一種鴨B型肝炎病毒的螢光定量pcr檢測方法及試劑的製作方法

2023-12-09 03:27:21

專利名稱：一種鴨B型肝炎病毒的螢光定量pcr檢測方法及試劑的製作方法
技術領域：
本發明屬於鴨B型肝炎病毒檢測技術領域，涉及一種鴨B型肝炎病毒的螢光定量PCR檢測方法及試劑。
背景技術：
1980年Mason等從家養的北京鴨體內發現鴨B型肝炎病毒(Duck Hepatitis BVirus, DHBV), DHBV屬於禽嗜肝DNA病毒，其嗜肝性、毒粒形態、結構和基因複製等方面與HBV很相似，目前，感染DHBV的北京麻鴨已成為HBV複製、感染機制研究與治療策略評估的重要實驗動物模型]。DHBV DNA的定量檢測成為應用此模型的一個重要指標，以往多採用Southern blot雜交、斑點雜交等方法對DHBV DNA進行定量，由於這些方法靈敏度較低、穩定性差、操作複雜，已被定量PCR方法取代。但是，由於缺乏標準的實驗動物和統一、通用的DHBV DNA定量檢測方法，各地研究者往往選擇本地麻鴨感染的DHBV，針對DHBV基因的不同區域建立檢測方法。由於不同地區、不同鴨種感染的DHBV基因存在差異，造成了研究者實驗結果缺乏可比性，借鑑已有方法也存在不確定性。既往研究針對DHBV的P基因或S基因設計引物，建立DHBV PCR檢測方法，缺乏通用性，因為DHBV有不同的亞型，編碼外膜蛋白和聚合酶蛋白的S基因和P基因容易變異。·

發明內容
本發明解決的問題在於提供一種鴨B型肝炎病毒的螢光定量PCR檢測方法及試齊U，該方法適於不同地區、不同鴨種的定量檢測，具有靈敏度高、特異性強的特點。本發明是通過以下技術方案來實現:—種鴨B型肝炎病毒的突光定量PCR檢測方法,包括以下操作:I)以包含DHBV Core基因片段的質粒載體作為標準品，以鴨血清中提取到的DNA為待檢品；分別以標準品和待檢品為模板，在包含上遊擴增引物、下遊擴增引物和連接有螢光標記物的檢測探針的擴增體系中進行擴增；所述的上遊引物為:ggactcgaacctagaaga ；所述的下遊擴增引物為:ttatttccta ggcgaggg ；所述的檢測探針為:accacagttg tctatgggag aag ；2)在擴增結束後，分別採集標準品和待檢品的擴增產物螢光標記物的螢光信號；3)根據標準品的擴增產物的螢光信號與質粒載體的對應關係建立標準曲線，然後根據待檢品的螢光信號在標準曲線上的位置，確定待檢品中鴨B型肝炎病毒的含量。所述的標準品為pGEM-T/DHBV Core重組質粒，是將DHBV Core區基因序列克隆到pGEM-T載體中。所述的DHBV Core區基因序列的獲得為:以pBR322/2DHBV質粒為模板，以上遊引物Fl和下遊引物Rl進行PCR擴增，所述的上遊引物 Fl 為:gggatccata tcaatgcttc tag ；
下遊引物Rl 為:gctcgagtta tttcctaggc gag。所述的待檢品的獲取為:血清中加入其體積I 2倍的DNA提取液，充分混勻，100°C煮沸5 15min，4°C放置過夜，離心取上清液，得到待檢品；所述的DNA提取液包括0.1 0.5mol/L的Na0H、2 1.5mol/L的NaCl、以及質量濃度為0.5 1.0%的SDS。所述的擴增體系包括0.05 0.1U的聚合酶、250 500 μ M的dNTP，10 20mMTris-HCl, 50 IOOmM KC1、1.5 3mM MgCl2，上遊引物25 IOOmM,下遊擴增引物25 lOOmM，檢測探針5 20mM，作為模板的標準品或待檢品的體積分數為10 20%。所述的擴增體系為25 μ 1，包括:2XHotStart Taq PCR MasterMixl2.5 μ I,包括:0.1UHotStart Taq Polymerase/μ I,500 μ M dNTP each,20mM Tris-HCl、ρΗ8.3，IOOmM KCl 和 3mM MgCl2 ；上遊引物0.5μ l、50mM ；下遊擴增引物0.5 μ 1、50mM ；檢測探針0.5 μ l、10mM ;DEPC-H209 μ I ；標準品或待檢品2 μ I。所述的螢光標記物為FAM，其對應的檢測波長為490nm。所述的擴增程序為:94°C預變性2min ；94°C 15s，49°C 30s，72°C 30s ；40 個循環。一種鴨B型肝炎病毒的螢光定量PCR檢測試劑，包括標準品和PCR擴增體系；所述的標準品為pGEM-T/DHBV Core重組質粒，是將DHBV Core區基因序列克隆到pGEM-T載體中；所述的PCR擴增體系包括0.05 0.1U的聚合酶、250 500 μ M的dNTP，10 20mM Tris-HCl，50 IOOmM KCl、1.5 3mM MgCl2，上遊引物 25 50mM，下遊擴增引物 25 50mM，檢測探針5 10mM，作為模板的標準品或待檢品的體積分數為10 20%。所述的pGEM-T/DHBV Core重組質粒中的DHBV Core區基因是以以上遊引物Fl和下遊引物Rl對DHBV Core區基因進行PCR擴增，所述的上遊引物Fl為:gggatccatatcaatgcttc tag ；下遊引物Rl 為:gctcgagtta tttcctaggc gag ；所述的擴增體系為25 μ 1，包括:2XHotStart Taq PCR MasterMixl2.5 μ I,包括:0.1UHotStart Taq Polymerase/μ I,500 μ M dNTP each,20mM Tris-HCl、ρΗ8.3，IOOmM KCl 和 3mM MgCl2 ；上遊引物0.5μ l、50mM ;下遊擴增引物0.5 μ 1、50mM ；檢測探針0.5 μ l、10mM ;DEPC-H2O 9 μ I ;模板2 μ I。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果:本發明提供的鴨B型肝炎病毒的螢光定量PCR檢測方法及試劑，針對C基因設計診斷PCR的引物與探針。由於DHBV核心抗原穩定性強，免疫原性強，編碼核心蛋白的C基因不易變異，具有高保守性，因此，針對C基因設計診斷PCR的引物與探針可以避免S基因和P基因容易變異的缺陷，所建立的PCR方法具有通用性。本發明提供的鴨B型肝炎病毒的螢光定量PCR檢測方法及試劑，所設計的引物及檢測探針與多達44條序列逐一進行了比較，使所設計的引物與44條序列最大程度的匹配，使引物與DHBV序列儘可能的吻合。從而保證了能夠最全面的檢測世界各地不同基因型和不同鴨種感染的DHBV病毒。本發明提供的鴨B型肝炎病毒的螢光定量PCR檢測方法，是一種通用性強、靈敏度高、特異性強、重複性好，適於不同地區、不同鴨種的DHBV DNA的Taqman實時螢光定量PCR方法。


圖1為重組質粒pGEM-T/DHBV Core酶切鑑定；其中，泳道I為重組質粒pEGM_T/DHBV Core，泳道2為pEGM-T/DHBV core重組質粒BamH I和XhoI雙酶切，泳道3為DNAmarker ；圖2為PCR擴增產物電泳圖，其中，泳道I為DNA marker，泳道2為PCR擴增產物；圖3為FQ-PCR標準品擴增曲線；圖4為標準品回歸曲線；圖5為ABI7300與Bio-RAD IQ5檢測結果相關性分析；圖6ABI7300與Bio-RAD IQ5檢測結果差值與均值分布圖。
具體實施例方式下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。本發明提供的一種鴨B型肝炎病毒的螢光定量PCR檢測方法，包括以下操作:I)以包含DHBV Core基因片段的質粒載體作為標準品，以鴨血清中提取到的DNA為待檢品；分別以標準品和待檢品為模板，在包含上遊擴增引物、下遊擴增引物和連接有螢光標記物的檢測探針的擴增體系中進行擴增；所述的上遊引物為:ggactcgaacctagaaga ；所述的下遊擴增引物為:ttatttccta ggcgaggg ；所述的檢測探針為:accacagttgtctatgggag aag ；2)在擴增結束後，分別採集標準品和待檢品的擴增產物螢光標記物的螢光信號；3)根據標準品的擴增產物的螢光信號與質粒載體的對應關係建立標準曲線，然後根據待檢品的螢光信號在標準曲線上的位置，確定待檢品中鴨B型肝炎病毒的含量。具體的，所述的標準品為pGEM-T/DHBV Core重組質粒，是將DHBV Core區基因序列克隆到PGEM-T載體中。所述的DHBV Core區基因序列的獲得為:以pBR322/2DHBV質粒為模板，以上遊引物Fl和下遊引物Rl進行PCR擴增，所述的上遊引物 Fl 為:gggatccata tcaatgcttc tag ；
下遊引物Rl 為:gctcgagtta tttcctaggc gag。所述的擴增體系包括0.05 0.1U的聚合酶、250 500 μ M的dNTP，10 20mMTris-HCl, 50 IOOmM KC1、1.5 3mM MgCl2，上遊引物25 IOOmM,下遊擴增引物25 lOOmM，檢測探針5 20mM，作為模板的標準品或待檢品的體積分數為10 20%。相應的鴨B型肝炎病毒的螢光定量PCR檢測試劑，包括標準品和PCR擴增體系；所述的標準品為pGEM-T/DHBV Core重組質粒，是將DHBV Core區基因序列克隆到pGEM-T載體中；所述的PCR擴增體系包括0.05 0.1U的聚合酶、250 500 μ M的dNTP，10 20mM Tris-HCl，50 IOOmM KCl、1.5 3mM MgCl2，上遊引物 25 50mM，下遊擴增引物 25 50mM，檢測探針5 10mM，作為模板的標準品或待檢品的體積分數為10 20%。下面以具體的實施例對各部分進行詳細的說明。實施例1:鴨B肝病毒螢光定量PCR診斷方法引物、探針的設計在GenBank中共檢索到44條鴨B肝病毒全基因組序列，分別來自中國(包括北京、湖北、上海、重慶、四川、桂林、河南、廣東等地)和外國(美國、德國、印度、加拿大、南非、澳大利亞等)，通過DNASIS軟體比較，各地DHBV基因序列存在很多差異，而不同地區報導的Core區序列bp241-414處序列基本一致，兩兩比較一致率最小為98%，最聞可達100%。所以，以該區域為模板，設計引物，並將多對引物與所有DHBV Core區核酸序列匹配，獲得最大程度匹配的引物與探針。所設計的引物序列及螢光探針序列如下:上遊引物F:DHBV bp 256-273 GGACTCGAACCTAGAAGA (Tm 值 54°C )，下遊引物R:DHBV bp 397-414 TTATTTCCTAGGCGAGGG(Tm 值 54°C )，螢光探針DHBV-Probe: DHBV bp 286-308 (FAM):ACCACAGTTGTCTATGGGAGAAG (TAM RA)(Tm 值 68°C )。為使引物與44條序列最大程度的匹配，將設計的多對引物進一步與各序列進行逐一比較，儘可能使獲得的引物與發布的DHBV序列吻合，上、下遊引物及探針序列均斜體劃線表示，不同的核酸序列大寫標註。

檢測結果如表I所示，引物、探針與42條DHBV Core基因序列100% —致，上遊引物僅與DQ276978.1有兩處差異(bp261C — T, bp270A — G)，下遊引物與X12798.1有一處差異(bp397C —A)。因此可以以所設計的引物對以此區域為模板，建立用於檢測DHBV DNA的通用、準確的實時螢光定量PCR方法。表1:GenBank所有DHBV全基因組core序列bp241 414展不
權利要求
1.一種鴨B型肝炎病毒的螢光定量PCR檢測方法，其特徵在於，包括以下操作: O以包含DHBV Core基因片段的質粒載體作為標準品，以鴨血清中提取到的DNA為待檢品；分別以標準品和待檢品為模板，在包含上遊擴增引物、下遊擴增引物和連接有螢光標記物的檢測探針的擴增體系中進行擴增； 所述的上遊引物為:ggactcgaac ctagaaga ； 所述的下遊擴增引物為:ttatttccta ggcgaggg ； 所述的檢測探針為:accacagttg tctatgggag aag ； 2)在擴增結束後，分別採集標準品和待檢品的擴增產物螢光標記物的螢光信號； 3)根據標準品的擴增產物的螢光信號與質粒載體的對應關係建立標準曲線，然後根據待檢品的螢光信號在標準 曲線上的位置，確定待檢品中鴨B型肝炎病毒的含量。
2.如權利要求1所述的鴨B型肝炎病毒的螢光定量PCR檢測方法，其特徵在於，所述的標準品為pGEM-T/DHBV Core重組質粒，是將DHBV Core區基因序列克隆到pGEM_T載體中。
3.如權利要求2所述的鴨B型肝炎病毒的螢光定量PCR檢測方法，其特徵在於，所述的DHBV Core區基因序列的獲得為: 以pBR322/2DHBV質粒為模板，以上遊引物Fl和下遊引物Rl進行PCR擴增，所述的上遊弓I物 Fl 為:gggatccata tcaatgcttc tag ； 下遊引物 Rl 為:gctcgagtta tttcctaggc gag。
4.如權利要求1所述的鴨B型肝炎病毒的螢光定量PCR檢測方法，其特徵在於，所述的待檢品的獲取為: 血清中加入其體積I 2倍的DNA提取液，充分混勻，100°C煮沸5 15min，4°C放置過夜,離心取上清液,得到待檢品； 所述的DNA提取液包括0.1 0.5mol/L的NaOH、2 2.5mol/L的NaCl、以及質量濃度為 0.5 1.0% 的 SDS0
5.如權利要求1所述的鴨B型肝炎病毒的螢光定量PCR檢測方法，其特徵在於，所述的擴增體系包括0.05 0.1U的聚合酶、250 500 μ M的dNTP，10 20mM Tris-HCl, 50 IOOmM KCl、1.5 3mM MgCl2，上遊引物25 IOOmM,下遊擴增引物25 IOOmM,檢測探針5 20mM，作為模板的標準品或待檢品的體積分數為10 20%。
6.如權利要求1所述的鴨B型肝炎病毒的螢光定量PCR檢測方法，其特徵在於，所述的擴增體系為25 μ I,包括:2XHotStart Taq PCR MasterMixl2.5 μ I,包括:0.1UHotStart Taq Polymerase/ μ I,500 μ M dNTP each,20mM Tris-HCl、ρΗ8.3,IOOmM KCl 和 3mM MgCl2 ； 上遊引物0.5μ l、50mM ； 下遊擴增引物0.5μ l、50mM ； 檢測探針0.5 μ l、10mM ； DEPC-H209 μ I ； 標準品或待檢品2 μ I。
7.如權利要求1所述的鴨B型肝炎病毒的螢光定量PCR檢測方法，其特徵在於，所述的螢光標記物為FAM，其對應的檢測波長為490nm。
8.如權利要求1所述的鴨B型肝炎病毒的螢光定量PCR檢測方法，其特徵在於，所述的擴增程序為:94°C預變性 2min ；94°C 15s，49。。30s, 72°C 30s ；40 個循環。
9.一種鴨B型肝炎病毒的螢光定量PCR檢測試劑，其特徵在於，包括標準品和PCR擴增體系； 所述的標準品為pGEM-T/DHBV Core重組質粒，是將DHBV Core區基因序列克隆到pGEM-T載體中； 所述的PCR擴增體系包括0.05 0.1U的聚合酶、250 500 μ M的dNTP，10 20mMTris-HCl, 50 IOOmM KCl、1.5 3mM MgCl2,上遊引物25 50mM，下遊擴增引物25 50mM，檢測探針5 10mM，作為模板的標準品或待檢品的體積分數為10 20%。
10.如權利要求9所述的鴨B型肝炎病毒的螢光定量PCR檢測試劑，其特徵在於，所述的pGEM-T/DHBV Core重組質粒中的DHBV Core區基因是以以上遊引物Fl和下遊引物Rl對DHBV Core區基因進行PCR擴增，所述的上遊引物Fl為:gggatccata tcaatgcttc tag ； 下遊引物 Rl 為:gctcgagtta tttcctaggc gag ； 所述的擴增體系為25 μ I,包括:2XHotStart Taq PCR MasterMixl2.5 μ I,包括:0.1UHotStart Taq Polymerase/ μ I,.500 μ M dNTP each,20mM Tris-HCl、ρΗ8.3,IOOmM KCl 和 3mM MgCl2 ； 上遊引物0.5μ l、50mM ； 下遊擴增引物0.5μ l、50mM ； 檢測探針0.5 μ l、10mM ； DEPC-H209 μ I ； 模板2 μ I。
全文摘要
本發明公開了一種鴨B型肝炎病毒的螢光定量PCR檢測方法及試劑，篩選出鴨B肝病毒Core區最大一致性的保守區核酸序列，以此為模板，設計、合成引物和螢光探針。構建pGEM-T/DHBV Core重組質粒，製備PCR標準品。通過優化反應體系和擴增條件。本發明提供的實時螢光定量PCR檢測方法具有通用性強、靈敏度高、特異性強、重複性好等優點，適於不同地區、不同鴨種的DHBV DNA的檢測。
文檔編號C12Q1/70GK103114153SQ20131004625
公開日2013年5月22日 申請日期2013年2月5日 優先權日2013年2月5日
發明者王亞文, 李義平, 劉正穩, 惠凌雲, 劉希, 馮艾, 王威, 張琳, 楊廣笑, 王全穎 申請人:西安交通大學醫學院第一附屬醫院