純化發酵液的方法

2023-12-05 20:13:01 3

專利名稱：純化發酵液的方法
對相關申請的交叉引用本申請要求申請日為2000年2月2日的臨時申請流水號60/184522的優先權，該臨時申請的內容被收作本文參考。
抑制素藥物目前是用於降低具有發生心血管疾病危險的患者血液中LDL含量的、在治療上現有的最有效的藥物。這種類型的藥物特別包括康派汀、洛伐他汀、西伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀。業已從某些方面對抑制素藥物的作用機制進行了說明。它通過競爭抑制3-羥基-3-甲基戊二醯-輔酶A還原酶(HMG-CoA還原酶)在肝臟中破壞膽甾醇和其他甾醇的合成。HMG-CoA還原酶能催化HMG-CoA向甲羥戊酸轉化，這一過程是膽甾醇生物合成的速度限制步驟。因此，它的抑制作用會導致在肝臟中膽甾醇形成速度的降低。
康派汀是化合物2-甲基丁酸1，2，3，7，8，8a-六氫-7-甲基-8-[2-(四氫-4-羥基-6-氧-2H-吡喃-2-基)乙基]-1-萘酯的常用藥物名稱，它具有以下結構式 康派汀康派汀又被稱作美伐他汀，它是被證實是HMG-CoA還原酶抑制劑的第一種抑制素藥物。業已從桔青黴和阿達青黴中純化了康派汀(參見被收作本文參考的US3983140；US4049495和US5691173)。
洛伐他汀是化合物2-甲基丁酸1，2，3，7，8，8，a-六氫-3，7-二甲基-8[2-(四氫-4-羥基-6-氧-2H-吡喃-2基)-乙基]-1-萘酯的常用藥物名稱，它具有以下結構式 洛伐他汀洛伐他汀又被稱作美菲洛林，它與康派汀的不同僅僅在於存在甲基，並且可以從土麴黴中分離(參見被收作本文參考的US4294926；US4420491；US4319039和US4294896)。業已從若干種其他微生物中分離了洛伐他汀(參見英國專利GB2046737；德國專利4402591；加拿大專利2129416；和匈牙利專利HU208997)。
康派汀和洛伐他汀以及其他抑制素是作為開環羥酸存在的，並且具有下面所示的內酯形式 內酯 羥酸內酯和羥酸之間的平衡使得純化很困難，因為游離酸和內酯形式的抑制素化合物具有不同的極性。純化一種形式的方法可能除去另一種形式，因此降低了總的產量。因此，在純化抑制素化合物時，一般必須非常小心，以便以高產量分離它們。
美國專利5202029涉及一種利用HPLC純化內酯形式的抑制素化合物的方法。將粗製發酵液(例如，洛伐他汀、西伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀和美伐他汀)溶解在有機溶劑中，並通過HPLC柱洗脫。來自該柱的抑制素洗脫物作為溶質溶解在洗脫劑中。將洗脫劑部分蒸發，然後加入水以便誘導結晶。工業規模生產的主要缺陷是層析柱的成本太高。
美國專利5616595涉及一種通過切向過濾從發酵液中回收多種水不溶性化合物的連續工藝。該工藝可應用於內酯形式的洛伐他汀、普伐他汀和西伐他汀。該工藝包括讓發酵液循環通過一個能保留不溶性化合物的過濾器。將所述化合物溶解在溶劑中，並對溶液進行過濾。以濾液形式收集所需化合物的溶液，然後對需要的化合物作進一步的純化。因為該化合物不溶於水，該工藝需要加溶溶劑，並且需要多個過濾膜。反覆的過濾使得該工藝在進行大規模生產時成本很高。
US5712130披露了一種分離內酯形式的洛伐他汀的工藝。在該工藝中，用乙酸丁酯從發酵液中提取洛伐他汀。然後對所得到的溶液進行離心，並放棄水相。在高於40℃的條件下對有機相進行真空蒸餾，這一過程除了能濃縮該溶液之外，還能通過除去水而促進內酯的形成。在冷卻時形成了洛伐他汀內酯的結晶，並且再結晶至90％或更高的純度。不過，在作為藥物使用之前，結晶的洛伐他汀必須作進一步的純化，這樣會降低總產量，並增加該方法的額外成本。
本發明的目的和概述現有的從發酵液中分離抑制素的方法不能通過在工業化規模上經濟的方法達到可以藥用水平的程度，或者需要進行層析分離以便得到高純度。本發明的一個目的是滿足本領域對以藥理學上可以接受的純度水平(即，不低於98.5％)從發酵液中分離抑制素的簡單、快速、高產的方法的需要。
本發明的另一個目的是一種從發酵液中分離抑制素化合物的方法，其中，抑制素化合物包括一種能夠形成內酯和稠合雙環的羧酸，該方法包括以下步驟通過讓發酵液與提取溶劑接觸，從發酵液中提取抑制素化合物，並且將抑制素化合物從發酵液中提取到提取溶劑中，其中，所述提取溶劑是疏水性有機提取溶劑；從發酵液中分離所述疏水性有機提取溶劑；濃縮含有所述提取的抑制素化合物的疏水性有機提取溶劑的溶液；以及通過結晶純化所提取的抑制素化合物。
本發明的另一個目的是一種用於從發酵液中分離抑制素化合物的方法，其中，所述抑制素化合物包括一種能夠形成內酯和稠合雙環的羧酸，該方法包括以下步驟(a)在鹼性條件下對發酵液進行預處理，以便除去非極性雜質；(b)將發酵液中的抑制素化合物提取到疏水性有機提取溶劑中；(c)從發酵液中分離疏水性有機提取溶劑；(d)濃縮含有提取的抑制素化合物的疏水性有機提取溶劑的溶液；(e)用含有一種鹼的水溶液洗滌濃縮的疏水性有機提取溶劑的濃縮溶液，以便純化內酯；和(g)通過結晶純化提取的抑制素化合物。發明詳述本發明是一種用於從發酵液中獲得高純度的抑制素化合物結晶的方法，例如，純化康派汀和洛伐他汀。本領域普通技術人員可以理解的是，本發明的方法可用於純化由微生物或酶促方法生產的其他化合物，並且，這些化合物包括諸如西伐他汀、普伐他汀和氟伐他汀的內酯。本領域普通技術人員還可以理解的是，純化抑制素化合物的最佳條件，可能根據要分離的特定抑制素化合物、發酵液以及生產該化合物的微生物而有所不同。
本發明的一個優選實施方案包括以下步驟(i)在鹼性條件下對發酵液進行預處理，以便除去非極性雜質；(ii)在酸性條件下以羥酸或內酯形式將抑制素由發酵液提取到疏水性有機提取溶劑中；(iii)從發酵液中分離疏水性有機提取溶劑；(iv)濃縮含有提取的抑制素化合物的疏水性有機提取溶劑；(v)通過結晶純化提取的抑制素化合物。
在本發明的另一個實施方案中，省略了在鹼性條件下對發酵液進行預處理的步驟。
在另一個實施方案中，在結晶之前，用含有鹼的水溶液洗滌濃縮的疏水性有機溶劑，以便提高產量。優選的鹼性溶液含有氫氧化銨(pH大約為7.5-10)，或者大約1％-5％(w/w)的碳酸氫鈉或碳酸鈉。
在鹼性條件下對發酵液進行預處理髮酵液的預處理，包括在鹼性條件下處理髮酵液，然後提取到疏水性有機提取溶劑或溶劑混合物中。預處理步驟的鹼性條件能將抑制素的內酯水解成相應的抑制素羥酸(Andrew Streitweiser，Jr.和Clayton Heathcock，有機化學介紹，858-60，麥克米蘭出版公司，第2版，1981)。抑制素羥酸保留在水性發酵液中，而脂性和油性物質以及其他非極性有機雜質由發酵液分配到預處理疏水性有機提取溶劑或溶劑混合物中。因此，在鹼性條件下對發酵液進行預處理，通過將抑制素羥酸與雜質分離，能導致抑制素羥酸在整體上的純化。
除去非極性雜質能提高結晶的總產量，因為據信發酵液中非極性雜質的存在會降低結晶的總產量。因此，在鹼性條件下對發酵液進行預處理，能夠從發酵液中除去非極性雜質，因此能顯著提高結晶步驟的總產量。
在預處理步驟，將發酵液或發酵液和疏水性有機提取溶劑的混合物pH調整到鹼性pH。優選通過添加無機鹼或有機胺調整其pH。優選的無機鹼或有機胺包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鋰、氫氧化鈣、氫氧化銨和三乙胺。最優選的鹼是氫氧化鈉。PH大約為7.0-13.9。對於康派汀和洛伐他汀來說，優選將pH調整到大約8.5-10.0的範圍內。對於康派汀和洛伐他汀來說，pH最優選為大約9.0-9.6。
在鹼性條件下的預處理溫育，可以在大約15℃-大約100℃的溫度下進行。大約15-20℃的溫度會導致純化抑制素的總產量降低。
在大約80-100℃下，預處理溫育的優選條件是在pH大約12.0-13.9的條件下進行大約15分鐘。在大約55-65℃下，預處理溫育的優選條件是在pH大約9.0-9.6的條件下進行2小時。在大約15-25℃下，預處理溫育的優選條件是在pH大約9.0-9.6的條件下進行48小時。
預處理疏水性有機提取溶劑包括，但不限於乙酸異丁酯、乙酸正丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、甲酸乙酯、丁基甲基酮、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、二氯乙烷、甲苯、乙腈、甲酸甲酯、甲醇、乙醇、異丙醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、叔丁醇、戊醇和苄醇。
另外，預處理疏水性有機提取溶劑可以包括上述任何溶劑的混合物。用於鹼性提取的有機溶劑包括，但不限於乙酸異丁酯、乙酸正丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、甲酸乙酯、丁基甲基酮、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、二氯乙烷、甲苯和苄醇。優選的預處理疏水性有機提取溶劑是乙酸異丁酯、乙酸乙酯和甲苯。最優選的疏水性有機提取溶劑是乙酸異丁酯。因為溶劑再生，醇類可以使用，但不是優選的。不過，在鹼性pH條件下，對於乙酸酯來說存在醇類。在鹼性條件下醇有助於打開內酯環。預處理還可以在沒有提取溶劑的條件下進行。
在該優選實施方案中，在預處理之後，在鹼性條件下讓疏水性有機提取溶劑與發酵液接觸，直到脂性和油性物質以及其他非極性有機雜質業已從發酵液中基本上除淨。可以用薄層層析或包括主觀判斷在內的任何其他方法評估非極性雜質從發酵液中清除掉的情況。為了使除去雜質的效果最佳，可以進行多次提取。不過，在用乙酸異丁酯進行鹼性提取時，1-2次提取是非常有效的。在進行鹼性提取時，溶劑的體積優選為發酵液體積的大約20％-大約50％(v/v)。
在酸性條件下提取發酵液之前調節pH在將抑制素化合物提取到疏水性有機提取溶劑中之前，優選用強酸將純化的發酵液的pH調整到大約1.0-6.4。洛伐他汀和康派汀的優選pH範圍為大約2.0-4.5。普伐他汀的優選pH範圍為大約4.5-6.0。用於pH調節的優選的酸是硫酸和磷酸。另外，抑制素化合物的提取可以通過將疏水性提取溶劑的pH調整到大約1.0-6.4的範圍內進行。
在酸性條件下以羥酸或內酯形式提取抑制素化合物在酸性條件下讓疏水性有機提取溶劑與純化的發酵液接觸，直到發酵液中的羥酸和內酯已經基本被除淨。可以用薄層層析或包括主觀判斷在內的任何其他方法評估內酯被回收到疏水性有機提取溶劑中的情況。為了獲得最佳的回收效果可以進行多次提取。不過，在疏水性有機提取溶劑是乙酸異丁酯，並且pH處在上述最佳範圍的情況下，進行2-3次提取是非常有效的。進行提取的優選條件是，發酵液的體積大約為有機提取溶劑體積的2倍。
用於提取康派汀的最優選的疏水有機提取溶劑是乙酸異丁酯。其他合適的疏水性有機提取溶劑包括，但不限於乙酸正丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、甲酸乙酯、丁基甲基酮、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、二氯乙烷和甲苯。優選的提取溶劑是乙酸異丁酯、乙酸正丁酯、乙酸乙酯和丁基甲基酮。在酸性提取條件下，不使用溶劑混合物。
發酵液和疏水性有機提取溶劑的相分離可以通過本領域眾所周知的方法分離發酵液和疏水性有機提取溶劑。分離的優選方法包括逆流提取。潷析器是用於完成這種方法的已知設備。在相分離之後，通過用水洗滌可以提高溶劑的純度。
濃縮疏水性有機提取溶劑在相分離之後，減少疏水性有機提取溶劑的體積。體積的減少可以通過在大約30-90℃的溫度下，在減壓條件下，通過蒸發而實現。蒸發優選是在大約40-70℃的溫度下，在減壓條件下進行的。另外，疏水性溶劑的蒸發是在較高的溫度下(低於大約90℃)，在減壓條件下或在大氣壓力下進行的。
通過結晶純化提取的抑制素化合物對疏水性有機提取溶劑進行蒸發，直到要結晶的抑制素化合物的濃度為50-250克/升。洛伐他汀最好是在80-100克/升的濃度下結晶；康派汀最好是在130-170克/升的濃度下結晶；而普伐他汀最好是在80-120克/升的濃度下結晶。
結晶可以在環境溫度下進行一夜。優選的溫度範圍是-10℃至大約5℃。結晶最優選是在大約-10℃下進行大約20小時。
結晶可以在下面的任意一種溶劑或下面這些溶劑的組合中進行乙醇、異丙醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、叔丁醇、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙腈、甲酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸正丁酯、甲苯、乙酸丙酯、和丁基甲基酮。優選的溶劑包括甲苯、異丙醇、乙酸異丁酯或乙醇-水的混合物。最優選的溶劑是乙酸異丁酯和乙醇-水的混合物。
用所述優選實施方案的方法獲得的結晶所含的雜質低於3.6％(w/w)，並且能以75％(w/w)以上的產量獲得。為了通過從水乙醇中再結晶實現抑制素的純化，水和乙醇的優選比例為大約0.8-大約2.0。水與乙醇的最優選的比例是0.9-1.2。用所述優選實施方案所獲得的結晶的純度至少為98.5％(w/w)。
在下面的實施例中將對本發明作進一步說明。除非另有說明，所有產量都是以％(w/w)形式表示的，並且表示總產量或所有步驟的產量。不過，本發明並不局限於這些實施例。本領域技術人員可以理解如何改變所列舉的製劑，以便獲得所需要的結果。
用硫酸將純化的發酵液酸化至pH為大約2.0-4.5。然後連續添加乙酸異丁酯(35立方米)，並且在原位混合之後，連續分離含有康派汀的乙酸異丁酯相。
在真空條件下濃縮乙酸異丁酯相，使體積大約為2150升。將濃縮的溶液在0-5℃下靜置一夜，在此期間，康派汀以78％(w/w)的產量和93％(w/w)的純度結晶。然後將粗製康派汀以75％(w/w)的產量和99.0％(w/w)的純度從1.2∶0.9的乙醇水混合物中再結晶出來。
例2在沒有在鹼性條件下進行發酵液的預純化步驟的情況下分離康派汀按例1所述方法製備含有康派汀的發酵液。用硫酸將發酵液(50升)酸化到pH大約為2.0-4.5。然後添加乙酸異丁酯(25升)和水(25升)，在混合大約0.5小時之後，分離含有康派汀的乙酸異丁酯相。用純的乙酸異丁酯(25升)重複提取。在真空條件下將合併的乙酸異丁酯相濃縮到體積大約為1.5升。將濃縮後的溶液在0-5℃下靜置一夜，在此期間，康派汀以33％(w/w)的產量和94.5％(w/w)的純度結晶。在例1中是使用鹼進行提取，與此不同的是，例2是使用沒有鹼提取的方法。
例3分離康派汀在濃縮乙酸異丁酯的鹼性條件下預處理髮酵液，並用碳酸氫鈉洗滌按例1所述方法製備發酵液。將乙酸異丁酯(25升)和水(25升)添加到水性發酵液(50升)中。通過添加濃氫氧化鈉將pH調整到大約9.0-9.6。然後將該混合物加熱到大約60℃，並保持該溫度大約2小時。然後分離各相。添加十二烷基三甲基氯化銨以便幫助在分離期間對混合物進行脫乳化。用硫酸將純化的發酵液酸化到pH大約為2.0-4.5。然後添加乙酸異丁酯(25升)，並在混合之後大約0.5小時，分離含有康派汀的乙酸異丁酯相。用純的乙酸異丁酯(25升)重複酸性提取。
在真空條件下將合併後的乙酸異丁酯濃縮到體積大約為1.5升。將濃縮溶液稀釋到體積大約為8升，並且用飽和碳酸氫鈉洗滌。將洗滌後的溶液再次濃縮到1.5升，並將其在0-5℃靜置一夜，在此期間，康派汀以67.5％(w/w)的產量和98.9％(w/w)的純度結晶。
在不進行初步鹼提取的條件下，只能以39％(w/w)的產量和99.1％(w/w)的純度獲得康派汀。
例4分離康派汀在鹼性條件下對發酵液進行預處理期間降低溫度的影響按例1所述方法製備發酵液。將乙酸異丁酯(25升)和水(25升)添加到水性發酵液(50升)中。通過添加濃氫氧化鈉將pH調整到大約9.0-9.6。將該混合物在大約15-20℃的溫度下保持大約2小時，然後分離各相。然後添加十二烷基三甲基氯化銨，以便在分離期間幫助對該混合物進行脫乳化。然後用硫酸將純化的發酵液酸化到pH大約為2.0-4.5。然後添加乙酸異丁酯(25升)，並在混合之後大約0.5小時，分離含有康派汀的乙酸異丁酯相。用純的乙酸異丁酯(25升)重複提取。在真空條件下將合併後的乙酸異丁酯濃縮到體積大約為1.5升。將濃縮後的溶液在0-5℃下靜置一夜，在此期間，康派汀結晶。然後從1.2∶0.9的乙醇水混合物中再結晶粗製的康派汀。總產量為67％(w/w)，純度為99.1％(w/w)。
例5分離康派汀在酸性提取時1.0-2.0的酸性pH和在結晶期間降低溫度的作用按例1所述方法製備發酵液。將乙酸異丁酯(25升)和水(25升)添加到水性發酵液(50升)中。通過添加濃氫氧化鈉將pH調整到大約9.0-9.6。將該混合物在大約60℃的溫度下保持大約2小時。然後分離各相。然後添加十二烷基三甲基氯化銨，以便在分離期間幫助對該混合物進行脫乳化。然後用硫酸將純化的發酵液酸化到pH大約為1.0-2.0。然後添加乙酸異丁酯(25升)，並在混合之後大約0.5小時，分離含有康派汀的乙酸異丁酯相。用純的乙酸異丁酯(25升)重複提取。
在真空條件下濃縮合併後的乙酸異丁酯相，直到康派汀的濃度大約為150克/升。將濃縮後的溶液在大約-10℃下保持大約20小時。過濾結晶並用乙酸異丁酯洗滌。然後從1.2∶0.9的乙醇水混合物中再結晶粗製的康派汀。康派汀是以67％的產量(w/w)和98.8％(w/w)的純度獲得的。酸性提取(pH為1.0-2.0)會降低產量。
當在大約15℃下進行具有在鹼性條件下對發酵液進行預處理的步驟的本實施例的方法時，康派汀的總產量降低到60％(w/w)，並且純度為98.7％(w/w)。
例6分離洛伐他汀用本領域熟知的方法製備含有洛伐他汀的發酵液(參見US5403728；44204914342767；4319039和4294846)。將乙酸異丁酯(25升)和水(25升)添加到水性發酵液(50升)中。通過添加濃氫氧化鈉將pH調整到大約9.0-9.6。將該混合物加熱到大約60±5℃的溫度，並且在該溫度下保持大約2小時。然後分離各相。然後添加十二烷基三甲基氯化銨，以便在分離期間幫助對該混合物進行脫乳化。
用硫酸將純化的發酵液酸化到pH大約為2.0-4.5。然後添加乙酸異丁酯(25升)，並在混合之後大約2小時，分離含有洛伐他汀的乙酸異丁酯相。用純的乙酸異丁酯(25升)重複提取。
在真空條件下濃縮合併後的乙酸異丁酯相，直到體積大約為2.7升。將濃縮後的溶液在大約-10℃下靜置大約36小時，在此期間，洛伐他汀以76％的產量(w/w)和96.4％(w/w)的純度結晶。然後從1.2∶0.9的乙醇水混合物中再結晶粗製的洛伐他汀，洛伐他汀是以71.4％的產量(w/w)和98.7％(w/w)的純度獲得的。
例7在沒有在鹼性條件下預純化發酵液的條件下分離洛伐他汀按例6所述方法製備發酵液。用硫酸將純化的發酵液(50升)酸化到pH大約為2.0-4.5。然後添加乙酸異丁酯(25升)和水(25升)，並在混合之後大約2小時，分離含有康派汀的乙酸異丁酯相。用純的乙酸異丁酯(25升)重複提取。在真空條件下濃縮合併後的乙酸異丁酯相，直到體積大約為2.7升。將濃縮後的溶液在大約-10℃下靜置大約36小時，在此期間，洛伐他汀以26％的產量(w/w)和88.0％(w/w)的純度結晶。
例8分離洛伐他汀用碳酸氫鈉進行洗滌按例6所述方法製備發酵液。將乙酸異丁酯(25升)和水(25升)添加到水性發酵液(50升)中。通過添加濃氫氧化鈉將pH調整到大約9.0-9.6。將該混合物加熱到大約60℃的溫度，並且在該溫度下保持大約2小時。然後分離各相。然後添加十二烷基三甲基氯化銨，以便在分離期間幫助對該混合物進行脫乳化。用硫酸將純化的發酵液酸化到pH大約為2.0-4.5。然後添加乙酸異丁酯(25升)，並在混合之後大約2小時，分離含有康派汀的乙酸異丁酯相。用純的乙酸異丁酯(25升)重複提取。
在真空條件下濃縮乙酸異丁酯相，直到體積大約為2.7升。將濃縮溶液稀釋到體積大約為11升，並且用飽和碳酸氫鈉洗滌。將洗滌後的溶液再次濃縮到2.7升，將濃縮後的溶液在大約-10℃下靜置大約36小時，在此期間，以73.4％的產量(w/w)和98.8％(w/w)的純度獲得了洛伐他汀。
權利要求
1.一種用於從發酵液中分離抑制素化合物的方法，其中，所述抑制素化合物包括一種能夠形成內酯和稠合雙環的羧酸，該方法包括以下步驟(a)在鹼性條件下對發酵液進行預處理，以便除去非極性雜質；(b)通過讓發酵液與提取溶劑接觸，從發酵液中提取抑制素化合物，並且將抑制素化合物從發酵液中提取到提取溶劑中，其中，所述提取溶劑是疏水性有機提取溶劑；(c)從發酵液中分離疏水性有機提取溶劑；(d)濃縮含有提取的抑制素化合物的疏水性有機提取溶劑的溶液；和(e)通過結晶純化提取的抑制素化合物。
2.如權利要求1的方法，其中，所述抑制素化合物是HMG-CoA還原酶的抑制劑。
3.如權利要求1的方法，其中，所述抑制素化合物選自由洛伐他汀、康派汀、和普伐他汀構成的一組。
4.如權利要求1的方法，還包括在鹼性條件下對含有抑制素化合物的發酵液進行預處理的步驟。
5.如權利要求4的方法，其中，在對發酵液進行預處理的步驟中，將發酵液保持在(a)大約15-100℃的溫度下；(b)pH大約為7.0-13.9；和(c)時間為0-大約48小時。
6.如權利要求4的方法，其中，在對發酵液進行預處理的步驟中，將發酵液保持在(a)大約55-65℃的溫度下；(b)pH大約為9.0-9.6；和(c)時間為大約2小時。
7.如權利要求4的方法，還包括用選自下列一組的無機鹼調整發酵液的pH的步驟氫氧化銨、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鋰和氫氧化鈣。
8.如權利要求1的方法，其中，所述提取步驟包括讓發酵液與疏水性有機提取溶劑接觸。
9.如權利要求4的方法，其中，所述預處理疏水性有機提取溶劑選自下列一組乙酸異丁酯、乙酸正丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、甲酸乙酯、丁基甲基酮、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、二氯乙烷、甲苯、乙腈、甲酸甲酯、甲醇、乙醇、異丙醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、叔丁醇、戊醇和苄醇，及其混合物。
10.如權利要求8的方法，其中，所述疏水性有機提取溶劑是乙酸異丁酯、乙酸正丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、甲酸乙酯、丁基甲基酮、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、二氯乙烷或甲苯。
11.如權利要求1的方法，其中，所述從發酵液中提取抑制素化合物的步驟還包括將發酵液的pH調整到大約1.0-6.4。
12.如權利要求11的方法，其中，將發酵液的pH調整到大約2.0-4.5。
13.如權利要求11的方法，其中，發酵液的pH是用選自硫酸和磷酸的酸調整的。
14.如權利要求1的方法，其中，所述從發酵液中提取抑制素化合物的步驟還包括將步驟(b)的疏水性有機提取溶劑的pH調整到大約1.0-6.4。
15.如權利要求1的方法，其中，步驟(b)的疏水性有機提取溶劑選自下列一組乙酸異丁酯、乙酸正丁酯、乙酸叔丁酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、甲酸乙酯、丁基甲基酮、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、二氯乙烷和甲苯。
16.如權利要求1的方法，其中，在步驟(b)之後，讓疏水性有機提取溶劑與含有鹼的水溶液接觸。
17.如權利要求16的方法，其中，所述鹼選自下列一組氫氧化銨、碳酸氫鈉和碳酸鈉。
18.如權利要求1的方法，其中，所述疏水性有機提取溶劑是乙酸異丁酯而所述抑制素化合物是康派汀。
19.如權利要求1的方法，其中，所述濃縮含有提取的抑制素化合物的疏水性有機提取溶劑溶液的步驟是在減壓條件下進行的。
20.如權利要求1的方法，其中，所述濃縮含有提取的抑制素化合物的疏水性有機提取溶劑溶液的步驟是在低於大約90℃的溫度條件下蒸發完成的。
21.如權利要求1的方法，其中，所述結晶步驟是在大約-10℃-大約20℃的溫度下進行的。
22.如權利要求21的方法，其中，所述結晶步驟是在大約0℃-大約5℃的溫度下進行的。
23.如權利要求21的方法，其中，所述結晶步驟是在大約-10℃-大約0℃的溫度下進行的。
24.如權利要求1的方法，其中，所述通過結晶純化提取的抑制素化合物的步驟是用選自下列一組的溶劑進行的乙醇、異丙醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、叔丁醇、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙腈、甲酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸正丁酯、乙酸叔丁酯、甲苯、乙酸丙酯、丁基甲基酮，及其混合物。
25.一種用於從發酵液中分離抑制素化合物的方法，其中，所述抑制素化合物包括一種能夠形成內酯和稠合雙環的羧酸，該方法包括以下步驟(a)在鹼性條件下對發酵液進行預處理，以便除去非極性雜質；(b)通過讓發酵液與疏水性有機提取溶劑接觸，從發酵液中提取抑制素化合物，並且將抑制素化合物從發酵液中提取到疏水性溶劑中；(c)從發酵液中分離疏水性溶劑；(d)濃縮含有提取的抑制素化合物的疏水性溶劑的溶液；(e)用含有鹼的水溶液洗滌濃縮的疏水性溶劑的溶液；和(f)通過結晶純化提取的抑制素化合物。
26.如權利要求25的方法，其中，所述鹼性水溶液包括氫氧化銨、碳酸氫鈉和碳酸鈉。
27.如權利要求25的方法，其中，所述抑制素化合物是HMG-CoA還原酶的抑制劑。
全文摘要
披露了通過提取和結晶從發酵液中純化抑制素化合物的方法。用預處理方法對發酵液進行處理，該方法包括鹼性預處理和鹼性純化。在預處理過程之後，在酸性條件下將抑制素化合物提取到疏水性溶劑中，並且，通過結晶進行純化。濃縮所述有機提取溶劑，然後用溫和的鹼進行提取。然後，通過結晶純化所述抑制素化合物。
文檔編號C07D309/30GK1406283SQ01805551
公開日2003年3月26日 申請日期2001年1月25日 優先權日2000年2月24日
發明者V·克裡, L·德克, I·福爾加克斯 申請人:拜奧蓋爾藥廠有限公司