血小板衍生生長因子c、其編碼dna及其應用的製作方法

2023-12-09 01:13:31

專利名稱：血小板衍生生長因子c、其編碼dna及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及結締組織細胞、成纖維細胞、肌成纖維細胞和神經膠原細胞的生長因子和/或內皮細胞的生長因子，尤其涉及新的血小板衍生生長因子/血管內皮生長因子樣生長因子，編碼這種因子的多核苷酸序列，以及利用或衍生自這種因子的藥物和診斷組合物和方法。
背景技術：
在發育的胚胎中，初生血管網的形成是通過中胚層細胞原位分化實現的，這個過程稱為血管發生。隨後的所有涉及胚胎中新生血管的產生或者成體中新血管的生成的過程，都由已形成的脈管系統中的毛細血管的出芽或者分裂過程決定，這個過程稱為血管生成(Pepper et al.，Enzyme Protein，1996 49 138-162；Breier et al.，Dev.Dyn.1995 204 228-239；Risau，Nature，1997 386 671-674)。血管生成過程不僅與胚胎發育和正常組織的生長、修復和再生相關，而且涉及雌性生物的生殖周期、妊娠的形成和保持和外傷與骨折的恢復過程。血管生成不僅在正常個體中發生，還與大量的病理過程相關，尤其與腫瘤的生長和轉移相關，還與其它一些與血管增殖，尤其是微血管系統增殖的病理過程相關，例如糖尿病引發的視網膜病、牛皮癬和關節炎。那麼，抑制血管生成就有助於預防疾病的發生或者減輕疾病的症狀。
另一方面，在一些需要進行血管化或者需要促進血管化的場合，例如在組織或者器官移植後，或者常見於冠心病、閉塞性血管炎中需要在創傷組織或者狹窄的動脈旁建立分支時，促進血管的生成過程又是希望進行的。
血管生成過程高度複雜，包括維持內皮細胞處於細胞周期，降解細胞外的基質，遷入並插入周圍的組織，最後形成管道。血管生成過程複雜的分子機制還遠遠超出人們現在對它的認識。
由於血管生成在許多生理和病理過程中的重要作用，人們已經對與控制血管生成相關的因子進行了細緻的研究。許多生長因子被證明可以調控血管生成過程。這些生長因子包括成纖維細胞生長因子(FGFs)、血小板衍生生長因子(PDGF)、轉移生長因子α(TGFα)和肝細胞生長因子(HGF)。見Folkman et al.，J.Biol.Chem.，1992267 10931-10934(review)。
有人認為，內皮細胞特異性的生長因子家族中的特殊的一類，即血管內皮生長因子(VEGFs)，VEGFs以及它們所對應的受體與刺激內皮細胞的生長和分化，從而分化成為具有特定功能細胞的過程直接相關。這些因子都屬於PDGF家族，並且主要都是通過內皮受體酪氨酸激酶(RTKs)實現功能。
PDGF家族中的九種不同的蛋白質已經被確定，分別命名為PDGF-A、PDGF-B、VEGF，剩餘的六個蛋白質和VEGF十分相近，分別是VEGF-B，可見國際專利PCT/US96/02957(WO 96/26736)和美國專利5,840,693和5,607,918(Ludwig癌症研究院和Helsinki大學)；VEGF-C，可見Joukov et al.，EMBO J.，1996 15 290-298和Lee etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996 93 1988-1992；VEGF-D，可見國際專利PCT/US97/14696(WO 98/07832)和Achen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998 95 548-553；胎盤生長因子(P1GF)，可見Maglione et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1991 88 9267-9271；VEGF2，可見可見國際專利PCT/US94/05291(WO 95/24473)(HumanGenome Sciences，Inc.)和VEGF3，可見可見國際專利PCT/US95/07283(WO 96/39421)(Human Genome Sciences，Inc.)。VEGF家族中的成員與VEGF相比較，胺基酸序列都有30％-45％是相同的。VEGF家族的成員都含有一個VEGF的同源結構域，由六個半胱氨酸殘基構成的半胱氨酸結。VEGF家族的功能包括改變內皮細胞有絲分裂的程度、引起血管滲透性、血管生成和淋巴管性質的變化。
血管內皮生長因子(VEGF)是同源二聚糖蛋白，可以從多種來源中分離。VEGF可以高度特異的使內皮細胞產生有絲分裂活動。在胚胎血管發生過程中形成新的血管或者在成體的血管生成過程中，VEGF都起著非常重要的調控作用(Carmeliet et al.，Nature，1996380 435-439；Ferrara et al.，Nature 1996 380 439-442；Freeara，Davis-Smyth，Endocrine Rev.，1997 18 4-25)。如果使一個VEGF的等位基因失活，胚胎就會因為脈管系統無法發育而致死，可見VEGF所執行功能的重要性(Carmeliet et al.，Nature，1996 380 435-439；Ferrara etal.，Nature 1996 380 439-442)。此外，VEGF對單核細胞還具有很強的化學誘導作用，可以誘導內皮細胞中產生血纖維蛋白溶酶原激活劑和血纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑，還可以促使微血管產生通透性。由於可以促使微血管產生通透性，所以常常也被稱為血管滲透因子(VPF)。VEGF的分離方法和性質可以參見Ferrara et al.，J.Cellular Biochem.，1991 47 211.218和Connolly et al.，J.CellularBiochem..1991 47 219-223。VEGF基因在mRNA水平上的截短產生了五種VEGF的異構體。
VEGF-B和VEGF相比，具有相似的血管生成和其它性質，但是表達VEGF-B的組織和表達VEGF的不同。VEGF-B在心臟中大量表達，而在肺中很少，而VEGF恰恰相反。這表明，雖然VEGF-B和VEGF在許多組織中都同時被表達，但是可能行使的功能有差異。
VEGF-B是通過酵母共雜交相互作用捕獲篩選技術進行分離的。篩選可以和I型細胞樹脂狀酸性結合蛋白(CRABP-I)發生相互作用的細胞蛋白。具體的分離過程及其性質可見專利PCT/US96/02957和Olofsson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996 932576-2581。
VEGF-C是從培養PC-3前列腺癌細胞系(CRL1435)的培養基中，根據是否可以對內皮細胞上特異的受體酪氨酸激酶VEGFR-3(Flt4)進行酪氨酸磷酸化這一現象進行篩選得到的。其中，VEGFR-3由轉染的細胞系表達。再利用連有重組VEGFR-3的親和層析柱對VEGF-C進行純化，再將其從PC-3 cDNA文庫中克隆出來。具體的分離過程和它的有關性質可見Joukov et al.，EMBO J.，1996 15 290-298。
VEGF-D可以從人類乳腺cDNA文庫中分離得到，這個文庫可以從Clontech直接購買。以人cDNA文庫中的「Soares Breast3NbHBst」(Achen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998 95 548-553)這一EST作為雜交探針進行篩選。具體的分離過程和它的有關性質可見國際專利PCT/US97/14696(WO98/07832)。
VEGF-D基因在成人體內廣泛表達，但當然也不是到處都表達。VEGF-D在心臟、肺和骨骼肌中大量表達。VEGF-D的中間體在脾、卵巢、小腸和結腸也有表達，在腎臟、胰腺、胸腺、前列腺和睪丸中的表達程度降低。而在腦、胎盤、肝或者外周白細胞中檢測不到VEGF-D的mRNA。
PlGF可以從足月的胎盤cDNA文庫中分離得到。具體的分離過程和它的有關性質可見Maglione et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1991 88 9267-9271。其具體的生物學功能目前尚不清楚。
VEGF 2可以從不依賴雌激素的人類乳腺癌細胞系中分離得到。VEGF 2和PDGF具有22％的同源性，與VEGF具有30％的同源性。現在還沒有方法可以分離編碼VEGF2的基因，也沒有VEGF 2生物學活性的有關數據。
VEGF 3可以從來源於結腸組織的cDNA文庫中分離得到。VEGF3與VEGF相比，有36％的部分是相同的，66％的部分是相似的。現在還沒有方法可以分離編碼VEGF3的基因，也沒有VEGF 3生物學活性的有關數據。
兩個蛋白的相似程度是通過比較胺基酸序列和兩個蛋白質之間保守胺基酸的變化決定的，而比較兩個蛋白質的相同程度只是比較胺基酸序列，而不比較兩個蛋白質之間保守胺基酸的變化。
PDGF/VEGF家族成員可以和酪氨酸激酶受體結合。現在已經發現有五種內皮細胞特有的酪氨酸激酶受體，分別命名為VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR/Flk-1)、VEGFR-3(Flt-4)、Tie和Tek/Tie-2。它們全都具有信號傳導必須的酪氨酸激酶活性。在血管發生和血管生成中VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、Tie和Tek/Tie-2起著非常關鍵和特異的作用，這已經通過在小鼠胚胎中通過定點突變使這些受體失活的試驗得以證明。
現在所知的能和VEGFs結合的酪氨酸激酶受體為VEGFR-1VEGFR-2和VEGFR-3。VEGFR-1和VEGFR-2可以高特異的和VEGF結合，同時VEGFR-1還可以和VEGF-B和PlGF結合。VEGF-C是VEGFR-3的配體，同時也可以激活VEGFR-2(Joukov et al.，TheEMBO Journal，1996 15 290-298)。VEGF-D和VEGFR-2和VEGFR-3都可以結合。關於Tek/Tie-2的配體可以參見國際專利No.PCT/US95/12935(WO 96/11269)(Regeneron Pharmaceuticals，Inc.)。Tie的配體至今仍然沒有發現。
最近，一種新的VEGF異型體的特異受體已經被純化並克隆，大小為130-135Kda(Soker et al.，Cell，1998 92 735-745)。這個VEGF受體可以通過外元7編碼的序列非常特異的和VEGF165結合，但是它和肝素只有較弱的結合能力(Soker et al.，Cell，1998 92 735-745)。令人驚訝的是，這個受體與人類NP-1是相同的，NP-1是涉及神經早期發生的一個受體。PlGF-2也可以和NP-1發生作用(Migdal et al.，J Biol.Chem.，1998 273 22272-22278)。
VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3都由內皮細胞表達。VEGFR-1和VEGFR-2由血管內皮表達(Oelrichs et al.，Oncogene，1992 8 11-18；Kaipainen et al.，J.Exp.Med.，1993 178 2077-2088；Dumont et al.，Dev.Dyn.，1995 203 80-92；Fong et al.，Dev.Dyn.，1996 207 1-10)。VEGFR-3由成體組織的淋巴內皮表達(Kaipanen et al.，Proc.Natl.Acad.Sic.USA，1995 9 3566-3570)。VEGFR-3同時也可以由圍繞腫瘤的血管表達。
去除VEGFR基因會導致血管系統發育異常，使得在妊娠中期胚胎死亡。通過對帶有完全失活VEGFR-1基因的胚胎的分析顯示這個受體在內皮功能性組織過程中是必須的(Fong et al.，Nature 1995376 66-70)。但是，僅僅缺失了編碼VEGFR-1的胞內酪氨酸激酶區域部分的基因卻產生可以存活的具有正常血管系統的小鼠(Hiratsukaet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998 95 9349-9354)。上述差異的原因仍然有待解釋，但是可以由此推測通過酪氨酸激酶進行的受體信號傳導對於VEGFR-1的正常功能的實現並不是必須的。通過對具有失活的VEGFR-2基因的純合體小鼠的研究表明，這個受體對於細胞增殖、血細胞生成和血管系統的生成是必須的(Shalaby et al.，Nature，1995 376 62-66；Shalaby et al.，Cell，1997 89 981-990)。VEGFR-3的失活會造成心血管系統的錯誤，因為這會使得大血管異常重組(Dumont et al.，Science，1998 282 946-949)。
雖然VEGFR-1主要在發育過程中在內皮細胞中表達，但是在胚胎發生早期在生血前體細胞中也產生(Fong et al.，Nature 1995 37666-70)。在成體中，單核細胞和巨噬細胞也表達這種受體(Barleon etal.，Blood，1996 87 3336-3343)。在胚胎中，VEGFR-1被絕大多數，但不是全部血管表達(Breier et al.，Dev.Dyn.，1995 204 228-239；Fong et al.，Dev.Dyn.，1996 207 1-10)。
受體VEGFR-3在胚胎發育早期在內皮細胞中廣泛表達，但是隨著胚胎發生的進程，它在靜脈內皮和淋巴內皮中的表達量是有限的(Kaipainen et al.，Cancer Res.，1994 54 6571-6577；Kaipainen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1995 92 3566-3570)。VEGFR-3在成體組織的淋巴內皮細胞中被表達。這個受體在胚胎發生過程中對於血管發育是非常關鍵的。把小鼠的VEGFR-3基因進行定向的失活，由於帶有缺陷腔體的大血管發生異常自組，會導致有缺陷的血管的形成，從而使得液體在心包腔中滯留，在性交後9.5天心血管系統發生功能障礙。根據這些發現，可以推測VEGFR-3在從初級血管網向更大的血管發育過程中是必須的。但是，VEGFR-3在淋巴管發育中的功能現在無法研究，因為上述的小鼠胚胎在淋巴系統形成之前已經死亡。科學家們推測VEGFR-3在淋巴發生和成體中的淋巴內皮細胞中有一定的表達，從而對淋巴管發育和淋巴發生起作作用。這是根據在轉基因小鼠的皮膚中發現VEGF-C的異位表達現象而作出的推測，得到的是一種VEGFR-3的配基，它的產生是由於真皮中淋巴內皮細胞的增殖和血管的增大。這個發現還進一步的顯示，VEGF-C也許最基本的功能是它在淋巴內皮中的作用，另外輔助功能是與VEGF共同行使在血管生成中的作用，並且對血管滲透壓進行調控(Joukov et al.，EMBO J.，1996 15 290-298)。
由於具有抗腫瘤組織血管發生的機制，一些VEGF和VEGF受體系統的抑制劑可以抑制腫瘤的生長。可見Kim et al.，Nature，1993362 841-844；Saleh et al.，Cancer Res.，1996 56 393-401。
由上述提及的內容，生長因子的VEGF家族都是PDGF家族的成員。PDGF在結締組織細胞、成纖維細胞、肌成纖維細胞和神經膠質細胞的生長和運動方面均具有重要的作用(Heldin et al.，「Structure of platelet-derived growth factorImplications for functionalproperties」，Growth Factor，1993 8 245-252)。在成體中，PDGF可以促進創傷組織的癒合(Robson et al.，Lancet，1992 339 23-25)。結構上，PDGF是由二硫鍵連接的同源多肽鏈A或者B組成的同源二聚體(PDGF-AA或者PDGF-BB)或者異源二聚體(PDGF-AB)。
PDGF及其異構體是通過與靶細胞上兩個結構相聯繫的受體酪氨酸激酶(RTKs)結合而實現其功能的。受體α和PDGF的A鏈、B鏈都能結合，而受體β只能和B鏈結合。這兩種受體可以被許多體外培養的細胞系表達，但主要由體內的間質細胞表達。PDGFs可以在體外調控細胞增殖、細胞存活和對細胞的趨化性(可見綜述Heldin et al.，Biochim Biophys Acta.，1998 1378 F79-113)。在體內，由於PDGFs在上皮細胞(PDGF-A)或者內皮細胞(PDGF-B)中表達，接近PDGFR表達的間質，所以PDGF可以以較快的方式發揮功效。在腫瘤細胞或者體外培養的細胞系中，PDGFs和PDGF受體的共表達會產生信號的自動傳遞環，這對細胞轉型非常重要(Betsholtz et al.，Cell，1984 39 447-57；Keating et al.，J.R.Coll SurgEdinb.，1990 35 172-4)。PDGFs的過度表達在一些病理情況下被發現，包括惡性腫瘤、動脈硬化和纖維增殖病(Heldinet al.，TheMolecular and Cellular Biology of Wound Repair，New YorkPlenumPress，1996，249-273)。
作為細胞增殖和細胞存活調控子的PDGFs的重要性在最近進行的小鼠相關基因的定向研究中被認識到，試驗顯示了除了不同的PDGFRs的配基之間會發生一些重疊之外，PDGFs和它們的受體在生理過程中所發揮的特有作用。具有兩個無效突變的PDGF配基或者其受體的純合體是無法存活的。大約50％的PDGF-A缺陷的純合體小鼠具有早期致死表現型，而剩餘的存活的小鼠具有複雜的產後表現型，具體狀況為由於缺少肺泡肌成纖維細胞而導致肺泡隔膜的異常形成，從而患有肺氣腫(Bostrom et al.，Cell，1996 85 863-873)。另外，PDGF-A缺陷的小鼠還會具有表皮缺陷的表現型，特徵為真皮組織較薄、畸形的毛囊和稀疏的毛髮(Karlsson et al.，Development，1999 126 2611-2)。在少突神經膠質細胞的發育和中樞神經系統的髓鞘形成的過程中也需要PDGF-A(Fruttiger et al.，Development，1999126 457-67)。PDGFR-α缺陷的表現型更容易發生早期胚胎死亡、頭部非完全閉合、神經冠發育異常、心血管系統缺陷和骨骼缺陷(Soriano et al.，Development，1997 124 2691-70)。PDGF-B和PDGFR-β缺陷的小鼠也具有與上述相似的表現型，特徵常常為腎、血液和心血管系統的異常(Leveen et al.，Genes Dev.，1994 8 1875-1887；Soriano et al.，Genes Dev.，1994 8 1888-96；Lindahi et al.，Science，1997277 242-5；Lindahi，Development，1998 125 3313-2)。其中腎和心血管系統的異常至少部分上與缺乏壁細胞(心血管平滑肌細胞、外膜細胞或者腎小球膜細胞)的正確重組到血管相關(Leveen et al.，GenesDev.，1994 8 1875-1887；Lindahl et al.，Science，1997 277 242-5；Lindahlet al.，Development，1998 125 3313-2)。
本發明概述本發明揭示了一種具有刺激和/或增強可以表達PDGF-C受體的細胞增殖或分化和/或生長和/或運動性功能的新的生長因子，這些細胞包括，但不僅僅限於，內皮細胞、結締組織細胞、肌成纖維細胞和神經膠質細胞。另外，由多核苷酸序列表達出的新的生長因子和用於治療和診斷的藥物組合物配方都屬於本發明的範疇。
第一，本發明揭示了一種分離的並且經過純化的多核苷酸分子，這種多核苷酸分子包括的核苷酸序列至少與

圖1所示的核苷酸序列(SEQ ID NO2)的37至1071位、圖3所示的核苷酸序列(SEQ IDNO3)的6至956位或者圖5所示的核苷酸序列(SEQ ID NO6)的196至1233位至少85％相同，有90％相同更好，最好是95％相同。圖1所示的核苷酸序列(SEQ ID NO2)的37至1071位、圖3所示的核苷酸序列(SEQ ID NO3)的6至956位或者圖5所示的核苷酸序列(SEQ ID NO6)的196至1233位編碼一個初生多肽，命名為為PDGF-C(原先命名為「VEGF-F」)，它在結構上與PDGF-A、PDGF-B、VEGF、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D是同源的。在提出的具體實例中，核酸分子是含有圖1所示的核苷酸序列(SEQ ID NO2)的37至1071位、圖3所示的核苷酸序列(SEQ IDNO3)的6至956位或者圖5所示的核苷酸序列(SEQ ID NO6)的196至1233位的cDNA分子。同時，本發明還包括這樣的核酸分子，它可以和圖1所示的核苷酸序列(SEQ ID NO2)的37至1071位、圖3所示的核苷酸序列(SEQ ID NO3)的6至956位或者圖5所示的核苷酸序列(SEQ ID NO6)的196至1233位或者它們的片段在嚴格條件下雜交。
第二，本發明的多肽分子具有刺激和/或增強可以表達PDGF-C受體的細胞增殖或分化和/或生長和/或運動性的功能，這些細胞包括，但不僅僅限於，內皮細胞、結締組織細胞、肌成纖維細胞和神經膠質細胞。它的胺基酸序列如圖2(SEQ ID NO3)、圖4(SEQIDNO5)、圖6(SEQ ID NO7)或者它們的片段和具有刺激和/或增強可以表達PDGF-C受體的細胞增殖或分化和/或生長和/或運動性的功能的類似物，這些細胞包括，但不僅僅限於，內皮細胞、結締組織細胞(如成纖維細胞)、肌成纖維細胞和神經膠質細胞。多肽的胺基酸序列應該和圖2(SEQ ID NO3)、圖4(SEQ ID NO5)、圖6(SEQ ID NO7)、它們的片段或者具有PDGF-C生物學活性的類似物的胺基酸序列有85％的部分是相同的，更好是90％相同，最好是95％的部分相同。在本發明的具體實例中，多肽分子是包含有PDGF-C中的PDGF/VEGF同源域(PVHD)部分的PDGF-C截短體。這個域是從胺基酸殘基230位至345位。但是，這個區域可以向N端延伸直達殘基164位。在這裡，PVHD被定義為PDGF-C的截短體。PDGF-C的截短體是PDGF-C的一種活性形式。
在本發明中，序列相同程度的比較是通過Lasergene軟體包(DNASTAR，Ltd.Abacus House，Manor Road，West Ealing，LondonW130AS United Kingdom)中的比較工具「MEGALIGN」進行的。比較過程經過人為精化。相同程度的比例根據比較中的序列計算。
這些多肽或者由多核苷酸表達的多肽應該具有刺激和/或增強可以表達PDGF-C受體的細胞增殖、分化、運動性、存活或心血管的滲透性的功能，這些細胞包括，但不僅僅限於，心血管內皮細胞、淋巴內皮細胞、結締組織細胞(例如成纖維細胞)、肌成纖維細胞和神經膠質細胞。另外，還應該可以促進創傷癒合。PDGF-C還具有血管生成效應，這是PDGF-C的活性之一。這些性質在下文中統稱為「PDGF-C的生物學活性」，可以通過本領域中常見的方法進行鑑定。
在這裡，「PDGF-C」指圖2(SEQ ID NO3)、圖4(SEQ ID NO5)、圖6(SEQ ID NO7)的多肽分子和它們的片段或者具有上述PDGF-C生物學活性的類似物。也可以指編碼PDGF-C或者其片段或者具有PDGF-C生物學活性的類似物的多核苷酸。這種多核苷酸可以是天然的，也可以是存在於一個載體中或者脂質體中。
另一方面，本發明揭示了一種具有以下胺基酸序列的多肽PXCLLVXRCGGXCXCC(SEQ ID NO1)。這些序列僅僅在PDGF-C中存在，從而可以和生長因子PDGF/VEGF家族中的其它成員相區別，區別在於在第三和第四個半胱氨酸(見圖9，SEQ ID NO8-17)之間插入了三個胺基酸殘基(NCA)。
將多肽進行保守的替換、插入或者缺失突變，但是仍然保持PDGF-C的生物學活性，這樣的突變的多肽分子顯然也屬於本發明的範疇。本領域內的工作者應該了解可以得到上述多肽的方法，例如使用定點突變技術、特異的酶切處理和連接。另外，將這種多肽組成的複合物中的胺基酸殘基用非天然的胺基酸或者胺基酸類似物進行替代，也有可能得到仍然具有PDGF-C活性的蛋白質複合物。可以用本領域內常見的方法製備和鑑定這些複合物。顯然，這些多肽複合物也屬於本發明的範疇。
另外，由於選擇性截短(VEGF和VEGF-B就是由於選擇性截短產生)和編碼PDGF-C的核酸序列自然產生的等位變體現象而產生的PDGF-C多肽分子的可能的變體也屬於本發明的範疇。等位變體是本領域內的標準術語，是指一段核酸序列在一個或者幾個核苷酸的位置上發生了替代、缺失或者插入的突變，但是這些變化並不影響其表達的多肽的功能。
這樣的PDGF-C變體可以通過對PDGF-C多肽的非必須區域進行修飾而得到。這些非必須區應該在如圖9(SEQ ID NO8—17)所指出的高度保守的區域之外。特別是，生長因子PDGF家族，包括VEGF，為二聚體，並且VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF、PDGF-A和PDGF-B在N端都具有完全保守的8個半胱氨酸區域，例如類似於PDGF/VEGF的區域(Olofsson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996 93 2576-2581；Joukov et al.，EMBO J.，1996 15290-298)。這些半胱氨酸可能與分子間和分子內的二硫鍵的形成相關。此外，在C端區域具有高度保守，但不是完全保守的半胱氨酸殘基。分子內二硫鍵形成了每個亞基內的環1、2和3，這些位點和生長因子PDGF/VEGF家族的受體結合相關(Andersson et al.，GrowthFactors.1995 12 159-164)。
本領域內的專業人員應該了解在那些具有活性的變體中這些半胱氨酸殘基應該是保守的，環1、2和3中的活性位點的胺基酸也應該是保守的。而分子中的其它區域，在生物學功能上就不顯得那麼重要，可以進行一定的修飾。這些經過修飾的多肽也應該可以通過常規的活性檢測方法對PDGF-C活性進行鑑定，例如使用實例6中的成纖維細胞增殖分析方法。
一些經過修飾的PDGF-C多肽具有和細胞上的PDGF-C受體結合的能力，這些細胞包括，但不僅僅限於，內皮細胞、結締組織細胞、肌成纖維細胞和/或神經膠質細胞，但是卻不能刺激細胞增殖、分化、遷移、運動性增強和存活，或者誘導血管增殖、結締組織發育、創傷癒合。這些修飾的多肽可以作為PDGF-C多肽和PDGF/VEGF家族的生長因子的競爭性或者非競爭性抑制劑，可以用於需要抑制或者降低PDGF-C多肽和PDGF/VEGF家族的生長因子作用的場合。這些具有結合能力，但是不能誘導有絲分裂、不誘導分化、不誘導遷移、不增強移動性、不提高存活率、不促進血管增殖和創傷癒合的PDGF-C多肽變體也屬於本發明的範疇。在這裡稱為「可與受體結合但不具有其它活性的變體」。為了激活其唯一的受體，PDGF-C形成一個二聚體。但是如果二聚體由上述的可與受體結合但不具有其它活性的變體單體和另一個野生型的PDGF-C或者野生型的PDGF/VEGF家族的生長因子單體組成，這樣的二聚體應該可以與受體結合，但是無法引發下遊的信號傳遞。
同時，還存在其它的修飾的PDGF-C多肽可以防止野生型的PDGF-C多肽和PDGF/VEGF家族的生長因子和細胞上相應的受體結合的能力，這些細胞包括，但不僅僅限於，內皮細胞、結締組織細胞(如成纖維細胞)、肌成纖維細胞和/或神經膠質細胞。這樣，這種二聚體將無法刺激內皮細胞的增殖、分化、遷移和存活率增加，也無法刺激結締組織細胞、肌成纖維細胞和/或神經膠質細胞的增殖、分化和運動性的增強。這些修飾的多肽可以作為PDGF-C多肽和PDGF/VEGF家族的生長因子的競爭性或者非競爭性抑制劑，可以用於需要抑制或者降低PDGF-C多肽和PDGF/VEGF家族的生長因子作用的場合。這些場合包括當初級或者遷移型的腫瘤細胞侵入正常細胞群落時發生的組織改型過程。這些和PDGF-C受體和生長因子PDGF/VEGF家族受體具有結合能力，但是不能誘導有絲分裂、不誘導分化、不誘導遷移、不增強移動性、不提高存活率、不促進血管增殖和創傷癒合的PDGF-C生長因子變體也屬於本發明的範疇。在這裡稱為「可以形成PDGF-C生長因子二聚體但不具有其它活性的變體或中間體」。
一個可以形成PDGF-C生長因子二聚體但不具有其它活性的變體或中間體的例子是一種突變了的PDGF-C，這種突變可以防止蛋白酶對CUB結構域的切割。可以形成PDGF-C生長因子二聚體但不具有其它活性的變體或中間體可以由具有活性的單體，例如VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-C、PDGF-A、PDGF-B或者PlGF，連接以突變了的可以耐受蛋白酶切的CUB結構域而形成。由上述可以形成PDGF-C生長因子二聚體但不具有其它活性的變體或中間體和連接有突變了的CUB結構域的單體構成的二聚體應該不能和它們相應的受體結合。
上述二聚體的一種變體是在由具有活性的單體，例如VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-C、PDGF-A、PDGF-B或者PlGF和突變了的CUB結構域之間，再插入一個蛋白酶切位點。插入的這個蛋白酶切位點可以切開CUB結構域和活性單體的連接，釋放出可以和相應受體結合的活性體。通過這種方式，可以製備出可控制活性單體釋放的二聚體。
第三，本發明揭示了一種編碼上述多肽或者多肽片段的核酸分子。核酸分子可以是DNA、基因組DNA、cDNA或者RNA，可以是單鏈，也可以是雙鏈的。核酸的來源可以從細胞或組織中抽提得到，也可以重組得到，或者直接合成的。由於遺傳密碼的簡併性，所以可以表達具有圖2(SEQ ID NO3)、圖4(SEO ID NO5)、圖6(SEQ ID NO7)所示的多肽分子、它們的片段、具有相應的生物學活性的類似物、可與受體結合但不具有其它活性的變體或者可以形成PDGF-C生長因子二聚體但不具有其它活性的變體或中間體的胺基酸序列的核酸分子種類應該有許多種。
第四，本發明揭示了帶有cDNA分子或者如第三方面所述的核酸分子的載體，以及可以被載體或者核酸分子轉化或者轉染的宿主細胞。它們可以來源於真核，也可以來源於原核。宿主細胞應該適於表達本發明所述的多肽分子，包括昆蟲細胞如Sf9細胞，可從美國標準菌種保藏組織(ATCC SRL-171)得到，可以用杆狀病毒載體轉染；或者人胚胎腎細胞系293-EBNA，可以被合適的表達質粒轉化。本發明首選的載體是由上述的核酸序列連接一個或者幾個合適的啟動子或者其它調控序列而成的表達載體，再將這可以表達本發明所述的多肽分子的載體轉化或者轉染宿主細胞。其它推薦的載體還有那些適於轉染不如動物細胞，或者可用於基因治療的載體，例如腺病毒、牛痘病毒、反轉錄病毒載體或者脂質體。
本發明同時揭示了一種製備可以由其帶有核酸分子表達出多肽的載體的方法，包括的步驟為在載體中，將核酸分子與一個或者幾個合適的啟動子或者調控序列相連。
本發明同時揭示了一種製備本發明所述的多肽分子的方法，包括的步驟為在宿主細胞中將核酸分子或者載體進行表達，再從宿主細胞或者培養細胞的培養基中分離出所表達的多肽分子。
第五，本發明得到了一種可以和本發明所述的多肽分子或者其片段進行特異反應的抗體分子。這種抗體可以識別PDGF-C的變體、具有免疫活性的片段、類似物和重組體。這樣的抗體可以作為PDGF-C的抑制劑或者激動劑，可以對PDGF-C進行檢測和定量。抗體可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體。可以使用這樣的單克隆或者多克隆抗體收集本發明所述的多肽分子及其它們的變體、片段和類似物。可以在多肽序列上連接一個表位標記，例如FLAG八肽(Sigma，St.Louis，MO)，以便於進行親和層析富集。在某些場合，例如在臨床上需要使用單克隆抗體抑制PDGF-C活性時，應該使用人源的單克隆抗體。這些抗體中可以進一步加入細胞毒性或者細胞抑制試劑。製備上述物質，包括重組DNA的方法都是本領域內常見的技術。
同時，可以特異的識別PDGF-C，並且自身帶有標記的抗體也屬於本發明的範疇。
為了便於檢測，本發明所述的多肽分子或者抗體可以帶有可檢測的標記物。這樣，帶標記的多肽分子就可以原位檢測其相應的受體。多肽分子抗體可以共價的，也可以非共價的與超磁物質、順磁物質、電子密度物質或者放射性物質連接，以便於檢測。如果用於診斷分析，可以使用放射性的或者非放射性的標記。放射性標記包括放射性同位素，例如125I或者32P。非放射性標記包括酶標試劑，如辣根過氧化物酶和螢光試劑，如FITC。標記可以是直接標記，也可以是間接標記，可以是共價標記，也可以是非共價標記。
本發明在臨床上的應用包括加速移植的組織或者器官的血管發生過程、刺激創傷組織的癒合、刺激結締組織的發育、建立損傷組織和動脈堵塞(例如冠心病)的旁路連接、抑制腫瘤組織或者糖尿病視網膜症中的血管生成過程和抑制初級或者遷移性腫瘤細胞侵入正常細胞群落過程中發生的組織轉型。另外，在腫瘤活檢中，對PDGF-C的量進行檢測，對於判斷腫瘤轉移危險性非常有幫助。
此外，PDGF-C和許多肺的生理現象相關。PDGF-C的檢測可以用於許多肺病的診斷中。PDGF-C同時可以用於許多肺病的治療當中，以增強肺部血管流通，提高肺部空氣和血的交換。相似的，對於心臟病缺陷患者，PDGF-C還可以用於增強心臟的血管流通和氧氣的滲透性。同樣，對於慢性氣管堵塞症患者，PDGF-C還可以增強血液和氣體交換。
本發明揭示了一種可以刺激哺乳動物血管生成、淋巴管生成、神經網絡生成、結締組織發育和創傷癒合的方法，包括的步驟為對哺乳動物施加有效劑量的PDGF-C、其片段或者具有PDGF-C生物學活性的類似物。可以將PDGF-C、其片段或者類似物與以下一種或者幾種VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF、PDGF-A、PDGF-B、FGF和/或肝素同時施加給試驗動物。
PDGF-C激動劑(例如抗體或者可以競爭性或非競爭性的結合PDGF-C形成二聚體並且和受體結合的抑制劑)可以用以處理例如心臟充血障礙的情況，通過在別的器官，例如肺中增加血管的滲透性，以造成液體的積累，從而抵消心臟中的血管滲透性的問題。PDGF-C同時還可以處理可在肺、腎和肝中發現的纖維變性的狀況。在腸道中施加PDGF-C，可以治療消化不良症，但同時肝、腎的血液流通和血管滲透性都增強了。
本發明還揭示了一種可以抑制哺乳動物血管生成、淋巴管生成、神經網絡生成、結締組織發育和創傷癒合的方法，包括的步驟為對哺乳動物施加有效劑量的PDGF-C激動劑。激動劑可以是任何能夠抑制PDGF-C活性的物質，機制可以是抑制PDGF-C與細胞上相應的受體結合，也可以是抑制受體的激活，例如通過使用「可與受體結合但不具有其它活性的變體」。激動劑包括，但不僅僅限於，抗PDGF-C的抗體，可以競爭性的或者非競爭性的抑制PDGF-C及其受體結合的抑制劑，例如上述的「可以形成PDGF-C生長因子二聚體但不具有其它活性的變體或中間體」，可以結合PDGF-C並且修飾PDGF-C以使其失去活性的複合物，還有上述多核苷酸序列的反義核酸分子。
本發明還提供了一種確定與PDGF-C的活性片段結合的試劑的方法，步驟為將PDGF-C的活性片段和檢測試劑混合，使用適當的方法監測結合的程度。試劑可以包含複合物和其它蛋白質。
本發明還提出了一個尋找可以和PDGF-C的活性片段結合的篩選系統。先製備PDGF-C的活性片段，將其與待檢測的試劑混合，再使用適當的方法定量測定待檢測的試劑與PDGF-C的活性片段的結合程度。這個篩選系統也可以用於確定可以抑制對全長PDGF-C的蛋白酶切的物質，這樣可以防止釋放出具有活性的PDGF-C的活性片段。當然，必須先準備好全長的PDGF-C。
使用這套篩選系統可以尋找那些可能改變PDGF-C生物學活性的化合物。這種篩選方法可以改造成類似於PANDEX(Baxter-DadeDiagnostics)系統的大規模、自動化裝置，以適應對可能的藥物進行有效的高通量的篩選。
在這個篩選系統中，PDGF-C的活性片段或者全長的PDGF-C要事先製備，最好採用重組DNA技術。檢測試劑，例如複合物和蛋白質，被引入包含有PDGF-C的活性片段或者全長的PDGF-C的反應容器。檢測試劑和PDGF-C的活性片段或者全長的PDGF-C的結合可以使用適當的方法確定，這些方法包括，但不僅僅限於，將檢測試劑使用放射性同位素或者化學標記進行標記。其它檢測試劑與PDGF-C的活性片段或者全長的PDGF-C的結合程度的方法還可參見美國專利公開5,585,277，它是通過監測摺疊了的和未摺疊的蛋白質的比例確定檢測試劑和PDGF-C的活性片段或者全長的PDGF-C的結合程度。這樣的檢測蛋白質摺疊的例子包括，但不僅僅限於，監測PDGF-C的活性片段或者全長的PDGF-C對特異的蛋白酶的耐受程度，或者檢測蛋白質和可以特異結合蛋白質摺疊態的抗體的結合程度。
本領域內的工作者都應該了解IC50值的大小和所選擇的檢測試劑相關。例如，IC50值小於10nM的檢測試劑非常適用於藥物治療情況。但是，其實特異性更高而結合強度更低的試劑更使用於這一情況。本領域內的工作者應該認識到關於試劑的結合能力、抑制活性和特異選擇性的信息對於研究相應的藥物非常有用。
當在治療中使用PDGF-C或者PDGF-C激動劑時，使用的劑量和方式將由被施加的個體和具體的待處理的情況決定，由醫師和獸醫根據判斷自行決定。給藥的方式包括口服、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、靜脈注射、植入、局部使用和不經過消化系統的使用方式等等。局部使用PDGF-C的方法和使用VEGF的方法相似。例如在促進創傷癒合時，或者其它需要增強血管生成效應的場合，可以將PDGF-C直接施加到需要的組織或者器官上，有效的劑量按照給藥量/體重的比值在0.1至1000μg/Kg之間。
PDGF-C或者PDGF-C激動劑可以結合適當的藥物載體使用。最後的組成為，具有藥效的適當量的PDGF-C或者PDGF-C激動劑，生物相容的無毒的鹽類以及生物相容的固體或者液體的載體或者佐劑。這樣的載體或者佐劑的例子包括，但不僅僅限於，鹼鹽、緩衝鹼鹽、Ringer溶液、礦物油、滑石、澱粉、明膠、乳糖、蔗糖、微晶纖維素、高嶺土、甘露糖醇、磷酸二鈣、氯化鈉、葡萄糖、水、甘油、乙醇、增稠劑、穩定劑、懸浮劑或者上述物質的組合。它們可以製成溶液、懸濁液、片劑、膠囊、軟膏、西也劑、糖漿、糯米紙囊劑、油膏或者其它的形式。藥物的形式應該根據給藥的方式決定。在這裡，含有PDGF-C的成分也可以換成一種或者幾種下列的物質PDGF-A、PDGF-B、VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF和/或肝素。藥物中含有的活性物質PDGF-C的重量比在0.1％至90％之間，一般在10％至30％之間。
對於肌內製劑，應該是無菌的形式，PDGF-C的活性片段以可溶性鹽例如鹽酸鹽的形式存在，溶解在藥物稀釋劑中，例如不含致熱源的蒸餾水、生理鹽水或者5％的葡萄糖溶液。對於不溶的化合物可以製備成懸濁的水溶液，或者使其懸浮在生物相容性的油鹼中，例如含有長鏈脂肪酸的酯中，例如乙基油酸酯。
本發明的發明思想還可以用作製造診斷/疾病預測設備，例如以檢測試劑盒的形式。在本發明的一個具體的試劑盒的實例中，試劑盒包括抗PDGF-C的抗體，以及一種檢測，更確切的說，測量估計PDGF-C及其抗體之間結合狀況的方法。在另一個具體實例中，上述的抗PDGF-C抗體稱為一抗，其上除了能與PDGF-C結合的位點外，還具有某種動物的抗原，另外試劑盒還提構了一種二抗抗體分子，抗一抗上具有的動物抗原。二抗上具有可檢測的標記物，PDGF-C或者未標記的一抗結合在基底的表面，這樣PDGF-C和一抗的相互作用程度可以根據基底上相應的標記物的數量決定，這種標記物是通過使二抗和結合了PDGF-C的一抗結合而引入的。在一個具體實例中，本發明所述的診斷/疾病預測設備就是以酶聯免疫吸附分析(ELISA)試劑盒的形式給出的。
在本發明的另一個具體實例中，這種診斷/疾病預測設備也可以包含聚合酶鏈式反應的方法，以擴增出待檢測的個體，並將其序列結構與本發明公布的序列結構進行比較，以檢測有無異常，判定PDGF-C表達的異常是否與某些疾病的特定階段相關。
另外，本發明的具體實例中，還可以使用限制性長度多態性(RFLP)分析方法，使用限制性內切酶切割待測樣品的基因組DNA，電泳，產生特異性的DNA條帶。再將這些條帶與本分明中公布的序列條帶進行比較，以檢測有無異常，判定PDGF-C表達的異常是否與某些疾病的特定階段相關。
本發明包括一種可以檢測可能與疾病階段相關的待檢測樣品的PDGF-C基因是否發生異常的方法。這種方法的步驟為從樣品中得到DNA或者RNA樣品，加入特異的引物，通過PCR的方法，選擇性的擴增出PDGF-C相關的基因，將從樣品中擴增出的核酸序列和圖1(SEQ ID NO2)或者圖3(SEQ ID NO5)中的序列進行比較。那些包含有能夠特異的結合樣品的PDGF-C基因的引物，和可以將PDGF-C基因從DNA樣品中擴增出來的聚合酶的試劑盒也屬於本發明的範疇。
本發明給出了一種在生物樣品中檢測PDGF-C的方法。具體步驟為將能夠和PDGF-C結合的試劑與樣品混合反應，再檢測結合程度。其中可以結合PDGF-C的部分最好是抗PDGF-C的抗體，最好是單克隆抗PDGF-C抗體。在一個具體實例中，結合程度是通過可檢測的標記物實現檢測的，適用的標記物上文已經討論。
本發明涉及到有PDGF-C構成的蛋白二聚體，特別是由二硫鍵連接的蛋白二聚體。二聚體可以是由兩條PDGF-C多肽組成的同源二聚體，也可以是由一條PDGF-C多肽和一條VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF、PDGF-A或者PDGF-B組成的異源二聚體。
本發明還給出了分離PDGF-C的方法，包括的步驟為將表達PDGF-C的細胞用肝素處理，以使得細胞釋放PDGF-C，再將釋放出的PDGF-C進行純化。
本發明還給出了一種包含反義核酸序列的載體。其中的反義核酸序列至少與編碼PDGF-C、PDGF-C片段或者具有PDGF-C生物學活性的類似物的DNA序列部分互補。或者，反義核酸序列也可以和PDGF-C基因的啟動子區域作用，或者和基因的其它非編碼區相互作用，從而達到抑制，至少是降低PDGF-C的表達程度。
根據上文所述，這樣包含反義核酸序列的載體可以用以抑制，至少是降低PDGF-C的表達程度。在那些PDGF-C表達與疾病相關的場合中，使用這種可以抑制PDGF-C表達的載體是相當有效的，這些場合例如，腫瘤產生PDGF-C以促進血管生成，或者組織重建，該過程發生在初級的或遷移的腫瘤細胞侵入正常細胞群體時。用攜帶有反義核酸序列的載體轉化該腫瘤細胞將抑制或阻礙腫瘤的生長或組織重建。
發明的另一方面與發現全長PDGF-C蛋白可能是潛在的生長因子有關。該生長因子需要通過蛋白水解釋放具有活性的PDGF/VEGF同源結構域而被激活。已知的蛋白水解位點位於全長蛋白的殘基231—234，即殘基-RKSR-。這是二元基序。該位點在鼠PDGF-C中結構保守。在PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C和PDGF-D中也發現已知的-RKSR-蛋白水解位點。在這四種蛋白中，在PDGF/VEGF同源結構域的最小結構域的前方序列中也發現了已知的蛋白水解位點。所有這些事實都表明-RKSR-是蛋白水解的位點。
優選的蛋白酶包括，但不僅僅限於，纖維蛋白溶酶、因子X和腸激酶。N-端CUB結構域可能作為抑制結構域起作用，該結構域可能用於保持PDGF-C以潛在的形式存在一些細胞外室中，當需要PDGF-C時該結構域可以通過特定的蛋白水解除去。
該發明提供了一種產生活化的截短形式的PDGF-C或調節PDGF-C的受體結合的特異性的方法。這些方法包括表達含有可編碼具有PDGF-C生物學活性的多肽的多核苷酸的表達載體，和支持至少一種酶的水解以用於處理表達的多肽產生有活性的PDGF-C的截短體。
本發明同時也提供了一種選擇性激活具有生長因子活性的多肽的方法。該方法包括表達可編碼具有生長因子活性和CUB結構域的多肽的多核苷酸的表達載體，在該多肽中，CUB結構域和具有活性的多肽片段之間含有一個蛋白水解位點，該方法支持至少一種酶的水解以用於處理表達的多肽產生激活的具有生長因子活性的多肽。
另外，本分明還包括分離編碼具有PDGF-C生物學活性的多肽的核酸分子，和分離編碼內部含有胺基酸序列為RKSR的蛋白水解位點或者內部含有結構保守的胺基酸序列的多肽的核酸分子的方法。
這個方面也包括一種分離的二聚體，此二聚體由具有活性的PDGF-C的單體和激活的連有CUB結構域的VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-C、PDGF-A、PDGF-B和PlGF的單體構成，或者反過來，由激活的VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-C、PDGF-A、PDGF-B和PlGF的單體和具有活性的的連有CUB結構域的PDGF-C的單體構成。該種二聚體可能包括也可能不包括位於激活的單體和CUB結構域連接處的蛋白水解位點。
如上所述的多核苷酸，這些多核苷酸的片段，以及與可以與這樣的多核苷酸或者多核苷酸片段在嚴格條件下進行雜交的非編碼的多核苷酸鏈具有充分相似性的多核苷酸的變體，它們均可用於識別、純化、分離編碼其它的非人源的哺乳類的PDGF-C的多核苷酸。因此這些多核苷酸片段和變體用於發明方面。嚴謹的雜交條件的例子如下雜交溫度42℃，5X SSC，20 mM Na3PO4，pH6.8，50％甲醯胺；清洗條件42℃，0.2X SSC。本領域的人員應該了解需要根據要進行雜交的核酸序列的長度和GC鹼基對的含量改變具體的條件。具體實例見「分子克隆實驗手冊」，第二版，頁9.47-9.51，冷泉港，紐約冷泉港實驗室(1989)。
另外，純化和分離的可編碼其它、非人源的、哺乳類的PDGF-C的多核苷酸也屬於本發明的範疇，正如純化和分離由此編碼的多肽和可與非人源PDGF-C變體進行特異性免疫反應的抗體。因此，這項發明包括純化和分離哺乳類PDGF-C多肽，也包括純化和分離編碼多肽的多核苷酸。
顯而易見，這項發明中的核酸和多肽可以通過合成或者重組的方法得到，也可以從天然物質中提取、純化。
在這裡，當舉具體的實例時，「包括」的意思是「包含，但不僅僅限於」。
附圖簡述圖1(SEQ ID NO2)顯示編碼人PDGF-C(hPDGF-C)(2108bp)的cDNA的完整的核酸序列；圖2(SEQ ID NO3)顯示推測的含有345個胺基酸殘基的全長hPDGF-C的一維序列(cDNA的翻譯部分對應於圖1中的核苷酸37到1071)；圖3(SEQ ID NO4)顯示編碼人PDGF-C(bPDGF-C)(1536bp)的片段的cDNA序列；圖4(SEQ ID NO5)顯示hPDGF-C的片段的胺基酸序列(即圖3中的第3位到第956位的核苷酸序列的翻譯)；圖5(SEQ ID NO6)顯示鼠PDGF-C(mPDGF-C)的cDNA的核苷酸序列；圖6(SEQ ID NO7)顯示鼠PDGF-C的片段的胺基酸序列(由圖5中的第196位到1233位核苷酸的cDNA翻譯而成)；圖7顯示圖2中的人PDGF-C的胺基酸序列和鼠PDGF-C的胺基酸序列的比較；圖8顯示鼠PDGF-C的圖解結構，由信號肽(用斜線框表示)，N端Clr/Cls/胚胎sea urchin蛋白Uegf/骨形態發生蛋白1(CUB)結構域，和C端PDGF/VEGF-同源結構域(用空白框表示)；圖9顯示人和鼠的PDGF-C的PDGF/VEGF同源結構域的序列比較，並和生長因子的VEGF/PDGF家族的其他成員相比較(SEQ IDNO8-17)；圖10顯示幾種屬於VEGF/PDGF家族的生長因子的進化樹；圖11提供存在於人和鼠的PDGF-Cs的CUB結構域的胺基酸序列的比較(SEQ ID NO18和19)和其他的存在於人骨發生蛋白-1(hBMP-1，3個CUB結構域CUB1-3)(SEQ ID NO20-22)和人NP-1(2個CUB結構域)(SEQ ID NO23和24)的CUB結構域的胺基酸序列；圖12顯示幾種人組織中PDGF-C表達的轉錄物的Northern雜交的分析；圖13顯示由低氧誘導的PDGF-C的mRNA的表達水平的變化；圖14顯示人腫瘤細胞系中的PDGF-C的表達；圖15顯示在轉染的COS-1細胞中通過免疫印跡技術檢測全長的人源PDGF-C的結果；圖16顯示全長PDGF-C的分離過程和部分特徵；圖17顯示只含有PDGF/VEGF同源結構域的人源PDGF-C的截短體的分離和部分特徵；圖18為標記的PDGF-BB同源二聚體結合到表達PDGF α-受體的PAE-1細胞上而得到的標準曲線；圖19提供代表抑制標記的PDGF-BB結合到表達PDGF α-受體的PAE-1細胞上的圖形，該抑制可通過增加大量的純化的全長和截短的PDGF-CC蛋白；圖20顯示全長和截短的PDGF-CC同源二聚體對PDGF-α-受體的磷酸化的影響；圖21顯示全長和截短的PDGF-CC同源二聚體對成纖維細胞的致有絲分裂活性；圖22顯示截短的PDGF-CC結合到PDGF受體上的鑑定結果；圖23顯示未消化的全長PDGF-C蛋白和纖維蛋白溶酶發生的26-28kDa的蛋白片段的免疫雜交；圖24表示全長PDGF-C和截短的PDGF-C的競爭性結合到PDGER-α受體的鑑定結果；圖25顯示在還原和非還原條件下通過SDS-PAGE對人PDGF-C CUB結構域進行分析的結果；圖26A-26V顯示正在發育的小鼠胚胎中的PDGF-C的表達狀況；圖27A-27F顯示正在發育的的腎中PDGF-C，PDGF-A和PDGFR-α的表達狀況；
圖28A-28F顯示從野生型(圖28A和28c)，PDGFR-α-/-(圖28B和28F)，PDGF-A-/-(圖28D)和PDGF-A/PDGF-B double-/-(圖28E)腎而來的E 16.5腎的組織學。
優選實施例的具體描述圖1(SEQ ID NO2)顯示完整的編碼人PDGF-C(hPDGF-C)(2108bp)的cDNA的核酸序列，該hPDGF-C是VEGF/PDGF家族的新成員。比較編碼hPDGF-C的克隆#4(見圖3和圖4-SEQ ID NO4和5)與鼠蛋白(相對應的27個胺基酸)得知克隆#4不是全長序列，缺乏了大約80個鹼基對的編碼序列。從人胎兒肺cDNA文庫中分離出的另外的cDNA克隆包括上述缺失序列的插入片段。克隆#10比克隆#4有更長的插入。克隆#10的插入從5』區域開始，並含有缺失的序列。克隆10#包括人PDGF-C的全序列。圖1(SEQID NO2)中列出一些5』-未翻譯的序列，一些已翻譯的編碼人PDGF-C的cDNA的序列和一些3』-未翻譯的核酸序列。終止密碼子位於起始ATG上遊21bp處(圖1中起始ATG下端劃線)。
通過對NCBI的EST資料庫和dbEST的搜索，尋找到一個人的EST序列(W21436)，該序列編碼鼠PDGF-C中與人同源的部分。由此，可以開始進行分離未發現的人PDGF/VEGF的工作。根據所得的人EST序列，兩個寡核苷酸鏈設計如下5』-GAA GTT GAG GAA CCC AGT G-3』5』端引物(SEQID NO25)5』-CTT GCC AAG AAG TTG CCA AG-3』3』端引物(SEQID NO26)使用上述的寡核苷酸引物可以通過PCR技術擴增出人胎兒肺5』-STRETCH PLUSλgt10 cDNA文庫中的長度為348bp的多核苷酸。再將PCR產物克隆到TA克隆試劑盒的PCR 2.1-載體上(Invitrogen)。隨後，根據標準的技術，長度為348bp的PCR產物克隆可用於構建hPDGF-C探針。
人胎兒肺5』-STRETCH PLUS gt10 cDNA文庫(Clontech)中的106種λ-克隆可根據標準的方法用hPDGF-C探針進行篩選。在幾個陽性克隆中，重點分析克隆#4，根據標準的方法，使用內部的和載體寡核苷酸確定其上插入的核苷酸序列。克隆#4的插入片段含有編碼全長的人PDGF-C(hPDGF-C)的cDNA的部分核苷酸序列。圖3(SEQ ID NO4)顯示了克隆#4插入的核苷酸序列(1536bp)。此cDNA翻譯的部分包括核苷酸第6位到第956位。圖4(SEQ ID NO5)顯示了推測可能是插入序列的翻譯部分的胺基酸序列。該胺基酸序列構成的多肽缺乏全長hPDGF-C多肽的最初28個胺基酸殘基，但是該多肽包括可以充分激活PDGF α受體的蛋白水解片段。應該注意到SEQ ID NO為5的第一個甘氨酸(Gly)並沒有在全長hPDGF-C中發現。
在通過對NCBI的dbEST資料庫的搜索，找到一個小鼠EST序列(AI020581)，該序列編碼部分一個新的小鼠PDGF、PDGF-C的一部分。絕大多數的小鼠cDNA是通過使用來源於小鼠胚胎λgt10cDNA文庫中的DNA作為模板進行PCR擴增而得到的。為了擴增cDNA的3』端，需要使用根據小鼠EST序列得到的有意義鏈引物(該引物的序列是5』-CTT CAG TAC CTT GGA AGA G，引物1(SEQ ID NO27))，為了擴增cDNA的5』端，需要使用根據小鼠EST序列得到的無意義鏈引物(該引物的序列是5』-CGC TTGACC AGG AGA CAA C，引物2(SEQ ID NO28))。λgt10載體引物是有意義鏈引物5』-ACG TGA ATT CGA CAA GTT CAG CCTGGT TAA(引物3(SEQ ID NO29))和無意義鏈引物5』-ACG TGGATC CTG AGT ATT TCT TCC AGG GTA(引物4(SEQ ID NO30))。載體引物和源自小鼠EST的內部引物被用於標準的PCR反應。被PCR擴增出的片段的大小分別大約是750bp(3′片段)和800bp(5』片段)。這些片段克隆入PCR2.1載體並使用載體引物和內部引物進行核酸序列分析。這些片段不含有mPDF-C的全長序列，鼠肝ZAP cDNA文庫用標準的方法進行篩選。構建一段32P標記的261bp的PCR片段作為探針，利用引物1和引物2並使用源於鼠胚胎λgt10文庫的DNA作為模板(見上)。將陽性的噬菌斑純化，再通過亞克隆獲得插入的核苷酸序列。載體特異性引物和內部引物被使用。通過分析產生的PCR克隆和分離出的克隆的核苷酸序列信息，可以推斷出mPDGF-C的全長的胺基酸序列(見圖6)(SEQ ID NO7)。
圖7顯示了鼠和人的PDGF-C的胺基酸序列的比較情況(SEQIDNO分別是6和2)。該比較表明人和鼠的PDGF-Cs有大約87％的相同性，在蛋白全長的345個胺基酸殘基中有45個胺基酸被替換。幾乎所有觀察到的胺基酸的替換本質上是保守的。預測的mPDGF-C中信號肽酶水解的位點位於殘基G19和T20之間。這一點會產生鼠類的可分泌的由326殘基構成的多肽。
圖8提供了帶有信號序列(用斜線框表示)、N-端CUB結構域和C-端PDGF/VEGF同源結構域(用空白框表示)的鼠PDGF-C的圖解的結構域的結構。劃線顯示的胺基酸序列與CUB結構域或與VEGF-同源結構域沒有明顯的相似性。
高度的序列相同性表明人和鼠的PDGF-C有幾乎相同的結構域結構。胺基酸序列的比較顯示鼠和人的PDGF-C均有一個新的結構域結構。除了位於兩種蛋白質(殘基164到345)的C-端區域的PDGF/VEGF-同源結構域之外，在兩種PDGF-Cs的N-端區域均有一個結構域可歸於CUB結構域(Bork and Beckmann，J.Mol.Biol.，1993231，539-545)。該大約110胺基酸的結構域最初從補體因子Clr/Cls中被鑑別出，但是最近又在其它幾種細胞外蛋白中發現，包括，信號分子，例如骨發生蛋白1(BMP-1)(Wozney et al.，Science，1988 242，1528-1534)，受體分子，例如NP-1(Soker et al.，Cell，1998 92 735-745)。儘管CUB結構域的功能不清楚，但是它有可能參與蛋白-蛋白相互作用或者參與與蛋白聚糖硫酸肝素之類的碳水化合物相互作用。
圖9顯示人和鼠的PDGF-Cs的C-端PDGF/VEGF-同源結構域的胺基酸序列的比較以及與PDGF/VEGF家族成員如VEGF165、PLGF-2、VEGF-B167、Pox Orf VEGF、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-A和PDGF-B的C-端PDGF/VEGF-同源結構域的胺基酸序列的比較(SEQ ID NO8-17)。在這張圖中VEGF-C和VEGF-D的N-端和C-端區域的一些胺基酸序列被略去了。間隙被引入以優化比較。該比較用J.Hein的方法(Methods Enzymol.，1990 183 626-45)和PAM250殘基權重表得到。用方框表示的殘基顯示的是與位於兩個遠距離單元內部的PDGF-Cs相匹配的胺基酸。
該比較顯示PDGF-C有預料中由半胱氨酸殘基構成的結構，除了一個例外。在半胱氨酸3和4之間，通常由2個殘基隔開，有三個胺基酸(NCA)的插入。PDGF-C中這種序列的特點是出乎意料的。
根據圖9中的胺基酸序列比較，可以構建出圖10顯示的進化樹。數據表明PDGF-C同源結構域與VEGF-C和VEGF-D的PDGF/VEGF-同源結構域密切相關。
正如圖11所示，將來源於幾種含CUB的蛋白質的胺基酸序列進行了比較。結果顯示人和鼠PDGF-C的簡單CUB結構域有顯著的相同性，同大多數相近的CUB結構域相比也有同樣的結果。來源於人BMP-1，具有3個CUB結構域(SEQ ID NO20-22)的序列和具有2個CUB結構域(CUB1-2)(SEQ ID NO分別是23和24)的人NP-1的序列圖中也有顯示。間隙被引入以優化比較。該比較用J.Hein的方法(Methods Enzymol.，1990 183 626-45)和PAM250殘基權重表而得到。
圖12顯示了在幾種人的組織中的PDGF-C轉錄物的表達產物的Northen雜交的分析結果。該分析表明PDGF-C由一個主要的大約為3.8-3.9kb的轉錄物和一個次要的2.8kb的轉錄物編碼所得。右邊的數目指的是mRNA(用kb表示)的大小。PDGF-C的組織表達由已經商業化的MTN技術檢測(Clontech)。該雜交檢測可根據供應商的指導進行，在68℃使用ExpressHyb溶液溫育一個小時(高度嚴格條件)，用來源於如上所述篩選出的胎兒肺cDNA文庫的353bp的hPDGF-C EST探針進行檢測。該雜交隨後在含有0.05％SDS的50℃ 2X SSC清洗30分鐘，然後再在含有0.1％的SDS的50℃ 0.1X SSC溶液中清洗40分鐘。然後將該雜交轉到膜上，在-70℃曝光。雜交結果顯示PDGF-C轉錄物在心臟，肝，腎，胰腺和卵巢中最豐富，而在其它的組織中，諸如胎盤，骨骼肌，前列腺，其含量水平很低。而在脾臟，結腸，外周血液白細胞中PDGF-C含量低於可檢測的水平。
圖13顯示由低氧引起的PDGF-C mRNA的表達的調節狀況。Marker(用kb表示)位於下面的面版的左邊。估計的PDGF-C mRNAs大小顯示於上面面板的左邊(分別為2.7和3.5kbs)。為了調查PDGF-C是否受低氧誘導，將培養的人皮膚成纖維細胞暴露於低氧條件下分別為0，4，8，24小時。使用寡聚-dT纖維素親和層析純化法將Poly(A)＋mRNA從細胞中分離出來。分離出的mRNA在12％的瓊脂糖中電泳，每道上樣4μg mRNA，然後進行Northern雜交，即和PDGF-C的探針雜交。這兩條帶的大小一方面由將同樣的濾膜和hVEGF、hVEGF-B和hVEGF-C探針的混合物雜交而決定(Enholmet al.Oncogene，1997 14 2475-2483)，另一方面依據已知的mRNA的大小的插值而決定。圖13中顯示的結果表明PDGF-C在人皮膚成纖維細胞中不受低氧的調節。
圖14顯示人腫瘤細胞系中的PDGF-C mRNA的表達。為了調查是否PDGF-C在人腫瘤細胞系中表達，從幾種已知的腫瘤細胞系中分離出Poly(A)＋mRNA，然後進行12％的瓊脂糖電泳，再通過和PDGF-C探針雜交的Northem雜交方法進行分析。圖14的顯示的結果表明PDGF-C mRNA在幾種類型的人腫瘤細胞系中表達，諸如JEG3(人絨毛膜癌，ATCC #HTB-36)，G401(Wilms氏腫瘤，ATCC#CRL-1441)，DAMI(成巨核細胞白血病)，A549(人肺癌，ATCC #CCL-185)和HEL(人紅白血病，ATCC #TID-180)。應該注意到可以通過抑制PDGF-C而抑制這些PDGF-C表達的腫瘤的進一步生長。同樣，也可檢測PDGF-C的表達作為一種鑑定特異的腫瘤類型的方法。
實施例1針對人PDGF-C的特異性抗肽抗體的產生兩條合成的肽段被用於產生針對人PDGF-C的抗體。第一條合成肽對應於全長PDGF-C的N-端的29-48殘基，其中包括N-端和C-端的額外的半胱氨酸殘基CKFQFSSNKEQNGVQDPQHERC(SEQID NO31)。第二條合成肽對應於全長PDGF-C內部區域的殘基230-250，其中包括位於C-端的額外的半胱氨酸殘基GRKSRVVDLNLLTEEVRLYSC(SEQ ID NO32)。根據供應商的指導這兩個合成肽通過使用N-琥珀醯亞氨基-1-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Pharmacia Inc.)而彼此連接到載體蛋白即拴孔糾纏血藍蛋白(KLH，Calbiochem)上，在磷酸緩衝鹽(PBS)中200-300毫克連接產物分別在弗氏完全佐劑中乳化並在兔的多位點進行皮下注射。每隔兩周對兔用同樣量的在弗氏完全佐劑中乳化的連接產物進行皮下注射。抽出收集兔血並用已知的標準方法製備血清。
實施例2哺乳動物細胞中全長的人PDGF-C的表達將編碼人PDGF-C的全長cDNA克隆入具有SV40啟動子的哺乳動物表達載體，即pSG5(Stratagene，La Jolla，CA)。使用DEAE-葡聚糖將由此載體轉染的COS-1細胞收集，用沒有插入cDNA的pSG5載體來作陰性對照。在轉染24小時後向轉染的COS-1細胞中加入無血清培養基，在加入培養基24小時後收集含有分泌的蛋白質的液體。這些液體在冰浴的三氯乙酸中作用30分鐘後易於產生聚沉，再用丙酮洗滌沉澱。該聚沉的蛋白在還原條件下溶解於SDS上樣緩衝液中並根據標準方法用SDS-PAGE膠將蛋白分開。分開的蛋白質電轉移到Hybond濾膜上再用針對全長PDGF-C的兔抗血清進行免疫雜交，兔抗血清的製備如上所述。結合的抗體可用增強的化學螢光(ECL，Amersham Inc.)方法檢測出來。圖15顯示該免疫雜交的結果。樣品只是部分還原，人PDGF-C的單體為大小為55kDa(下面的帶)，而二聚體大小為100kDa(上面的帶)。該結果表明蛋白質以完整的形式分泌並且在哺乳動物細胞中的分泌的過程中沒有主要的蛋白水解過程。
實施例3在杆狀病毒感染的Sf9細胞中的全長和截短的人PDGF-C的表達人PDGF-C的cDNA的(970bp)的全長編碼部分可根據標準的條件和程序使用Deep Vent DNA聚合酶(Biolabs)通過PCR方法進行擴增。全長PDGF-C擴增30個循環，每個循環包括94℃變性1分鐘，56℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘。5』端引物是5』CGGGATCCCGAATCCAACCTGAGTAG3』(SEQ ID NO33)，該引物包括一個BamHI位點(用下劃線表示)用於進行克隆。3』端引物是5′GGAATTCCTAATGGTGATGGTGATGATGTTTGTCATCGTCATCTCCTCCTGTGCTCCCTCT3′(SEQ ID NO34)。該引物包括一個EcoRI位點(用下劃線表示)和由腸激酶位點產生的C-端6XHis tag的序列。另外，人PDGF-C的PDGF/VEGF同源結構域(PVHD)的殘基230-345可根據標準的條件和方法使用Deep VentDNA聚合酶(Biolabs)通過PCR方法進行擴增。PDGF-C的PVHD的殘基230-345擴增25個循環，每個循環包括94℃變性1分鐘，56℃退火4分鐘，72℃延伸4分鐘。5』端引物是5』CGGATCCCG.GAAGAAAATCCAGAGTGGTG3′(SEQ ID NO35)該引物包括一個BamHI位點(下劃線)用於克隆。3』端引物是5′GGAATTCCTAATGGTGATGGTGATGATGTTTGTCATCGTCATCTCCTCCTGTGCTCCCTCT-3′(SEQ ID NO36)，該引物包括一個EcoRI位點(下劃線)和編碼由腸激酶位點產生的C-端6X His tag的序列。PCR產物用BamHI和EcoRI消化，然後克隆入杆狀病毒表達載體即pAcGP67A。證實PCR產物的正確序列克隆入載體可通過核酸測序得到驗證。然後根據手冊(Pharminogen)將線性化的杆狀病毒DNA的表達載體共轉染入Sf9昆蟲細胞Sf9。根據手冊(Pharminogen)在開始大規模蛋白生產和純化之前先將重組杆狀病毒擴增數次。
用重組杆狀病毒感染用無血清培養基培養的Sf9細胞(multiplicity of infection～7)。感染4天之後，收集含有重組蛋白質的培養基，將其和Ni-NTA-瓊脂糖珠體(Qiagen)溫育。將珠體收集到柱中，使用高強度的洗脫條件50mM磷酸鈉緩衝液，pH8，含有300mM NaCl(洗脫緩衝液)，結合的蛋白質可通過增加洗脫緩衝液中咪唑的濃度(從100mM到500mM)洗脫下來。洗脫的蛋白質在還原和非還原的條件下通過12.5％的聚丙醯胺膠的SDS-PAGE進行分析。在進行免疫雜交的分析時，蛋白質電轉移到Hybond濾膜，轉移時間45分鐘。
圖16A-C顯示全長人的PDGF-C蛋白的分離過程及其部分特徵。在圖16A中，通過使用針對N-端肽的抗肽抗體進行雜交(如上述)，可以看見重組的全長蛋白質。在圖16B中，通過使用針對內部肽的抗肽抗體進行雜交(如上述)，可以顯現出重組的全長蛋白質的條帶。通過使用考馬斯亮藍染色的方法可以看見分離得到的蛋白質帶。通過使用考馬斯亮藍染色的方法可以看見分離得到的蛋白質(圖16C)。圖16A-C底部的數字指的是用於將蛋白質從Ni-NTA柱上洗脫下來的咪唑的濃度，以摩爾表示。圖16A-C顯示全長的蛋白質在非還原條件下以99kDa的大小遷移，在還原條件下以55kDa的大小遷移。這一點表明全長的蛋白質是二硫鍵交聯的二聚體。
圖17A-C顯示只含有PDGF/VEGF同源結構域的人PDGF-C的截短形式的分離過程和部分特徵的分析。在圖17A中，從Ni-瓊脂糖柱洗脫下來的片段的免疫雜交的分析表明蛋白質可以根據咪唑的濃度變化洗脫下來(範圍100-500mM)。洗脫下的片段在非還原條件下分析，通過使用針對內部肽的抗肽抗體進行雜交(如上述)，可以看見截短後的人PDGF-C。圖17B顯示和圖17A中考馬斯亮藍染色的相同的片段。這一點表明該過程產生了高度純化的物質以36kDa的大小進行遷移。圖17C顯示還原條件和非還原條件下的截短的人PDGF-C蛋白質以考馬斯亮藍染色後的條帶。數據表明蛋白質是由二硫鍵連接的可分泌的二聚體，單體以24kDa的大小遷移。
實施例4全長和截短的PDGF-C的受體結合性質通過考察全長的和截短的PDGF-C與可溶的Ig-融合蛋白的結合能力(其中該Ig-融合蛋白包括VEGF-1、VEGF-2或者VEGF-3的胞外結構域)，從而可以了解全長的和截短的PDGF-C與VEGF受體的相互作用狀況(Olofsson et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998 9511709-11714)。這裡融合蛋白是指VEGFR-1-Ig、VEGFR-2-Ig或者VEGFR-3-Ig，它們在人293EBNA細胞中表達。所有的Ig融合蛋白都是人源VEGFRs。轉染後，將細胞保溫24小時，用含0.2％的牛血清白蛋白的DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Medium)清洗，再繼續培養24小時。加入蛋白A-Sepharose珠體，可以使得融合蛋白從培養基中聚沉下來。這些珠體與100μl的10X結合緩衝液(5％牛血清白蛋白，0.2％Tween 20和10μg/ml的肝素)及900μl用以培養293個細胞的條件培養基聯合使用，這293個細胞已經用編碼含有全長或截短的PDGF-C的哺乳動物表達質粒或用對照載體轉染過，然後通過代謝用35S-半胱氨酸和甲硫氨酸作標記4-6小時。2.5小時以後，室溫下，用4℃下的曾含有磷酸緩衝鹽的結合緩衝液洗滌Sepharose珠體3次並在SDS-PAGE緩衝液中煮沸。結合到Ig-融合蛋白質的標記蛋白質可以通過還原條件下的SDS-PAGE來分析。用磷光分析儀可以檢測出帶有放射性標記的蛋白質。在所有的這些分析中，放射性標記的PDGF-C沒有顯示出與任何VEGF受體有相互作用。
下一步，通過分析他們與PDGF-BB競爭結合到PDGF受體上的能力，以檢測全長的和截短的PDGF-C結合到人PDGF-C受體α和β的能力。結合實驗以可以穩定表達人PDGF-C受體α和β的豬主動脈內皮-1細胞為對象(Erikson et al.，EMBO J，1992，11，543-550)。結合實驗的具體過程參照Heldin et al.，EMBO J，1988，71387-1393。不同濃度的全長和截短人PDGF-C或人PDGF-BB與5ng/ml的125I-PDGF-BB在結合緩衝液(含有1mg/ml牛血清白蛋白的PBS)中混合。液體和放置於24孔培養板中的可以表達受體的PAE-1細胞冰浴90分鐘。在用結合緩衝液洗滌三遍以後，通過在20mM Tris-HCl，pH 7.5，10％甘油，1％Triton X-100中裂解細胞以抽提附著於細胞上的125I-PDGF-BB。細胞帶有的放射性用β計數器檢測。圖18顯示了125I標記的PDGF-BB同源二聚體結合到表達PDGFα-受體的PAE-1細胞上的標準曲線。加入到保溫體系中的未標記的過量的蛋白質將有效的和放射性標記的示蹤物的細胞結合相競爭。
圖19顯示截短的PDGF-C有效的競爭結合到PDGF α-受體上，而全長的PDGF則不然。全長和截短的蛋白質均不能競爭結合到PDGF β-受體上。
實施例5PDGF α-受體磷酸化為了驗證是否PDGF-C引起了PDGF α-受體的磷酸化的增加，檢測了全長和截短的PDGF-C結合到PDGF α-受體上和刺激磷酸化增加的能力。無血清培養的可以穩定表達人PDGF α-受體的豬主動脈內皮細胞與PBS在置於冰上90分鐘，該PBS添加有1mg/ml BSA和10ng/ml PDGF-AA，100ng/ml全長人PDGF-CC同源二聚體(flPDGF-CC)，100ng/ml的截短PDGF-CC同源二聚體(cPDGF-CC)，10ng/ml PDGF-AA和100ng/ml的截短PDGF-CC的混合物。全長和截短PDGF-CC同源二聚體按上述方法製備。在加入多肽後60分鐘，用細胞裂解液裂解細胞(20mM tris-HCl，pH7.5，0.5％Triton-X100，0.5％脫氧膽酸，10mM EDTA，1mM orthvanadate，1mM PMSF，1％Trasylol)。PDGF α-受體可從澄清的溶胞產物中用針對人PDGF α-受體的兔抗血清進行免疫聚沉(Eriksson et al.，EMBO J，1992 11 543-550)。聚沉的受體進行SDS-PAGE。經過SDS膠電泳之後，聚沉的受體轉移到硝酸纖維素膜上，該膜用抗磷酸化酪氨酸抗體PY-20檢測(Transduction Laboratories)。然後該膜與連有辣根過氧化物酶的抗鼠抗體溫育。用增強的化學螢光法檢測結合的抗體(ECL，Amersham Inc.)。然後洗去膜上的物質，再用PDGF α-受體兔抗血清進行檢查，受體的量通過和連有辣根過氧化物酶的抗兔抗體溫育，再進行檢測來決定。用增強的化學螢光法檢測結合的抗體(ECL，Amersham Inc.)。通過對膜上PDGF α-受體抗體的檢測顯示所有的泳道均含有等量的受體。實驗中以PDGF-AA作為對照。圖20顯示的是截短的而不是全長的PDGF-CC，它能夠有效的誘導PDGF α-受體酪氨酸磷酸化。這一點表明截短的PDGF-CC是潛在的PDGF α-受體的激動劑。
實施例6PDGF-C對成纖維細胞的致有絲分裂作用圖21顯示截短和全長的PDGF-CC對成纖維細胞的致有絲分裂活性。測活方法見Moil et al.，J.Biol.Chem.，1991 266 21158-21164。無血清培養的人包皮成纖維細胞與1ml無血清培養基溫育24小時，該培養基中含有0.2umCi[3H]的胸腺嘧啶核苷，又添加了1mg/mlBSA和3ng/ml、10ng/ml、30ng/ml全長PDGF-CC(flPDGF-CC)，截短的PDGF-CC(cPDGF-CC)或者PDGF-AA。在三氯乙酸聚沉後，[3H]胸腺嘧啶核苷滲入DNA的程度由β-計數器決定。結果表明，不是全長的PDGF-CC，而是截短的PDGF-CC才是潛在的促成纖維細胞分裂劑。實驗中以PDGF-AA作為對照。
PDGF-C不與任何已知的VEGF受體結合。PDGF-C是目前所知的唯一的能夠結合PDGF α-受體，並增加其磷酸化的VEGF家族成員。PDGF-C也是目前所知唯一的潛在的促成纖維細胞分裂的VEGF家族成員。這些特徵表明PDGF-C的截短形式可能不是VEGF家族成員，而是一種新的PDGF。另外，全長的蛋白質可能是潛在的生長因子，需要經過蛋白水解釋放出活性的PDGF/VEGF同源結構域，它才被激活。已知的蛋白水解位點位於全長蛋白質的殘基231-234(-R-K-S-R-)處的二元基序。通過比較鼠和人的PDGF-Cs，顯示該位點的結構是保守的(圖7)。優選的蛋白酶包括因子X和腸激酶，當然並不僅限於此。N-端CUB結構域可以作為抑制結構域，可用於在某些細胞外室定位潛在的生長因子(例如細胞外骨架)，需要的話它可以通過特定的蛋白水解除去，例如在胚胎發育過程中、組織再生期間和組織重建過程，包括骨重建，活性血管生成，腫瘤惡化，腫瘤侵入，轉移形成和/或傷口癒合。
實施例7結合有截短的PDGF-C的PDGF受體通過檢測截短了的PDGF-C與分別表達PDGF α或β受體的豬主動脈內皮-1(PAE-1)細胞結合的能力，以評估截短了的PDGF-C和PDGFα和β受體之間的相互作用(Eriksson et al.，EMBO J，1992，11，543-550)。實驗中具體的結合步驟可參見Heldin et al.，EMBOJ，1988，7 1687-1393。在10μl硼酸鈉緩衝液中，用Bolton-Hunter試劑(Amersham)對截短了的PDGF-C蛋白(5μg)進行放射性標記，使其放射活性達到4x105cpm/ng。將含有不同濃度的帶放射性標記的截短的PDGF-C的結合緩衝液(1mg/ml牛血清白蛋白PBS)，加入24孔培養板，培養板每孔中均含有可表達受體的細胞PAE-1，置於冰上90分鐘，或加入未標記的蛋白，置於冰上90分鐘。使用結合緩衝液洗滌三次，用裂解液(20mM Tris-HCl，pH7.5，10％甘油，1％Triton-100)裂解細胞以抽提結合在細胞上的125I-標記的PDGF-C。細胞結合的放射性劑量由γ-計數器測定。在某些實驗中加入了過量100倍的截短了的PDGF-C，並未檢測到非特異性的結合。所有的結合數據為三次實驗的平均值，實驗中實驗的誤差在10-15％。如圖22所示，截短的PDGF-C僅僅與表達PDGF α受體的細胞結合，而不與表達PDGF β受體的細胞結合。當用過量100倍的未標記蛋白定量的替換帶放射性標記的PDGF-C，結果顯示結合是特異性的。
實施例8蛋白水解酶對全長PDGF-C影響為了證明全長PDGF-C是否可以被特定的蛋白水解作用激活並從CUB結構域釋放出和PDGF/VEGF同源的結構域，使用不同的蛋白酶處理全長蛋白。例如，在含有1mM CaCl2、1mM MgCl2和0.01％Tween 20的20mM Tris-HCl(PH7.5)中，使用濃度為每毫升2-3單位的纖維蛋白溶酶(Sigma)處理全長PDGF-C，37攝氏度溫育1.5-4.5小時。釋放出的結構域與上述在轉染細胞裡產生的截短的PDGF-C在大小上基本是相同的。纖維蛋白溶酶消化的PDGF-C和未被消化的全長PDGF-C在還原狀態下進行SDS-PAGE膠。SDS-PAGE凝膠電泳後，分開的蛋白被轉移到硝酸纖維素濾膜上，濾膜用兔抗多肽抗血清探針標記，標記位置在全長蛋白的230—250位殘基處(殘基GRKSRVVDLNLLTEEVRLYSC(SEQ ID NO37)正好位於PDGF/VEGF同源結構域的N-末端)。用增強的化學螢光法(ECL，Amersham Inc)可以檢測抗體的結合。圖23顯示了用55kDa未消化的全長蛋白和纖維蛋白溶酶消化的全長蛋白後的26-28kDa蛋白免疫雜交的結果。
實施例9PDGF α受體結合纖維蛋白溶酶消化的PDGF-C為了確定PDGF α受體與纖維蛋白溶酶消化的PDGF-C的相互作用，用纖維蛋白溶酶消化的PDGF-C結合豬主動脈內皮-1細胞表達的PDGF α受體，以檢測其結合能力(Eriksson et al.，EMBO J，1992，11 543-550)。受體結合實驗按例7步驟操作，用30ng/ml I125標記的切斷的PDGF-C作為示蹤劑。如圖24所示，增加纖維蛋白溶酶消化的PDGF-C濃度，可以比未消化的全長PDGF-C更有效地與PDGF α受體競爭結合。這些實驗顯示了全長PDGF-C是一個潛在的生長因子，不能與PDGF α受體相互作用，而受限於蛋白水解作用，使其釋放C-末端的PDGF/VEGF同源結構域，這對於產生一個有活性的PDGF α受體的配體/激動劑是必需的。
實施例10克隆並表達人PDGF-C CUB結構域人PDGF-C基因中有430個鹼基的cDNA片段編碼CUB結構域(在全長PDGF-C的第23-159位胺基酸殘基)，可以利用Deep VentDNA聚合酶(Biolabs)在標準條件和步驟下進行PCR擴增，該編碼序列5』端引物用5』cgggatcccgaatccaacctgagtag3』(SEQ ID NO38)。這個引物包含一個BamHI位點(下劃線)用以克隆。該編碼序列3』端引物用5』ccggaattcctaatggtgatggtgatgatgtttgtcatcgtcgtcgacaatgttgtagtg3』(SEQ ID NO39)。這條引物包含一個EcoRI位點(下劃線)，並且此序列C末端編碼一個由腸激酶位點連接的6x組氨酸標記。擴增後的PCR片段隨後被克隆到pACgp67A轉化載體上。CUB-pACgp67A表達框的正確序列由自動核酸測序儀驗證。然後依照製備的流程(Pharmingen)，表達載體與Baculogold線性化的杆狀病毒DNA共轉化到昆蟲細胞Sf9中。重組的杆狀病毒在大規模蛋白生產之前被擴增若干次，蛋白純化步驟根據手冊進行(Pharmingen)。
用重組杆狀病毒感染用無血清培養基培養的Sf9細胞(multiplicity of infection～7)。感染72小時之後，收集含有重組蛋白質的培養基，將其和Ni-NTA-瓊脂糖珠體(Qiagen)溫育。將珠體收集到柱中，使用高強度的洗脫條件50mM磷酸鈉緩衝液，pH8，含有300mM NaCl(洗脫緩衝液)，結合的蛋白質可通過增加洗脫緩衝液中咪唑的濃度(從100mM到500mM)洗脫下來。洗脫的蛋白質在還原和非還原的條件下通過聚丙醯胺膠的SDS-PAGE進行分析。
圖25顯示了考馬斯亮藍染色凝膠後的結果。人PDGF-CUB結構域是一個二硫鍵連接的同源二聚體，分子量在非還原狀態下約為55kD，而兩個約25和30kD的單體分別在還原狀態下存在。造成這種差異的原因可能是在CUB結構域25和55位胺基酸這兩個葡糖醯胺化位點進行了不同的N-連接的葡糖醯胺化反應。圖左側是加有標準蛋白的泳道。
實施例11PDGF-C轉錄子在發育的小鼠胚胎中的定位為了更多了解PDGF-C的生物學功能，在小鼠胚胎的頭部(圖26A-26S)和尿生殖道(圖26T-26V)區域通過非放射性組織切片原位雜交技術觀測PDGF-C的表達狀況。非放射性組織切片原位雜交使用步驟和PDGF-A及PDGFR-α探針可參見Bostrom et al.，Cell，1996 85 863-873。PDGF-C探針源於小鼠PDGF-C cDNA。圖26A-26V所示的雜交模型是胚胎E16.5，但在E14.5、E-15.5、E-17.5也可見到相類似的模型。檢測探針作為對照，在雜交區段沒有顯示同樣的模型。
圖26A所示的是齒基(t)通過口腔的額部區段。箭頭所指的是口部外胚層PDGF-C表達的位點。同時標明了舌(to)。圖26B-26D顯示了PDGF-C在發育齒管的上皮細胞中的表達。與發育中的顎外胚層一樣(圖26C右箭頭)，個別細胞在這個區域顯示出很強的標記(圖26D箭頭)。圖26E顯示了通過眼部的額部區段，這裡發現PDGF-C在毛囊(雙箭頭)和發育中的眼瞼處表達。同時標明了視網膜(r)。在圖26F和26G中，PDGF-C的表達在發育中的毛囊根鞘外側上皮被發現。圖26H中，PDGF-C在發育的眼瞼中的表達被顯示。在發育開口有個別帶有很強標記信號的PDGF-C陽性細胞出現。同時標明了晶狀體(1)。圖26I，PDGF-C在發育淚腺中的表達用箭頭指出。圖26J，PDGF-C在發育中的外耳表達。表達見於外部聽覺道(左箭頭)和表皮裂口處的早期耳廓(e)。圖26K和26L是PDGF-C在耳蝸的表達。表達見於半環狀管(26K箭頭處)。臨近發育中毛細胞的上皮細胞存在PDGF-C mRNA的極化分布(圖26L箭頭)。圖26M和26N是PDGF-C在口腔的表達。水平切片展示了頰上皮(圖26M箭頭)和形成中低唇頰與齒齦上皮(圖26N箭頭)間裂口中PDGF-C的表達。齒原基(t)和舌(to)同時被顯示出來。圖26O和26P顯示了水平切片上PDGF-C在發育鼻孔中的表達，。PDGF-C表達最強出現在上皮分層和正常管道形成之前(圖26O和26P箭頭)。發育中的鼻孔也被註明(n)。圖26Q-26S顯示了PDGF-C在發育唾液腺管中的表達。圖26Q是舌下腺。圖26R和26S顯示了上頜腺、唾液腺(sg)和唾液管(sd)。圖26T-26V顯示了PDGF-C在尿生殖道的表達。圖26T顯示了PDGF-C在發育中腎的後腎中胚層的表達。圖26U顯示了PDGF-C在尿道(ua)和發育中陰莖的上皮周圍的表達。圖26V顯示了PDGF-C在發育中輸尿管(u)的表達。
實施例12PDGF-C、PDGF-A和PDGFR-α在發育中腎的表達PDGF-C表達的最強處點之一在發育的腎中，因此PDGF-C、PDGF-A和PDGFR-α的表達也見於發育的腎中。圖27A-27F顯示了非放射性原位雜交的結果，(在未染的背景下用DIC光學檢測所染的藍色)顯示了E16.5時它們mRNA在腎中的表達，PDGF-C(圖27A和27B)、PDGF-A(圖27C和27D)及PDGFR-α(圖27E和27F)。在圖27B、27D和27F中的白色虛線描繪出了皮層邊界的輪廓。圖27A、27C和27E中短線表示250μM，圖27B、27D和27F中代表50μM。
PDGF-C表達見於後腎間質(圖27Amm)，在稠合間質中(圖27B箭頭)表達水平增強，稠合間質可以經過上皮轉化進一步進行管狀發育，位於輸尿管芽(ub)的兩側。PDGF-C在早期腎單位上皮聚集處(B箭頭處)保持較低水平的表達，在成熟腎小球(gl)到管結構沒有表達。
PDGF-A表達沒有在這些早期聚集體中發現，但在管發育的較晚階段強烈表達(圖24C和24D)。PDGF-A在早期腎單位的上皮聚集體中表達(圖27D箭頭處)，但一旦腎單位進一步發育，PDGF-A表達變得對發育的細尿管絆(圖27D箭頭)有限制性。在發育骨髓的細尿管絆(圖27C箭頭)中可見表達最為強烈。在分支輸尿管(u)和輸尿管芽(ub)中不見PDGF-A。
因此，PDGF-C和PDGF-A表達模式在發育腎單位中具有空間的和時間的差異。在腎單位發育的最早階段(間質聚集體)表達PDGF-C，而在最晚階段(細尿管絆)表達PDGF-A。
PDGFR-α表達貫穿於發育中腎的間質(圖27E和27F)，因此可以成為PDGF-C和PDGF-A的靶標。在發育的腎中也表達PDGF-B，但僅發生在血管內皮細胞裡。PDGFR-β表達發生在周圍血管間質，PDGF-B激活PDGFR-β這一過程是腎小球中的腎小球細胞重組的必須條件。
這些結果證明了PDGF-C表達發生在PDGFR-α表達位點附近，但不在PDGF-A或PDGF-B的表達位點附近。這顯示了PDGF-C可能在體內通過PDGFR-α發揮作用，且不需要PDGF-A或PDGF-B的幫助。
既然在發育的腎中PDGF-C獨一無二的表達模式顯示其行使PDGFR-α激動劑的功能，並且與PDGF-A和PDGF-B不相關，我們將胚胎16.5天的腎在組織學水平做了一個比較比較PDGFR-α敲除小鼠(圖28B和28F)和野生型小鼠的腎(圖28A和28C)，以及PDGF-A敲除小鼠(圖28D)和PDGF-A/PDGF-B全部敲除小鼠(圖28E)的腎。短線在圖28A和28B中表示250mm，在圖28C-F中表示50μm。
使用PDGF-A、PDGF-B和PDGFR-α雜合突變體(Bostron et al.，Cell，1996 85 863-873；Leveen et al.，Genes Dev.，1994 8 1875-1887；Soriano et al.，Development，1997 124 2691-70)構建C57B16/129sv雜交系，再進行雜交以產生純合突變胚胎。PDGF-A/PDGF-B雜合突變體被雜交來產生PDGF-A/PDGF-B敲除胚胎。由於PDGF-A-/-在E10前的高度致死性(Bostron et al.，Cell，1996 85 863-873)，雙基因敲除的E16.5胚胎所佔比例在雜交系中少於1/40。除了PDGF-A/PDGF-B雙基因敲除的胚胎只獲得了一例外，其餘純合的腎表現型胚胎每種基因型至少被驗證了兩例。
有趣的是在PDGFR-α-/-的腎皮層中(圖28A箭頭和圖28F星號)缺少間隙充質，而在所有其它基因型中間隙充質都存在(圖28C-E星號)。分支輸尿管(u)和後腎間質(mm)及它的上皮衍生物在所有突變體都表現正常。在PDGF-A/PDGF-B雙敲除胚胎中反常的腎小球反映出由於缺少PDGF-B導致腎小球中腎小球細胞無法進行重組。
這些結果顯示了PDGFR-α敲除中有一種腎的表現型沒有在PDGF-A或PDGF-A/PDGF-B敲除的個體中出現，因此反映了潛在的源於PDGF-C的信號缺失。表現型由發育中腎皮層標記的間隙充質缺失組成。在PDGFR-α-/-的腎中，這些細胞的缺失正是由於正常PDGFR-α陽性細胞相鄰於PDGF-C的表達位點。
檢驗PDGF-C功能的生物分析方法實驗的實施是為了評估PDGF-C是否與PDGF-A、PDGF-B、VEGF、VEGF-B、VEGF-C或VEGF-D有相似的可以影響結締組織細胞、成纖維細胞、肌成纖維細胞和神經膠質細胞的生長和運動性，改變內皮細胞功能，調節血管生成，促進創傷癒合的作用。依據受體結合分布的研究，可以進行進一步的實驗。I.對內皮細胞PDGF-C致有絲分裂為了檢測PDGF-C對內皮細胞致有絲分裂能力，PDGF-C多肽被引入含5％血清的細胞培養基中，應用含10％血清的培養基繁殖牛主動脈內皮細胞(BAEs)。BAEs先被接種在24孔培養板中，每個孔中細胞密度在加PDGF-C前一天達到10,000。加入多肽3天以後用胰蛋白酶分離並計數。純化的VEGF在此實驗中作為陽性對照。
II.內皮細胞功能實驗A)內皮細胞增殖內皮細胞生長實驗採用眾所周知的技術方法如Ferrara和Henzel，Nature，1989 380 439-443，Gospodarowics et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989 86 7311-7315，及Claffey et al.，Biochem.Biophys.Acts，1995 1246 1-9。
B)細胞附著實驗檢測PDGF-C對於多形核粒細胞黏附內皮細胞的影響。
C)趨化性用標準Boyden腔趨化性實驗檢測PDGF-C對趨化性的影響。
D)纖維蛋白溶酶原活化實驗內皮細胞被用來檢測PDGF-C對纖維蛋白溶酶原活性抑制生成的影響，採用Pepper et al.，Biochem.Biophy.Res.Commun.，1991 181902-906的方法。
E)內皮細胞遷移實驗PDGF-C刺激內皮細胞遷移並形成管狀的能力在如下實驗中描述Montesano et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1986 83 7297-7301。或者，三維膠原凝膠實驗Joukov et al.，EMBO J.，1996 15 290-298中有所記述，或者可以在修飾的Boyden腔裡用凝膠化膜(Glaser et al.，Nature，1980 288 483-484)。
III.血管生成實驗PDGF-C在絨毛尿囊膜上誘導血管生成響應的能力在下面實驗記述Leung et al.，Science，1989 246 1306-1309。或者採用大鼠角膜實驗Rastinejad et al.，Cell，1989 56 345-355；這是一個體內血管生成實驗可接受的方法，其結果能容易的轉化到其它體內系統。
IV.傷口癒合PDGF-C刺激傷口癒合的能力可以用大多數臨床相關的可見模型檢測，如Schilling et al.，Surgery，1995 46 702-710中記述的或利用Hunt et al.，Surgery，1967 114 302-307。
V.促紅細胞生成系統使用促紅細胞生成素系統的特殊細胞群體進行各種體內和體外的實驗。在小鼠體外幹細胞分析的實驗中，使用螢光細胞分選儀來純化細胞，結果比較令人滿意。
A)重新植入幹細胞這些細胞能夠重新植入經過致死照射的小鼠的骨髓，並有Lin-，Rhhl，Ly-6A/E+，c-kit+幾種表現型。在這些細胞中，單獨加入PDGF-C，或者將PDGF-C與其它因子一起加入細胞，隨後通過摻入的3H-胸腺嘧啶核苷測量細胞的增值。
B)晚期幹細胞這些細胞有相對很小的骨髓再移植能力，但是能產生D13 CFU-S。這些細胞也有Lin-，Rhhl，Ly-6A/E+，c-kit+幾種表現型。在這些細胞中加入PDGF-C，然後注射到經過致死照射的接受體中，對D13脾臟菌落計數。
C)祖代富集(Progenitor-Enriched)細胞這些細胞在體外對單一生長因子的刺激有響應，並具有Lin-，Rhhl，Ly-6A/E+，c-kit+幾種表現型。此實驗目的為驗證是否PDGF-C能直接作用於促紅細胞生成素的祖代細胞。在瓊脂培養基上，將PDGF-C與這些細胞溫育，7-14天後將存活的菌落計數。
VI.動脈粥樣硬化平滑肌細胞在發育或動脈粥樣硬化的發生中扮演了重要的角色，需要它們的表現型從收縮狀態變成合成的狀態。通過影響平滑肌細胞的生長和表現型的變化，巨噬細胞、內皮細胞、T淋巴細胞和血小板都在動脈粥樣硬化過程中起一定作用。用修飾的Rose腔，其中不同細胞類型被接種到對面，一個體外實驗可以動態測量增殖率和平滑肌細胞在多細胞環境下表現型的適應性，由此它被用來檢測PDGF-C對平滑肌細胞的影響。
VII.轉移用Lewis的肺癌模型作PDGF-C抑制轉移能力的實驗，例如用Cao et al.，J.Exp.Med.，1995 182 2069-2077的方法。
VIII.平滑肌細胞的遷移PDGF-C對平滑肌細胞和其它細胞類型遷移的影響可以用Koyama et al.，J.Biol.Chem.，1992 267 22806-22812記述的方法驗證。
IX趨化性PDGF-C對成纖維細胞、單核細胞、粒細胞及其它細胞的影響可用Siegbahn et al.，J.Clin.Invest.，1990 85 916-920記述的方法驗證。
X.在其它細胞類型中的PDGF-C
PDGF-C對增殖、分化和其它細胞類型功能的影響，例如肝細胞、心肌及其它細胞、內分泌細胞和成骨細胞等，可以用已知的技術方法驗證，譬如通過體外培養基中攝取3H-胸腺嘧啶核苷。PDGF-C在這些和其它組織中的表達能被Northern斑點雜交或原位雜交技術測量。
XI.PDGF-C變異體和類似物的構建PDGF-C是PDGF生長因子家族的一員，它和PDGF-C家族其它成員保持高度相同的同源性。PDGF-C包含8個保守的半胱氨酸殘基，這是這個生長因子家族的特點。這些保守的半胱氨酸殘基形成了鏈內二硫鍵，產生了半胱氨酸結結構，而內鏈二硫鍵形成的蛋白二聚體也是PDGF生長因子家族成員的特點。PDGF-C和酪氨酸蛋白激酶生長因子受體相互作用。
對此蛋白結構和與受體結合必須的活性位點及其相關聯的活力所知甚少，根據許多已知的PDGF家族生長因子成員中活性位點和重要胺基酸殘基，設計PDGF-C活力突變體可以大大推進人們在這方面的認識。
已發表的闡明PDGF生長因子家族成員結構和活力關係的文章有許多，其中關於PDGF內容的有Oestman et al.，J.Biol.Chem.，1991266 10073-10077；Andersson et al.，J.Biol.Chem.，1992 267 11260-11266；Oefner et al.，EMBO J.，1992 11 3921-3926；Flemming et al.，Molecular and Cell Biol.，1993 13 4066-4076和Anderson et al.，GrowthFactors，1995 12 159-164；關於VEGF的包括Kim et al.，GrowthFactors，1992 7 53-64；Potgens et al.，J.Biol.Chem.，1994 269 32879-328885和Claffey et al.，Biochem.Biophys.Acta，1995 1246 1-9。這些文章中顯示，由於8個保守半胱氨酸殘基，PDGF生長因子家組成員都展示了特徵結狀摺疊結構和二聚作用，以至於在二聚體分子的每個末端都形成了三個暴露的環形區，預計活性受體結合位點就定位在這裡。
基於以上信息，可以利用現有的生物技術人工設計PDGF-C突變體，即保留8個半胱氨酸殘基以形成結狀的摺疊排列和二聚體，從而可能高度保存PDGF-C活力，同時僅僅通過保留或置換保守胺基酸殘基，檢測在蛋白結構的環1、環2和環3區上可能的受體序列。
在蛋白結構上形成特異靶位點的突變，是蛋白化學家研究方法中的標準技術(Kunkel et al.，Methods in Enzymol.，1987 154 367-382)。這些位點直接誘變在VEGF上的範例可見Potgens et al.，J.Biol.Chem.，1994 269 32879-32885和Claffey et al.，Biochem.Biophys.Acta，1995 1246 1-9。其實，位點直接突變是極其普通的，商業化的試劑盒很容易實現這些步驟(例如Promega 1994-1995商品目錄142—145頁)。
對於PDGF-C突變體來說，測試其對結締組織細胞、成纖維細胞、肌成纖維細胞和神經膠質細胞生長及能動活性，內皮細胞增殖活性，血管生成活性及創傷癒合的作用，可以用已建立好的篩選步驟迅速驗證。例如對於內皮細胞有絲分裂實驗的類似步驟Claffey等已有描述(Biochem.Biophys.Acta，1995 1246 1-9)，可以直接使用。相似的，PDGF-C對其它細胞類型增殖、細胞分化和人新陳代謝方面的影響可以用人們現有的技術檢測。
上述對本發明的描述和所列舉的具體實例只起著解釋和說明的作用，不起限制的作用，即不意味著本發明僅僅包含上述的內容。本領域內的專業人員可以在本發明的基本發明思想的基礎上，根據自己的需要，進行一定的改變和修飾，所以，權利要求中涉及的源自於本發明的擴展也屬於本發明的範疇。
序列表110烏爾夫·埃裡克松卡琳·奧瑟李旭日安尼卡·蓬滕馬爾科·於特拉卡裡·阿利塔洛阿恩·厄斯特曼卡爾—亨裡克·黑爾丁克裡斯特·貝茨霍爾茨120血小板衍生生長因子C、其編碼DNA及其應用130序列表14060/102，4611411998-09-3015060/108，1091511998-11-1215060/110，7491511998-12-0315060/113，0021511998-12-1815060/135，4261511999-05-2115060/144，0221511999-07-1516039170PatentIn Ver.2.0210121116212PRT213Homo sapiens4001Pro Xaa Cys Leu Leu Val Xaa Arg Cys Gly Gly Xaa Cys Xaa Cys Cys1 5 10 1521022112108212DNA213Homo sapiens4002ccccgccgtg agtgagctct caccccagtc agccaaatga gcctcttcgg gcttctcctg 60gtgacatctg ccctggccgg ccagagacga gggactcagg cggaatccaa cctgagtagt 120aaattccagt tttccagcaa caaggaacag aacggagtac aagatcctca gcatgagaga 180attattactg tgtctactaa tggaagtatt cacagcccaa ggtttcctca tacttatcca 240agaaatacgg tcttggtatg gagattagta gcagtagagg aaaatgtatg gatacaactt 300acgtttgatg aaagatttgg gcttgaagac ccagaagatg acatatgcaa gtatgatttt 360gtagaagttg aggaacccag tgatggaact atattagggc gctggtgtgg ttctggtact 420gtaccaggaa aacagatttc taaaggaaat caaattagga taagatttgt atctgatgaa 480tattttcctt ctgaaccagg gttctgcatc cactacaaca ttgtcatgcc acaattcaca 540gaagctgtga gtccttcagt gctaccccct tcagctttgc cactggacct gcttaataat 600gctataactg cctttagtac cttggaagac cttattcgat atcttgaacc agagagatgg 660cagttggact tagaagatct atataggcca acttggcaac ttcttggcaa ggcttttgtt 720tttggaagaa aatccagagt ggtggatctg aaccttctaa cagaggaggt aagattatac 780agctgcacac ctcgtaactt ctcagtgtcc ataagggaag aactaaagag aaccgatacc 840attttctggc caggttgtct cctggttaaa cgctgtggtg ggaactgtgc ctgttgtctc 900cacaattgca atgaatgtca atgtgtccca agcaaagtta ctaaaaaata ccacgaggtc 960cttcagttga gaccaaagac cggtgtcagg ggattgcaca aatcactcac cgacgtggcc 1020ctggagcacc atgaggagtg tgactgtgtg tgcagaggga gcacaggagg atagccgcat 1080caccaccagc agctcttgcc cagagctgtg cagtgcagtg gctgattcta ttagagaacg 1140tatgcgttat ctccatcctt aatctcagtt gtttgcttca aggacctttc atcttcagga 1200tttacagtgc attctgaaag aggagacatc aaacagaatt aggagttgtg caacagctct 1260tttgagagga ggcctaaagg acaggagaaa aggtcttcaa tcgtggaaag aaaattaaat 1320gttgtattaa atagatcacc agctagtttc agagttacca tgtacgtatt ccactagctg 1380ggttctgtat ttcagttctt tcgatacggc ttagggtaat gtcagtacag gaaaaaaact 1440gtgcaagtga gcacctgatt ccgttgcctt gcttaactct aaagctccat gtcctgggcc 1500taaaatcgta taaaatctgg attttttttt ttttttttgc tcatattcac atatgtaaac 1560cagaacattc tatgtactac aaacctggtt tttaaaaagg aactatgttg ctatgaatta 1620aacttgtgtc rtgctgatag gacagactgg atttttcata tttcttatta aaatttctgc 1680catttagaag aagagaacta cattcatggt ttggaagaga taaacctgaa aagaagagtg 1740gccttatctt cactttatcg ataagtcagt ttatttgttt cattgtgtac atttttatat 1800tctccttttg acattataac tgttggcttt tctaatcttg ttaaatatat ctatttttac 1860caaaggtatt taatattctt ttttatgaca acttagatca actattttta gcttggtaaa 1920tttttctaaa cacaattgtt atagccagag gaacaaagat ggatataaaa atattgttgc 1980cctggacaaa aatacatgta tntccatccc ggaatggtgc3tagagttgga ttaaacctgc 2040attttaaaaa acctgaattg ggaanggaan ttggtaaggt tggccaaanc ttttttgaaa 2100ataattaa 21082103211345212PRT213Homo sapiens4003Met Ser Leu Phe Gly Leu Leu Leu Val Thr Ser Ala Leu Ala Gly Gln1 5 10 15Arg Arg Gly Thr Gln Ala Glu Ser Asn Leu Ser Set Lys Phe Gln Phe20 25 30Ser Ser Asn Lys Glu Gln Asn Gly Val Gln Asp Pro Gln His Glu Arg35 40 45Ile Ile Thr Val Ser Thr Asn Gly Ser Ile His Ser Pro Arg Phe Pro50 55 60His Thr Tyr Pro Arg Asn Thr Val Leu Val Trp Arg Leu Val Ala Val65 70 75 80Glu Glu Asn Val Trp Ile Gln Leu Thr Phe Asp Glu Arg Phe Gly Leu85 90 95Glu Asp Pro Glu Asp Asp Ile Cys Lys Tyr Asp Phe Val Glu Val Glu100 105 110Glu Pro Ser Asp Gly Thr Ile Leu Gly Arg Trp Cys Gly Ser Gly Thr115 120 125Val Pro Gly Lys Gln Ile Ser Lys Gly Asn Gln Ile Arg Ile Arg Phe130 135 140Val Ser Asp Glu Tyr Phe Pro Set Glu Pro Gly Phe Cys Ile His Tyr145 150 155 160Asn Ile Val Met Pro Gln Phe Thr Glu Ala Val Ser Pro Ser Val Leu165 170 175Pro Pro Ser Ala Leu Pro Leu Asp Leu Leu Asn Asn Ala Ile Thr Ala180 185 190Phe Ser Thr Leu Glu Asp Leu Ile Arg Tyr Leu Glu Pro Glu Arg Trp195 200 205Gln Leu Asp Leu Glu Asp Leu Tyr Arg Pro Thr Trp Gln Leu Leu Gly210 215 220Lys Ala Phe Val Phe Gly Arg Lys Ser Arg Val Val Asp Leu Asn Leu225 230 235 240Leu Thr Glu Glu Val Arg Leu Tyr Ser Cys Thr Pro Arg Asn Phe Ser
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gacctgctta 480ataatgctat aactgccttt agtaccttgg aagaccttat tcgatatctt gaaccagaga 540gatggcagtt ggacttagaa gatctatata ggccaacttg gcaacttctt ggcaaggctt 600ttgtttttgg aagaaaatcc agagtggtgg atctgaacct tctaacagag gaggtaagat 660tatacagctg cacacctcgt aacttctcag tgtccataag ggaagaacta aagagaaccg 720ataccatttt ctggccaggt tgtctcctgg ttaaacgctg tggtgggaac tgtgcctgtt 780gtctccacaa ttgcaatgaa tgtcaatgtg tcccaagcaa agttactaaa aaataccacg 840aggtccttca gttgagacca aasaccggtg tcaggggatt gcacaaatca ctcaccgacg 900tggccctgga gcaccatgag gagtgtgact gtgtgtgcag agggagcaca ggaggatagc 960cgcatcacca ccagcagctc ttgcccagag ctgtgcagtg cagtggctga ttctattaga 1020gaacgtatgc gttatctcca tccttaatct cagttgtttg cttcaaggac ctttcatctt 1080caggatttac agtgcattct gaaagaggag acatcaaaca gaattaggag ttgtgcaaca 1140gctcttttga gaggaggcct aaaggacagg agaaaaggtc ttcaatcgtg gaaagaaaat 1200taaatgttgt attaaataga tcaccagcta gtttcagagt taccatgtac gtattccact 1260agctgggttc tgtatttcag ttctttcgat acggcttagg gtaatgtcag tacaggaaaa 1320aaactgtgca 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100 105 110His Tyr Ser Ile Ile11521019211117212PRT213Homo sapiens40019Glu Arg Ile Ile Thr Val Ser Thr Asn Gly Ser Ile His Ser Pro Arg1 5 10 15Phe Pro His Thr Tyr Pro Arg Asn Thr Val Leu Val Trp Arg Leu Val20 25 30Ala Val Glu Glu Asn Val Trp Ile Gln Leu Thr Phe Asp Glu Arg Phe35 40 45Gly Leu Glu Asp Pro Glu Asp Asp Ile Cys Lys Tyr Asp Phe Val Glu50 55 60Val Glu Glu Pro Ser Asp Gly Thr Ile Leu Gly Arg Trp Cys Gly Ser65 70 75 80Gly Thr Val Pro Gly Lys Gln Ile Ser Lys Gly Asn Gln Ile Arg Ile85 90 95Arg Phe Val Ser Asp Glu Tyr Phe Pro Ser Glu Pro Gly Phe Cys Ile100 105 110His Tyr Asn Ile Val11521020211113212PRT213Homo sapiens40020Cys Gly Glu Thr Leu Gln Asp Ser Thr Gly Asn Phe Ser Ser Pro Glu1 5 10 15Tyr Pro Asn Gly Tyr Ser Ala His Met His Cys Val Trp Arg Ile Ser20 25 30Val Thr Pro Gly Glu Lys Ile Ile Leu Asn Phe Thr Ser Leu Asp Leu35 40 45Tyr Arg Ser Arg Leu Cys Trp Tyr Asp Tyr Val Glu Val Arg Asp Gly50 55 60Phe Trp Arg Lys Ala Pro Leu Arg Gly Arg Phe Cys Gly Ser Lys Leu65 70 75 80Pro Glu Pro Ile Val Ser Thr Asp Ser Arg Leu Trp Val Glu Phe Arg85 90 95Ser Ser Ser Asn Trp Val Gly Lys Gly Phe Phe Ala Val Tyr Glu Ala100 105 110Ile21021211112212PRT213Homo sapiens40021Cys Gly Gly Asp Val Lys Lys Asp Tyr Gly His Ile Gln Ser Pro Asn1 5 10 15Tyr Pro Asp Asp Tyr Arg Pro Ser Lys Val Cys Ile Trp Arg Ile Gln20 25 30Val Ser Glu Gly Phe His Val Gly Leu Thr Phe Gln Ser Phe Glu Ile35 40 45Glu Arg Met Asp Ser Cys Ala Tyr Asp Tyr Leu Glu Val Arg Asp Gly50 55 60His Ser Glu Ser Ser Thr Leu Ile Gly Arg Tyr Cys Gly Tyr Glu Lys65 70 75 80Pro Asp Asp Ile Lys Ser Thr Ser Ser Arg Leu Trp Leu Lys Phe Val85 90 95Ser Asp Gly Ser Ile Asn Lys Ala Gly Phe Ala Val Asn Phe Phe Lys100 105 11021022211113212PRT213Homo sapiens40022Cys Gly Gly Phe Leu Thr Lys Leu Asn Gly Ser Ile Thr Ser Pro Gly1 5 10 15Trp Pro Lys Glu Tyr Pro Pro Asn Lys Asn Cys Ile Trp Gln Leu Val20 25 30Ala Pro Thr Gln Tyr Arg Ile Ser Leu Gln Phe Asp Phe Phe Glu Thr35 40 45Glu Gly Asn Asp Val Cys Lys Tyr Asp Phe Val Glu Val Arg Ser Gly50 55 60Leu Thr Ala Asp Ser Lys Leu His Gly Lys Phe Cys Gly Ser Glu Lys65 70 75 80Pro Glu Val Ile Thr Ser Gln Tyr Asn Asn Met Arg Val Glu Pro Lys85 90 95Ser Asp Asn Thr Val Ser Lys Lys Gly Phe Lys Ala His Phe Phe Ser100 105 110Glu21023211113212PRT213Homo sapiens40023Gly Asp Thr Ile Lys Ile Glu Ser Pro Gly Tyr Leu Thr Ser Pro Gly1 5 10 15Tyr Pro His Ser Tyr His Pro Ser Glu Lys Cys Glu Trp Leu Ile Gln20 25 30Ala Pro Asp Pro Tyr Gln Arg Ile Met Ile Asn Phe Asn Pro His Phe35 40 45Asp Leu Glu Asp Arg Asp Cys Lys Tyr Asp Tyr Val Glu Val Phe Asp50 55 60Gly Glu Asn Glu Asn Gly His Phe Arg Gly Lys Phe Cys Gly Lys Ile65 70 75 80Ala Pro Pro Pro Val Val Ser Ser Gly Pro Phe Leu Phe Ile Lys Phe85 90 95Val Ser Asp Tyr Glu Thr His Gly Ala Gly Phe Ser Ile Arg Tyr Glu100 105 110Ile21024211119212PRT213Homo sapiens40024Cys Ser Gln Asn Tyr Thr Thr Pro Ser Gly Val Ile Lys Ser Pro Gly1 5 10 15Phe Pro Glu Lys Tyr Pro Asn Ser Leu Glu Cys Thr Tyr Ile Val Phe20 25 30Ala Pro Lys Met Ser Glu Ile Ile Leu Glu Phe Glu Ser Phe Asp Leu35 40 45Glu Pro Asp Ser Asn Pro Pro Gly Gly Met Phe Cys Arg Tyr Asp Arg50 55 60Leu Glu Ile Trp Asp Gly Phe Pro Asp Val Gly Pro His Ile Gly Arg65 70 75 80Tyr Cys Gly Gln Lys Thr Pro Gly Arg Ile Arg Ser Ser Ser Gly Ile85 90 95Leu Ser Met Val Phe Tyr Thr Asp Ser Ala Ile Ala Lys Glu Gly Phe100 105 110Ser Ala Asn Tyr Ser Val Leu1152102521119212DNA213Homo sapiens40025gaagttgagg aacccagtg 192102621120212DNA213Homo sapiens40026cttgccaaga agttgccaag202102721119212DNA213Murinae gen.sp.40027cttcagtacc ttggaagag 192l02821119212DNA213Murinae gen.sp.40028cgcttgacca ggagacaac 192102921130212DNA213Murinae gen.sp.40029acgtgaattc agcaagttca gcctggttaa 302103021130212DNA213Murinae gen.sp.40030acgtggatcc tgagtatttc ttccagggta 302103121122212PRT213Homo sapiens40031Cys Lys Phe Gln Phe Ser Ser Asn Lys Glu Gln Asn Gly Val Gln Asp1 5 10 15Pro Gln His Glu Arg Cys202103221121212PRT213Homo sapiens40032Gly Arg Lys Ser Arg Val Val Asp Leu Asn Leu Leu Thr Glu Glu Val1 5 10 15Arg Leu Tyr Ser Cys202103321126212DNA213Homo sapiens40033cgggatcccg aatccaacct gagtag 262103421161212DNA213Homo sapiens40034ggaattccta atggtgatgg tgatgatgtt tgtcatcgtc atctcctcct gtgctccctc 60t 612103521129212DNA213Homo sapiens40035cggatcccgg aagaaaatcc agagtggtg2103621161212DNA213Homo sapiens40036ggaattccta atggtgatgg tgatgatgtt tgtcatcgtc atctcctcct gtgctccctc 60t 612103721121212PRT213Homo sapiens40037Gly Arg Lys Ser Arg Val Val Asp Leu Asn Leu Leu Thr Glu Glu Val1 5 10 15Arg Leu Tyr Ser Cys202103821126212DNA213Homo sapiens220223來自編碼CUB結構域的人PDGF—C 430bp cDNA片段的正向PCR引物，其包括—BamHI位點40038cgggatcccg aatccaacct gagtag2103921160212DNA213Homo sapiens220223來自編碼CUB結構域的人PDGF—C 430bp cDNA片段的反向PCR引物，其包括—EcoRI位點和編碼之前為腸激酶位點的C—末端6XHis的序列
site40039ccggaattcc taatggtgat ggtgatgatg tttgtcatcg tcgtcgacaa tgttgtagtg 60
權利要求
1.一種分離的核酸分子，包含具有與圖1、圖3或者圖5(分別為SEQ ID NO2、4和6)的序列至少85％相同性的多核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的分離的核酸分子，其中序列的相同性是至少90％。
3.根據權利要求1所述的分離的核酸分子，其中序列的相同性是至少95％。
4.根據權利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述核酸是cDNA。
5.根據權利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述核酸是哺乳動物的多核苷酸。
6.根據權利要求5所述的分離的核酸分子，其中所述核酸是鼠類的多核苷酸。
7.根據權利要求6所述的分離的核酸分子，包含圖5的序列(SEQ ID NO6)。
8.根據權利要求5所述的分離的核酸分子，其中所述核酸是人類的多核苷酸。
9.根據權利要求8所述的分離的核酸分子，其中所述核酸包含圖1或者圖3的序列(分別為SEQID NO2和4)。
10.一種分離的核酸分子，它編碼一種多肽分子或其具有PDGF-C生物學活性的類似物或片段，該多肽分子的胺基酸序列與圖2(SEQ ID NO3)、圖4(SEQ ID NO5)中的胺基酸序列至少具有85％相同性。
11.根據權利要求10所述的分離的核酸分子，其中的胺基酸序列的相同性是至少90％。
12.根據權利要求10所述的分離的核酸分子，其中的胺基酸序列的相同性是至少95％。
13.一種分離的核酸分子，它編碼的多肽分子的胺基酸序列包括以下的胺基酸序列PXCXXVXRCGGXXXCC(SEQID NO1)。
14.一種載體，包括權利要求1所述的核酸，該核酸與一段啟動子序列可操縱相連。
15.根據權利要求14所述的載體，其為真核載體。
16.根據權利要求14所述的載體，其為原核載體。
17.根據權利要求14所述的載體，其為質粒。
18.根據權利要求14所述的載體，其為杆狀病毒載體。
19.一種構建表達多肽或多肽的具有PDGF-C生物學活性的類似物或片段的載體的方法，其中所述多肽的胺基酸序列與圖2(SEQID NO3)或圖6(SEQ ID NO7)的胺基酸序列至少有85％相同性，所述方法包括將權利要求1、10或者13所述的分離的核酸以與啟動子可操縱相連的方式插入所述的載體中。
20.用權利要求14的載體轉化或者轉染的一種宿主細胞。
21.根據權利要求20所述的宿主細胞，其為真核細胞。
22.根據權利要求20所述的宿主細胞，其為COS細胞。
23.根據權利要求20所述的宿主細胞，其為原核細胞。
24.根據權利要求20所述的宿主細胞，其為293EBNA細胞。
25.根據權利要求20所述的宿主細胞，其為昆蟲細胞。
26.一種用載體轉化或者轉染的宿主細胞，所述載體包含與一啟動子可操縱相連的權利要求1所述核酸序列，從而所述的宿主細胞表達一種多肽或其具有PDGF-C生物學活性的類似物或片段，該多肽的胺基酸序列與圖2(SEQ ID NO3)或圖6(SEQ ID NO7)中的胺基酸序列具有至少85％的相同性。
27.一種分離的多肽或其具有PDGF-C生物學活性的類似物或片段，該多肽具有與圖2(SEQ ID NO3)或圖6(SEQ ID NO7)的胺基酸序列至少85％相同性的胺基酸序列。
28.根據權利要求27所述的分離的多肽，其為鼠多肽。
29.根據權利要求27所述的分離的多肽，其為人類多肽。
30.根據權利要求27所述的分離的多肽，其具有刺激和/或增強表達PDGF-C受體的細胞的增殖和/或分化和/或生長和/或運動的能力。
31.一種由一種多核苷酸表達產生的分離的多肽，所述多核苷酸包含與圖1、圖3或者圖5(SEQ ID NO2、4或6)的序列具有至少85％相同性的多核苷酸序列，或者所述多核苷酸是在嚴格條件下與上述的至少一條DNA序列雜交的多核苷酸。
32.一種分離的多肽，包括以下的特徵性序列PXCXXVXRCGGXXXCC(SEQ ID NO1)。
33.一種分離的多肽二聚體，包含權利要求27所述的多肽。
34.根據權利要求33所述的多肽二聚體，其為所述多肽的同二聚體。
35.根據權利要求33所述的多肽二聚體，其為所述多肽與VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-A、PDGF-B或者PlGF形成的異二聚體。
36.根據權利要求33所述的多肽二聚體，其為二硫鍵連接的二聚體。
37.一種藥物組合物，包含促進細胞增殖有效量的 27、31或者32所述的多肽，以及選自VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-A、PDGF-B或PlGF中的至少一種其它生長因子。
38.根據權利要求37所述的藥物組合物，還包含肝素。
39.一種藥物組合物，包含促進細胞增殖有效量的 27、31或者32所述的分離的多肽，以及至少一種藥物載體或者稀釋劑。
40.一種藥物組合物，包含刺激PDGF受體量的的 27、31或者32所述的分離的多肽，以及至少一種藥物載體或者稀釋劑。
41.一種藥物組合物，包含刺激結締組織或者創傷癒合有效量的權利要求27、31或者32所述的分離的多肽，以及至少一種藥物載體或者稀釋劑。
42.一種在測試樣品中擴增權利要求1所述的多核苷酸的裝置，所述裝置包含與權利要求1所述的核酸互補的至少一對引物。
43.一種在測試樣品中擴增權利要求1所述的多核苷酸的裝置，所述裝置包含一種聚合酶和與權利要求1所述的核酸互補的至少一對引物，用於通過聚合酶鏈式反應擴增多核苷酸以便於將該多核苷酸與權利要求1所述的核酸進行比較。
44.一種和權利要求27、31或32所述的多肽特異反應的抗體。
45.根據權利要求44所述的抗體，其是多克隆抗體。
46.根據權利要求44所述的抗體，其是單克隆抗體，或者F(ab』)2、F(ab』)、F(ab)片段或嵌合抗體。
47.根據權利要求45或46所述的抗體，其用可檢測的標記物標記。
48.根據權利要求47所述的抗體，其中所述可檢測的標記是放射性同位素。
49.一種製備權利要求27、31或者32所述的多肽的方法，該方法包括以下步驟培養用載體轉化或者轉染的宿主細胞，所述載體包含與啟動子序列可操縱相連的編碼所述多肽的多核苷酸，從而編碼所述多肽的該核酸序列被表達；從所述宿主細胞中或者培養所述宿主細胞的培養基中分離所述多肽。
50.一種刺激哺乳動物的結締組織生長或者創傷癒合的方法，包括給予哺乳動物有效量的權利要求27、31或者32所述的多肽。
51.一種產生有活性的PDGF-C截短形式的方法，包括表達權利要求69所述的包含編碼多肽的多核苷酸的表達載體的步驟。
52.一種調節PDGF-C的受體結合特異性的方法，包括如下步驟表達包含編碼如權利要求27、31和32所述多肽的多核苷酸的表達載體；並提供蛋白酶解量的至少一種酶，用以對表達的多肽進行處理，得到PDGF-C的活性截短形式。
53.一種選擇性激活具有生長因子活性的多肽的方法，包括如下步驟表達一種表達載體，該表達載體包含一種多核苷酸，該多核苷酸編碼具有生長因子活性的多肽、CUB結構域和多肽與CUB結構域之間的蛋白酶切位點；並提供蛋白酶解量的至少一種酶，用以對表達的多肽進行處理，得到具有生長因子活性的活性多肽。
54.根據權利要求27、31和32所述的分離的多肽，其包含具有胺基酸序列RKSR或者其結構保守胺基酸序列的蛋白酶切位點。
55.根據權利要求10所述的核酸分子，該核酸分子編碼的多肽包含胺基酸序列為RKSR或者其結構保守胺基酸序列的蛋白酶切位點。
56.一種分離的異二聚體，其包含VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-C、PDGF-A、PDGF-B或者PlGF的活性單體和與一個CUB結構域相連的PDGF-C活性單體。
57.一種分離的異二聚體，其包含PDGF-C活性單體和與一個CUB結構域相連的VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-C、PDGF-A、PDGF-B或者PlGF的活性單體。
58.根據權利要求56所述的異二聚體，進一步包含在活性單體與CUB結構域之間的蛋白酶切位點。
59.根據權利要求57所述的異二聚體，進一步包含在活性單體與CUB結構域之間的蛋白酶切位點。
60.一種分離的多核苷酸，其包含與圖1、圖3或圖5(SEQ IDNO2、4或6)的序列至少有85％相同性的多核苷酸序列，或者與至少一種所述DNA序列在嚴格條件下雜交的多核苷酸。
61.一種增強哺乳動物成纖維細胞有絲分裂的方法，包括對哺乳動物施用促進哺乳動物的有絲分裂有效量的如權利要求27、31或32所述的多肽。
62.一種誘導PDGF-α受體活化的方法，包括加入刺激PDGF-α受體的量的如權利要求27、31或32所述的多肽。
63.一種抑制哺乳動物中表達PDGF-C的腫瘤的腫瘤生長的方法，包括對所述的哺乳動物施用抑制PDGF-C的量的PDGF-C拮抗劑。
64.一種鑑定人類腫瘤特定類型的的方法，包括獲取腫瘤樣品，以及檢測其PDGF-C表達的步驟。
65.根據權利要求64所述的方法，其中特定的腫瘤類型為絨毛膜癌、維爾姆斯氏瘤、巨核細胞白血病、肺癌和紅白血病。
66.一種鑑定PDGF-C拮抗劑的方法，包括如下步驟將基本純化的PDGF-C活化截短形式製備物與檢測試劑混合；和利用任何適當的方式監測對PDGF-C生物學活性的抑制。
67.一種鑑定PDGF-C拮抗劑的方法，包括如下步驟將基本純化的全長PDGF-C製備物與檢測試劑混合；和利用任何適當的方式監測對CUB結構域從PDGF-C中的裂解的抑制。
68.根據權利要求27所述的分離的多肽，其中所述的細胞為內皮細胞、結締組織細胞、肌成纖維細胞或者神經膠質細胞。
69.一種構建載體的方法，該載體表達一種多肽，該多肽包含與圖2(SEQ ID NO3)或圖6(SEQ ID NO7)的第230至345位胺基酸殘基有至少85％相同性的胺基酸序列，所述方法包括將編碼所述胺基酸殘基的分離的核酸分子以與啟動子可操縱相連的方式插入所述載體。
70.根據權利要求46所述的抗體，其中所述的單克隆抗體是人源抗體。
71.一種製備PDGF-C的活化截短形式的方法，該方法包括將包含編碼如權利要求27、31和32所述多肽的多核苷酸的表達載體進行表達；並提供蛋白酶解量的至少一種酶，用以對表達的多肽進行處理，得到PDGF-C的活化截短形式。
72.一種在腫瘤細胞侵襲正常細胞群體過程中抑制組織轉型的方法，包括對哺乳動物施用抑制PDGF-C的量的PDGF-C拮抗劑。
73.一種治療哺乳動物纖維變性症狀的方法，包括對哺乳動物施用抑制PDGF-C的量的PDGF-C拮抗劑。
74.根據權利要求73所述的方法，其中所述的纖維變性症狀在肺、腎或者肝中發現。
全文摘要
本發明涉及生長因子PDGF/VEGF家族的一個新成員,PDGF－C,還涉及其編碼核苷酸序列,其生產方法,其抗體或其他拮抗劑,表達其的轉染或轉化的宿主細胞,含有其的藥物組合物,及其在醫藥和診斷方面的應用。
文檔編號A61P17/00GK1330664SQ99811565
公開日2002年1月9日 申請日期1999年9月30日 優先權日1998年9月30日
發明者烏爾夫·埃裡克松, 卡琳·奧瑟, 李旭日, 安尼卡·蓬滕, 馬爾科·於特拉, 卡裡·阿利塔洛, 阿恩·厄斯特曼, 卡爾－亨裡克·黑爾丁, 克裡斯特·貝茨霍爾茨 申請人:路德維格癌症研究所, 萊森希亞有限公司