggtatgatgcgcgtatgtataagtcctggggccaggggaccctggtc360accgtctcctc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