一種細胞特異性ndrg2基因表達下調的載體的製作方法

2023-12-09 09:53:16 2

專利名稱：：一種細胞特異性ndrg2基因表達下調的載體的製作方法
技術領域：
：本發明屬於II型糖尿病相關基因功能
技術領域：
，涉及II型糖尿病相關基因ndrg2的基因功能研究，特別涉及一種細胞特異性ndrg2基因表達下調的載體。
背景技術：
：ndrg2及其在組織細胞特異性的表達人的ndrg2基因(N-MycDownsteam-RegulatedGene)是鄧燕春等發現並克隆到的一個在腫瘤細胞中低表達的新基因(鄧燕春，藥立波，劉新平等.一種含有ACP樣結構域新基因的發現生物化學與生物物理進展.2001，28(1):72-76)，由於該基因在結構上與已經發現的N-myc下遊調節基因ndrgl(N-mycdown-streamregulatedgenel)具有較高的同源性，故將其命名為ndrg2。該基因cDNA全長2024bp，編碼357個胺基酸，染色體定位於14ql2.1，具有16個外顯子15個內含子，其GenBank登錄號為AF15卯92。劉新平等用免疫組化的方法對小鼠胚胎組織和成體組織以及人體的某些組織進行了系統性的研究，以明確ndrg2基因的表達譜(HuXL，LiuXP,DengYCh,etal.ExpressionanalysisofNDRG2geneinmouseembryonicandadulttissues.CellTissueRes.2006，325(l):67-76)，發現ndrg2是小鼠胚胎組織分化相關基因，隨著胚胎發育ndrg2的表達水平逐漸增高，特別表現在骨骼肌、心肌、腦、腎和胰腺組織，在成體動物中ndrg2的表達仍然表現出這些組織的特異性。特別引人注意的是ndrg2表達在胰腺的胰島p細胞，而胰島的ot細胞和PP細胞不表達。這種在胰島P細胞的特異性表達提示ndrg2與胰島p細胞中的特殊功能有關。ndrg2可能是胰島素受體介導的信號轉導通路中的新分子胰島p細胞功能障礙和外周組織胰島素抵抗是n型糖尿病發病的重要特徵，經典理論認為在n型糖尿病中胰島素作用障礙主要是由於骨骼肌、脂肪、肝臟等組織的胰島素依賴性葡萄糖攝取及利用障礙，即所謂的胰島素外周抵抗；而胰島p細胞功能障礙是由於葡萄糖感知和胰島素分泌之間的聯繫受損所致(KitamuraT，KidoY，NefS，MerenmiesJ,ParadaLF,AcciliD.PreservedPancreaticBeta-celldevelopmentandfunctioninmicelackingtheinsulinreceptorrelatedreceptor.MolcellBiol2001Aug:21(16):5624-30),而目前對胰島素外周組織胰島素抵抗和胰島P細胞功能缺陷之間的關系所知甚少。近年來的研究已證實，胰島p細胞上也存在胰島素受體以及胰島素受體底物，即胰島P細胞中也存在胰島素刺激的信號轉導通路。KitamuraT發現胰島J3細胞胰島素受體基因敲除的小鼠出現I3細胞對葡萄糖剌激的第一相胰島素分泌減少80%，糖耐量受損等II型糖尿病的某些特徵，直接證明了p細胞胰島素受體在維持血糖穩定方面的重要作用(NadeejaW^jesekara，DanielKonrad，MohamedEweida,Muscle-SpecificPtenDeletionProtectsagainstInsulinResistanceandDiabetes.MolecularandCellularBiology,February2005，Vol.25,No.3,1135-1145)。但是除了P細胞胰島素受體缺陷外，由P細胞胰島素受體介導的信號轉導通路的障礙有可能導致P細胞自身胰島素抵抗而又加重了胰島素分泌減少，進而造成惡性循環。外周組織中胰島素受體介導的信號轉導途徑的研究表明，胰島素首先結合酪氨酸激酶受體，使其B亞基磷酸化被激活之後，再激活胰島素受體底物IRS-1或IRS-2，然後激活PI3K，PI3K再激活PDK、Akt/PKC，促進Glut4的轉位和葡萄糖的轉運。但只有PI3K、Akt的激活還不足以引起Glut4轉位達到最高水平，提示其中還有未知的分子在起作用。James證實大鼠肌肉組織中ndrg2是Akt下遊的磷酸化蛋白(JamesG.4Burchfield，AleciaJ.Lennard,SakuraNarasimhan,WilliamE.AktmediatesInsulin-stimulatedPhosphorylationofNdrg2.TheJournalofBiologicalChamistry2004,279(18),18623-18632)，這表明ndrg2參與了外周組織中胰島素受體介導的信號轉導。這雖然為外周組織中胰島素的信號轉導途徑的認識增加了新內容，但是不知道ndrg2被磷酸化後，它的功能發生了什麼變化，以及這種變化對GSK-3和GS(糖原合成酶)以及GLUT4(葡萄糖轉運蛋白)的作用有無影響。因為已知GSK-3和GS以及GLUT4是胰島素信號轉導途徑中的三個重要的效應分子，它們的活性直接反映了胰島素對糖代謝的結果。搞清這些問題是理解ndrg2是否參與胰島素受體介導的信號轉導途徑過程的關鍵，也是闡明ndrg2與j3細胞自身胰島素抵抗有無關係的關鍵。上述對ndrg2的研究，雖然得到了一些有意義的信息，但是這些結果是採用體外細胞培養得到的，難免具有一定局限性。當進一步研究ndrg2在胰島中的作用以及其與n型糖尿病的關係時，必須調整研究策略。因為糖尿病是一種全身多組織器官相互關聯的胰島素功能受損性疾病，如果還只停留在細胞水平上進行研究，就只能在離體條件下，了解ndrg2對胰島功能的影響，而不可能了解由此而產生的對外周組織的影響，而這一點恰恰是在研究II型糖尿病最不該忽視的；所以需要採用轉基因動物從整體水平上研究ndrg2基因在小鼠胰島細胞中的功能和其與II型糖尿病的關係。RNAi轉基因技術是研究ndrg2基因功能的有效手段傳統的製作轉基因動物是利用DNA同源重組的原理將目的基因敲除(Knockout),這是一種研究基因功能的有效技術，但是有些目的基因完全敲除後會引起胚胎致死而達不到預期的目標。上述的研究發現ndrg2基因是小鼠胚胎發育的重要基因，因此傳統的基因敲除製作轉基因動物可能不適合研究ndrg2基因的功能。RNA幹涉(RNAi)是由外源或內源性的雙鏈RNA(double2starandRNA，dsRNA)導入細胞而引起的與dsRNA同源的目的mRNA降解，進而抑制或下調其相應的基因表達(GuiliangTang.siRNAandmiRNA:aninsightintoRISCs.TRENDSinBiochemicalSciences.2005，Vol.30，No.2，pl06國114)，可用於基因功能的研究。利用RNAi技術在RNA水平抑制基因的表達製備轉基因動物，有別於傳統的轉基因動物製作方法在於使某個目的基因表達下調(Knockdown)而不是敲除(Knockout),避免發生目的基因被敲除後引起胚胎致死的問題，適合於ndrg2基因功能的研究。目前用於RNAi轉基因動物的使目的基因表達下調的RNAi轉基因載體，其miRNA連接位點(miRflankingregion)上遊採用的是聚合酶III依賴的啟動子(CMV),由於該啟動子在廣泛的組織細胞內啟動下遊miRNA連接位點接入的幹涉序列，因此目的基因的表達下調不具有組織細胞特異性。而對於ndrg2基因的研究需要建立一個胰島細胞特異性的RNAi-ndrg2轉基因動物，所得到的轉基因動物只在胰島組織ndrg2基因表達被下調，而其他胰島素依賴的靶組織，比如肌肉、脂肪、肝等ndrg2基因表達正常，以便從整體水平上研究ndrg2在轉基因動物細胞中的基因功能和其與II型糖尿病的關係。
發明內容本發明解決的問題在於提供一種細胞特異性ndrg2基因表達下調的載體及其應用於ndrg2基因功能研究，進一步闡明ndrg2與II型糖尿病的關係，為製備新一代的抗n型糖尿病的藥物奠定基礎。本發明是通過以下技術方案來實現一種細胞特異性ndrg2基因表達下調的載體，包含RNAi轉基因載體，其特徵在於，在RNAi轉基因載體上連接前胰島素原啟動子，在前胰島素原啟動子下遊插入miR接入位點，在miR接入位點連接針對下調ndrg2基因的miRNA序列。所述的前胰島素原啟動子是前胰島素原II啟動子，其序列如SEQ.ID.NO.1所示。所述的下調ndrg2基因的miRNA序列包括轉錄後形成莖環結構的正意序列和反意序列。所述的下調ndrg2基因的miRNA序列其核苷酸序列為SEQ.ID.N0.2所示的序列。所述的前胰島素原啟動子和miR接入位點之間還連接有標記基因或篩選基因。所述的連接前胰島素原啟動子的RNAi轉基因載體是pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2miR，利用胰島素啟動子置換pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR載體中的CMV啟動子。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果1、本發明所構建的RNAi轉基因載體採用RNA聚合酶II依賴的前胰島素原啟動子，由前胰島素原啟動子特異性的在胰島P細胞啟動下遊的miRNA序列，特異性的在胰島P細胞啟動針對ndrg2基因的RNA幹涉，下調其表達。2、本發明所構建的RNAi轉基因載體針對目標基因ndrg2的3'-UTR編碼部位設計miRNA序列，其在轉錄成熟之後能夠與ndrg2特異性的結合，形成RISC複合體，下調ndrg2的表達，經實驗證實其下調效果明顯。3、本發明在前胰島素原啟動子和miR接入位點之間還連接有標記基因或篩選基因便於對載體的表達、RNA幹涉結果的觀察。4、本發明利用pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR載體為基礎，成功構建了針對小鼠ndrg2的轉基因載體，能特異性的在小鼠胰島P細胞中下調ndrg2基因的表達，用於動物模型的構建及胰島P細胞ndrg2基因功能的研究。5、本發明所提供的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2miR轉基因載體轉入小鼠卵細胞後生出來的子代小鼠，只有胰島P細胞中的ndrg2基因被下調，而其他胰島靶組織例如肝、肌肉和脂肪細胞中的ndrg2表達正常，是研究從整體水平上研究ndrg2在轉基因動物細胞中的基因功能和其與II型糖尿病的關係的理想模型。圖1是PcDNA6,2-GW/EmGFP-miR載體的質粒圖譜；圖2是PcDNATM6.2-GW/EmGFP-ndrg2miR載體的雙酶切鑑定圖3是pcDNATM6.2-GW/EmGFP-ndrg2miR載體的測序結果圖4是小鼠基因組前胰島素原II啟動子擴增電泳圖5是pcDNATM6.2-GW/EmGFP-ndrg2miR載體切除壯觀黴素抗性基因和CMV啟動子之後的電泳鑑定結果圖6是pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII△spe-miR載體的雙酶切鑑定圖；圖7是包含前胰島素原II啟動子的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPn△spe-ndrg2miR載體的測序結果；圖8是含有壯觀黴素抗性基因的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPn-ndrg2miR載體的雙酶切鑑定圖9是ndrg2基因在不同細胞中表達的WesternBlot鑑定圖10是螢光顯微鏡下觀察pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2miR載體在不同細胞中的表達；圖11是pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2miR載體幹涉效果及細胞特異性的WesternBlot檢測圖12是轉然pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2miR載體的|3TC3細胞的NDRG2蛋白表達的WesternBlot檢測。下面結合附圖和實驗對本發明作進一步的詳細說明，所述是對本發明解8釋的而不是限定。具體實施例方式MicroRNA(miRNA)是一類真核生物內源性的小分子單鏈RNA，通常為1825bp長，能夠通過與耙mRNA特異性的鹼基配對引起耙mRNA的降解或抑制其翻譯，從而對基因進行轉錄後的表達調控，是RNA幹涉中一種重要的分子工具。近幾年來，在動物細胞和植物組織中，上百種miRNA被陸續發現，這些小分子調控RNA是從60200bp的具有髮夾狀結構的前體中被切割出來而成熟的。在動物細胞中，miRNA基因的轉錄初產物(pri-miRMA)很快被核糖核酸酶IIIDrosha(RNaselllDrosha)加工成為miRNA前體(pre-miRNA)，然後由細胞核轉運至細胞質中，經另一種RNaselllDicer識別剪切為成熟miRNA。這些成熟的miRNA其他蛋白質一起組成RISC複合體(RNA-inducedsilencingcomplex),與耙mRNA特異性的鹼基配對識別，從而引起耙mRNA的降解或者翻譯抑制。(李偉，金由辛，生物化學與生物物理進展，2005;(32)8，709-711)本發明構建的細胞特異性ndrg2基因表達下調的載體，轉染宿主細胞後，只有在胰島P細胞特異性的下調ndrg2基因的表達。在所構建的載體中，以RNA聚合酶II依賴的啟動子驅動下遊序列轉錄出一個莖環結構的RNA，它可被細胞核中的RNaselllDrosha切成短的pre-miRNA，這種pre-miRNA進到細胞漿後再被RNaselllDicer剪切成成熟的miRNA，然後生成不同的RNA-蛋白質複合物，使目的基因ndrg2在轉錄後被表達下調(Knockdown)。構建的載體中所包含以下所述的各元件a、在RNAi轉基因載體上連接胰島素基因啟動子；RNAi轉基因載體以PcDNA6.2-GW/EmGFP-miR(購於美國invitrogen公司)為例說明，將其中的CMV啟動子替換成胰島素基因啟動子一前胰島素原II啟動子。胰島素啟動子屬於RNA聚合酶II依賴的啟動子，只在胰島e細胞啟動胰島素基因的表達作用，將其連接入所構建載體，實現其在胰島e細胞特異性表達。5699bp的PcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體的質粒圖譜如圖1所示，在PcDNA6.2-GW的CMV啟動子之後連接EmGFP-miR多克隆位點，miR接入位點(miRflankingregion)在標記基因綠色螢光蛋白EmGFP之後，其連接的黏性末端為5'-acga，3'-cagg，其5'端多克隆位點包括Dral、sall、BamHI，3'端多克隆位點包括BglII和Xho1，該載體還包含兩個抗性篩選基因壯觀黴素抗性基因(spectinomycinR)和滅稻瘟素抗性基因(BlasticidinR)。b、在胰島素基因啟動子下遊的miR接入位點連接miRNA序列；miRNA序列針對靶基因設計，其轉錄之後能夠特異性的結合ndrg2進行RNA幹涉，下調ndrg2的基因表達。在miRNA序列的兩端設計粘性連接末端，在連接末端之間連接幹涉序列，幹涉序列的設計針對靶基因特定位點的，包括正意序列(sensetarget)和反意序列(antisensetarget),以在轉錄之後形成莖環結構。具體為在5'-miRflanking的-acga和3'-miRflanking的粘性末端-cagg之間插入針對幹涉ndrg2基因的miRNA序列，該miRNA序列被轉錄之後形成莖環結構的RNA，經細胞RNaseIIIDrosha加工成為pre-miRNA，其序列中帶有針對目的基因ndrg2的幹涉序列，在成熟之後與細胞內源性ndrg2的mRNA特異性結合，形成miRNA幹涉，下調ndrg2的表達。連接上述元件的RNAi載體構建完成之後，轉染E.coliToplO克隆篩選後經測序鑑定，與預期設計序列一致的載體命名為Ins-RNAi-ndrg2。下面以小鼠為例，詳細說明針對ndrg2為靶基因Ins-RNAi-ndrg2載體的構建方法1、miRNA序列是載體構建的關鍵，設計以ndrg2為耙基因的miRNA序列在於選擇特定的位點，以便幹涉序列與ndrg2的mRNA結合後能夠下調其表達，具體如下a、針對ndrg2基因518-538bp編碼區鹼基部位設計的miRNA引物；針對ndrg的518-538bp編碼區鹼棊部位設計的雙鏈形式的miRNA序烈為*tgctgagaacaagaccttcaactgtggttttggccactgactgaccacagttgggtcttgttet64cctgagaacaagacccaactgtggtcagtcagtggecaaaaccacagttgaaggtcttgttctc64上述64bp的miRNA引物，其中正鏈的l-4bp為與RNAi轉基因載體PcDNA6.2-GW/EmGFP-miR(購於美國invitrogen公司)粘性末端acga的互補序列，劃線部分6-26bp的序列為所針對的ndrg2鹼基部位，轉錄後為反意序列(antisensetarget)，46-64bp為轉錄後的正意序列(sensetarget),正鏈的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；負鏈的2-60bp為正鏈的互補序列，61-64bp為粘性末端aatg的互補序列。b、上述DNA雙鏈序列人工合成雙鏈形式的寡聚核苷酸鏈；上海生工測序公司合成，退火條件是從溫度95-C降到55'C，l分鐘。退火後形成具有與PcDNA6.2-GW/EmGFP-miR的miR接入位點相適應的粘性末端的雙鏈形式寡聚核苷酸鏈(dsOligo)。c、再將所形成的ds01igo用T4DNA連接酶連入用BamHI和BglII雙酶切的，含壯觀黴素抗性基因的RNAi載體pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR;構建包含上述miRNA序列的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-ndrgmiR載體，並轉化大腸桿菌ToplO，挑選陽性菌落，搖菌並提取質粒。質粒用BamHI和BglII酶切鑑定，能切下約138bp大小的片段(此片段中包括雙鏈寡核苷酸大小為64bp，其餘為酶切位點的片段)。dsOligo連入ii載體後酶切鑑定結果如圖2所示，中泳道M為marker,泳道16分別為pcDNATM6.2-GW/EmGFP-ndrg2miR的6個轉染細胞後提取質粒的克隆，其中，較暗的小片段138bp為插入的miRNA幹涉片段，較明亮的大片段為切除了幹涉dsOligo之後的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR片段。經酶切鑑定正確的質粒，送上海生工測序公司測序，與預先設計的miRNA序列一致，pcDNATM6.2-GW/EmGFP-ndrg2miR載體構建成功。以其測序結果見圖3所示。2、置換前胰島素原啟動子，構建具有細胞特異性表達的載體；以上載體均在pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR載體的基礎上構建，啟動子為CMV，為構建在胰島|3細胞中特異性表達miRNA的載體，需要把載體中的CMV啟動子置換為小鼠前胰島素原啟動子。啟動子的置換是利用MluI和SacI雙酶切pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR載體，但同時也把載體中克隆篩選基因壯觀黴素抗性基因(spectinomycinR)切除了，僅留下滅稻瘟素抗性基因(BlastiddinR)。啟動子的置換具體如下a、克隆小鼠胰島素原啟動子；從GeneBank中發現小鼠存在兩種前胰島素原基因，分別為前胰島素原I和前胰島素原II，根據基因庫檢索，前胰島素原I的基因編號是X04725，前胰島素原II的基因編號是X04724。小鼠主要轉錄的是前胰島素原II，因此克隆了前胰島素原II轉錄起始上遊長度為579bp的序列，包括前胰島素原II轉錄的核心啟動子，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.l所示；前胰島素原II啟動子引物Ins2P:gcacgcgtaccacagggcttcagct25Ins2R:gagagctctgattgtagcggatcactt27其中，Ins2P為MluI的酶切識別位點，Ins2R為SacI的酶切識別位點。以小鼠基因組DNA為模板的PCR擴增條件95°C變性5min;94。C變性30s，56。C退火15s，72。C延伸2min，30個循環；72°C延伸5min;50nL反應體系。如圖4所示的小鼠基因組前胰島素原II啟動子擴增電泳，其中泳道M為DNA分子量marker,泳道1為621bp的前胰島素原I啟動子，泳道2為579bp的前胰島素原II啟動子，說明啟動子克隆成功。b、利用擴增出來的前胰島素原II啟動子序列置換CMV啟動子，構建GW/EmGFP-InsPII-ndrg2miR載體；用MiuI和SacI對pcDNA6.2-GW/EmGFP-ndrg2miR雙酶切，切除壯觀黴素抗性基因和CMV啟動子，酶切之後的電泳鑑定結果如圖5所示，泳道M為DNA分子量marker,泳道16為pcDNATM6.2-GW/EmGFP-ndrg2miR的MluI和SacI雙酶切後的6個克隆的條帶，電泳中的中間條帶(lOllbp條帶)為壯觀黴素抗性基因片段，電泳中的小條帶(588bp條帶)為CMV啟動子片段。電泳中的大條帶(4164bp條帶)中含有ndrg2miRNA幹涉片段的切除壯觀黴素的pcDNATM6.2-GW/EmGFP△spe-ndrg2miR載體。將4164bp和568bp的前胰島素原II啟動子片段回收並在T4DNA連接酶反應體系中進行連接。然後轉化ToplO大腸桿菌，用滅稻瘟素抗性進行篩選。挑取4個陽性克隆，提取質粒後電泳鑑定結果如圖6所示，泳道M為marker,泳道16為pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII△spe-miR的6個雙酶切克隆，其中570bp大小DNA片段為前胰島素原II啟動子片段，另外的大的DNA片段為含miRNA的載體片段。確認前胰島素原II啟動子克隆入載體後進行測序，測序結果如圖7所示，與預先設定的序列一致。並命名為pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII△spe-ndrg2miR。c、在pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPIIAspe-ndrg2miRl載體中插入壯觀黴素抗性基因(spectinomycinR)用MluI酶切質粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPIIAspe-ndrg2miR，並回收該質粒，與上一步回收的lOllbp條帶(壯觀黴素抗性基因)在T4DNA連接酶反應體系中進行連接。然後轉化ToplO大腸桿菌，用壯觀黴素抗性基因進行篩選。挑取陽性克隆，提取質粒後並用MluI和EcoRI進行雙酶切，能切下B57bp大小DNA片段的為陽性克隆，電泳鑑定如圖8所示，泳道M為marker,泳道16是含有壯觀黴素抗性基因的1357bp大小的DNA片段。該質粒為PcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2miR,到此完成了全部的載體構建工作。3、在不同細胞中pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2miR載體的活性實驗a、應用8個細胞株小鼠白血病L1210、小鼠前列腺癌RM-1、小鼠骨髓瘤SP20、小鼠肉瘤S37、小鼠肝癌H22、小鼠乳腺EMT6、小鼠肌肉C2C12、小鼠胰島瘤(3TC3、小鼠成纖維細胞NIH3T3。以上細胞培養並裂解後經WesternBlot(WesternBlot檢測試劑購自Thermo公司SuperSignalWestPicoStablePeroxideSolution,NDRG2抗體購自ABNOVA公司)，觀察細胞中NDRG2蛋白的表達，結果如圖9所示，以a-tubulin蛋白作為內參照，表明8個細胞株中均有NDRG2的表達，但表達水平不同。b、螢光顯微鏡觀察pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2miR在不同細胞中的表達小鼠NIH3T3細胞、HEK293細胞、小鼠C2C12細胞、Hela細胞、Hepal-6細胞和小鼠(3TC3細胞培養至對數期時，加入pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2miR質粒和轉染試劑(Invitrogen公司Lipofectamine2000Reagent,1微克質粒/2.5微升)繼續培養，48小時後在螢光顯微鏡下觀察。結果如圖10所示。在6個細胞株中只有小鼠pTC3細胞發出標記基因EmGFP表達後的螢光，說明轉染的PcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2miR質粒只在小鼠的胰腺P細胞表達，說明胰島素原啟動子具有細胞特異性。以上細胞培養經過螢光檢測後裂解，進行WesternBlot檢測(WesternBlot檢測試齊!l購自Thermo公司SuperSignalWestPicoStablePeroxideSolution,NDRG2抗體購自ABNOVA公司)，觀察細胞中NDRG2蛋白的表達，結果如圖11所示，以a-tubulin蛋白作為內參照，6個檢測細胞株中除pTC3細胞夕卜，其他細胞經上述載體(pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2miR質粒)轉染前後的NDRG2的表達沒有明顯變化，而J3TC3細胞在轉染miRNA載體後不僅在螢光顯微鏡下觀察到標記基因EmGFP表達後的螢光，而且以a-tubulin蛋白作為內參照可見(3TC3細胞中的NDRG2蛋白的表達明顯降低，而其他細胞中的NDRG2的表達沒有受到影響，證明此載體在胰島細胞特異性下調NDRG2的表達。c、進一步檢測pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2miR載體對卩TC3細胞中的NDRG2表達的幹涉效果卩TC3細胞培養並裂解後經WesternBlot觀察細胞中NDRG2蛋白的表達，結果如圖12所示，以a-tubulin蛋白作為內參照，泳道negative是Invitrogen公司的基礎載體(圖1提供的載體)，泳道1、泳道2和泳道3分別是PcDNA6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2miR載體轉化pTC3細胞的三個克隆的NDRG2的表達結果，可以看出與對照相比，NDRG2蛋白的表達明顯下調，miRNA幹涉效果明顯。經上述實驗證明以下結果1、本發明構建的RNAi轉基因載體pcDNATM6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2miR能特異性的在小鼠胰島p細胞中下調ndrg2基因的表達，用於胰島p細胞ndi:g2基因功能的研究。2、攜帶有Ins-RNAi-ndrg2元件的RNAi轉基因載體，能夠特異性的有效的下調ndrg2基因表達水平，用於胰島P細胞ndrg2基因功能的研究，便於篩選新的抗II型糖尿病的藥物。而本發明所提供的pcDNA6.2-GW/EmGFP-InsPII-ndrg2miR轉基因載體轉入小鼠卵細胞後生出來的子代小鼠，只有胰島P細胞中的ndrg2基因被下調，而其他胰島靶組織例如肝、肌肉和脂肪細胞中的ndrg2表達正常，是從動物整體水平上研究ndrg2在轉基因動物胰島細胞中的功能和其與II型糖尿病關係的新模型。核苷酸序列表中國人民解放軍第四軍醫大學—種細胞特異性ndrg2基因表達下調的載體21579DNA前胰島素原II啟動子13CgCgt3CC3cagggcttcagctcagctg過CCCCC33gtggg3城gg朋卿g卿t3g60accattaagtgccttgctgcctgaattctgctttccttctacctctgaga120g卿gctggggactcggctg3gttaagaacccagctatcaattgg犯ctgtga犯cagtc180agatactaggtccccaactgcaacttcctgggg犯tgatgtgg犯a^itg240ctcagccaaggacaaaga犯gcatcacccactctggaacaatgtcccctgctgtgaactg300gttcatcaggccatceigggccccttgttaagactctaattaccctaggact鄉t卿gg360tgttgacgtccaatgagcgctttctgcagacctagcacca鵬卿tgtttggaaactgc420agcttcagcccctctggccatctgctgacctaccccacctggagccctta3tgggtca犯■c鄉aaagtcC鄉gggC3g卿ggaggtgctttggtctata幼ggtagtggggacccag540taaccaccagccctaagtgatccgcteicaatcagagctc579〈210〉2〈211〉64〈212〉DNA〈213〉人工合成〈400〉2tgctgagaacaagaccttcaactgtggttttggccactgactgaccacagttgggtcttg60ttct6權利要求1、一種細胞特異性ndrg2基因表達下調的載體，包含RNAi轉基因載體，其特徵在於，在RNAi轉基因載體上連接前胰島素原啟動子，在前胰島素原啟動子下遊插入miR接入位點，在miR接入位點連接針對下調ndrg2基因的miRNA序列。2、如權利要求1所述的細胞特異性ndrg2基因表達下調的載體，其特徵在於，所述的前胰島素原啟動子是前胰島素原II啟動子，其序列如SEQ.ID.NO.1所示。3、如權利要求l所述的細胞特異性ndrg2基因表達下調的載體，其特徵在於，所述的miRNA序列包括轉錄後形成莖環結構的正意序列和反意序列。4、如權利要求l所述的細胞特異性ndrg2基因表達下調的載體，其特徵在於，所述的miRNA序列其核苷酸序列為SEQ.ID.NO.2所示的序列。5、如權利要求l所述的細胞特異性ndrg2基因表達下調的載體，其特徵在於，前胰島素原啟動子和miR接入位點之間還連接有標記基因或篩選基因。6、如權利要求1所述的細胞特異性ndrg2基因表達下調的載體，其特徵在於，連接前胰島素原啟動子的RNAi轉基因載體是pcDNA6.2-GW/EmGFP-InsPII-miR，利用前胰島素原II啟動子置換pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR載體中的CMV啟動子。全文摘要本發明公開了一種細胞特異性ndrg2基因表達下調的載體，包含RNAi轉基因載體，在RNAi轉基因載體上連接前胰島素原啟動子，在前胰島素原啟動子下遊插入miR接入位點，在miR接入位點連接針對下調ndrg2基因的miRNA序列。本發明所構建的RNAi轉基因載體採用RNA聚合酶II依賴的前胰島素原啟動子，由前胰島素原啟動子特異性的在胰島β細胞啟動下遊的miRNA序列，特異性的在胰島β細胞啟動針對ndrg2基因的RNA幹涉，下調其表達；用於動物模型的構建及胰島β細胞ndrg2基因功能的研究。文檔編號C12N15/85GK101565717SQ200910022350公開日2009年10月28日申請日期2009年5月5日優先權日2009年5月5日發明者劉新平,吳有盛,藥立波申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學