基於細胞自噬的抗腫瘤藥物的篩選方法
2023-12-09 02:04:36
基於細胞自噬的抗腫瘤藥物的篩選方法
【專利摘要】本發明屬於生物製藥領域，涉及腫瘤細胞自噬的誘導劑與小分子化合物聯用引起細胞死亡來篩選候選聯用分子的篩選方法，所篩選到的化合物分子本身不一定具有抗腫瘤活性，但和細胞自噬誘導劑，如HDAC抑制劑聯用則顯示抗腫瘤活性，由此也可以確定藥物聯用的方案。本發明中，以腫瘤細胞為對象，用細胞自噬誘導劑分別與各單一化合物一起處理體外培養的腫瘤細胞，測定所述的化合物與細胞自噬誘導劑引起培養的細胞死亡的程度，篩選基於細胞自噬的抗腫瘤藥物。本發明經細胞實驗，結果證明了上述方法可以用於聯用藥物的篩選，進一步製備HDAC抑制劑與小分子化合物的抗腫瘤藥物組合物，所述的藥物組合物適於所有劑型。
【專利說明】基於細胞自噬的抗腫瘤藥物的篩選方法
【技術領域】
[0001]本發明屬醫藥【技術領域】，涉及基於細胞自噬的抗腫瘤藥物篩選方法；具體涉及一種增加癌細胞對HDAC抑制劑敏感的小分子化合物及其篩選方法，以及HDAC抑制劑與小分子化合物的抗腫瘤藥物組合物。
【背景技術】
[0002]隨著溶酶體研究的深入,專注於包含細胞質和細胞器囊泡研究的Christian deDuve開啟了細胞自曬新領域,這些和溶酶體相關的囊泡，也即自卩遼體(Autophagosome),在生物體內廣泛存在，Christian de Duve也因為溶酶體的研究而獲得1974年度的諾貝爾生理醫學獎。近十年來，研究發現有大自卩遼(Macroautophagy)、小自卩遼(Microautophagy)和分子伴侶介導的自曬(Chaperone-MediatedAutophagy, CMA)三種細胞自曬形式。研究顯示，在細胞自噬發生過程中，有許多蛋白直接或間接參與了細胞自噬發生過程的不同階段，如Beclin I, Vps34對細胞自噬的產生至關重要，通過特定自噬基因的RNA幹擾或化合物，如 3—MA (3-methyladenine)、hydroxychloroquine、bafilomycin Al 5? monensin 抑制自噬發生的不同途徑來抑制自噬的發生，但自噬的抑制不一定能誘導細胞死亡。自噬在腫瘤發生發展中的作用已引起研究者越來越廣泛的關注，許多抗腫瘤藥物都可以誘發自噬的產生，自噬能賦予癌細胞耐受化療和放療療法，因此針對細胞自噬來控制腫瘤的發生，甚至相應的治療策略已成為腫瘤防治的手段之一。
[0003]目前已有許多關於細胞自噬誘導劑和細胞自噬抑制劑的篩選方法，這些方法都集中於以細胞自噬過程中的某個分子為靶標，如螢光標記的LC3強弱變化等來篩選細胞自噬相關化合物，這些化合物不一定有殺死癌細胞的能力。眾所周知，細胞自噬是細胞自我調節的正常生理過程，一般細胞自噬可以保護細胞免受死亡威脅，但過度活躍的自噬同樣可以引起細胞的死亡，這種雙刃劍式的影響使細胞自噬難以成為發現腫瘤細胞死亡誘導劑的工具。
[0004]現有技術公開了 HDAC (組蛋白去乙醯化酶)和組蛋白乙醯化轉移酶是一對調控組蛋白及非組蛋白乙醯化狀態的酶，在正常生理條件下，它們的調控作用處於相對平衡的狀態，細胞在發生轉化時，增強的HDAC活性使原有的基因表達失去平衡，與細胞增殖和細胞周期調控相關的基因表達失衡，導致細胞的轉化惡變，目前HDAC已成為腫瘤領域一個研究熱點，其中有些已用作腫瘤防治的靶標，HDAC抑制劑在體內和體外都能有效抑制腫瘤細胞的增殖，誘導腫瘤細胞分化或凋亡，多個HDAC抑制劑如LBH589已進入III期臨床試驗，SAHA已於2012年獲美國FDA批准上市。
[0005]另有研究顯示，抗腫瘤藥物的聯用往往表現出較原藥更強的抗腫瘤效果，細胞自曬抑制劑氯喹(Chloroquine, CQ)、氫化氯喹(hydroxychloroquine, HCQ)和一些細胞毒藥物聯用已進入臨床試驗，和SAHA的聯用在體外實驗中也表現出較好的效果，但目前還沒有藥物聯用方案的篩選方法。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是，涉及基於細胞自噬的抗腫瘤藥物及其篩選方法；具體涉及一種增加癌細胞對HDAC抑制劑敏感的小分子化合物及其篩選方法，以及HDAC抑制劑與小分子化合物的抗腫瘤藥物組合物。
[0007]本申請基於LBH589和SAHA誘導細胞內hsp90的乙醯化，hsp90的乙醯化可以發生在多個位點的研究，研究發現了 7個乙醯化位點，其中顯示，在LBH589的作用下，細胞內hsp70和hsp90的乙醯化，也促進細胞自噬的發生，自噬抑制劑3-MA及CQ都能抑制LBH589誘導的自噬活性而引起癌症細胞的死亡；本發明利用HDAC抑制劑誘導的細胞自噬為靶標，篩選出能抑制這種自噬的、引起癌症細胞死亡的化合物，從而確定HDAC抑制劑和哪種化合物聯用能刺激癌症細胞的死亡，且用該方法發現使癌症細胞對HDAC抑制劑敏感的小分子化合物。
[0008]本發明所涉及HDAC抑制劑包含所有能誘導細胞內熱休克蛋白hsp90乙醯化、並發生細胞自噬的化合物，本發明的實施例中選用了 HDAC抑制劑LBH589和SAHA。細胞自噬對細胞的影響依細胞所處環境有關，細胞自噬的抑制並不一定導致細胞的死亡，但HDAC抑制劑誘導細胞自噬的發生以保護細胞免受死亡威脅，在此情形下抑制細胞的自噬，如，具有抑制細胞自噬功能的氯喹將促使細胞死亡。本發明以比較細胞死亡程度，以細胞死亡所釋放的寡核小體和單核小體的量衡量細胞死亡的多少為測試的指標；進一步建立與細胞自噬誘導劑聯用的小分子化合物篩選方法，更進一步的確定藥物聯用的方案。
[0009]本發明通過下述技術方案進行:
以腫瘤細胞為對象，用細胞自噬誘導劑分別與各單一化合物一起處理體外培養的腫瘤細胞，測定所述的化合物與細胞自噬誘導劑引起培養的細胞死亡的程度，篩選基於細胞自噬的抗腫瘤藥物。
[0010]更具體的，本發明以腫瘤細胞為對象、用HDAC抑制劑分別與各單一化合物一起處理96孔板中培養的腫瘤細胞，HDAC抑制劑用於誘導96孔板中的細胞發生自噬，測定這些小分子化合物和HDAC抑制劑聯用引起細胞死亡的程度，由此篩選出可以和HDAC抑制劑聯用而有效地殺死癌細胞的小分子化合物。本發明的一個實施例中，進行了 HDAC抑制劑LBH589和氯喹聯用的抗腫瘤活性測定，結果顯示100 nM的LBH589和20μΜ氯喹聯用時可以提高LBH589殺死MCF-7細胞的能力，但20μΜ氯喹本身對MCF-7的死亡影響不大；另一個實施例中，顯示HDAC抑制劑LBH589增強乳腺癌細胞對氯喹的敏感性；另一個實施例中，進行了與HDAC抑制劑LBH589聯用小分子化合物的篩選實驗，結果顯示，OD平均值越高聯用效果越好；以及manzamine A與LBH589聯用能更有效地抑制乳腺癌細胞的生長；本發明的實驗結果證明了上述方法可以用於聯用藥物的篩選。進一步製備HDAC抑制劑與小分子化合物的抗腫瘤藥物組合物，所述的藥物組合物適於所有劑型。
[0011]
【專利附圖】
【附圖說明】
圖1.氯喹增強MCF-7細胞對LBH589的敏感性，
I:對照組；2:5μΜ喜樹鹼，陽性對照；3:含DMSO的對照組；4: 25nM LBH589; 5:50ηΜ;
6:1OOnM; 7: 100ηΜ+20μΜ 氯喹；8: 20μΜ。
[0012]圖2.LBH589增強MDA-MB-231細胞對氯喹的敏感性。
[0013]I:DMS0 對照組；2:100μΜ 氯喹；3:25nM LBH589 ；4: 25ηΜ ?ΒΗ589+20μΜ 氯喹；
5:25ηΜ ?ΒΗ589+50μΜ 氯喹；6:25ηΜ ?ΒΗ589+100μΜ 氯喹。
[0014]圖 3.LBH589 聯用 Manzamine A 對 MDA-MB-231 細胞生長的影響。
【具體實施方式】
[0015]下面結合實驗例對本發明進一步詳細描述，但不限制本發明。
[0016]實施例1.HDAC抑制劑LBH589和氯喹聯用測定抗腫瘤活性
用10%的FBS培養基培養過夜的乳腺癌細胞MCF-7經消化後稀釋成含20000個/ml的細胞懸浮液，每孔加入200μ1細胞懸浮液，於37°C和5%的CO2條件下培養24小時後，吸掉培養基，加入含不同濃度的LBH589及/或20μΜ氯喹的培養基，含5μΜ喜樹鹼和20μΜ氯喹培養基的細胞分別用作陽性和陰性對照。共同培養24小時後，200g離心10分鐘，用Roche公司的Cell Death Detect1n ELISAplus測定細胞死亡程度。結果顯示，隨著LBH589濃度的增加，MCF-7細胞的死亡越多；100 nM的LBH589和20μΜ氯喹聯用時可以提高LBH589殺死MCF-7細胞的能力，但20μΜ氯喹本身對MCF-7的死亡影響不大(如圖1所示)。本發明將該實驗進一步延伸應用於篩選聯用藥物。
[0017]實施例2.HDAC抑制劑LBH589增強乳腺癌細胞對氯喹的敏感性
10%的FBS培養基培養過夜的乳腺癌細胞MDA-MB-231經消化後稀釋成含20000個/ml的細胞懸浮液，每孔加入 200μ1細胞懸浮液，於37°C和5%的CO2條件下培養24小時後，吸掉培養基，加入含25nM的LBH589及不同濃度氯喹的培養基，24小時後採用同實施例1的方法檢測細胞死亡程度。結果顯示，隨著氯喹濃度的增加，MDA-MB-231細胞對LBH589的敏感性增強，細胞死亡增加，而沒有LBH589存在下的氯喹，即使濃度高達100μΜ對MDA-MB-231細胞的死亡也無明顯影響(如圖2所示)。
[0018]實施例3.篩選與HDAC抑制劑LBH589聯用的小分子化合物
10%的FBS培養基培養過夜的乳腺癌細胞MDA-MB-231經消化後稀釋成含20000個/ml的細胞懸浮液，每孔加入200μ1細胞懸浮液，於37°C和5%的CO2條件下培養24小時後，吸掉培養基，加入含25nM的LBH589及不同濃度氯喹的培養基或含100μΜ CQ的培養基作為參照，測定含25nM LBH589及10μΜ各化合物的培養條件下，採用同實施例1的方法檢測乳腺癌細胞經24小時培養後的細胞死亡程度。表1-1和表1-2顯示了 62個單體化合物分別與25nM LBH 589聯用的三次實驗結果的平均值，其中，OD平均值越高代表聯用效果越好。
[0019]1-1.與LBH589聯用化合物的篩選 ___
【權利要求】
1.基於細胞自噬的抗腫瘤藥物的篩選方法，其特徵在於，以腫瘤細胞為對象，用細胞自噬誘導劑分別與各單一化合物一起處理體外培養的腫瘤細胞，測定所述的化合物與細胞自噬誘導劑引起培養的細胞死亡的程度，篩選基於細胞自噬的抗腫瘤藥物。
2.按權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的細胞自噬誘導劑是誘導熱休克蛋白hsp90乙醯化的自噬誘導劑。
3.按權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述的細胞自噬誘導劑是HDAC抑制劑。
4.按權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述的HDAC抑制劑選自LBH589或SAHA。
5.一種抗腫瘤藥物組合物，其特徵在於，由細胞自噬誘導劑與氯喹組成，其中所述的細胞自噬誘導劑為LBH589或SAHA。
6.一種抗腫瘤藥物組合物，其特徵在於，由細胞自噬誘導劑與manzamine A組成，其中所述的細胞自噬誘導劑為LBH589或SAHA。
7.按權利要求1所述 的方法，其特徵在於，所述的腫瘤細胞為乳腺癌細胞。
【文檔編號】A61K31/4706GK104164471SQ201410150221
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年4月15日 優先權日:2013年11月4日
【發明者】楊永華, 姜曉筱, 包勇, 劉慧娟, 寇鑫輝 申請人:復旦大學