一種檢測牛腹瀉病毒的螢光定量pcr試劑盒及應用的製作方法

2023-12-09 03:48:36

專利名稱：：一種檢測牛腹瀉病毒的螢光定量pcr試劑盒及應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及生物
技術領域：
，更具體涉及一種檢測牛腹瀉病毒的螢光定量PCR試劑盒，同時還涉及螢光定量PCR試劑盒的用途，該螢光定量PCR試劑盒可高效方便地對牛血液製品和牛血清進行定量檢測和質量監控，也可以進行牛病毒性腹瀉-黏膜病的流行病學調查，還可以為相關基礎研究提供技術支持，應用前景十分廣泛。
背景技術：
：牛腹瀉病毒屬瘟病毒屬(Pestivirus)，黃病毒科(Flaviviridae)，是最小的有囊膜的RNA病毒，主要引起牛病毒性腹瀉一黏膜病，是奶牛和肉牛群的常發病。該病主要發生於牛，犢牛更易感。牛群中的抗體檢出率極高，因此可能普遍存在輕症或隱性感染。在急性發作型，死亡率甚高，且新生犢牛經常發生致死性腹瀉，給畜牧業、國際貿易出口和食品安全等帶來嚴重的問題。由於BVDV的組織培養宿主範圍相當廣，常導致培養細胞汙染來自血清的BVDV，且常常不易引起注意，給細胞培養以及相關基礎研究帶來一定的問題。牛腹瀉病毒的快速撿測是控制和消滅該病的前提，但其常規檢測方法有一些不足之處，檢測技術一般來說有血清學診斷技術、生物學試驗、分子生物學診斷技術三類1.血清學診斷技術包括補體結合實驗、中和實驗、凝集實驗、免疫擴散、沉澱實驗、免疫電泳技術、免疫螢光染色、雙抗體夾心ELISA和免疫電鏡技術等。在這些方法中得到普遍承認且廣泛應用的有補體結合實驗、間接血凝試驗、瓊脂擴散實驗、中和實驗。但由於所有實驗均用到抗血清和抗原免疫反應，反應時間長，材料多，準備周期長，檢測具有明顯的滯後性，只能定性不能定量，而且重複性差。2.生物學試驗包括動物實驗、雞胚接種和細胞培養。這種檢測方法存在不敏感問題，而且有些樣品中存在抗補體活性，影響檢測效果。動物實驗成本高，周期長，浪費生物資源和人力物力。3.分子生物學診斷技術包括核酸雜交實驗、聚丙烯醯胺凝膠電泳、聚合酶鏈式反應、負染電鏡檢測等。核酸雜交、聚丙烯醯胺凝膠電泳等檢測方法更適合於對病毒特性進行更加深入的研究，由於整個系統操作複雜，過程繁多，成本高，不適宜同時進行大批量檢測，因而受到很大限制。相比之下，普通RT-PCR方法特異性好，檢測靈敏度高，不但可以檢測活病毒核酸，也能直接檢測滅活的核酸片段。樣品可以是器官、組織、細胞中的BVDV，並可與不同的BVDV株與豬瘟病毒、邊界病毒相區別，這是免疫學方法無法替代的。但這種傳統的定量方法測定的都是PCR的終產物，而不是起始DNA或RNA拷貝數。由於PCR的終產物量與起始模板量之間沒有線性關係，所以根據最終的PCR產物量不能計算出起始DNA或RNA拷貝數。因此，如何快速、準確測定牛腹瀉病毒是面臨的主要難題之一。近年來發展起來的螢光定量PCR(FluorogeneticQuantitativePCR,FQ-PCR)技術以其靈敏度高、速度快、特異性強等優點在基因表達水平分析(NellemannC，VinggaardAM,DalgaardM,etal.QuantificationofAntiandrogenEffectDeterminedbyLightCyclerTechnology[J].Toxicology,2001，163:29-38)、病原體的定性(BhudeviB，WeinstockD.FluorogenicRT國PCRassay(TaqMan)forDetectionandClassificationofBovineViralDiarrheaVirus[J].Vet.Microbiol.,2001,83:1-10.)和定量檢湖!)(KathyF丄Tang，JunWang,DonaldV丄ightaer.QuantitationofTaurasyndromevirusbyreal-timeRT-PCRwithaTaqManassay[J].J.Virol.Methods,115(2004)109-114.;BirgitLiss*.Improvedquantitativereal-timeRT國PCRforexpressionprofilingofindividualcells[J].NucleicAcidsRes.,2002,Vol.30No.17e89,;FranckHousseaua,limberlyR丄indseya,etal.Quantitativereal-timeRT-PCRasamethodformonitoringTlymphocytereactivitytofull-lengthtyrosinaseproteininvaccinatedmelanomapatients[J].J.Immunol.Methods266(2002)87-103.;DesireN,DeheeA，SchneiderV,etal.QuantificationofHumanImmunodeficiencyVirusType1ProviralLoadbyaTaqManReal-TimePCRAssay[J].J.Clin.Microbiol,2001,39:1303-1310.;MartellM，GomezJ，EstebanJI,etal.High-ThroughputReal-TimeReverseTranscription-PCRQuantitationofHepatitisCVirusRNA[J〗.J.Clin.Microbiol,1999，37:327-332.;Marley，M.S.,Givens,M.D"Galik,P.K.,Riddell,K.P,Stringfellow,D.A..Developmentofaduplexquantitativepolymerasechainreactionassayfordetectionofbovineherpesvirus1andbovineviraldiarrheavirusinbovinefollicularfluid[J].Theriogenology,2008,70(2):153-160;FlorenceKP,GlauciaPB,MireilleS，etal.QuantitationofHCVRNAusingreal-timePCRandfluorimetry[J].J.Virol.Methods,2001，95:111-119.)等方面得到廣泛應用，並且已經成為當前病毒核酸定量主要方法，國內目前也已有關於C肝、B肝、支原體、愛滋病、結核定量檢測的試劑盒上市
發明內容-本發明的目的是在於提供了一種檢測牛腹瀉病毒的螢光定量PCR試劑盒，該試劑盒適用於目前存在市場上的所有類型螢光定量基因擴增儀，靈敏度高、定量快速準確、檢測範圍廣、穩定性好。本發明的另一個目的是在於提供了一種螢光定量PCR試劑盒在奶牛感染牛腹瀉病毒流行病學調査中的應用，可對牛血液製品和牛血清進行定量檢測和質量監控，也可以進行牛病毒性腹瀉-黏膜病的流行病學調查，還可以為相關基礎研究提供技術支持，應用前景十分廣泛。為了實現上述目的，本發明要用以下技術措施一種檢測牛腹瀉病毒的螢光定量PCR試劑盒它包括a)RNA抽提液、b)逆轉錄反應液、c)RNA酶抑制劑、d)逆轉錄酶、e)引物和螢光探針(TaqMan)、f)標準陽性DNA模板、g)螢光定量PCR反應液，其特徵在於採用傳統的兩步法擴增(Two-StepRT-PCR)，即第一步進行逆轉錄反應，將RNA樣品逆轉錄成cDNA，第二步進行螢光定量PCR反應，同時引入標準陽性DNA樣品定量檢測未知樣品。用DNA作為標準品，使得定量反應結果更加穩定可靠，並大大增加了實驗的重複性，減少誤差。逆轉錄反應液含有逆轉錄酶反應液，RNA酶抑制劑，螢光定量反應液含有引物和螢光探針，引物序列分別為正義引物(FP)5，-CAGGTGATCCCTTATTTGGTGAAAG-3，(SEQIDNO:l)，反義引物(RT):5，-TCACAGGTCCTCTGCTATTAC-3，(SEQIDNO:2)，擴增子大小為143bp。螢光探針序歹ij為5'國FAM-CCACCCTCAATCGACGCTAAAGCTCCCA-TAMRA-3'(SEQIDNO:3)，探針的5'端標記螢光發射基團FAM(6—羧基螢光素)，3'端標以螢光淬滅基團TAMRA。標準陽性DNA模板由已插入牛腹瀉病毒5'-UTR區185bp片段的pGEM-T載體(購自Promega公司)轉化大腸桿菌DH5a(購自Invitrogen)，增殖後提取質粒，並於紫外分光光度計測A26定量並10倍5梯度稀釋。所述的逆轉錄反應液是由5xbuffer，lO^imol/L的反義引物，逆轉錄酶，RNA酶抑制劑，10mMdNTPs和無RNA酶的滅菌雙蒸水組成；螢光定量PCR反應液是由2xPremix，10|amol/L的正義引物和反義引物，10pmol/L螢光探針和無菌雙蒸水組成。所述的標準陽性模板DNA核苷酸序列為cttatttggtgaaaggggagcagtccaccctcaatcgacgctaaagctcccacacaagagaggggaacgegatgttccaaccaacttggcatccttaccaaaaagaggtgactgcaggtcgggtaatagcagaggacctgtga在本發明的一個優選方案中，採用傳統的兩步法擴增(Two-StepRT-PCR)，即第一步進行逆轉錄反應，將RNA樣品逆轉錄成cDNA，第二步進行螢光定量PCR反應，同時引入標準陽性DNA樣品定量檢測未知樣品。用DNA作為標準品，使得定量反應結果更加穩定可靠，並大大增加了實驗的重複性，減少誤差。在本發明的一個具體方案中，逆轉錄反應液由反義引物(RT)，逆轉錄酶，RNA酶抑制劑，5xbuffer溶液，10mMdNTPs和無RNA酶的滅菌雙蒸組成；螢光定量PCR反應液由正義引物(FP)，反義引物(RT)，螢光探針(TaqMan)，2xbuffer溶液和滅菌雙蒸水組成；在本發明的一個具體方案中，逆轉錄反應液由5xbuffer溶液5pl，10nmol/L的反義(RT)引物2.5^1，lOmMdNTPsl.5jal，逆轉錄酶和RNA酶抑制劑各1^1，無RNA酶的滅菌雙蒸水9pl組成；螢光定量反應液由2xbuffer溶液12.5pl，10nmol/L正義(FP)、反義(RT)引物各3(il，10nmol/L螢光探針0.75^1，滅菌雙蒸水0.75^1組成。其中螢光探針為(SEQIDNO:3)所示的核苷酸序列，螢光探針5'端標記的螢光報告基團是FAM，3'端標記螢光淬滅基團TAMRA。在本發明的一個優選方案中，標準陽性DNA模板由含有插入目的片段的pGEM-T(購自promega公司)載體轉化大腸桿菌DH5a，增殖後提取質粒，並於紫外分光光度計測A260定量並10倍梯度稀釋。實驗所用的標準品製備過程為PCR產物電泳後切下含有目的片段的凝膠，用Omega公司的凝膠純化試劑盒純化，與pGEM-T載體(購自promega公司)4'C過夜連接，轉化感受態細胞，轉化產物塗平板培養，挑取白斑PCR鑑定陽性後送博亞生物工程有限公司測序，根據測序結果將篩選的陽性克隆菌接種到含氨卞的LB培養基過夜培養，用SDS鹼裂解法製備質粒DNA，經Omega公司的凝膠純化試劑盒純化後於紫外分光光度計測八26o定量，並稀釋至梯度109-102拷貝/10^1，-70°。保存。在本發明提供檢測牛腹瀉病毒的螢光定量PCR試劑盒中，有一條一端標記有螢光報告基團另一端標記有螢光淬滅基團的特異性螢光探針，在探針完整時，兩基團在空間結構上距離相互靠近，5'端報告基團產生的螢光因為螢光共振能量轉移(FRET)而被3'端淬滅基團淬滅，故體系中沒有螢光信號的變化。在PCR退火和延伸過程中，探針與模板特異性結合，隨著引物的延伸，TaqDNA聚合酶利用其5'-3'外切活性對探針進行切割釋放出報告基團，這樣破壞了兩基團之間的FRET，報告基團所釋放的螢光可以被內置在定量檢測儀內的螢光探測器檢測，模板每複製一次，就有一個探針被切斷，伴隨一個螢光信號的釋放。由於被釋放的螢光基團數目和PCR產物數量是一對一的關係，所以螢光量的增加與PCR產物的積累量呈比例關係。對牛腹瀉病毒的定量可通過與標準品的循環域值(Ct，ThresholdCycle)相比較得出。Ct值是PCR過程中，螢光量的積累超過基底螢光量的循環數，Ct值與起始模數呈一定比例關係，Ct值越小，起始模板數越多，相反，Ct值越大，起始模板數越少。利用陽性梯度標準模板的Ct值製成標準曲線，再根據待測樣品的Ct值可準確測出該樣品的起始拷貝數。在本發明提供檢測牛腹瀉病毒的螢光定量PCR試劑盒中，針對牛腹瀉病毒的基因組的靶片段特殊性，將反應體系(引物和探針濃度、Mg^濃度、擴增程序等)的優化，並將Q-PCR技術和定量檢測系統(包括LigthCycler系統，Roche，ABIPrism系統，PEAppliedBiosystems)相結合，將其用於各種來源的牛腹瀉病毒樣品的定量檢測。通過優化方案，反覆實驗，以及與傳統檢測方法進行比較，建立了定量檢測牛腹瀉病毒的方法，並研製出牛腹瀉病毒的定量檢測試劑盒，該試劑盒的靈敏度可在每個反應體系中檢出100個以下的病毒基因拷貝數，檢測範圍可以達到八個數量級。在本發明的另外一個方面，本發明還提供了一種螢光定量PCR試劑盒對牛腹瀉病毒進行檢測的方法，該方法包括下列步驟A)用f)標準陽性DNA模板由插入目的片段的pGEM-T(購自promega公司)載體轉化大腸桿菌DH5a，增殖後提取質粒，並用紫外分光光度計定量；B)用a)RNA抽提液從待測標本中提取RNA，然後加b)逆轉錄反應液，c)RNA酶抑制劑，d)逆轉錄酶，e)反義引物進行逆轉錄；C)螢光定量PCR由e)引物和螢光探針(TaqMan)，g)PCR螢光定量反應液，f)標準陽性DNA模板或逆轉錄反應產物組成，己加入了標準品及待測樣品的螢光定量反應液PCR反應體系上機，用螢光定量檢測儀進行PCR檢測；D)通過比較待測樣品和標準品的循環域值根據標準曲線計算出待測樣品的起始拷貝數。在本發明中提供的檢測牛腹瀉病毒的螢光定量PCR試劑盒可對各種來源的牛腹瀉病毒樣品進行準確定量檢測，並可對牛血液製品和牛血清進行定量檢測和質量監控，也可以進行牛病毒性腹瀉-黏膜病的流行病學調査，還可以為相關基礎研究提供技術支持，應用前景十分廣泛。本發明與現有技術相比具有以下優點和效果1.與傳統定量方法相比，此實時螢光定量PCR具有高靈敏性，高特異性和高準確性的特點，直接對PCR每循環一次就收集一個數據，建立實時擴增曲線，準確地確定Ct值，從而根據Ct值確定起始RNA拷貝數，做到了真正意義上核酸定量。2.與一步法相比，本實驗採用的兩步法擴增(Two-StepRT-PCR)，用已知濃度的DNA標準品使得定量反應結果更加穩定可靠，並大大增加了實驗的重複性，減少誤差。3.檢測範圍廣，在109-102copies/reaction濃度範圍內有極好的線性關係(R=0.999)，檢測範圍可以達到八個數量級，已達到國際先進水平，其靈敏度可檢測100c叩ies以下，是其它任何方法無法比擬的。4.適用於各種型號的螢光定量擴增儀，一次實驗中三個重複樣品相應的變異係數(CV)小於2%，說明其極高的重複性和穩定性。5.該實時螢光定量PCR利用外標準曲線，是迄今為止定量最準確，重現性最好的定量方法，已得到全世界的公認，廣泛用於基因表達研究、藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應當理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明要求保護的範圍，下列實施例中未註明具體實驗條件和方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等主編，科學出版社，2002，分子克隆實驗指南(第三版)；D丄.斯佩克特等主編，科學出版社，2001，細胞實驗指南；F.M.奧斯伯等主編，科學出版社，2005，精編分子生物學實驗指南，或按照製造廠商建議的條件。8實施例1牛腹瀉病毒的螢光定量PCR試劑盒組成及其反應條件A).試劑盒組成a)試劑盒組成如下(IO次反應)RNA提取液A(4ml/管)RNA提取液B(800nl/管)逆轉錄反應液(9(Hil/管)反轉錄酶(lOpl/管)RNA酶抑制劑(400U/管)強陽性標準品(100倍稀釋定值準品20^1/管，共四管)PCR反應管(無菌、無RNA酶和DNA酶)DEPCH20(2ml/管)陰性標準品(50pl/管)臨界陽性標準品(50pl/管)螢光定量PCR反應液(125pl/管)(RNA提取液A為Invitrogen公司產品。b)逆轉錄反應液，d)逆轉錄酶購自Promega公司，g)螢光定量PCR反應液和RNA酶抑制劑(40U/pl)購自TAKARA公司。)B).逆轉錄反應液(反應總體積是25pl):由5xbuffer溶液5^1，lOpmol/L的反義引物RT(SEQIDNO:2)2.5^1，10mMdNTPsl.5^d，逆轉錄酶和RNA酶抑制劑各lnl，無RNA酶的滅菌雙蒸水9^1和待測樣品5^1組成；螢光定量反應液由2xbuffer溶液12.5nl，10nmol/L正義引物FP(SEQIDNO:l)、反義引物RT各3pl，10pmol/L螢光探針0.75pl，滅菌雙蒸水0.75(il，待測樣品的cDNA或標準品組成。其中螢光探針為(SEQIDNO:3)所示的核苷酸序列，螢光探針5'端標記的螢光報告基團是FAM，3'端標記螢光淬滅基團TAMRA。C).反應條件如下(採用兩步法)cDNAsynthesis:70。C10min0。C2min0。Cpause42°C50min70°ClOminPCR:95°C，2min94。C，15s60°C，60s40cycles在每個循環的第二步結束時進行螢光檢測。對BVDV的定量可通過與標準品的循環域值(Ct，ThresholdCycle)相比較並根據標準曲線計算出待測樣品的起始拷貝數。D).螢光定量PCR試劑盒檢測牛腹瀉病毒的靈敏度、檢測範圍及穩定性取轉錄的標準品RNA10、l(^c/r濃度範圍，每個濃度三個重複，加RNA裂解液400(al充分混勻，室溫(20-25°C)靜置10分鐘，加80(^1氯仿，室溫靜置3分鐘，於4'C12000g/min離心IO分鐘，上清液轉移到另一個離心管，加200W異丙醇，室溫沉澱10分鐘，4°C12000g/min離心IO分鐘，輕輕倒出上清，加lml75。/。(體積比)乙醇充分吹散，於4。C7500g/min離心5分鐘，棄上清，RNA沉澱在室溫下自然乾燥，加無RNA酶水25|iil60°C10min溶解。E).取D)步所提RNA5然後加逆轉錄反應液5xbuffer5pl，反義引物RT(SEQIDNO:2)2.5|dl(10|amol/L)，10mMdNTPs1.5jj1，RNA酶抑制劑(40U/w)，逆轉錄酶lpl，分別加入對應編號的PCR反應管，在PCR儀上進行逆轉錄實驗。反應條件為70°ClOmin，0°C2min，42°C50min，70°C10min。螢光定量PCR反應液12.5pl，10(amol/L正義引物FP(SEQIDN0:1)、反義引物RT(SEQIDN0:2)各3nl，螢光探針0.75nl(10(amoI/L)，待測樣品cDNA或標準品DNA5jxl，分別加入對應編號的PCR反應管，在螢光定量檢測儀上平行做PCR檢測。循環條件為95'C預變性2min;94°C15s，60°C60s，擴增40個循環。把螢光檢測的程序設置在每個循環的第二步結束時進行，檢測波長為518nrn。循環結束後，運用儀器自帶分析軟體，讀取待檢樣品拷貝數。結果為:tableseeoriginaldocumentpage10tableseeoriginaldocumentpage11</tabl以上結果表明該試劑盒檢測範圍廣，在10、10^/r濃度範圍內有極好的線性關係，相關係數R=0.999其檢測範圍可以達到九個數量級，其靈敏度可檢測lOOc叩ies以下，且穩定性好，一次實驗中三個重複樣品相應的變異係數(CV)小於1%，說明其極高的重複性，適用於各種型號的螢光定量擴增儀，是其它任何方法無法比擬的。實施例2:牛腹瀉病毒螢光定量PCR試劑盒在BVDV流行病學調查中的應用A).試劑盒組成a)試劑盒組成如下(IO次反應)RNA提取液A(5ml/管)RNA提取液B(5ml/管)RNA提取液C(10ml/管)過濾柱A和吸附柱B(無菌、無RNA酶和DNA酶)逆轉錄反應液(90pl/管)反轉錄酶(10pl/管)強陽性標準品(100倍稀釋定值準品20|11/管，共四管)PCR反應管(無菌、無RNA酶和DNA酶)DEPCH20(2ml/管)陰性標準品(50nl/管)臨界陽性標準品(50pl/管)螢光定量PCR反應液(125pl/管)(RNA提取液A、B、C和過濾柱吸附柱為天根公司產品。b)逆轉錄反應液，d)逆轉錄酶購自Promega公司，g)螢光定量PCR反應液和RNA酶抑制劑(40U/^U)購自TAKARA公司)B).奶牛血清中提取病毒過程取200nl待測的血清樣品或加入病毒的陽性血清樣品，加入50(^1RNA提取液A(使用前加入P-巰基乙醇，終濃度1%(體積比)；上述溶液轉移至過濾柱CS，12000rpm離心2min，收集濾液；向濾液中加入1倍體積的70%乙醇，得到的溶液和沉澱一起轉入吸附柱B中，12000rpm離心lmin，棄廢液；吸附柱B中加入350^1RNA提取液B，12000rpm離心lmin，棄廢液，重複一次；吸附柱B中加入700nlRNA提取液C(使用前加入無水乙醇)，室溫放置2min，12000rpm離心lmin，重複一次；空離吸附柱，12000卬m離心2min;30|alRNase-freeddH20加入吸附柱B，室溫2-5min，12000rpm離心2min;得到的RNA用於下遊的逆轉錄實驗。C).逆轉錄反應液(反應總體積是25pl):由5xbuffer溶液5^1，1Opmol/L的反義引物RT(SEQIDN0:2)2.5pl，10mMdNTPsl.5pl，逆轉錄酶和RNA酶抑制劑各1^1，無RNA酶的滅菌雙蒸水9^1和待測樣品5^1組成；螢光定量反應液由2xbuffer溶液12.5^1，10(imol/L正義引物FP(SEQIDNO:l)、反義引物RT各3pl，10pmol/L螢光探針0.75^1，滅菌雙蒸水0.75^d，待測樣品的cDNA或標準品組成。其中螢光探針為(SEQIDNO:3)所示的核苷酸序列，螢光探針5'端標記的螢光報告基團是FAM，3'端標記螢光淬滅基團TAMRA。D).反應條件如下(採用兩步法)cDNAsynthesis:70。C10min0。C2min0。Cpause42°C50min1270。C10minPCR:95°C，2min94°C，15s60°C，60s40cycles在每個循環的第二步結束時進行螢光檢測。對BVDV的定量可通過與標準品的循環域值(Ct，ThresholdCycle)相比較並根據標準曲線計算出待測樣品的起始拷貝數。E).奶牛血清中牛腹瀉病毒的檢測將不同來源的25份奶牛血清按B)所示的處理方法提取病毒RNA，分別進行逆轉錄和螢光定量PCR反應(按C)，D)所示進行)，每個樣品重複兩次，循環結束後，運用儀器自帶分析軟體，讀取待檢樣品拷貝數。結果為tableseeoriginaldocumentpage136-065A17-2-009A18-114A19-2-147A20-6-730A21-03-6116A22-2-082A23-4-042A24-6-905A25-以上結果表明，奶牛編號為601，2-149，6-312的牛血清中含有牛腹瀉病毒，表明奶牛群中存在少量的奶牛攜帶BVDV，同時證實了牛腹瀉病毒螢光定量PCR試劑盒能成功應用於BVDV流行病學調査，牛血清以及牛血液製品的監測，重複性好，CV值均小於1X。實施例3:牛腹瀉病毒螢光定量PCR試劑盒在市售牛血清檢測中的應用A).試劑盒組成-a)試劑盒組成如下(IO次反應)RNA提取液A(4ml/管)RNA提取液B(800pl/管)逆轉錄反應液(90pl/管)反轉錄酶(10^d/管)RNA酶抑制劑(400U/管)強陽性標準品(100倍稀釋定值準品20pl/管，共四管)PCR反應管(無菌、無RNA酶和DNA酶)DEPCH20(2ml/管)陰性標準品(50pl/管)臨界陽性標準品(50pl/管)螢光定量PCR反應液(125pl/管)(RNA提取液A為Invitrogen公司產品。b)逆轉錄反應液，d)逆轉錄酶購自Promega公司，g)螢光定量PCR反應液和RNA酶抑制劑(40U/(al)購自TAKARA公司。)B).逆轉錄反應液(反應總體積是25^1):由5xbuffer溶液5pl，1Opmol/L的反義引物RT(SEQIDN0:2)2，，10mMdNTPsl.5(il，逆轉錄酶和RNA酶抑制劑各1^1，無RNA酶的滅菌雙蒸水9^1和待測樣品5pl組成；螢光定量反應14液由2xbuffer溶液12.5pl，10pmol/L正義引物FP(SEQIDNO:l)、反義引物RT各3ilU，10)^mol/L螢光探針0.75nl，滅菌雙蒸水0.75pl，待測樣品的cDNA或標準品組成。其中螢光探針為(SEQIDNO:3)所示的核苷酸序列，螢光探針5'端標記的螢光報告基團是FAM，3'端標記螢光淬滅基團TAMRA。C).反應條件如下(採用兩步法)cDNAsynthesis:70°C10min0°C2min0°Cpause42°C50min70°ClOminPCR:95°C，2min94°C，15s60°C，60s40cycles在每個循環的第二步結束時進行螢光檢測。對BVDV的定量可通過與標準品的循環域值(Ct，ThresholdCycle)相比較並根據標準曲線計算出待測樣品的起始拷貝數。D)實驗方法1.細胞培養1)培養的原代牛腎細胞(BovineKidneyCell,BKC)細胞鋪制6孔板x4塊，2ml/孑L，50%匯合度；2)待檢血清用MEM配製為5%(體積比)濃度；3)細胞貼壁後，更換為待檢血清配製的培養基，2ml/孔；4)同時設陰性和陽性對照，陽性對照加含有BVDV的5%(體積比)FBSMEM;5)37°C，5%(體積比)C02培養箱中培養，並觀察是否有CPE的產生。6)72h後，收集細胞，2000rpm離心5min暫存於-8(TC。其餘樣品同樣方法處理。提取細胞的總RNA，作為RT的模板。2.細胞中總RNA的提取每個樣品加入RNA提取液A400^1，常溫放置10min，加入RNA提取液B80W，劇烈震蕩15s，常溫(20-25°C)放置23min;4。C，12000rpm離心15min，取上清200nl，移入一個新的EP管，再加入異丙醇200^1，室溫下靜置10min;4°C，12000rpm離心15min;棄上清，沉澱加入75%(體積比)冷乙醇400^1，渦旋，4°C，7500卬m離心5min，棄上清留沉澱，於室溫靜置5~10min晾乾乙醇，加入25^1DEPC水溶解沉澱。3.逆轉錄反應和螢光定量PCR反應按B)，C)所示進行。E).實驗結果tableseeoriginaldocumentpage16陰性對照-以上結果表明杭州四季青公司，批號為080504的血清中被汙染了少量的牛腹瀉病毒，其它公司待檢批號的血清均表現為牛腹瀉病毒陰性，同時表明該試劑盒能用於檢測細胞樣品中的病毒。SEQUENCELISTING武漢三利生物技術有限公司—種檢測牛腹瀉病毒的螢光定量PCR試劑盒及應用—種檢測牛腹瀉病毒的螢光定量PCR試劑盒及應用3Patentlnversion3.3125DNA人工合成1caggtgatcccttatttggtgaaag25221DNA人工合成2tcacaggtcctctgctattac2132317DNA人工合成3ccaccctcaatcgacgctaaatctccca2權利要求1、一種檢測牛腹瀉病毒的螢光定量PCR試劑盒，該試劑盒含有a)RNA抽提液、b)逆轉錄酶反應液、c)逆轉錄酶、d)RNA酶抑制劑、e)引物和TaqMan探針、f)標準陽性DNA模板、g)螢光定量PCR反應液，其特徵在於引物序列分別為正義引物5』-CAGGTGATCCCTTATTTGGTGAAAG-3』，反義引物5』-TCACAGGTCCTCTGCTATTAC-3』，擴增子大小為143bp，螢光探針序列為5′FAM-CCACCCTCAATCGACGCTAAAGCTCCCA-TAMRA-3′，探針的5』端標記螢光發射基團FAM，3』端標記螢光淬滅基團TAMRA，標準陽性DNA模板由已插入牛腹瀉病毒5』-UTR區185bp片段的pGEM-T載體轉化大腸桿菌DH5α，增殖後提取質粒，並於紫外分光光度計測A260定量並10倍梯度稀釋。2、根據權利要求1所述的一種檢測牛腹瀉病毒的螢光定量PCR試劑盒，其特徵是所述的逆轉錄反應液是由5xbuffer，10|amol/L的反義引物，逆轉錄酶，RNA酶抑制劑，10mMdNTPs和無RNA酶的滅菌雙蒸水組成。3、根據權利要求1所述的一種檢測牛腹瀉病毒的螢光定量PCR試劑盒，其特徵在於所述的螢光定量PCR反應液是由2xPremk，lOpmol/L的正義引物和反義引物，10^miol/L螢光探針和無菌雙蒸水組成。4、根據權利要求1所述的一種檢測牛腹瀉病毒的螢光定量PCR試劑盒，其特徵是所述的標準陽性模板DNA核苷酸序列為cttatttggtgaaaggggagcagtccaccctcaatcgacgctaaagctcccacacaagagaggggaacgcgatgttccaaccaacttggcatccttaccaaaaagaggtgactgcaggtcgggtaatagcagaggacctgtga。5、權利要求1所述的一種檢測牛腹瀉病毒的螢光定量PCR試劑盒在奶牛感染牛腹瀉病毒流行病學調查中的應用。全文摘要本發明公開了一種檢測牛腹瀉病毒的螢光定量PCR試劑盒及應用，該試劑盒含有a)RNA抽提液、b)逆轉錄酶反應液、c)逆轉錄酶、d)RNA酶抑制劑、e)引物和TaqMan探針、f)標準陽性DNA模板、g)螢光定量PCR反應液，其特徵在於正義引物、反義引物、螢光探針序列，探針的5』端標記螢光發射基團FAM，3』端標記螢光淬滅基團TAMRA，標準陽性DNA模板由已插入牛腹瀉病毒5』-UTR區185bp片段的pGEM-T載體轉化大腸桿菌DH5α，增殖後提取質粒，並於紫外分光光度計測A260定量並10倍梯度稀釋。試劑盒的製備步驟A.標本及標準品處理；B.兩步法RT-PCR擴增及實時螢光檢測；螢光定量PCR試劑盒在定量檢測抗牛腹瀉病毒藥物中的應用。使定量結果更加準確、可靠、穩定、且重複性好。文檔編號C12Q1/70GK101560572SQ20091006209公開日2009年10月21日申請日期2009年5月15日優先權日2009年5月15日發明者張國榮,鄭從義,佳郭,璇黃申請人:武漢三利生物技術有限公司