分型診斷四種感染人瘧原蟲的探針、試劑盒及其使用方法
2023-12-09 06:29:01
分型診斷四種感染人瘧原蟲的探針、試劑盒及其使用方法
【專利摘要】本發明公開了一種用於診斷四種感染人瘧原蟲的探針、試劑盒及其使用方法。其中，惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲分別採用對應的種特異性探針，探針5』端均加有10個T尾，紫外交聯固定於尼龍雜交膜。所述試劑盒由PCR和反向斑點雜交反應試劑及材料構成，可在室溫下進行惡性瘧原蟲、問日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲或者其中的兩種或者三種或者四種瘧原蟲的分型診斷，提供了一種簡便、快速的瘧原蟲分型診斷技術。
【專利說明】分型診斷四種感染人瘧原蟲的探針、試劑盒及其使用方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種用於瘧原蟲分型診斷的探針、試劑盒及其使用方法，尤其涉及一 種用於診斷惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲的探針及其試劑盒和使用方 法，屬於瘧原蟲檢測領域。
【背景技術】
[0002] 瘧原蟲是原生動物門、孢子蟲綱（Sporozoa)，球蟲目（Cocciidea)，血孢子蟲亞目 (Haemosporidiidea)，原蟲科（Plasmadiidea)中的一個屬，即痕原蟲屬（plasmodiam)的總 稱。寄生於人體者包括惡性皰原蟲（Plasmodium falciparum)、間日皰原蟲（Plasmodium vivax)、卵形痕原蟲（Plasmodium ovals)、三日痕原蟲（Plasmodium malariae)四種。我 國以間日瘧分布最廣，除青藏高原外，遍及全國。惡性瘧次之，分布於秦嶺一淮河以南，以雲 貴、兩廣與海南為最。三日瘧在長江南北各省均有散在病例。卵形瘧只在雲南和廣東有少 數病例報告。
[0003] 瘧疾是對人類健康危害最嚴重的傳染病之一，我國自2000年以來瘧疾疫情出現 回升，其中雲南、海南兩省較為嚴重，許多省受到輸入性惡性瘧的威脅，尤其是境外輸入性 惡性瘧的威脅。隨著經濟全球化和國際交往的增多，近年來勞務輸出人數逐年增加，輸入性 瘧疾病例逐年增多，呈逐年上升趨勢。輸入性病例大多源於非洲、緬甸等惡性瘧高發區勞務 輸出的歸國人員，2008年我國瘧疾死亡病例全部為境外勞務回國人員，2009年有21個省 (市、區）有輸入性惡性瘧病例報告，且瘧疾死亡也全部為輸入病例。2010年報告輸入性惡 性瘧1161例，佔惡性瘧報告病例數的92. 3%，較2009年（897例）上升29. 4%。2012年全 國31個省（市、區）有報告瘧疾病例，與2011年相比，本地感染瘧疾病例明顯下降，輸入性 瘧疾病例比例明顯上升，尤其是境外輸入性瘧疾病例比例從2011年的66. 4 % (2974/4479) 上升到2012年的91.0% (2474/2718)，其中以惡性瘧為主。因此，關注瘧疾疫情，特別是境 外輸入性惡性瘧疫情十分重要。
[0004] 目前，瘧疾診斷方法主要分3類：一是以傳統的鏡檢法為基礎的病原學診斷，通過 增加血樣中的原蟲數目、改進染色方法或兩者結合來提高檢測效率，如螢光染色技術等；二 是上世紀70年代發展起來的免疫學診斷方法，如間接螢光抗體法、酶聯免疫吸附法等，其 中免疫層析技術因其快速、簡便等特點已成為瘧疾診斷的研宄熱點；三是上世紀80年代興 起的分子生物學診斷方法，通過檢測瘧原蟲種、株特異性的基因片段來確定瘧原蟲感染，如 基因探針和PCR技術等。PCR技術因其高度的敏感性、特異性以及對蟲種、蟲株的鑑別力 在瘧疾診斷中發揮越來越重要的作用，套式PCR等方法可進一步提高診斷的敏感性和準確 性。但PCR方法仍費力耗時，需要多次試驗確定混合感染。如何在一次反應中檢測多個蟲 種、蟲株、甚至基因型成為近年來研宄的熱點。
[0005] 反向斑點雜交（reverse dot blot，RDB)是1989年由Saiki等提出的一種斑點 雜交技術，並將其應用於血液病和Beta地中海貧血的檢測，該方法操作簡便，在膜上添加 針對不同亞型或突變的探針，可以在一張膜上同時檢測多個樣品，有利於降低成本，節省時 間。RDB只需要相對較短的寡核苷酸探針就能提供明顯的雜交信號，通過調整雜交條件可以 鑑別出模板中一個鹼基的差異。該技術較正向斑點雜交和凝膠電泳轉印雜交具有快速、簡 便、敏感性高、特異性強的特點，尤其是在基因分型、基因突變檢測、病原體的檢測等方面有 其獨特的優勢。
【發明內容】
[0006] 本發明的主要目的是提供一套用於分型診斷瘧原蟲的探針，可用於惡性瘧原蟲、 間曰瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲或者其中的兩種或者三種或者四種瘧原蟲的聚合酶 鏈反應-反向斑點雜交分型診斷。
[0007] 所述探針針對各瘧原蟲的種特異性片段設計，探針5'端均加有10個T尾，其核苷 酸序列為：
[0008]
【權利要求】
1. 一套用於分型診斷四種感染人瘧原蟲的探針，其特徵在於，所述探針系針對惡性瘧 原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲和三日瘧原蟲的種特異性片段設計，探針5'端均加有10個 T尾，其核苷酸序列為：
所述探針可用於惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲或者其中的兩種或 者三種或者四種瘧原蟲的聚合酶鏈式反應-反向斑點雜交分型診斷。
2. -種用於分型診斷四種感染人瘧原蟲的試劑盒，其特徵在於，包括聚合酶鏈式反 應通用引物溶液（PM)和聚合酶鏈式反應預混合液（RM)，固定有各型瘧原蟲探針的尼龍雜 交膜（chip)，室溫雜交液（Hyb)，洗液I(Wl)，洗液II(W2)，鏈黴親和素標記的鹼性磷酸酶 (AP)，鹼性磷酸酶緩衝液（Bufferl)，顯色緩衝液（Buffer2)，顯色底物（NBT/BCIP)，其特徵 在於，所述試劑盒可以在室溫條件下進行惡性瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、間日瘧原 蟲或者其中的兩種或者三種或者四種瘧原蟲的分型診斷； 所述的聚合酶鏈式反應通用引物溶液（PM)，其特徵在於，引物5'端均以 生物素標記，上遊引物（5' -3' ：GAGGGCAAGTCTGGTGCCAG)與下遊引物（5' -3' ： CATCTGAATACGAATGTCCCCAAGC)按照I: 1的比例配製而成的，引物濃度為10mol/L;所述 的固定有各蟲種瘧原蟲探針的尼龍雜交膜（chip)，其特徵在於，固定有如權利要求1所述 的四種分型診斷感染人瘧原蟲探針（SEQNo. 1、SEQNo. 2、SEQNo. 3、SEQNo. 4)中至少一 種探針，各型皰原蟲探針的點樣濃度為25-100μmol/L，優選濃度為50μmol/L，點樣量為 0. 3~0, 5uL0
3. -種如權利要求2所述的用於分型診斷四種感染人瘧原蟲的試劑盒的使用方法，其 特徵在於，包括聚合酶鏈式反應擴增和室溫反向斑點雜交兩個主要步驟，反向斑點雜交可 在室溫下完成； 所述的聚合酶鏈式反應擴增，其特徵在於，其50μL的反應體系包括：聚合酶鏈式反應 預混合液（RM) 25μL，DEPC水22μL，引物混合液（PM) 2μL，DNA模板1μL，陰性對照中以 DEPC水代替DNA模板；擴增程序為：94°C，3min;94°C，30s，53°C，30s，72°C，30s，共30個循 環；最後在72°C下5min延伸； 所述的室溫反向斑點雜交方法，其特徵在於，使用如權利要求2所述的室溫雜交液 (Hyb)進行雜交，具體步驟為： (1) 將固定有分型診斷四種感染人瘧原蟲探針的尼龍雜交膜置於雜交袋或雜交管內， 加入300μL雜交液； (2) 帶有生物素標記的擴增產物於95°C變性5min，迅速冰浴2min; (3) 向雜交液中加入30μL變性擴增產物，室溫雜交3hr; (4) 棄去雜交液，用洗液I、洗液II各洗滌2次，每次5min; (5) 棄去洗液，加入1000倍稀釋的鹼性磷酸酶標記的鏈黴親和素，於室溫反應30min; (6) 棄去酶液，用底物緩衝液洗滌2次，每次5min; (7) 棄去底物緩衝液，加入新配製的底物，避光反應5-15min; (8) 將底物棄去，用去離子水終止反應，待膜乾燥後判定結果，出現明顯藍紫色斑點的 判定為陽性結果，無斑點的判定為陰性結果。
4.如權利要求1所述的探針、如權利要求2所述的試劑盒和如權利要求3所述的用於 瘧原蟲診斷的聚合酶鏈式反應-反向斑點雜交分型診斷方法包括但不限定於採用微全分 析技術；其特徵在於，待測試樣浸提液的細胞裂解、核酸提取純化、核酸擴增和檢測均集成 在微全分析系統上自動完成，該微全分析系統由微膜片泵（閥）驅動，通過程序控制微膜片 泵（閥）的開啟與閉合實現微流體樣品的驅動控制。
【文檔編號】C12Q1/68GK104450903SQ201410717439
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月1日 優先權日:2014年12月1日
【發明者】鄒明強, 薛強, 殷宏, 王飛, 劉翌, 馬吉湘 申請人:中檢國研(北京)科技有限公司