用於α病毒結構蛋白表達的無啟動子盒的製作方法

2023-12-10 04:32:26 5

專利名稱：：用於α病毒結構蛋白表達的無啟動子盒的製作方法
技術領域：
：本發明涉及用於製備重組α病毒顆粒的改良構建體和製備重組α病毒顆粒的方法。
背景技術：
：α病毒目前用作研發傳染病和癌症疫苗的載體平臺(例如，參見U.S.專利No.5，792，462；6，156，558；5，811，407；6，531，135；6，541，010；6，783，939；6，844，188；6，982，087；7，045，335；5，789，245；6，015，694；5，739，026；Pushko等，Virology239(2)389-401(1997),Frolov等，J.Virol.71(1):248_258(1997)；Smerdou和Liljestrom,J.Virol.73(2)1092-1098(1999))。α病毒包括披膜病毒科中的屬，並且發現屬中的成員遍布全世界，在脊椎動物和無脊椎動物宿主中都有。其中，得到最多研究的用於載體平臺的α病毒是委內瑞拉馬腦炎(VEE)病毒、西門利克森林病毒(SFV)和辛德畢斯病毒(SV)，該屬的原型成員。一個這樣的載體平臺是α病毒複製子系統，描述於GarofT等的U.S.專利No.6，190，666，Johnston等的U.S.專利No.5，792，462和6，156，558中，Dubensky等的U.S.專利No.5，814，482,5,843，723,5,789，245,6,015，694,6,105，686和6，376，236；U.S.公開申請No.2002-0015945(Polo等)，U.S.公開申請No.2001-0016199(Johnson等)，Frolov等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:11371_11377和Pushko等(1997)Virology239:389-401中。將α病毒複製子載體工程化，以含有並表達一個或更多個目標核酸，其中目標核酸可以編碼，例如，抗原、細胞因子、核酶或酶。α病毒複製子可以源自任何α病毒，其中如委內瑞拉馬腦炎(VEE)病毒，辛德畢斯病毒，例如了1339株，南非蟲媒病毒似.86和西門利克森林病毒。然後將載體引入培養物中的細胞中，使α病毒複製，並且其中還表達了α病毒的結構蛋白，使得通過α病毒結構蛋白將載體包裝成α病毒複製子顆粒(ARP)。然後從培養物中收集ARP，並傳送至對象，用於各種治療目的。已經研發了各種構建體來提高ARP系統在疫苗應用中的免疫原性和有效性。還將這些構建體中的許多進行了設計，以降低通過基因組片段的重組形成可複製(replication-competent)α病毒的可能性。Johnson等(U.S.專利No.5，792，462和6，156，558)認識到從單個輔助系統(其中一套完整的α病毒的結構蛋白基因在一個RNA分子上，而非結構蛋白基因和異源目標核酸在分開的複製子RNA上)重組的可能，並因此設計了利用兩個輔助RNA來編碼結構蛋白的「雙-輔助」系統。Dubensky等(U.S.專利No.5，789，245)和Polo等(U.S.專利No.6，242，259)描述了使用穩定轉化至包裝細胞系中的兩個DNAa病毒結構蛋白表達盒，以通過將複製中的α病毒載體引入包裝細胞的培養物中時產生表達那些結構蛋白的RNA來包裝α病毒載體。Lijiestrom和同事已經提出了證實「單個輔助系統」將產生野生型α病毒顆粒的數據(Berglimd等，Biotechnology11(8):916_920(1993))。Smith等已經描述了其他指導結構蛋白表達的新輔助RNA(W02004/085660)。通過將病毒編碼序列分布在三個核酸中，其中兩個包括輔助系統，如上所述，形成可複製病毒(「RCV」)的重組的理論頻率相對於單個輔助系統明顯下降。這些系統包括使用α病毒亞基因組啟動子，通常稱為26S啟動子或病毒連接區啟動子，以提供用作獨立轉錄單位的構建體，和使用α病毒RNA聚合酶識別信號，使得輔助系統可以利用α病毒複製機制的存在，用於輔助功能的擴增和有效表達。在現有的系統中，已知包裝信號通常包括在複製子RNA中並排斥在輔助構建體之夕卜。然而，儘管如此，輔助RNA以較低的頻率得到包裝或共同包裝(Lu和Silver，J.VirolMethods,91(1):59-65(2001))，並且具有末端識別信號的輔助構建體將在複製子存在下得到擴增和表達，潛在地與其他輔助分子或複製子RNA產生重組事件。使用α病毒複製子顆粒的動物研究已經使用了IO5至IO8的劑量，並且107、5Χ107和IO8已經有效地用於非人靈長類動物中，這也是用於人類臨床試驗中的劑量。此外，較高劑量，如2X108、5XIO8和109，在用於人類的應用中也是有用。這樣的劑量需要大規模的製造程序，並且在這樣的規模下，在統計學上可能的是使用現有的RNA輔助系統可能產生可複製α病毒。因此，本領域中仍然存在需要來提供用於製造α病毒複製子顆粒的改良系統，以進一步降低形成可複製α病毒的預測頻率，以及優化製造策略和成本。本發明提供了缺乏啟動子序列的編碼α病毒結構蛋白的α病毒RNA輔助分子，由此顯著降低在輔助分子和複製子載體之間可能發生的功能性重組事件的理論數量，導致重組α病毒顆粒生產過程中可複製α病毒形成率的理論預測下降。發明概述本發明提供分離的RNA分子，其包含a)α病毒5』複製識別序列，其中已經從所述5』複製識別序列中除去起始密碼子；b)編碼α病毒結構蛋白的核苷酸序列；和C)α病毒3』複製識別序列，條件是RNA分子不含有指導(b)的核苷酸序列轉錄的啟動子，並且其中α病毒5』和3』複製識別序列在α病毒非結構蛋白的存在下指導整個RNA分子的複製。在此另外提供的是製備α病毒複製子顆粒的方法，其包括在由此生產α病毒複製子顆粒的條件下，將一個或更多個本發明的RNA分子引入細胞中，由此RNA分子的組合連同α病毒複製子RNA—起編碼生產α病毒複製子顆粒需要的所有α病毒結構蛋白。此外，提供了製備α病毒複製子顆粒的方法，其包括在由此生產α病毒複製子顆粒的條件下，將下列引入細胞中a)α病毒複製子RNA;b)—個或更多個本發明的RNA分子；和c)一個或更多個啟動子輔助α病毒輔助構建體，由此(b)的RNA分子的組合和(c)的輔助構建體編碼生產α病毒複製子顆粒需要的所有α病毒結構蛋白。在其他實施方案中，本發明提供了α病毒複製子顆粒群，其中該群不含有可檢測的可複製病毒顆粒，如通過在培養物中的允許(permissive)細胞上傳代所測定的。在此還提供了α病毒複製子顆粒群，其中該群不含有可檢測的可複製病毒顆粒，如通過在培養物中的允許細胞上傳代所測定的，其中α病毒複製子顆粒在α病毒結構蛋白或α病毒非結構蛋白或α病毒結構蛋白和α病毒非結構蛋白兩者中含有一個或更多個減毒突變。此外，本發明提供了誘導對象中免疫應答的方法，其包括將有效量的本發明的α病毒複製子顆粒群給予對象。附圖簡述圖1顯示了全長(FL)無啟動子輔助分子的5』複製識別序列(RRS)的結構。用輪廓線和黑線表示5』複製識別序列內的衣殼或糖蛋白(GP)起始密碼子的起始密碼子上遊的位置。輪廓線表示與衣殼或GP的編碼序列符合閱讀框的起始密碼子。黑線表示與衣殼或GP的編碼序列不符合閱讀框的起始密碼子。垂直線下的數字表示用於5』複製識別序列中推定起始密碼子的第一個核苷酸位置，編號從分子的5』端開始。圖2顯示了無啟動子輔助分子中5』複製識別序列刪除的結構。框出的框表示每個構建體內保留的5』複製識別序列，而框內的數字是序列以核苷酸的長度。細黑線表示已經從每個構建體刪除的5』複製識別序列。帶有斜線的框表示衣殼或GP的編碼序列的位置。圖3是Northern印跡分析。從Vero細胞提取總細胞RNA，這些細胞已經用30μgpERK/342/MS/BoNTA複製子RNA和30μgdHEl_6Ml(無啟動子El輔助子)或30μg含有26S的GP輔助RNA(13.4.6)電穿孔。將每個樣品的RNA(5μg)在1%乙二醛凝膠上跑膠並轉移至BrightStar膜(Ambion;Austin，TX)。使用基因組正義α病毒RNA3』端特異性的探針來檢測輔助子的複製。泳道1:RNA分子量標記，泳道2:dHEl-6Ml輔助子+BoNTA複製子，泳道3啟動子輔助GP輔助子+BoNTA複製子。圖4是顯示了泛素單體的C-端胺基酸和核苷酸序列以及用於泛素化(dHcapU和dHgpU)或標準(dHcap和dHgp)構建體的α病毒衣殼和糖蛋白編碼序列的N-端殘基的圖。這些序列右端的"MetPhe","ProMetPheProThrMetSer，，禾口『『ThrMetSer，，表示在衣殼和GP蛋白的N-端發現的胺基酸。泛素化構建體具有在13.2.2和13.4.6輔助子中未發現的其他N-端殘基。最右側的框表示3』RsrII位點和作為初級核苷酸序列編碼結果的胺基酸。最左側的框表示對於從VEE結構蛋白切割泛素關鍵的殘基。圖5顯示了在包裝研究中從電穿孔產生VRP的細胞產生的細胞裂解物的Western印跡分析(一個使用衣殼特異性抗體，另一個使用糖蛋白(GP)特異性抗體)(表10)。除了複製子，將兩個RNA輔助子電穿孔至細胞中，如下泳道1，dHcap6-mutl和13.4.6(GP)；泳道2，Hcap4和dHgp6-mutl；泳道3，dHcapU和dHgpU；泳道4，dHcap(FL)和dHgp(FL)；泳道5，Hcap4和dHgpU；泳道6，Hcap4和dHgp(FL)；泳道7，dHcapU和13.4.6；泳道8，dHcap(FL)和13.4.6；泳道9，Hcap4和13.4.6；泳道10，分子量標記。圖6顯示了在Vero細胞中產生的衣殼輔助RNA的Northern印跡分析，該Vero細胞中除了複製子外，已經將兩個RNA輔助子電穿孔至該細胞中，如下泳道1，dHcap6-mutl禾口13.4.6(GP)；泳道2，Hcap4和dHgp6_mutl；泳道3，dHcapU和dHgpU；泳道4，dHcap(FL)和dHgp(FL)；泳道5，Hcap4和dHgpU；泳道6，Hcap4和dHgp(FL)；泳道7，dHcapU和13.4.6；泳道8，dHcap(FL)和13.4.6。用星號標註每個泳道中可翻譯的衣殼RNA分子。圖7顯示了在Vero細胞中產生的糖蛋白(GP)輔助RNA的Northern印跡分析，該Vero細胞中除了複製子外，已經兩個RNA輔助子電穿孔至該細胞中，如下泳道1，dHcap6-mutl禾口13.4.6(GP)；泳道2，Hcap4和dHgp6_mutl；泳道3，dHcapU禾口dHgpU；泳道4，dHcap(FL)和dHgp(FL)；泳道5，Hcap4和dHgpU；泳道6，Hcap4和dHgp(FL)；泳道7，dHcapU和13.4.6；泳道8，dHcap(FL)和13.4.6。用星號標註每個泳道中可翻譯的糖蛋白RNA分子。發明詳述如在此所用的，「一(a)」、「一(an)」和「該(the)」可以表示一種或更多種，這取決於其中使用它的內容。例如，「一(a)」種細胞可以表示一種細胞或更多種細胞。此外，如在此所用的，「和/或」指的是並包括一種或更多種相關所示項目的任何和所有可能的組合，以及以可替換的方式(「或」)解釋時，組合的缺乏。此外，術語「約」，如在此所用的，涉及可測量值時，如本發明的化合物或試劑的含量、劑量、時間、溫度等，表示包括特定含量士20%、士10%、士5%、士1%、士0.5%或甚至士0.的變動。術語「5』α病毒複製識別序列」、「3』α病毒複製識別序列」、「5』複製識別序列」和「3』複製識別序列」指的是在α病毒中發現的RNA序列、從其衍生的序列或基於各種α病毒中保守序列的合成序列，這些序列通過非結構α病毒複製酶蛋白識別並導致病毒RNA的複製。在一些實施方案中，這些序列是DNA的形式，以促進本發明的構建體、質粒和核酸的製備、突變和/或操縱，來產生VRP。這些序列也稱為「5』和3』端」，非結構蛋白_介導的擴增需要的5』和3』病毒序列，非結構蛋白-介導的擴增需要的5』和3』序列，5』或3』保守序列元件(CSE)，5』或3』非編碼區，5』或3』非編碼區序列，複製需要的順式5』或3』病毒序列，啟動α病毒轉錄的5』或3』序列和/或α病毒5』和3』序列，5』和3』名稱指的是它們在α病毒基因組中位置。在本發明的核酸分子中，這些5』和3』端的使用將導致這兩端之間編碼的RNA序列的複製和/或轉錄。可以通過標準分子生物技術來修飾這些序列(例如，在任一端截短和/或修飾來除去啟動(即，起始)密碼子或增強可翻譯性)，用以進一步最小化重組的可能和/或用於引入克隆位點等，附加條件是它們必須仍然能通過α病毒複製機制來識別。如在此所用的，術語「啟動密碼子」或「起始密碼子」指的是RNA中的AUG和DNA中的ATG，其可以或不可以用於功能蛋白的翻譯中。術語「一個/幾個α病毒結構蛋白」指的是由α病毒編碼的一種結構蛋白或組合。這些通過野生型病毒作為多聚蛋白來產生並且通常在文獻中描述為C-E3-E2-6k-El。E3和6k作為兩種糖蛋白E2和El的跨膜/轉運信號。因此，在此術語El的使用可以指El、E3-El、6k-El或E3_6k_El，而在此術語E2的使用可以指E2、E3_E2、6k_E2、PE2、p62或E3-6k-E2。術語「糖蛋白輔助子」或「GP輔助子」在此通常指編碼E2和El糖蛋白的輔助分子；在本發明的特定實施方案中，在分開的輔助分子上編碼El和E2。術語「輔助子」和「輔助分子」可以互換使用並且指的是表達編碼一個或更多個α病毒結構蛋白的核酸的核酸分子。術語「輔助細胞」和「包裝細胞」在此可以互換使用並且指的是在其中產生α病毒複製子顆粒的細胞。輔助細胞包含一組如在此所述的編碼一個或更多個α病毒結構蛋白的輔助分子和/或輔助構建體。輔助子可以是RNA或DNA或兩者。輔助細胞或包裝細胞可以是α病毒-允許的任何細胞，即，在引入複製子RNA時可以產生α病毒顆粒。α病毒-允許的細胞包括，但不限於，Vero、幼倉鼠腎(BHK)、293、293T/17(ATCC登錄號CRL-11268)、雞胚成纖維細胞(CEF)、UMNSAH/DF-1(ATCC登錄號CRL-12203)和中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。如在此所用的「啟動子」是指導RNA分子轉錄的核酸序列。如在此所用的「分離的細胞」是已經從細胞自然產生的環境中取出的細胞或細胞群和/或從細胞在其自然環境中的狀態改變或修飾的細胞或細胞群。本發明的分離細胞可以是例如在細胞培養物中的細胞。本發明的分離細胞還可以是在動物體內的細胞和/或引入動物中的細胞，並且其中細胞已經例如通過將本發明的α病毒顆粒引入細胞中而得到了改變或修飾。如在此所用的，「α病毒亞基因組啟動子」或「26S啟動子」是最初在野生型α病毒基因組中限定的啟動子，其指導亞基因組信使RNA的轉錄，作為α病毒複製過程的一部分。在本發明的一些實施方案中所用的異源核酸(例如，目標基因或「G0I」或目標核酸或「Ν0Ι」)是不存在於野生型α病毒基因組中的核酸和/或是不以與其存在於本發明重組核酸中的相同次序存在於野生型α病毒基因組中的核酸。例如，在特定的實施方案中，將NOI用作感染性、缺陷型α病毒顆粒(例如，α病毒複製子顆粒)裝配中的輔助核酸或作為用於對抗由特定α病毒引起的疾病的疫苗的免疫原時，NOI編碼一個或更多個α病毒結構蛋白(例如，C、PE2/E2、E1、E3、6K)。本發明是基於令人驚訝和出乎意料的發現含有編碼α病毒結構蛋白的核苷酸序列以及α病毒5』和3』序列但缺乏啟動子序列(例如，亞基因組α病毒啟動子序列，有時稱為26S或病毒連接區啟動子)的RNA分子可以複製，其中已經從5』複製識別序列中去除啟動密碼子，使得全長正鏈RNA可以得到有效地翻譯並產生足量的反式α病毒結構蛋白，用於在培養的細胞系中生產α病毒複製子顆粒。這些「無啟動子」RNA分子，在此有時稱為「Δ26S輔助子」，通過降低輔助分子和複製子載體之間發生的功能性重組事件產生的預測理論頻率提高了α病毒複製子顆粒群(例如，為用作疫苗或佐劑生產的)的理論安全限度。任何切割輔助系統需要最少兩個獨立的重組事件來產生可複製α病毒(RCV)。對於α病毒，認為重組主要是通過RNA複製複合物的隨機鏈轉換的結果(Weiss等，1991)，儘管已經報導了同源重組。對於第一個重組事件，例如，複製複合物將在文獻中公開的切割輔助子/複製包裝系統中的RNA輔助分子的3』端開始(例如，Johnson等，U.S.專利No.5，792，462)。如果複合物通過26S或病毒連接區持續該輔助RNA的複製，然後作為模板在複製子RNA中轉換成外源核苷酸序列，並通過複製子5』端完成複製，所得到的「重組複製子中間產物」將含有編碼所有非結構蛋白的序列，一些或所有含有外源目標核酸(NOI)編碼區的轉錄單位和表達一種α病毒結構蛋白的新插入的轉錄單位。為了形成RCV，必須通過鏈轉換事件轉換成重組複製子中間產物(如上所述)的3』複製識別序列來產生隨後的第二個重組事件，因為這是導致用於全部沒有插入突變的非結構和結構蛋白編碼序列的功能性轉錄單位停留的唯一位置。因為輔助RNA分子含有26S啟動子，理論上，兩個這樣的重組事件可以形成RCV。精確的重組點不是關鍵的，因為每個重組插入片段將是獨立的轉錄單位。使用本發明的無啟動子輔助分子產生RCV也還需要最少兩個獨立的重組事件，但用於獲得功能性重組的約束條件要比文獻中已知的RNA輔助分子的高得多，並因此產生RCV的理論頻率低得多。這是因為，在26S啟動子不存在的情況下，大部分重組事件沒有導致能表達α病毒結構蛋白的功能性轉錄單位的形成。因此，使用無啟動子輔助分子產生RCV需要產生結構多聚蛋白開放閱讀框(即，實質上與產生這些輔助子的野生型病毒中發現的結構相似)，並且這依此需要兩個所需的重組事件以特定的次序並在非常特定的核苷酸位置發生。最初的重組事件必須涉及衣殼輔助編碼序列，因為其必須相對於糖蛋白位於正確的位置(即，5』)，以切割其自身並產生功能性衣殼蛋白。衣殼輔助子必須通過核苷酸-或近-核苷酸_正確重組事件與複製子載體重組，以實現其中衣殼蛋白從複製子26S啟動子表達的重組。即，只有以下情況的重組是功能性的1)直接在複製子26S啟動子的下遊，2)與異源GOI的任何剩餘部分符合閱讀框，和3)i導致GOI/α病毒衣殼融合蛋白的產生(因此產生失活的α病毒衣殼)。第二種重組事件，涉及α病毒糖蛋白輔助子，除了限於在3』複製識別序列中發生，處於和第一種情況相同的約束條件下。因此，本發明使用無啟動子輔助分子生產顆粒的方法在理論上將以比文獻中已知輔助分子低得多的頻率產生RCV，該頻率足夠低，以致用本發明的方法沒有檢測到這樣的RCV。本發明的這種令人驚訝的性質在於以下的事實之前用於產生裝配α病毒顆粒的輔助子/複製子系統的努力依賴於使用強啟動子，最常見的是α病毒26S亞基因組啟動子，以提供足夠的RNA分子，從其翻譯用於裝配的結構蛋白。與現有文獻截然相反，發明人發現了他們可以利用直接翻譯成全長分子的RNA輔助分子，而沒有文獻中已知的在野生型α病毒繁殖和輔助RNA系統中從26S啟動子轉錄較小的信使RNA和通常伴隨該過程的信使擴增。然後通過由細胞核糖體機制識別全長RNA5』端的帽來完成本發明的輔助RNA的直接翻譯。在真核細胞內，從mRNA啟動翻譯涉及一系列密切相關的事件，這些事件使核糖體亞基募集至mRNA。在帽依賴性翻譯的情況中，存在於mRNA5』端的甲基_7_G(5』)pppN結構，稱為「帽」，由細胞啟動因子eIF4F來識別，eIF4F由eIF4E、eIF4G和eIF4A組成。(綜述參見Hershey&Merick.基因表達的番羽譯控制(TranslationalControlofGeneExpression),pp.33-88,ColdSpringHarbor,NY:CoIdSpringHarborLaboratoryPress,2000)。α病毒是正鏈RNA病毒；當病毒RNA進入細胞時，從該RNA產生非結構α病毒蛋白(nsPl、nsP2、nsP3和nsP4)的翻譯，並且這些蛋白各自產生全長負鏈RNA模板。然後將負鏈RNA複製，以產生全長(「基因組」)正鏈RNA和在26S啟動子啟動的較小(「亞基因組」)正鏈。產生正鏈時，α病毒的非結構蛋白還給RNA加帽，使其在細胞質是可用的，用於通過核糖體來翻譯。「帽」指的是添加至RNA5』端的甲基化殘基。在本發明的特定實施方案中，在體外產生的輔助RNA分子(其是正鏈RNA)沒有加帽。將正鏈輔助RNA引入還含有複製子RNA的真核細胞中時，最初主要發生了負鏈合成。在α病毒複製子RNA的存在下，從其合成非結構蛋白，將負鏈模板(輔助子和複製子兩者)複製成然後加帽的正鏈RNA。在本發明的其他實施方案中，使用本領域公知的和可購得的試劑，例如，來自Promege(Madison，WI)和Ambion(Austin，TX)，將輔助RNA在體外加帽。帽包括，例如，G帽、C帽、A帽、甲基化G(m7G(5，ppp(5『)pppG(5)A))；未甲基化的G(G(5』ppp(5，)A))；ARCA(反義帽類似物，3-0-Me-m7G(5，)pppG(5))；三甲基化(m2』2』7G(5，ppp(5，)pppG))，2_way巾冒(m7G(5，ppp(5，)m7G))。在一些實施方案中，為了ARP的最大產量，用於生產ARP的本發明的所有輔助子是加帽或未加帽的。使用加帽的輔助RNA記錄了最高產量，但在特定的實施方案中，未加帽的輔助RNA可以產生足夠高的產量，使得可以避免加帽的成本。還可以的是僅將一個輔助RNA加帽，儘管這有時候也限制了ARP產量。概括而言，發明人已經顯示了可以通過著眼於幾個變量的常規試驗來優化ARP產量，如改變加帽的使用，轉錄混合物中帽類似物與NTP的比例和用於產生ARP的RNA比例。因此，在特定的實施方案中，本發明提供了分離的RNA分子，其包括下列、基本上由下列組成和/或由下列組成a)α病毒5』複製識別序列，其中已經除去至少一個啟動密碼子；b)編碼α病毒結構蛋白的核苷酸序列；和c)α病毒3』複製識別序列，條件是RNA分子不含有指導(b)的核苷酸序列轉錄的啟動子，並且其中α病毒5』和3』複製識別序列在α病毒非結構蛋白的存在下指導完整RNA分子的複製。各種核酸序列可以滿足本發明的核酸構建體中的5』和3』端功能。例如，序列可以包括α病毒5』複製識別序列和其他相鄰序列，如以上例舉的，用於VEEa病毒。此外，可以在天然5』α病毒中進行刪除，以除去特定的二級結構元件，例如，莖-環結構。在特定的實施方案中，可以從本發明的輔助構建體中除去這些莖-環結構中的一個或更多個。或者，可以將非α病毒或其他序列用作該元件，同時保持相似的功能性能力，例如，在辛德畢斯病毒的情況中，用於tRNA天冬醯胺的核苷酸10-75(Schlesinger等，US專利No.5，091，309)。在一些實施方案中，3』α病毒複製識別序列的長度大約為300個核苷酸，其基本上含有天然α病毒3』複製識別序列。在α病毒中保守的最小3』複製識別序列是19個核苷酸的序列(Hill等，JournalofVirology，2693-2704(1997))。此外，對於辛德畢斯病毒，已經顯示出就在3』複製識別序列之後的poly(A)尾必須至少是11-12個殘基長，並且3』複製識別序列的3』13nt對於有效的負鏈RNA合成是關鍵的(Hardy和Rice，JournalofVirology,79=4630-4639(2005))0因此，用於3』端的序列可以包括完整的α病毒3』複製識別序列，或3』複製識別序列截短的片段，其仍然保持作為識別序列的功能，或長度是25至325個核苷酸的3』端並就在3』複製識別序列之後含有poly(A)尾，最小長度為ll_12nt。可以用於該內容中的其他序列實例包括，但不限於，維持相似的允許負鏈RNA合成啟動的功能性能力的非α病毒或其他序列(例如，George等，J.Virol.74:9776_9785(2000)中所述的序列)。本發明RNA分子中所用的5』和3』複製識別序列可以源自相同的或不同的任意組合的α病毒，並且它們可以與源自相同或不同α病毒的複製子載體以任意組合來使用。在本發明的特定實施方案中，選擇輔助RNA分子的5』和3』序列來最大化輔助子在生產VRP中的性能和最小化產生RCV的理論潛力。特定的實施方案可以包括5』和3』序列的修飾以及從α病毒刪除原始5』或3』序列的一部分，在此描述了其實例。存在本發明中所述5』和3』序列的多種組合，並且不同的組合可以用於各個輔助分子。測試在此教導的各種修飾和刪除的組合來測定它們在VRP生產中的性能是在本領域技術人員的能力範圍內的。本發明的RNA輔助分子依賴於核糖體從5』帽結構掃描通過5』複製識別序列，以在它們的天然蛋氨酸起始密碼子處啟動α病毒結構蛋白的翻譯。這些區域中其他啟動密碼子的存在通過允許翻譯以在用於結構蛋白的天然起始密碼子之外的位點啟動而降低了這些輔助子的有效性，因此隨著核糖體沿著mRNA移動至α病毒結構蛋白編碼區中產生了融合蛋白，或在核糖體隨後到達5』複製識別序列中的終止密碼子時產生了短的非功能性肽。因此，由於該區域中各種起始和終止密碼子的存在，在這些輔助子中完整5』α病毒非編碼區(即，從野生型α病毒的5』端直至26S亞基因組啟動子的第一個密碼子的完整序列)的使用不是關鍵的。因此，在特定的實施方案中，本發明的RNA分子可以從5』複製識別序列除去一個或更多個啟動密碼子。一個或更多個的意思是根據本領域的標準方法除去或滅活的兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、11、12或更多個啟動密碼子(即，起始密碼子)。因此，本發明提供了本發明的RNA分子，其中已經從5』複製識別序列除去了一個或更多個啟動密碼子，例如，通過從AUG突變成GUG。在特定的實施方案中，提供了RNA分子，其中已經從5』複製識別序列除去了所有的啟動密碼子，例如，通過從AUG突變成GUG。例如，在圖1所示的以下位置可以除去任何任意組合的一個或更多個啟動密碼子，例如，突變的:12、45、148、154、160、258、294、299、331、390、411、441和499。除去啟動密碼子的意思是將核苷酸序列進行修飾(例如，根據在此所述的和本領域已知的方法)以刪除或改變啟動密碼子，由此除去或改變該位點的啟動或活性(例如，翻譯活性)。在一些實施方案中，可以除去大部分的啟動密碼子，但可能在特定輔助構建體的5』區中只有少數這樣的密碼子在該情況下通常是由核糖體識別的。因此，對於特定的5』序列，在可能的10-12個密碼子中除去2-3個這樣的密碼子，可能導致表達水平與其中所有10-12個密碼子都除去的構建體沒有明顯差異。在本發明的範圍內，存在各種特定的5』序列，源自野生型α病毒序列，用於本發明的輔助分子中時，將導致包裝或輔助細胞內的充分表達，以提供可接受的α病毒複製子顆粒產量。本發明的RNA分子可以包含編碼下列的核苷酸序列1)α病毒衣殼蛋白，2)以任意次序的α病毒El和Ε2蛋白，3)以任意次序的α病毒衣殼蛋白和α病毒El蛋白，4)以任意次序的α病毒衣殼蛋白和α病毒Ε2蛋白，5)α病毒Ε2蛋白和/或6)α病毒E1蛋白。在其他實施方案中，本發明的單個RNA分子可以編碼三個α病毒結構蛋白，即，衣殼蛋白、α病毒El蛋白和α病毒Ε2蛋白，以任意次序。在一些實施方案中，本發明的RNA分子可以特意排除編碼α病毒結構蛋白的核苷酸序列(例如，可以特意排除編碼衣殼、α病毒El蛋白、α病毒Ε2蛋白或衣殼、El蛋白和Ε2蛋白任意組合的核苷酸序列的分子)。在本發明的各種實施方案中，RNA分子可以含有來自委內瑞拉馬腦炎(VEE)病毒5』端的序列，其包括5』複製識別序列。如Pushko等(1997)中所述的，VEE啟動子輔助的輔助子的5』複製識別序列通常由VEE序列的575個核苷酸(nt)組成。頭519個是連續的並表示未翻譯區(UTR)的44個nt和nsPl的頭475個nt(44+475=519)。剩餘的56個nt編碼nsP4基因的最後21個nt(包括TAA終止密碼子)，最小26S啟動子的7個nt(該序列部分與nsP4基因重疊)和VEE結構蛋白基因啟動密碼子的28個nt前導序列上遊(21+7+28=56)。因此，由Pushko等(1997)描述的用於啟動子輔助的輔助子的完整5』複製識別序列由VEE序列的575個nt組成。本發明的無啟動子輔助子編碼上述啟動子輔助的輔助子中發現的頭514個核苷酸(nt)的全部或一部分。除了上述的514個nt，就在結構蛋白編碼序列起始位點(DNA中的ATG;RNA中的AUG)的上遊還存在編碼RsrII限制酶位點的序列(7個nt)。包含這些nt將用於全長衣殼輔助子的5』複製識別序列(dHcap(FL))增加至521個nt(不包括啟動密碼子的A殘基)。在無啟動子衣殼輔助子的一些實例和無啟動子糖蛋白輔助子的所有實例中，增加了其他修飾，以就在結構蛋白編碼序列啟動密碼子的上遊但在RsrII序列的下遊包括近-共有Kozak序列(3個nt(ACC))。由於Kozak修飾，全長糖蛋白輔助子(dHgp(FL))具有524個nt的5』複製識別序列。為了以下描述的目的，將用於無啟動子衣殼和糖蛋白輔助子的這些核苷酸序列限定為「全長」(「FL」)5』VEE序列，該序列中的刪除形成包括5』複製識別序列的其他實施方案。這些實施方案最小包括VEE核苷酸序列的核苷酸1至141(不包括啟動密碼子的A殘基)。在5』序列的頭200個核苷酸內，預測了RNA中有四個莖-環(SL)結構。可用於本發明的輔助構建體中的5』序列的實施方案可以包括該區域中的1個、2個、3個或全部SL序列。除去SL2區但保留SL1、SL3和SL4結構的實施方案可用於本發明的輔助構建體中。SL結構1和2包含在頭145個核苷酸中；SL3和4存在於核苷酸145至200之間。因此，在一些實施方案中，5』複製識別序列包括在長度是524個核苷酸的構建體5』非編碼區中(例如，圖2中的dHgp(FL))，而在其他實施方案中，5』複製識別序列可以包括在5』非編碼區中，任何地方長度從70(例如，含有SLl、SL3和SL4)至524個核苷酸。例如，5，複製識別序列的長度可以是141、144(dH#8)200,203(dH#7)、248、249(dH#6)、309、312(dH#5)、351、354(dH#4)、412、415(dH#3)450、452(dH#2)、499或502(dH#l)個核苷酸，包括在此沒有特意指出的70至524之間的任何數字(例如，237、379、444等)。應當注意到精確的核苷酸數和長度在不同的α病毒之間和給定的α病毒的不同株之間稍有不同。基於在此所述的任何α病毒中的相應結構和/或功能和/或二級結構，鑑定在此所述的核苷酸的相應位置，並形成本發明的RNA輔助分子以及從任何α病毒的初級核苷酸序列進行上述修飾，是在本領域技術人員的能力範圍之內的。本發明的RNA輔助分子還包括來自α病毒3』端的序列，在特定的實施方案中，其可以是，但不限於委內瑞拉馬腦炎病毒，其包括α病毒3』複製識別序列。就α病毒中的長度和序列而言，所有α病毒的3』端19個核苷酸是高度保守的，而El糖蛋白的最後一個密碼子和高度保守的19個核苷酸之間的3』序列是不太保守的。3』非編碼區的長度(包括保守的19個核苷酸，在此為SEQIDNO:52)可以為25至325個核苷酸。在本發明的特定實施方案中，3』序列在VEE3』端的73至117個核苷酸之間。在特定的實施方案中，本發明的α病毒3』複製識別序列可以包括以下核苷酸序列，或基本上由以下核苷酸序列組成和/或由以下核苷酸序列組成SEQIDNO55(對於dHcap(FL)至dHcap7；dHcap(FL)mm至dHcap7mm，dHcap(FL)mutl至dHcap7-mutl)，SEQIDNO56(對於Hgp(FL)至dHgp7，dHgp(FL)mm至dHgp7-mm,dHgp(FL)mutl至dHgp7_mutl)，SEQIDNO57(對於dHcap6mutl(w/stop)),SEQIDNO58(對於dHcap7mutl(w/stop)+19nt禾口dHgp7mutl_S+19nt)禾口SEQIDNO59(dHcap6mutl(ff-stop))。在特定的實施方案中，本發明的α病毒5』複製識別序列可以包括以下核苷酸序列，或基本上由以下核苷酸序列組成和/或由以下核苷酸序列組成SEQIDNO1(dHcap(FL))、SEQIDNO2(dHcap1)、SEQIDNO:3(dHcap2)、SEQIDNO:4(dHcap3)、SEQIDNO:5(dHcap4)、SEQIDNO:6(dHcap5)、SEQIDNO:7(dHcap6)、SEQIDNO:8(dHcap7)、EQIDNO:9(dHcap8)、SEQIDNO:10(dHgp(FL)、SEQIDNO:11(dHgp1)、SEQIDNO:12(dHgp2)、SEQIDNO:13(dHgp3)、SEQIDNO:14(dHgp4)、SEQIDNO:15(dHgp5)、SEQIDNO:16(dHgp6)、SEQIDNO:17(dHgp7)、SEQIDNO:18(dHgp8)、SEQIDNO:19(dHcap(FL)-mm)、SEQIDNO:20(dHcap1-mm)、SEQIDNO:21(dHcap2_mm)、SEQIDNO:22(dHcap3_mm)、SEQIDNO:23(dHcap4-mm)、SEQIDNO:24(dHcap5_mm)、SEQIDNO:25(dHcap6-mm)、SEQIDNO:26(dHcap7-mm)、SEQIDNO:27(dHgp(FL)-mm)、SEQIDNO:28(dHgpl_mm)、SEQIDNO:29(dHgp2-mm)、SEQIDNO30(dHgp3-mm)、SEQIDNO31(dHgp4_mm)、SEQIDNO:32(dHgp5-mm)、SEQIDNO33(dHgp6-mm)、SEQIDNO34(dHgp7-mm)、SEQIDNO35(dHcap(FL)mutl)、SEQIDNO36(dHcap1mutl)、SEQIDNO:37(dHcap2mutl)、SEQIDNO:38(dHcap3mutl)、SEQIDNO:39(dHcap4mutl)、SEQIDNO:40(dHcap5mutl)、SEQIDNO41(dHcap6mutl)、SEQIDNO42(dHcap7mutl)、SEQIDNO43(dHgp(FL)mutl)、SEQIDNO:44(dHgpImut1)、SEQIDNO45(dHgp2mutl)、SEQIDNO:46(dHgp3mutl)、SEQIDNO:47(dHgp4mutl)、SEQIDNO48(dHgp5mutl)、SEQIDNO:49(dHgp6mutl)、SEQIDNO50(dHgp7mutl)、SEQIDNO:51(dHcap6-mutl_dSL2)、SEQIDNO:52(dHgp6-mutl-dSL2(-S))；SEQIDNO:53(dHcapU)和SEQIDNO:54(dHgpU)。括號中給出了為其已經合成這些5』序列實例的特定輔助子。由於使用其他的核苷酸來提供近-最佳Kozak共有序列以增強結構蛋白編碼序列在一些輔助構建體中的翻譯，序列長度可以略有不同。(用於結構蛋白編碼序列的編碼區的ATG(RNA中的AUG)不包括在這些5』序列中)。包含上述核苷酸序列的本發明的RNA分子可以用於本發明的方法中，以任意組合、任意次序和/或任意數量用於α病毒複製顆粒的生產。本發明另外提供了含有本發明RNA分子的載體和/或核酸構建體。此外還提供了含有本發明的一個或更多個RNA分子和一個或更多個α病毒複製子載體的細胞。一個或更多個的意思是一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個等。本發明的細胞是其中可以表達編碼α病毒蛋白的核酸構建體的任何細胞。本發明的細胞實例包括，但不限於，Vero、幼倉鼠腎(BHK)、293、293T/17(ATCC登錄號CRL-11268)、雞胚成纖維細胞(CEF)、UMNSAH/DF-1(ATCC登錄號CRL-12203)、PERC6和中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在此還提供了製備α病毒複製子顆粒的方法，其包括將本發明的一個或更多個RNA分子引入細胞中，由此RNA分子的組合連同α病毒複製子RNA在由此產生α病毒複製子顆粒的條件下編碼生產α病毒複製子顆粒需要的所有α病毒結構蛋白。在本發明的一些實施方案中，α病毒顆粒模擬天然α病毒的結構構成，其中用衣殼蛋白覆蓋複製子RNA，然後用含有α病毒糖蛋白的細胞膜包被。在這樣的實施方案中，α病毒結構蛋白全部來自相同的α病毒。在可替換的實施方案中，α病毒蛋白可以來自不同的α病毒，只要這些不同的蛋白在顆粒裝配過程中彼此「識別」或它們是修飾的(如文獻中所述的)，使得它們能夠彼此識別。在本發明方法的一些實施方案中，將本發明的兩個RNA分子引入本發明的細胞中，其中兩個RNA分子以由此在包裝細胞中產生生產α病毒複製子顆粒所需的全部結構蛋白的組合編碼不同的α病毒結構蛋白。因此，本發明提供了一種方法，其中將兩個RNA分子引入細胞中並且其中兩個RNA中的第一個RNA分子編碼一個或更多個α病毒結構蛋白但不是全部結構蛋白，而兩個RNA分子中的第二個RNA分子編碼不是由第一個RNA分子編碼的一個或更多個α病毒結構蛋白。還提供了一種方法，其中將本發明的三個RNA分子引入細胞中，其中三個RNA分子以由此在細胞中產生生產α病毒複製子顆粒所需的全部結構蛋白的組合各自編碼不同的α病毒結構蛋白。因此，提供了一種方法，其中將本發明的三個RNA分子引入細胞中，其中三個RNA分子中的第一個RNA分子編碼一個或更多個α病毒結構蛋白但不是全部結構蛋白，而三個RNA分子中的第二個RNA分子編碼一個或更多個不同於由第一個RNA分子編碼的α病毒結構蛋白的α病毒結構蛋白，並且三個RNA分子中的第三個RNA分子編碼一個或更多個不同於由第一個RNA分子和第二個RNA分子編碼的α病毒結構蛋白的α病毒結構蛋白。例如，在一個實施方案中，第一個RNA分子可以編碼α病毒衣殼蛋白，第二個RNA分子可以編碼α病毒糖蛋白El和第三個RNA分子可以編碼α病毒糖蛋白Ε2。在一些實施方案中，通過由α病毒結構蛋白包裝的複製子RNA編碼α病毒結構蛋白中的一個或更多個，但不是全部。例如，在此要求的α病毒複製子顆粒製備方法中所用的重組RNA可以包括作為目標核酸和/或除了目標核酸以外的編碼一個α病毒結構蛋白或超過一個α病毒結構蛋白的核苷酸序列。因此，在特定的實施方案中，複製子RNA編碼一個α病毒結構蛋白或超過一個α病毒結構蛋白。可以將該複製子RNA和本發明的一個或更多個RNA輔助分子一起引入細胞群中，使得複製子RNA和RNA輔助分子產生全部的α病毒結構蛋白，並且在所述細胞中將RNA複製子包裝至顆粒中。在更多的實施方案中，提供了製備α病毒複製子顆粒的方法，其包括將下列引入細胞中a)α病毒複製子RNA；b)本發明的一個或更多個RNA分子；和c)一個或更多個啟動子輔助的α病毒輔助構建體，由此(b)的RNA分子和(c)的輔助構建體的組合在由此產生α病毒複製子顆粒的條件下編碼生產α病毒複製子顆粒需要的全部α病毒結構蛋白。因此，在本發明的其他實施方案中，「啟動子輔助的輔助構建體」，即，在啟動子例如26S啟動子的指導下表達一個或更多個α病毒結構蛋白的重組DNA或RNA分子，結合本發明的輔助分子來使用。在一組RNA分子的實施方案中，「啟動子輔助的輔助構建體」包括第一個核酸序列，其編碼(i)5』α病毒複製識別序列，(ii)轉錄啟動子，(iii)編碼一個或更多個α病毒結構蛋白的核酸序列和(iv)3』α病毒複製識別序列。在另一組RNA分子的實施方案中，「啟動子輔助的輔助構建體」是重組輔助核酸，如W02004/085660中所述的(2004年10月7日公開，在此引入作為參考)，其包括編碼5，α病毒複製識別序列的核酸序列，就在IRES元件上遊的α病毒亞基因組啟動子，至少一個編碼α病毒結構蛋白的核酸和編碼3』α病毒複製識別序列的核酸。在更多的實施方案中，這些啟動子輔助的輔助構建體可以包含位於就在亞基因組啟動子的下遊和就在IRES元件上遊的間隔核酸。間隔核酸可以包含任何隨機或特定的非編碼核酸序列或由任何隨機或特定的非編碼核酸序列組成，該序列足夠長以防止至少一些從信使RNA的5』帽的翻譯，並且在一些實施方案中，防止全部翻譯，使得結構蛋白的翻譯然後直接受IRES的指導，部分或全部。或者，間隔核酸可以是給予核酸足夠的二級結構以防止至少一些和可能全部的從信使RNA的5』帽的翻譯活性的長度和序列結構。本發明中所用的啟動子輔助的輔助構建體還可以是DNA分子，其可以穩定地整合至輔助細胞的基因組中，或從沒有明顯整合的游離基因(例如，質粒)瞬時表達。本發明的DNA分子可以是任何DNA載體，包括但不限於，非整合DNA載體，如質粒，或病毒載體。在本發明使用如在此所述的「輔助細胞」或「包裝細胞」並包括本發明的無啟動子RNA分子的實施方案中，輔助細胞可以進一步包括任意組合的啟動子輔助的輔助構建體(RNA和/或DNA)，使得輔助細胞包括足以產生本發明α病毒複製子顆粒的編碼α病毒結構蛋白的核苷酸序列的組合。在特定的實施方案中，El和Ε2糖蛋白由第一個輔助構建體編碼，而衣殼蛋白由第二個輔助構建體編碼。在另一個實施方案中，El糖蛋白、Ε2糖蛋白和衣殼蛋白各自由分開的輔助構建體編碼(例如，第一個、第二個和第三個)。在其他實施方案中，衣殼蛋白和糖蛋白El或Ε2由第一個輔助構建體編碼，而剩餘的未包括在第一個輔助構建體中的糖蛋白El或Ε2由第二個具有或不具有衣殼編碼序列的輔助構建體編碼。在其他實施方案中，α病毒糖蛋白El和Ε2以及衣殼蛋白可以全部在一個輔助構建體上編碼，以任何次序和/或任何數量。在本發明包括的實施方案中，還可能的是通過超過一個的輔助構建體來表達給定的α病毒結構蛋白。可以將本發明的無啟動子RNA輔助子，任選結合在此所述的其他已知輔助子，以任意組合、任何次序和/或任何數量引入α病毒允許細胞中。在本發明的一些實施方案中(例如，用於編碼無啟動子RNA分子的DNA構建體或啟動子輔助的RNA輔助構建體)，使用指導從DNA轉錄RNA的啟動子，即，DNA依賴性RNA聚合酶，在體外轉錄反應中合成RNA，並且適於該用途的特定啟動子包括，但不限於，SP6、Τ7和T3RNA聚合酶啟動子。在本發明的所有實施方案中，考慮了至少一個α病毒結構和/或非結構蛋白由無啟動子輔助分子和/或啟動子輔助的輔助構建體和/或複製子載體來編碼，以及複製子核酸的非翻譯區可以含有一個或更多個減毒突變，如在此所述的，以任意組合。本發明進一步提供了α病毒複製子顆粒群，其中該群在每IO8個α病毒複製顆粒中含有少於一個可複製α病毒顆粒。在進一步的實施方案中，該群在每ΙΛΙΟΟ11、IO12或IO13個α病毒複製子顆粒中含有少於一個可複製α病毒顆粒。本發明另外提供了α病毒複製子顆粒群，其中該群不含有可檢測的可複製病毒顆粒，如通過根據本領域公知的方法在培養物中的允許細胞上的傳代所測定。在此還提供了一組α病毒複製顆粒，其中該群在每108、109、IOiqUOiiUO12或IO13個α病毒複製子顆粒中不含有可檢測的或含有少於一個的可複製α病毒顆粒，如通過在培養物中的允許細胞上的傳代所測定，其中α病毒複製子顆粒在α病毒結構蛋白或α病毒非結構蛋白或α病毒結構蛋白和α病毒非結構蛋白兩者中含有一個或更多個減毒突變。此外，提供了α病毒複製子顆粒群，其中該群不含有可檢測的可複製病毒顆粒，如通過在培養物中的允許細胞上的傳代所測定，其中α病毒複製子顆粒在α病毒結構蛋白或α病毒非結構蛋白或α病毒結構蛋白和α病毒非結構蛋白兩者中含有一個或更多個減毒突變。發明人已經證實了儘管缺少可識別的「包裝信號」，本發明的輔助RNA以及文獻中描述的輔助RNA在培養的細胞中通過α病毒結構蛋白得到包裝，有時候以明顯高於文獻中報導的頻率。因此，通過該群中顆粒子集的存在，將本發明的α病毒複製子顆粒群與文獻中描述的那些顆粒區分開來，該群中包裝了本發明的新輔助分子。術語「α病毒複製子顆粒」、「ARP」、「病毒複製子顆粒」或「重組α病毒顆粒」在此可互換使用，意思是引入了表達一個或更多個異源RNA序列的α病毒複製子RNA的病毒粒子樣結構複合物。通常，病毒粒子樣結構複合物包括一個或更多個包埋在脂質包膜中的α病毒結構蛋白，脂質包膜包裹核殼，其依次包裹RNA。脂質包膜通常源自產生顆粒的細胞的質膜。在特定的實施方案中，α病毒複製子顆粒由核殼結構圍繞，核殼結構由α病毒衣殼蛋白組成，並且α病毒糖蛋白包埋在細胞衍生的脂質包膜中。結構蛋白和複製子RNA可以源自相同或不同的α病毒。在特定的實施方案中，複製子RNA源自VEE，而結構蛋白源自辛德畢斯病毒(參見，例如，Dubensky等，U.S.專利No.6，376，236)。α病毒複製子顆粒是傳染性的，但是傳播缺陷的，即，在編碼α病毒結構蛋白的輔助核酸不存在的情況下，複製子RNA不能在顆粒最初感染的細胞外傳代。術語「α病毒RNA複製子」、「α病毒複製子RNA」、「α病毒RNA載體複製子」和「載體複製子RNA」可互換使用，其指的是表達非結構蛋白基因的RNA分子，使得其可以指導其自身的複製(擴增)，並最少包括5』和3』α病毒複製識別序列(其可以是最小的序列，如上所述，但或者可以是來自α病毒的完整區域)，α病毒非結構蛋白的編碼序列和多腺苷酸化通道。其可以另外含有啟動子和/或IRES。還可以將其工程化來表達α病毒結構蛋白。Johnson等和Polo等描述了各種用於這樣的α病毒RNA複製子的構建體，並且在此將這樣的構建體引入作為參考。在α病毒複製子RNA的一個實施方案中，將α病毒非結構蛋白分成兩個分開的翻譯單位，如U.S.專利公開2003-0119182-Α1中所述的，在此引入作為參考。沒有異源序列的α病毒複製子RNA，S卩，空複製子，可以用於α病毒複製子顆粒中來生產佐劑組合物。或者，α病毒複製子RNA可以表達編碼α病毒結構蛋白的核酸和/或其他異源核酸序列，後一種情況可以選自各種源自病毒、原核生物和/或真核生物的序列。異源序列種類的實例包括，但不限於，免疫原(包括天然的、修飾的或合成的抗原蛋白、肽、免疫原性片段或抗原決定部位)、細胞因子、毒素、治療蛋白、酶、反義序列和免疫應答調節劑。如果合適並且是特定應用所需，然後將轉錄的mRNA翻譯，S卩，合成蛋白質或產生功能性RNA。這些mRNA在真核細胞內「加帽」，S卩，在mRNA的5』端存在甲基-7-鳥苷(5』)pppN結構(「帽」或「5』帽」)，並且該帽通過從mRNA合成蛋白的翻譯啟動因子來識別。因此，26S啟動子指導轉錄，而「帽」提供了用於翻譯的啟動信號。在一些實施方案中，複製子RNA可以缺乏編碼任何α病毒結構蛋白的核酸。在其他實施方案中，α病毒複製RNA可以包含編碼一個或兩個α病毒結構蛋白的核酸，但是複製子RNA不含有編碼全部α病毒結構蛋白的核酸。因此，本發明所得到的α病毒複製子顆粒是傳播缺陷的，因為複製子RNA沒有編碼包被複製子RNA和裝配傳染性病毒粒子所需的全部結構蛋白。所要求的本發明中所用的α病毒RNA複製子的特定實施方案可以含有一個或更多個減毒突變，如在此詳細描述的。減弱核苷酸置換的實例包括在此所述的在VEE5』端中的核苷酸3處的突變以及α病毒S.A.AR86中的nsPl胺基酸位置，nsP2胺基酸位置96或nsP2胺基酸位置372處的突變。本發明的α病毒複製子顆粒可以含有來自任何α病毒的複製子RNA。此外，本發明的α病毒複製子顆粒可以含有來自本發明任一種α病毒的α病毒結構蛋白。因此，複製子顆粒可以由來自相同的α病毒或來自不同α病毒的複製子RNA和結構蛋白構成，後一種情況將是嵌合α病毒複製子顆粒(例如，包含基於VEE病毒的複製子RNA和辛德畢斯病毒結構蛋白的顆粒)。在本發明的特定實施方案中，本發明的α病毒結構蛋白可以是辛德畢斯病毒結構蛋白、SFV結構蛋白、VEE結構蛋白、羅斯河病毒結構蛋白、EEE結構蛋白和/或TOE結構蛋白。這些可以彼此任意組合併可以結合非結構蛋白和其他α病毒序列而存在，其他序列如5』α病毒複製識別序列，α病毒亞基因組啟動子和3』α病毒複製識別序列，來自這些或其他α病毒中的任何一種，以生產本發明的嵌合重組α病毒複製子顆粒和/或嵌合重組核酸。在本發明的一些實施方案中，本發明可以包括含有一個或更多個減毒突變的α病毒核酸、α病毒蛋白、α病毒複製子RNA和/或α病毒複製子顆粒，減毒突變限定為一個或更多個核苷酸的核苷酸刪除、添加和/或置換，或包含重排或嵌合構建的突變，其導致與合適的野生型α病毒相比，含有突變的活病毒失去了毒力。合適的減毒突變將取決於所用的α病毒，並且是本領域技術人員已知的。示例性減毒突變包括，但不限於，公開於Johnson等的U.S.專利No.5，505，947，Johnson等的U.S.專利No.5，185，440，Davis等的U.S.專利No.5，643，576，Johnson等的U.S.專利No.5，792，462；6,156，558和5，639，650中所述的那些，在此將每一篇的公開內容全部引入作為參考。用於VEEEl糖蛋白的特定減毒突變可以包括在El胺基酸位置81、272或253任一處的減毒突變。從VEE-3042突變體製得的α病毒複製子顆粒在Ε1-81處含有異亮氨酸置換，而從VEE-3040突變體製得的病毒複製子顆粒在Ε1-253處含有減毒突變。用於VEEΕ2糖蛋白的特定減毒突變可以包括在Ε2胺基酸位置76、120或209任一處的減毒突變。從VEE-3014突變體製得的α病毒複製子顆粒在Ε1-272和Ε2-209處含有減毒突變(參見U.S.專利No.5，792，492)。用於VEEΕ3糖蛋白的特定減毒突變包括由Ε3胺基酸56-59的刪除構成的減毒突變。從VEE-3526突變體製得的病毒複製子顆粒在Ε3中含有該刪除(aa56-59)以及在E1-253處的第二個減毒突變。用於S.A.AR86E2糖蛋白的特定減毒突變包括在E2胺基酸位置304、314、372或376任一處的減毒突變。或者，減毒突變可以是E2糖蛋白中的胺基酸的置換、刪除或插入，例如，在以下胺基酸位置的任一處或更多處，任意組合158、159、160、161和162(參見Polo等，PCT公開No.W000/61772)。或者，本發明的RNA分子可以源自TC83，VEE的疫苗株(參見W02005/113782，在此將其引入作為參考)。本發明的另一種減毒突變可以是在VEE基因組RNA的核苷酸3處的減毒突變，即，5』甲基化帽之後的第三個核苷酸(參見，例如，U.S.專利No.5，643，576，描述了在nt3的G—C突變)。該突變，位於病毒或複製子的非編碼序列中，在一些實施方案中，可以是G—A或G—U突變。當α病毒結構和/或非結構蛋白來自S.A.AR86時，文獻中已經描述了結構和非結構蛋白中的示例性減毒突變(參見，例如，U.S.專利No.5，639，650和U.S.專利No.6，982，987，在此將其公開內容全部引入作為參考)。本發明的α病毒可以是辛德畢斯病毒株(例如，TR339)、VEE(例如，在甲基化帽或TC83後的基因組RNA的核苷酸3處具有突變)、S.A.AR86病毒、GirdwoodS.Α.病毒、Ockelbo病毒和/或其嵌合病毒。對於各種α病毒的完整基因組序列以及各種結構和非結構蛋白的序列在文獻中可獲得，並包括辛德畢斯病毒基因組序列(GenBank登錄號No.J02363、NCBI登錄號No.NC_001547)、S.A.AR86基因組序列(GenBank登錄號No.U38305)、VEE基因組序列(GenBank登錄號No.L04653、NCBI登錄號No.NC_001449)、VEE的TC-83疫苗株(KinneyRM等(1989)，Virology17019-30；結合關注RM等(1993)，J.Virol.67(3)1269-1277)；GirdwoodS.A基因組序列(GenBank登錄號No.U38304)，西門利克森林病毒基因組序列(GenBank登錄號No.X04129,NCBI登錄號No.NC_003215)和TR339基因組序列(Klimstra等，(1988)，J.Virol.727357；McKnight等，(1996)J.Virol.701981)。根據在此公開的方法並結合本領域技術人員已知的技術來製備α病毒複製子顆粒。這些方法包括首先將選定的輔助子和α病毒複製子RNA引入α病毒允許細胞群中，然後在本領域公知的允許產生α病毒複製子顆粒的條件下培養細胞。將輔助子和α病毒複製子RNA引入輔助細胞群的步驟可以通過任何方式來進行，如在此公開的和本領域普通技術人員已知的。根據例如U.S.專利No.7，078，218中所述的方法從輔助或包裝細胞中收集α病毒複製子顆粒製劑，在此將該專利內容全部引入作為參考。或者，可以使用本領域技術人員已知的其他技術(例如，U.S.專利No.5，492，462和6，156，558)從包裝細胞收集它們。根據在此所述的和文獻中已知的方法來評價這些製劑中可複製病毒(RCV)的存在。本發明的製劑不含有可檢測的RCV，如通過在培養物中的α病毒允許細胞上的傳代所測定的。在一些實施方案中，可以使用本發明在對象中包裝編碼免疫多肽的α病毒RNA複製子(例如，用於疫苗接種)，用於免疫治療(例如，治療患有癌症或腫瘤的對象)或免疫調節因子(例如，用於輔佐ARP或其他疫苗形態)。本發明提供了引發或增強對象中免疫應答的方法，包括將有效量的通過本發明的輔助構建體包裝至顆粒中的核酸給予對象。如在此所用的，「引發免疫應答」和「使對象免疫」包括在對象中產生對本發明的蛋白和/或多肽(例如，免疫原、抗原、免疫性肽和/或一個或更多個抗原決定部位)的體液免疫和/或細胞免疫應答。「體液」免疫應答，因為該術語是本領域公知的，指的是包括抗體的免疫應答，而「細胞」免疫應答，因為該術語是本領域公知的，指的是包括T-淋巴細胞和其他白血球的免疫應答，尤其是由HLA-限制的細胞毒性T細胞(即，「CTL」)引起的免疫原特異性應答。還考慮了本發明的核酸、顆粒、製劑和藥物組合物可以用於將目標NOI傳送至細胞的方法中，該細胞可以是對象中的細胞。因此，本發明提供了將異源核酸傳送至細胞的方法，其包括將有效量的用本發明的輔助構建體包裝的顆粒、製劑和/或組合物引入細胞中。還提供了將異源核酸引入對象中細胞中的方法，其包括將有效量的用本發明的輔助構建體包裝的顆粒、製劑和/或組合物引入細胞中。細胞可以是能夠吸收並表達外源核酸的任何細胞。在由此表達異源核酸來產生由異源核酸編碼的蛋白、肽或其他編碼序列產物(例如，功能性RNA序列)的條件下培養細胞。可以根據公知的用於免疫和/或基因治療的方案，將這樣的方法用來將治療作用給予本發明的細胞和/或對象。本發明的「對象」包括，但不限於，溫血動物，例如，人、非人靈長類動物、馬、奶牛、貓、狗、豬、大鼠和小數。本發明進一步提供了在藥物學上可接受的載體中含有本發明的顆粒和/或製劑的組合物(例如，藥物組合物)。「藥物學上可接受的」意思是在生物學上或其他不是不利的材料，即，可以與選定的顆粒和/或其製劑一起為對象給藥的材料，而沒有引起實質性的有害生物作用或以有害方式影響組合物中含有的任何其他成分。藥物學上可接受的載體適於給藥或傳送至人和本發明的其他對象。自然選擇載體以最小化活性成分的任何降解和最小化對象中的任何副作用，這是本領域技術人員公知的(參見，例如，Remington'sPharmaceuticalScience；最近的一版)。本發明的藥物製劑，如疫苗或其他免疫原性組合物，含有致免疫量的使用本發明的輔助構建體產生的感染性的、傳播缺陷的a病毒複製子顆粒，結合藥物學上可接受的載體。示例性藥物學上可接受的載體包括，但不限於，無菌無熱原水和無菌無熱原生理鹽水溶液。「致免疫量」是本發明製劑中足以在給予或傳送了顆粒製劑的對象中引起免疫應答的感染性a病毒顆粒的含量。認為約104至約109，尤其是106至108傳染單位或「IU」/劑是合適的，如通過在此所述的測試所測定的，該含量取決於待治療對象的年齡和物種。可以通過任何合適的方式來給藥，如腹膜內、肌內、鼻內、陰道內、靜脈內、皮內(例如，通過基因槍)、直腸內和/或皮下。可以通過皮膚多次劃破法和/或通過貼劑或液體經皮來給藥在此的組合物。可以以在一段時間內釋放組合物的生物可降解材料的形式在皮下來傳送組合物。如在此所用的，「有效量」指的是本發明的群體或組合物或製劑足以產生所需效果的含量，該效果可以是治療效果。有效量將隨著對象的年齡、一般狀況、待治療病症的嚴重程度、給藥的特定藥劑、治療的持續時間、任何同時進行的治療的性質、所用的藥物學上可接受的載體以及本領域技術人員知識和專長範圍內的類似因素而改變。按照需要，可以通過本領域技術人員參考有關書本和文獻和/或通過使用常規實驗來確定任何個體病例中的「有效量(參見，例如，Remington,TheScienceAndPracticeofPharmacy(第20版，2000))。或者，本發明的藥物製劑適於為對象給藥的黏膜(例如，通過鼻內給藥、口腔給藥和/或吸入)。可以將製劑方便地製成單位劑型並可以通過本領域公知的任一種方法來製備。此外，本發明的組合物可以用於感染或轉染至樹突細胞中，該細胞是根據本領域公知的方法從對象的細胞分離或生長得到的，或轉染至來自對象的分散的外周血單核細胞(PBMC)或其各種細胞亞級分上。如果使用exvivo方法，可以根據本領域公知的標準實驗方案，將細胞或組織取出並在體外維持，同時將本發明的組合物引入細胞或組織中。可以通過本領域已知的任何方式來配製含有一組本發明顆粒(將組合物給藥於人或動物時，其指導目標核酸序列的表達)的致免疫組合物。通常將這樣的組合物，尤其是疫苗，製成可注射的，如液體溶液或懸浮液。也可以製備在注射之前適於溶解於或懸浮於液體中的固體形式。凍幹製劑也是合適的。通常將活性致免疫成分(例如，a病毒複製子顆粒)與藥物學上可接受的和/或與活性成分相容的賦形劑和/或載體混合。合適的賦形劑包括但不限於無菌水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其組合，以及穩定劑，例如，HAS或其他合適的蛋白質和還原糖。此外，如果需要，疫苗可以含有少量輔助物質，如溼潤劑和/或乳化劑，pH緩衝劑和/或提高疫苗功效的佐劑。有效佐劑的實例包括但不限於QS-21、弗氏佐劑(完全的和不完全的)，鋁鹽(明礬)，磷酸鋁，氫氧化鋁；N-乙醯-胞壁醯-L-蘇氨醯-D-異穀氨醯胺(thr-MDP)；N-乙醯-nor-胞壁醯-L-丙氨醯-D-異穀氨醯胺(CGP11637，稱為nor_MDP)；N-乙醯胞壁醯-L-丙氨醯-D-異穀氨醯-L-丙氨酸-2-(1，-2，-二棕櫚醯-sn-丙三氧基-3-羥基磷醯基氧)-乙胺(CGP19835A，稱為MTP-PE)；和RIBI，其在2%角鯊烯/吐溫80乳液中含有從細菌提取的三種成分，單磷醯基脂A，海藻糖二梅菌酸酯和細胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。佐劑的其他實例包括，但不限於，水包油型乳液製劑，免疫調節劑，如細菌細胞壁成分或合成的分子，或寡核苷酸(例如，CpG)和核酸聚合物(雙鏈和單鏈的RNA和DNA)，其可以結合可選擇的主鏈部分，例如，聚乙烯聚合物。可以通過測量針對a病毒複製子顆粒的致免疫產物的抗體或細胞毒性T_細胞的含量來測定佐劑的功效，該致免疫產物是由給予還含有佐劑或佐劑組合物的疫苗製劑中的含顆粒組合物引起的。還可以使用本領域已知的其他製劑和給藥方式。可以將佐劑結合本發明的組合物或結合可以結合本發明的組合物使用的其他疫苗製劑。本發明的組合物還可以包括其他藥劑、藥物、載體和稀釋劑。可以將本發明的組合物優化並結合其他疫苗接種方案來提供最寬的(即，覆蓋免疫應答的所有特徵，包括以上所述的那些特徵)可能的細胞和體液應答。在特定的實施方案中，這可以包括使用異源初免-加強免疫(prime-boost)策略，其中將本發明的組合物結合含有一種或更多種下列的組合物來使用源自病原體或腫瘤的免疫原，重組免疫原，裸露核酸，用含脂質部分配製的核酸，非a病毒載體(包括但不限於痘病毒載體，腺病毒載體，腺相關病毒載體，皰疹病毒載體，水泡性口膜炎病毒載體，副粘病毒載體，細小病毒載體，乳頭狀病毒載體，逆轉錄病毒載體，慢病毒載體)和其他a病毒載體。示例性a病毒載體可以是含有複製子的顆粒，基於DNA的含複製子載體(有時候稱為「ELVIS」系統，參見，例如，U.S.專利No.5，814，482)和/或裸露RNA載體。以與劑型相容的方式並且以預防和/或治療有效的含量來給藥本發明的含致免疫(或另外生物學活性的)a病毒顆粒的製劑和組合物。待給藥的含量，在一個劑量中通常為約104至約109感染單位/mL，這取決於待治療的對象，給藥或傳送顆粒的途徑，表達產物的免疫原性，所需的效應免疫應答的類型和所需的保護程度。在一些實施方案中，約106、107和108I.U.的劑量在人對象中特別有效。所需的待給藥或傳送的活性成分的有效量可以取決於醫師、獸醫或其他健康從業者的判斷，並且對於給定的對象是特定的，但這樣的決定在這樣的從業者的技術範圍內。可以以單劑量或多劑量進度表來給予本發明的組合物和製劑。多劑量進度表是如下的一種情況其中給藥的主要過程可以包括1至10或更多的分開劑量，接著按照維持和或加強所需效果(例如，免疫應答)的需要在隨後的時間間隔下給藥其他劑量，例如，每周或1至4個月給藥第二個劑量，並且如果需要，幾個月(例如，4或6個月)/年後給予隨後的劑量。可以根據公知的實驗方案來測定本發明治療方法的功效，用於測定本發明病症治療的成果。治療功效的測定，包括但不限於，全部存活，無疾病存活，症狀、進展時間和/或生活質量的改善等，如本領域公知的。「在治療」或「治療中」或「治療」指的是給予患有失調、疾病或病症的對象調節效果的任何類型的作用，其例如可以是有益的效果，包括對象病症的改善(例如，一個或更多個症狀)，病症進展的延遲或減輕，失調、疾病或病症發作的防止或延遲，和/或失調、疾病或病症的任一個臨床參數的變化等，如本領域公知的。可以理解只是通過說明給出了之前的詳述，並且可以在其中進行改變和變化而沒有脫離本發明的精神和範圍。實施例實施例1:dHcap和dHgp輔助子的構建設計了引物(衣殼F(SEQIDNO98),GPF(SEQIDNO:60)禾口13-101.pr4(SEQIDN0:6)(表1)，用以從VEE輔助質粒(對於衣殼輔助子，稱為「13.2.2」，對於糖蛋白輔助子，稱為「13.4.6」)擴增衣殼和糖蛋白(GP)基因，這描述於U.S.專利No.5，792，462，Pushko等，1997(Virology239389-401)和PCT公開W002/03917(Olmsted等)中。這些引物各自提供了RsrII限制位點，並且還結合衣殼或糖蛋白編碼序列的起點。以上引用的參考文獻中所述的DNA質粒是獲得結構蛋白編碼片段的方便來源，例如，通過PCR擴增。或者，可以從VEE或其減毒變體的全長克隆獲得這些編碼片段(參見，U.S.專利No.5，185，440；U.S.專利5，505，947)。使用這些引物的擴增形成具有以下元件的片段，從PCR產物的5』至3』端列出5，-RsrII限制位點，VEE結構蛋白編碼序列0RF，3，UTR,SphI限制位點_3，。然後用RsrII和SphI限制酶消化PCR產物並連接空VEE複製子載體，如U.S.專利No.5，792，462，Pushko等，1997(Virology239:389-401)和PCT公開W002/03917(Olmsted等)中所述的。該複製子RNA含有VEE非結構基因和26S亞基因組RNA啟動子的單個拷貝，接著是多克隆位點(MCS)。在疫苗構建體中，將一個或更多個編碼免疫原的序列插入該克隆位點。用RsrII和SphI(除去大部分nsPl和全部nSPS2-4)消化該載體，並在連接時，產生了包括完整a病毒5，和3，端的輔助子，即，「全長」端。因此，將這兩個輔助子稱為dHcap(FL)和dHgp(FL)，並且它們具有SEQIDNO1和SEQIDNO10各自的5，序列以及SEQIDNO55和SEQIDNO:56各自的3，序列(圖1)。隨後，在存在於dHcap(FL)和dHgp(FL)輔助子中的522nt5，端中製得八個大約每個50nt的連續刪除(圖2)。以兩個步驟來進行該程序。首先，設計八個與13.2.2和13.4.6輔助子(如上所述)的5，端直至位置502互補的反向引物(dHelpl-8R，SEQIDNO:63_70)，並且將每個工程化來另外含有RsrII限制位點(表1)。設計了正向引物(3-16.1.1(SEQIDNO:62)，表1)，然後將其與任一個反向引物混合，擴增具有以下元件的片段(5』至3』列出)5』-Xbal限制位點，T7啟動子，5』截短端，RsrII限制位點_3』。其次，將擴增的5』截短端片段克隆至用Xbal和RsrII線性化的dHcap(FL)和dHgp(FL)輔助子中。這產生了八組5，截短端輔助子構建體，稱為dHcapl-8和dHgpl-8，其各自具有SEQIDN0:2_9和SEQIDNO11-18的5，序列。在此作為SEQIDNO55提供了dHcap系列每個成員的3，序列和在此作為SEQIDNO56提供了dHgp系列每個成員的3，序列。實施例2.無啟動子輔助表達盒的表達分析方法為了測定在此所述的A26S輔助構造表達結構蛋白有多好，將每個輔助子連同上述的VEE複製子載體一起電穿孔至Vero細胞中。為了證明本發明新的無啟動子結構蛋白表達盒的能力，通過將GFP或肉毒桿菌神經毒素編碼序列插入VEE複製子載體的克隆位點中。使用在此所述的無啟動子結構蛋白表達盒的各種組合進行的從顆粒表達這些編碼序列證明了這些盒的實用性和新穎性。根據製造商的程序使用RiboMAXT7Express轉錄試劑盒(PromegaCorporation,Madison,WI)通過失控轉錄從每個輔助子和複製子載體轉錄RNA。在電穿孔之前，通過矽基色譜分離來純化輔助子和複製子RNA。混合三十微克(30yg)的每種輔助子和複製子RNA，並電穿孔至3-5X107個Vero細胞中。將電穿孔的細胞在培養基中稀釋並接種於25cm2燒瓶或96孔平板中。然後將電穿孔的細胞在37°C下培養16_24hr。A.IFA分析用磷酸鹽緩衝的鹽水(PBS)將接種於96孔平板中的電穿孔細胞洗滌一次，然後用丙酮甲醇(11)在室溫下固定五分鐘。然後使用結構蛋白特異性鼠抗體來分析細胞的VEE衣殼或GP蛋白的表達。將一抗稀釋於PBSFBS(11)中，並將100yl加入每個孔中。將平板在37°C下培養30min，用150ylPBS洗滌三次，然後用AlexaFluor488山羊抗鼠二抗(Invitrogen，Carlsbad,CA)在37°C下培養30min。培養後，如上所述再次將細胞洗滌，並在通過紫外線螢光顯微鏡(NikonEclipseTE300)觀察之前，將100yl終體積的PBS加入每個孔中。B.Northern分析用PBS洗滌接種於25cm2燒瓶中的電穿孔細胞，然後按照製造商建議的實驗方案使用RNAwizRNA分離試劑(Ambion，Austin,TX)提取總細胞RNA。通過分光光度測定法來測定RNA濃度。將五微克(5iig)的每種樣品通過乙二醛瓊脂糖凝膠來電泳，RNA被動轉移至BrightStarpius(Ambion)膜。按照製造商建議的實驗方案使用BrightStarBioDeteCt試劑盒(Ambion)，用VEE3』複製識別序列正鏈的特異性生物素化DNA寡聚物來進行Northern分析。通過將處理過的膜暴露於膠片來檢測化學發光。C.dHcap(FL)和dHgp(FL)表達的分析為了證明全長A26S輔助子(dHcap(FL)和dHgp(FL))能夠複製並表達蛋白，將這些輔助RNA連同複製子載體一起電穿孔至細胞中，需要複製子載體來提供促進輔助RNA複製的a病毒非結構蛋白。用30或60iig的dHcap(FL)和dHgp(FL)輔助RNA結合30yg的複製子RNA將Vero細胞電穿孔。如上所述，將電穿孔的細胞進行處理，用於IFA、WeStern印跡和Northern分析。實施例3全長的和截短的A26S輔助子的表達分析dHcap(FL)和dHgp(FL)輔助子表達了蛋白，如通過IFA和Western印跡所測定的，並且得到了有效地複製，如通過Northern印跡所證明的。分析用於衣殼和GP的完整組的截短A26S複製子(刪除1_8)，通過IFA分析蛋白表達，通過Northern印跡測定各自的表達和複製有多好。將每個dHcap輔助RNA結合VEE複製子RNA和13.4.6糖蛋白輔助RNA，並將三個RNA電穿孔至Vero細胞中。如上所述進行Northern分析和IFA。使用衣殼特異性抗體的IFA的結果顯示於表2中。所有dHcap輔助子對於通過IFA測定的衣殼表達都是陽性的，儘管dHcapS輔助子只是弱陽性的。從電穿孔細胞提取的RNA的Northern分析表明所有截短的衣殼A26S輔助子複製良好，除了dHcap8。以相似的方式檢測dHgp輔助子，除了該實驗中不包括13.2.2衣殼輔助子。將每個dHgp輔助子結合VEE複製子RNA，電穿孔至細胞中，並如上所述產生用於IFA和Northern分析的樣品。抗-GPIFA的結果顯示於表3中。與dHcap輔助子相似，所有dHgp輔助子是陽性的，除了dHgp8。所有dHgp輔助子輔助良好，除了dHgp8。實施例4改良的無啟動子輔助構建體發明人注意到dHcap(FL)和dHgp(FL)表達了融合蛋白，如通過Western印跡顯示的。這樣的融合蛋白可能是在用於A26S輔助子轉錄產物上的衣殼或GP的起始密碼子的框內起始密碼子上遊處翻譯啟動的結果。一種這樣的上遊密碼子是用於VEEnsPl的天然起始密碼子(位於VEE病毒基因組中的核苷酸45處)，其存在於dHcap和dHgp輔助子的5』端，在偏好的情況中，用於翻譯的啟動(例如，Kozak共有序列)。可能是可以通過核糖體從這些輔助子的加帽5』端的掃描來使用有利的Kozak環境中的起始密碼子，由此產生非功能性的融合蛋白並降低從位於更下遊的合適起始密碼子產生功能性衣殼和糖蛋白多肽。使用兩種方法來降低所產生的這種融合蛋白的含量並提高全長衣殼和糖蛋白的蛋白表達。首先，將上述的偏好起始密碼子突變成TAG終止密碼子，而剩餘的起始密碼子未改變。採用這種方法使5』端序列儘可能地保持與天然VEE基因組中存在的序列相接近，以維持這些輔助子依賴的複製元件。其次，nt3的起始密碼子下遊(包括nsP1(偏好)起始密碼子)和衣殼或糖蛋白編碼序列開放閱讀框(0RF)全部從AUG變成GUG(存在總的12個變化)。採用這種方法來測定較低偏好的ATG密碼子(RNA中的AUG)是否也對全長衣殼的產生或糖蛋白表達具有不利影響。A.dHcap-mutl和dHgp-mutl輔助子的構建為了形成偏好nsPl起始密碼子已經變成TAG終止密碼子的dHcap和dHgp輔助子，對每個dHcap和dHgp輔助子進行定點誘變，產生完整組(FL和截短1-7)的突變輔助子，稱為dHcap-mutl和dHgp-mutl輔助子，其各自具有在此如SEQIDNO35-42和43-50提供的5』序列。根據製造商的實驗方案使用QuikchangeXL定點誘變試劑盒(Stratagene，LaJolla，CA)進行定點誘變，使用表4中的正向(SEQIDN071)和反向(SEQIDNO72)引物。B.dHcap-mm和dHgp-mm輔助子的構建為了產生帶有不具有nt3的任何起始密碼子下遊和衣殼或GP0RF起始密碼子的5』端的dHcap和dHgp輔助子，進行了定點誘變，將所有幹涉atg(rna中的aug)密碼子變成gtg(rna中的gug)密碼子。將dHgp(fl)構建體用作定點誘變的模板。使用Quikchange多定點誘變試劑盒(Stratagene)來引入密碼子改變，使用製造商的實驗方案。用於引入密碼子改變的引物顯示於表5中(seqIDno:73-82)。將含有所有密碼子變化的dHgp(el)構建體稱為dHgp(fl)-mm(具有在此作為seqIDno:19提供的5，序列)。證實序列存在所有密碼子變化後，將該dna用於產生dHcap(fl)-mm構建體，通過用來自dHgp(fl)-mm的5，複製識別序列替換dHcap(fl)5，複製識別序列。通過用RsrII和NotI酶消化dna來完成這。然後將dHcap(fl)-mmRsrII/NotI5，複製識別序列片段連接線性化的dHcap(fl)DNA，產生dHcap(fl)-mm(具有在此作為seqIDNO27提供的5，序列)。此外，將dHgp(fl)-mmDNA用作模板來產生用於衣殼和GP輔助子的5』截短端組，使用以上對於dHcapl-7和dHgpl_7所述的方法和引物。將新的輔助子稱為dHcaplmm-dHcap7mm(具有在此作為seqIDNO:20-26提供的5，序列)和dHgpImm-dHgp7mm(具有在此作為seqIDNO28-34提供的5，序列)。C.mutl和mm無啟動子輔助子的表達分析分析了從上述A26S輔助子的各種mutl和mm形式的蛋白質產生。在該實驗中，通過Western印跡分析了dHcap6_mutl(具有在此作為SEQIDNO41提供的5，序列)、dHcap6-mm(具有在此作為SEQIDNO25提供的5，序列)、dHcap7-mm(具有在此作為SEQIDNO26提供的5，序列)和dHgp-7mm(具有在此作為SEQIDNO27提供的5，序列)以及13.2.2和13.4.6輔助子。含有mm突變的A26S輔助子主要表達了全長衣殼或GP蛋白，幾乎沒有可檢測的融合蛋白。Mutl輔助子表達了大量全長結構蛋白，但它們還持續表達一些融合蛋白。對相同的樣品進行了Northern分析來分析mutl和mmA26S輔助子的複製特徵。結果表明dHcap6-mutl輔助子和13.2.2衣殼輔助子複製一樣好。相反，dHcap6-mm,dHcap7-mm和dHgp7-mm輔助子似乎複製的程度低於13.2.2或mutl輔助子。實施例5使用A26S輔助子產生VEE複製子顆粒表6中列出的是結合不同的無啟動子衣殼和GP輔助子與VEE複製子RNA來產生VEE複製子顆粒(VRP)的各種實驗。此外，在一些實驗中，引入細胞中的各個輔助子RNA的含量也是不同的。通過用所示含量的輔助RNA以及30iig複製子RNA電穿孔5X107至lX108Vero細胞來產生VRP。通常，對於其中產生顆粒的所有實驗，將電穿孔的細胞接種於含有無血清培養基的300cm2燒瓶中並在收集VRP之前培養16-24hr。通過以下方法來測定VRP滴定度用十倍連續稀釋的樣品感染生長於96孔平板中的Vero細胞，將細胞培養16-18hr，固定細胞並使用VEEnsP2蛋白特異性抗體或目標核酸產物進行IFA。將VRP產量報導為來自實驗的總產量(即，表6)或基於每ml的來自20ml製劑的總產量(表7，9-13，15和16)。還通過細胞病變效應(CPE)試驗測試了這些製劑中可複製病毒(RCV)的存在。CPE試驗由細胞培養物中的兩次盲目傳代組成，以篩選RCV的存在。對於傳代1，用Vero細胞單層將來自VRP製劑的樣品在37°C下培養lhr，然後除去樣品流體並用新鮮培養基替換，將培養物培養24hr，以允許可能存在的任何RCV擴增。對於傳代2，在傳代1結束時將細胞培養物上清液加入新鮮Vero細胞單層中並在37°C下培養72hr。在傳代2結束時，使用倒置光學顯微鏡檢查培養物的CPE。已經將該試驗標準化，並對於在大量VRP存在下檢測活病毒的靈敏度進行了評價。在該試驗中使用V3014或TC-83，摻加示蹤劑研究表明了在1X108VRP的背景基礎上3-8PFU較低的檢測極限。已經對使用本發明的無啟動子輔助子產生的超過1013的VRP進行了該試驗，尚未檢測到RCV。儘管該試驗的檢測極限，使用該檢測極限，對於產生RCV的可能重組頻率的理論計算低得多，S卩，101QVRP中1個，10"VRP中1個，1012VRP中1個或1013VRP中1個。實施例6.「切割糖蛋白」無啟動子輔助子A.分開的E2和E1無啟動子輔助子的構建通過將E2和E1糖蛋白盒分開克隆至dHgp6-mutl輔助子的主鏈中來構建其中E2和E1編碼序列置於分開的輔助子上的糖蛋白無啟動子輔助子的構建。設計引物來通過PCR從pHCMV-Vsp擴增VEE結構蛋白編碼區的衣殼-E3-E2區(參見，U.S.專利No.7，045，335，在此引入作為參考)。將擴增的片段克隆至pCR-BlimtIITQPO載體中(Invitrogen)，產生PCR-CE3E2。將CE3E2測序來確保在PCR擴增過程中沒有引入錯誤。為了產生含有CE3E2結構區的啟動子輔助的輔助子，用Spel限制酶來消化pCR-CE3E2DNA來釋放E3E2片段。然後將E3E2(SpeI)片段連接用Spel酶線性化的衣殼輔助子(13.2.2)來產生pHCE3E2。通過消化來自PHCE3E2的E3-E2編碼區來製備無啟動子E2輔助子(稱為dHE2_6Ml)。首先用AscI限制酶將pHCE3E2DNA質粒線性化，然後用T4DNA聚合酶處理來形成平端。相似地，用SphI限制酶將dHgp6-mutlDNA質粒線性化並用T4DNA聚合酶處理來形成平端。然後用Spel限制酶消化兩個線性化的、T4-聚合酶處理過的DNA，並將所得到的3.6kbdHgp6_mutl載體片段和1.4kbE3-E2片段各自凝膠純化。然後使用T4DNA連接酶將兩個純化的片段連接在一起，以產生dHE2-6Ml無啟動子輔助子。以幾個步驟來完成無啟動子E1輔助子的產生。設計引物來擴增兩個結構蛋白編碼片段1)衣殼-E3(CE3)，和2)6K-E1(6KE1)。將PCR產物克隆至pCR-BluntTOPO載體(Invitrogen)中，產生pCR_CE3和pCR_6KEl。將克隆測序以確保在擴增過程中沒有引入錯誤。為了產生含有E1糖蛋白的E3和6K前導序列上遊的盒，產生了另一個中間構建體。通過用BamHI酶消化PCR_6KE1DNA並純化6KE1片段來完成這。然後將6KE1(BamHI)片段連接用BamHI酶線性化的pCR_CE3DNA，產生pCR_CE36KEl。為了產生含有CE36KE1盒的啟動子輔助的輔助子，用Spel和SphI酶消化PCR-CE36KE1DNA，釋放結構蛋白編碼序列盒。然後將CE36KE1(Spel/SphI)片段連接用Spel和SphI線性化的衣殼輔助子(13.2.2)來產生PHCE36KE1。通過從pHCE36KEl質粒消化E3-6K-E1編碼區來完成無啟動子E1輔助子(稱為dHEl-6Ml)的產生。用Spel和SphI限制酶消化pHCE36KEl和dHgp6_mutl，並將得到的3.6kbdHgp6-mutl載體片段和1.7kbE3-6K-E1片段凝膠純化。然後使用T4DNA連接酶將兩個純化的片段連接在一起，以產生dHEl-6Ml無啟動子輔助子。B.切割糖蛋白無啟動子輔助子的分析將單個的糖蛋白輔助子在體外轉錄，並在連同VEE複製子RNA電穿孔至Vero細胞中之前，將RNA轉錄產物純化。通過Northern印跡分析輔助子複製，並使用E1和E2糖蛋白特異性抗體通過IFA分析蛋白表達。Northern結果表明dHEl_6Ml和dHE2_6Ml輔助子都有效複製了。代表性的Northern印跡顯示於圖3中。為了測定兩個單獨的糖蛋白-表達無啟動子輔助子是否可以結合A26S衣殼輔助子來包裝複製子RNA，以產生VRP。將三個輔助子結合表達肉毒桿菌神經毒素A片段的VEE複製子RNA並電穿孔至Vero細胞中。來自一個試驗的VRP產量顯示於表7中。實施例7.修飾的5』和3』端無啟動子輔助盒A.修飾的5』端輔助盒的構建在大部分a病毒的RNA的5』端(頭250nt)的預測二級結構含有四個莖環(SL)結構(SL1、SL2、SL3和SL4)。Frolov等(RNA,71638-1651(2001))證明了從辛德畢斯病毒輔助RNA除去編碼SL2的核苷酸序列提高了該輔助子的複製。如下通過PCR從dHcap6-mutl除去VEE5，端的SL2區(基於M-摺疊程序)，nt46至ntll6，包括端點。從dHcap6-mutlDNA擴增兩個片段。使用引物13-82.1.9[SEQIDNO.83]和dLS2(EcoRV)R[SEQIDN0.84](表8)來擴增含有dHcap6_mutl5，端的45個核苷酸和編碼主鏈質粒序列的核苷酸的大約1千鹼基對(kb)的5』片段。使用引物dSL2(EcoRV)F[SEQIDNO.85]和3_8.pr4[SEQIDNO.86]來擴增含有開始於核苷酸117的VEE5』端部分和編碼直至VEE3』端的完整衣殼序列的核苷酸的大約1.5kb的3』片段。用XhoI和EcoRV限制酶消化5，IkbPCR片段。用EcoRV和NotI限制酶消化3，1.5kbPCR片段。通過用XhoI和NotI消化將質粒dHgp6-mutl線性化，並純化所得到的2.5Kb載體主鏈。為了產生其中刪除了SL2區的新輔助子，在此稱為「dHcap6-mut1(dSL2)」，將5，(XhoI/EcoRV)片段，3，(ECoRV/NotI)片段和XhoI/NotI線性化載體連接在一起。將具有在此作為SEQIDNO.51提供的5，端序列的dHCap6-mutl(dSL2)輔助子完整測序，以確保在PCR擴增過程中沒有引入錯誤。為了產生相匹配的dHgp6-mutl(dSL2)輔助子，用XhoI和RsrII限制酶消化dHgp6-mutlDNA,並純化5.4kb片段。通過用XhoI和RsrII消化該DNA並純化1.Ikb片段來收集來自dHcap6-mutl(dSL2)的修飾5，端。將這兩個片段連接在一起來產生dHgp6-mutl(dSL2)，其具有和dHcap6_mutl(dSL2)相同的5，端[SEQIDN0.51]。B.縮短的3』端無啟動子輔助盒的構建在這些實施例中，對於衣殼輔助構建體dHcap(FL)，dHcapl至dHcap7，dHcap(FL)mm,dHcaplmmMdHcap7mm,dHcap(FL)mut1禾口dHcapImutl至dHcap7mutl,在此作為SEQIDNO.55提供了3』端序列。儘管本發明的VEE衣殼蛋白缺乏完整的糖蛋白編碼區，但在衣殼輔助子上保留了小部分的E3蛋白，以允許在包裝細胞內發生胰凝乳蛋白酶樣切割，來產生成熟的衣殼蛋白。對於糖蛋白輔助構建體dHgp(FL)，dHgpl至dHgp7，dHgp(FL)mm,dHgplmm至dHgp7mm，dHgp(FL)mut1和dHgpImutl至dHgp7mutl，3，端序列是較短的序列，因為在糖蛋白輔助構建體中不需要用於產生成熟衣殼蛋白所需的含有切割位點的序列。在此作為SEQIDNO.56提供了這些實施例中用於這些糖蛋白構建體的3』序列。此外，構建了具有較短3』端長度的無啟動子RNA輔助子。通過降低α病毒3』端序列的含量，進一步降低了產生可複製VEE病毒所需的第二次重組事件的理論可能性。最初，在以下兩個步驟中產生了具有功能性26S啟動子的糖蛋白的輔助子，該啟動子只含有包括α病毒高度保守的3』序列[SEQIDNO.52]的19個核苷酸。首先，產生了含有糖蛋白(GP)編碼序列盒的質粒，該盒具有獨特的5』盒3』限制位點。設計引物來擴增具有獨特的SphI位點(「GP(SphI)R」，SEQIDNO.87，表8)和5，端的現有內部SpeI位點(「3-16.1.3」，SEQIDNO.88，表8)的VEEGP，SphI位點就在3，端的El終止密碼子之後。擴增的片段是克隆至pCR2.IDNA中的TA(Invitrogen,Carlsbad,CA)，產生pCR2.l/GP19nt5，。其次，設計正向引物來引入SphI位點，就在VEE3』端的19個核苷酸保守序列的上遊(3’trunk(SphI)F，SEQIDNO.89，表8)。設計質粒主鏈序列特異性的反向引物來擴增將含有3』端獨特AflII限制位點的片段(3，trunc(AflIII)R,SEQIDNO.90，表8)。用SphI和AflII消化使用這些引物擴增得到的片段，並連接成13.4.6糖蛋白輔助子(實施例1中所述的)，已經用SphI和AflI限制酶將其線性化，因此導致pGP輔助子-intl的構建。pGP輔助子-intl構建體在GP終止密碼子和輔助子的3』端(包括19nt保守序列)之間具有72個核苷酸區。為了產生只具有19個核苷酸3，端的GP輔助子，用SpeI和SphI消化pCR2.1/GP19nt5'DNA，並將GP編碼序列連接至用SpeI和SphI限制酶消化的pGP輔助子-intl中。將所得到的構建體命名為PGP輔助子19nt。然後將pGP輔助子19nt用於產生具有不同長度的3』複製識別序列的Δ26S輔助子。用NcoI和NotI限制酶消化pGP輔助子19nt構建體，並將含有糖蛋白編碼序列的2515個鹼基對片段進行凝膠純化，該編碼序列具有19nt3』端片段。然後將該2515個鹼基對(NcoI/NotI)片段連接至用NcoI和NotI限制酶消化的dHgp構建體中，產生各種dHgp19nt構建體。C.表達α病毒衣殼蛋白的修飾無啟動子輔助盒的構建在VEE病毒感染的細胞中，VEE衣殼蛋白從結構糖蛋白切割自身，結構糖蛋白是從26S亞基因組mRNA翻譯的。儘管本發明的VEE衣殼輔助子缺乏完整的糖蛋白編碼區，但在衣殼輔助子上保留了一小部分Ε3蛋白，以允許在包裝細胞內發生胰凝乳蛋白酶樣切割，來產生成熟的衣殼蛋白。在衣殼的3』端引入終止密碼子，替代胰凝乳蛋白酶樣切割位點，將提高使用糖蛋白輔助子產生功能性重組體的難度。即，對於使用本發明的dHgp輔助子來產生的功能性重組(即，產生可複製病毒)，重組事件必須是核苷酸完美的，以替代衣殼編碼序列中的工程化終止密碼子並維持活性衣殼切割位點。產生了兩種形式的在3』端結合了終止密碼子的dHcap輔助子。一種形式，dHcap6-mutl-dSL2(終止)，其具有在此作為SEQIDN0:57提供的3』序列，替代了具有終止密碼子的天然衣殼蛋白的C-端色氨酸殘基；另一種形式保留了C-端色氨酸殘基(dHcape-mutl(W-終止)，其具有在此作為SEQDINO59提供的3』序列)並就在色氨酸殘基的下遊插入了終止密碼子。使用引物來擴增衣殼編碼序列，設計該引物，以在5』端工程化獨特的RsrII位點(衣殼(RsrII-Kozak)F,SEQIDN0:91，表8)和3，端獨特的SphI位點(衣殼(終止)SphIR，SEQIDNO:92或衣殼(W-終止)SphIR,SEQIDN0:93，表8)。還將正向引物工程化，以在近-最佳Kozak共有序列中放置衣殼起始密碼子(Kozak，Cell,44(2):283_292(1986))，以增強衣殼mRNA翻譯的核糖體啟動。用RsrII和SphI限制酶消化擴增的衣殼編碼序列，並連接至用RsrII和SphI線性化的Δ26S輔助質粒中，以產生dHcap6-mutl-dSL2(終止)和dHcap6_mutl(W-終止)構建體。D.表達α病毒糖蛋白的修飾啟動子輔助盒的構建VEE衣殼蛋白是在衣殼C-端色氨酸殘基之後切割的胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶。基於胰凝乳蛋白酶的切割特異性，預期可以容許就在色氨酸下遊位置中的所有胺基酸殘基，除了甲硫氨酸和脯氨酸。預期就在色氨酸下遊的這些胺基酸在很大程度上降低胰凝乳蛋白酶切割活性。在天然VEE病毒中，存在包括VEEΕ3信號序列的18個胺基酸。設計構建體來減少Ε3信號序列中的胺基酸數量，同時維持Ε3序列的信號功能。因為預期可以在衣殼C-端色氨酸的下遊位置中容許包含Ε3序列的18個胺基酸中的16個，如果在重建VEE結構糖蛋白編碼序列的核苷酸完美重組事件發生時，將它們就放置在C-端色氨酸的下遊，降低Ε3信號序列中的胺基酸數量將降低作為切割位點功能性的位點數量。作為這種方法的實例，通過PCR除去正常存在於Ε3信號序列中的N-端絲氨酸殘基，留下亮氨酸殘基作為N-端殘基，並且構建dHgp無啟動子輔助子來確定這樣的修飾gp輔助子是否能起作用來包裝VRP。設計正向PCR引物(Gp(RsrII-Ser)F，SEQIDNO94)來除去E3的N-端絲氨酸殘基並維持獨特的RsrII限制位點(表8)。設計反向引物(3-16.2.14，SEQIDNO:95)來擴增將含有獨特的SnaBI限制位點的gp片段(表8)。用RsrII和SnaBI消化所得到的gpPCR片段並連接質RsrII和SnaBI消化的dHgp6_mutlDNA中，產生dHgp6_mutl(-S)。Ε.使用5，和3，修飾的Δ26S啟動子進行VRP產生實驗還製備了含有上述修飾組合的輔助子。在VRP產生實驗中分析dHcap和dHgp無啟動子輔助子的不同組合和RNA濃度，以測定它們怎樣有效地包裝VEE複製子RNA(表達肉毒桿菌神經毒素片段A或流感HA的)。此外，對輔助子組合的子集分析了A26S輔助子加帽對VRP產量的作用。使用Δ26S輔助子不同組合的VRP產量的代表性實例顯示於表9-13中。通過連續稀釋VRP並用Vero細胞在37°C和5%CO2下培養過夜，在48-孔平板中在Vero細胞單層培養物中進行了定量VRP感染性和產量的效能測定。過夜培養後(18-20小時)，將細胞洗滌，固定，並用抗原特異性一抗接著FITC綴合的二抗將固定的單層染色。通過紫外線螢光顯微鏡(NikonEclipseTE300)檢測含有FITC標記的抗原-抗體複合物的細胞。將單個的抗原陽性細胞計數並從已知的稀釋和接種體積來計算表示為IU/mL的滴定度。實施例8.結合泛素單體的無啟動子輔助子A.含有泛素單體的Δ26S輔助子的構建在真核細胞中，通過細胞泛素羧基端水解酶(UCH)就在其C-端甘氨酸之後切割用泛素融合或標記的蛋白質(Pickart和Rose,J.Biol.Chem260:7903_7910(1985))。就在衣殼和糖蛋白編碼序列上遊符合閱讀框地放置泛素編碼序列的單體將消除使用本發明的特定無啟動子輔助構建體產生的融合蛋白(這樣的融合體是由用於每個結構蛋白編碼序列的ATG上遊多個轉錄起始位點引起的)。消除發生是因為所有框內融合蛋白將包括泛素單體，並因此它們可以通過UCH來切割，由此釋放沒有任何上遊、外源蛋白序列的全長VEE結構蛋白。設計引物泛素F(SEQIDNO96)和泛素R(SEQIDNO97)(表14)，以在擴增的泛素單體編碼序列的5』和3』端引入RsrII位點，同時保持泛素單體通過UCH切割需要的Arg-Gly-Gly序列(圖4)。這些特定的構建體在切割後在每個所得到的結構蛋白上形成了天然結構蛋白上不存在的其他N-端胺基酸殘基(S卩，對於衣殼輔助子，為額外的脯氨酸；對於糖蛋白輔助子，為額外的脯氨酸和蘇氨酸)(圖4)。使用PfuTaq聚合酶(Stratagene)將泛素編碼序列進行PCR擴增並克隆至dHcap(FL)和dHgp(FL)獨特的RsrII位點中。篩選轉化體以測定泛素插入片段的方向。分離各自稱為dHcapU和dHgpU的用於衣殼和糖蛋白的陽性泛素克隆(各自具有在此作為SEQIDNO.53和54提供的5』端序列)，並測序來證實沒有將錯誤引入擴增的泛素編碼序列中。在分開的反應中使用RiboMaxExpressRNA試劑盒從dHcapU、dHgpU、dHcap(FL)、dHgp(FL)、Hcap4和13.4.6質粒轉錄用於電穿孔的RNA並用氯化鋰沉澱。B.使用泛素修飾的Δ26S輔助子的VRP產生實驗用表達HIV分化體C糖蛋白的VEE複製子RAN(「DU151gpl60」)將Vero細胞電穿孔並在所示RNA含量下選擇無啟動子衣殼和GP輔助子的組合。在一些實施方案中，使用了「Hcap4」衣殼輔助子。這是具有截短5』端(對應於上述的dHcap4截短)但保留26S亞基因組啟動子序列的輔助子，並且在U.S.專利No.7，045，335中有充分描述，在此將其引入作為參考。在大約0.8ml的體積中，在0.4cm比色皿中，在500V、25μF、4個脈衝下進行電穿孔。將每個電穿孔接種於含有IOOmlOptipro(Gibco，Carlsbad,CA)的l_850cm2轉瓶中。在18hr時在0.2μm濾器上收集VRP，使用25ml的0.5MNaCl洗滌。用1400的抗-gpl20山羊抗體(其識別HIVgpl60蛋白)滴定VRP鹽洗物質。包裝實驗的結果顯示於表15中。隨後進行電穿孔來比較用衣殼輔助子dHcapU或dHCap6-mutl(W-終止)結合dHgp6-mutl包裝的各種核酸的滴定度。使用VEEnsP2特異性多克隆抗體來滴定VRP(表16)。C.通過Western分析電穿孔細胞中的結構蛋白表達從表16中概括的包裝研究中用於產生VRP的細胞製得細胞裂解物。在半乾轉移至PVDF(PVDF在IX轉移緩衝液中400mA下40min)之前，將來自每個樣品的細胞裂解物在200V、400mA下在IXMPOS中在4-12%Bis-TrisNovex凝膠中電穿孔45min。將膜在IXBMB阻斷/TBS中阻斷過夜。一抗為1A4A抗-VEEGP的1500稀釋和抗-VEE衣殼的11500稀釋，稀釋於IXBMB阻斷/TBS中。Western印跡結構顯示於圖5中。將從dHgpU表達的糖蛋白加工成TE2和E2GP形式，比從dHgp(FL)表達的糖蛋白更完整。這通過沒有使用存在於dHgp(FL)中的泛素看到的融合蛋白模式的差別得到了證明(圖5，使用GP抗體在Western印跡上比較了泳道3和4)。將泛素置於dHcapU輔助子中的衣殼蛋白的N-端導致衣殼融合蛋白消失(圖5)和使用13.4.6糖蛋白輔助子包裝時gpl60滴定度高於2個對數的增加(表15)。D.通過Northern分析電穿孔細胞的結構蛋白RNA表達從表15中概括的包裝研究中用於產生VRP的細胞提取總細胞RNA。用RNAwiz試劑(Ambion，Inc.,Austin，TX)裂解細胞，用氯仿提取，沉澱並接受使用衣殼和GP特異性探針的Northern分析(各自為圖6和圖7)。所有RNA物質與從各種構建體預期的大小一致。實施例9.使用加帽和未加帽的Δ26S輔助構建體的VRP產生Α.表達各種α病毒的糖蛋白的VRP使用表達作為目標核酸(NOI)的VEE(3022)、東方馬腦炎病毒(EEE)(4200)或西方馬腦炎病毒(WEE)(2100)的糖蛋白編碼序列的VEE複製子來產生VRP，其中已經刪除了每個furin切割位點。用NotI將編碼用於產生VRP的輔助子的DNA質粒線性化，並按照製造商的說明使用T7RiboMax試劑盒(Pr0mega，MadiS0n，WI)進行體外轉錄，並且按照其中所示的，補充7.5mMCAP類似物(Promega)。在表17中，將使用帽類似物產生的輔助子表示為「+帽」，沒有使用帽類似物的那些表示為「_帽」。按照以上實施例5中所述的，用複製子、衣殼輔助子和GP輔助子RNA的組合將Vero細胞電穿孔並產生VRP。三個分開實驗的結果顯示於表17-19中。B.表達流感株Wisconsin的HA編碼序列的VRP在該實驗中，在用於產生編碼VEE衣殼或VEE糖蛋白的Δ26S輔助子RNA的轉錄反應中，Cap類似物與GTP的摩爾比是不同的。如下裝配轉錄反應Promega5X轉錄緩衝液；rNTP混合物(6mMUTP、CTP、ATP)；GTP(0-6mM,如表中所示)；(PromegaCorporationWoodsHollowRd.，MadisionWI,目錄#Ρ1300)和Ribom7GCap類似物(6mM)(PromegaCorporationWoodsHolloffRd.，MadisionWI，目錄#P1712)。使用Promega的5X緩衝液和7.5mMrNTP進行其他反應，使用或未使用7.5mRibom7GCap類似物來模擬製造商指定的T7RiboMAXExpressRNA轉錄試劑盒條件(PromegaCorporationWoodsHolloffRd.，MadisionWI,目錄#P1320)，其通常使用試劑盒中提供的2X緩衝液來運行。該實驗中包裝的VEE複製子編碼流感HA(A/WI/05)蛋白。將30μg複製子RNA；10μgΔ26S衣殼輔助子RNA和60μgA26S糖蛋白輔助子RNA用於每次電穿孔。將Vero細胞擴大，然後洗滌並重懸浮於蔗糖緩衝液中至1.2XIO8細胞/mL。將這些細胞與RNA混合，然後用設定為500伏特、25μFd和四個脈衝的BioRadGenePulseII裝置電穿孔。將細胞轉移至含有lOOmLOptiPlO的轉瓶中，並在37°C下培養。電穿孔後二十四小時，收集VRP。在Vero的48-孔平板上滴定VRP，結果顯示於表25中。實施例10.使用由A26S輔助構建體製得的VRP對抗小鼠中肉毒桿菌神經毒素的保護將表達肉毒桿菌神經毒素血清型A或B的重鏈的非毒性C-端片段的VEE複製子載體(各自為BoNTA或BoNTB)包裝至VRP中，使用(i)30yg未加帽的13.2.2和13.4.6輔助子或(ii)20yg加帽衣殼Δ26S輔助子和60μg加帽糖蛋白Δ26S輔助子，如實施例5中所述的。在第O天和第28天，使用IXIO7IU劑量的這些VRP來接種Swiss小鼠。在第二次免疫後一個月，用殺滅50%動物需要的BoNTA或BoNTB神經毒素劑量1000倍的劑量(IOOOLD50)來激發小鼠。激發實驗的結果概括於表20中。實施例11.使用表達來自天花病毒的抗原的VRP的免疫原性和保護研究A.使用Δ26S輔助構建體產生的VRP在小鼠和靈長類動物中的免疫原性使用Kamrud等所述的方法(Virology360(2):376_87(2007))，構建優化來表達四個牛痘病毒(VACV)基因(L1R、B5R、A27L和A33R)的VEE複製子載體。將這四個VACV基因總稱為「4ρ0χ」。將4pox基因克隆至兩個不同的VEE複製子載體系統中，一個基於VEE的3014株，而另一個基於TC-83疫苗株。使用每個優化的VACV編碼序列-表達複製子載體來產生VRP，通過將30μg複製子、20μgΔ26S衣殼輔助RNA和60μgΔ26SGP輔助RNA混合，並將它們電穿孔至Vero細胞中。按照實施例5中所述的產生顆粒並收集。然後將單獨的VACVVRP混合，產生用於免疫BALB/c小鼠或獼猴的4poxVRP混合物，並通過VACV抗原特異性ELISA分析來測量體液應答。接種小鼠中檢測的VACV-特異性ELISA應答顯示於表21中，而接種獼猴中檢測的VACV-特異性ELISA應答顯示於表22中。B.小鼠中和非人靈長類動物中使用4poxVRP的保護1.小鼠通過鼻內途徑使用2XIO6PFU牛痘病毒(IHD-J株)來激發小鼠，並且將結果呈現於表23中。2.非人靈長類動物通過靜脈內途徑使用5XIO6PFU的猴痘病毒來激發非人靈長類動物。使用世衛組織的損傷數量評分系統來確定疾病嚴重程度，並且將結果呈現於表24中。如本領域技術人員所理解的，對於所要求發明的每個方面存在幾個實施方案和要素，並且在此將不同要素的所有組合結合為本發明的實施方案，因此沒有將在此例舉的特定組合解釋為所要求的本發明範圍的限制。如果將特定的要素在組合中可用要素組中除去或添加進去，那麼認為該要素組已經結合了這樣的變化。在此引用的參考文獻，包括非專利出版物，專利申請和專利，在此將其全部引入作為參考，至如同在此單獨和特意指出引入作為參考並全部重現的程度。表1.產生A26S輔助子的引物tableseeoriginaldocumentpage31表2.dHcapl-8輔助子的IFA分析tableseeoriginaldocumentpage31tableseeoriginaldocumentpage32表3tableseeoriginaldocumentpage32表4.產生mutl輔助子的定點誘變引物tableseeoriginaldocumentpage32tableseeoriginaldocumentpage33tableseeoriginaldocumentpage34tableseeoriginaldocumentpage35BoNTA複製子tableseeoriginaldocumentpage35表7.使用Δ26S衣殼、El和Ε2輔助子產生的VRP產量pERK/342/MS/BoNTA[30yg]tableseeoriginaldocumentpage35表8.用於設計Δ26S輔助子的5』和3』區修飾的PCR引物tableseeoriginaldocumentpage36表9.複製子包裝的pERK/342/MS/BoNTΑ[30μgRNA]tableseeoriginaldocumentpage36tableseeoriginaldocumentpage37表10.複製子包裝的pERK/342/MS/BoNTA[30μgRNA]tableseeoriginaldocumentpage37表IL複製子包裝的pERK/342/MS/BoNTA[30μgRNA]衣殼複製子[RNA]GP複製子[RNA]VRP滴定度IFU/mldHcap7-mutl[20yg]dHgp7_mutl[90μg]4.9XIO7dHcap7-mutll9nt[30yg]dHgP7_mutl[90μg]2.2XIO7表12.複製子包裝的pERK/342/MS/BoNTA[30μgRNA]tableseeoriginaldocumentpage37tableseeoriginaldocumentpage38表13pERK/383/MS/HA(AWyoming)[30μgRNA]tableseeoriginaldocumentpage38表14tableseeoriginaldocumentpage38tableseeoriginaldocumentpage39tableseeoriginaldocumentpage40tableseeoriginaldocumentpage41表19.tableseeoriginaldocumentpage41表20.接種使用Δ26S輔助子產生的VRP的小鼠的激髮結果tableseeoriginaldocumentpage41NA不適用1在複製子中含有表達無關蛋白的編碼序列表21.tableseeoriginaldocumentpage42表22.tableseeoriginaldocumentpage42表23.小鼠中的保護研究tableseeoriginaldocumentpage42表24.獼猴中的保護研究tableseeoriginaldocumentpage43INTC=太多以致難以計數表25.A26S輔助子的加帽對編碼來自流感Wisconsin株的HA編碼序列的a病毒輔助子載體的包裝的作用的研究tableseeoriginaldocumentpage44tableseeoriginaldocumentpage45權利要求分離的RNA分子，其包括a)α病毒5』複製識別序列，其中從所述5』複製識別序列中去除了至少一個起始密碼子；b)編碼α病毒結構蛋白的核苷酸序列；和c)α病毒3』複製識別序列，條件是所述RNA分子不含有指導(b)的核苷酸序列轉錄的啟動子，並且其中(a)和(c)的α病毒5』和3』複製識別序列指導整個RNA分子在α病毒非結構蛋白的存在下複製。2.權利要求1的RNA分子，其中編碼α病毒結構蛋白的核苷酸序列選自編碼下列的核苷酸序列1)α病毒衣殼蛋白，2)以任意次序的α病毒El和Ε2蛋白，3)以任意次序的α病毒衣殼蛋白和α病毒El蛋白，5)以任意次序的α病毒衣殼蛋白和α病毒Ε2蛋白，6)α病毒Ε2蛋白和7)α病毒El蛋白。3.權利要求1的RNA分子，其中α病毒5』複製識別序列是委內瑞拉馬腦炎病毒的5』複製識別序列。4.權利要求3的RNA分子，其中5』複製識別序列的長度是70至524個核苷酸。5.權利要求1或權利要求3的RNA分子，其中α病毒3』複製識別序列是委內瑞拉馬腦炎病毒的3』複製識別序列。6.權利要求1的RNA分子，其中3』複製識別序列的長度是19至325個核苷酸。7.權利要求1的RNA分子，其中至少一個起始密碼子是用於非結構蛋白l(nspl)的起始密碼子。8.權利要求1的RNA分子，其中從5』複製識別序列中除去了所有起始密碼子。9.權利要求1的RNA分子，其中將RNA在5』端加帽。10.製備α病毒複製子顆粒的方法，其包括將一個或更多個權利要求1的RNA分子引入細胞中，由此RNA分子的組合連同α病毒複製子RNA—起，在由此產生α病毒複製子顆粒的條件下，編碼產生α病毒複製子顆粒需要的所有α病毒結構蛋白。11.權利要求10的方法，其中將兩個RNA分子引入細胞中，其中兩個RNA中的第一個RNA分子編碼一個或更多個α病毒結構蛋白，兩個RNA分子中的第二個RNA分子編碼一個或更多個α病毒結構蛋白，其中至少一個不同於由第一個RNA分子編碼的α病毒結構蛋白。12.權利要求10的方法，其中將三個RNA分子引入細胞中，其中三個RNA分子中的第一個RNA分子編碼一個或更多個α病毒結構蛋白，三個RNA分子中的第二個RNA分子編碼一個或更多個α病毒結構蛋白，其中至少一個不同於由第一個RNA分子編碼的α病毒結構蛋白，並且第三個RNA分子編碼一個或更多個α病毒結構蛋白，其中至少一個不同於由第一個RNA分子和第二個RNA分子編碼的α病毒結構蛋白。13.權利要求10的方法，其中將一個或更多個RNA分子中的至少一個在5』端加帽。14.製備α病毒複製子顆粒的方法，其包括將下列引入細胞中a)α病毒複製子RNA；b)一個或更多個權利要求1的RNA分子；和c)一個或更多個啟動子輔助的α病毒輔助構建體，由此(b)的RNA分子和(c)的輔助構建體的組合在由此產生α病毒複製子顆粒的條件下編碼產生α病毒複製子顆粒需要的所有α病毒結構蛋白。15.權利要求14的方法，其中將一個或更多個RNA分子中的至少一個在5』端加帽。16.α病毒複製子顆粒群，其包括含有權利要求1的RNA分子的顆粒子集，其中該群在每IO8個α病毒複製子顆粒中不含有可檢測的可複製α病毒病毒顆粒，如通過在培養物中的允許細胞上的傳代所測定的。17.α病毒複製子顆粒群，其包括含有權利要求1的RNA分子的顆粒子集，其中該群在每IO8個α病毒複製子顆粒中不含有可檢測的可複製α病毒病毒顆粒，如通過在培養物中的允許細胞上的傳代所測定的，其中α病毒複製子顆粒在α病毒結構蛋白或α病毒非結構蛋白或α病毒結構蛋白和α病毒非結構蛋白兩者中包含一個或更多個減毒突變。18.組合物，其在藥物學上可接受的載體中含有權利要求16或權利要求17的群。19.誘導對象中免疫應答的方法，其包括為對象給藥有效量的權利要求16或權利要求17的群。20.細胞，其含有權利要求1的RNA分子。21.載體，其含有權利要求1的RNA分子。22.核酸構建體，其含有權利要求1的RNA分子。23.細胞，其含有權利要求21的載體。24.細胞，其含有權利要求22的核酸構建體。全文摘要本發明提供了一種分離的RNA分子，其包括a)α病毒5』複製識別序列，其中從5』複製識別序列中去除了至少一個起始密碼子；b)編碼α病毒結構蛋白的核苷酸序列；和c)α病毒3』複製識別序列，條件是RNA分子不含有指導(b)的核苷酸序列轉錄的啟動子，並且其中(a)和(c)的α病毒5』和3』複製識別序列指導整個RNA分子在α病毒非結構蛋白的存在下複製。文檔編號C07K14/705GK101802199SQ200880103660公開日2010年8月11日申請日期2008年6月20日優先權日2007年6月21日發明者J·F·史密斯,K·I·卡姆魯德,M·莫漢申請人:阿爾法瓦克斯公司