中國人群遺傳性耳聾基因slc26a4的突變類型和突變頻率及其用途的製作方法
2023-12-09 04:56:11 3
專利名稱：：中國人群遺傳性耳聾基因slc26a4的突變類型和突變頻率及其用途的製作方法中國人群遺傳性耳聾基因SLC26A4的突變類型和突變頻率及其用途
背景技術：
：SLC26A4基因由Everett等在一個常染色體隱性遺傳性疾病——Pendred症候群(大前庭水管或伴內耳畸形，神經性聾和甲狀腺腫)的家系中首先發現，後來Usami等對單純大前庭水管家系進行SLC26A4基因篩査，同樣發現該基因存在突變。SLC26A4基因又稱PDS基因(Pendredsyndrome,PDS),位於人類染色體7q31，含有21個外顯子，編碼含有780個胺基酸的蛋白質Pendrin。SLC26A4基因mRNA全長4930bp(SEQIDNO:l)，開放閱讀框架2343bp。SLC26A4基因開放閱讀框架起始於2號外顯子，分布穿越剩餘20個外顯子。除21號外顯子(2380bp)外，其它外顯子長度約為55-231bp。第21號外顯子中只有部分鹼基參與編碼胺基酸，其餘不參與蛋白的編碼，功能上屬於5'UTR區，第l號外顯子功能上屬於3'UTR區。作為PDS基因的表達產物，Pendrin主要由780個疏水性胺基酸組成，是一種跨膜蛋白，屬於離子轉運體家族，有12個跨膜區，N末端和C末端位於細胞內。Pendrin參與轉運機體內氯/碘離子，氯/甲酸根、氯/碳酸氫根離子和蔗糖轉運。Pendrin主要表達於甲狀腺，在內耳、胎腎和胎腦中也有分布。在甲狀腺，Pendrin表達於濾泡上皮細胞頂端亞膜單位。Royaux認為Pendrin作為甲狀腺上皮細胞內碘的頂端轉運子，將細胞內碘轉運到濾泡腔，與甲狀腺過氧化物酶作用導致碘的有機化，並與甲狀腺球蛋白結合，維持甲狀腺的正常功能。在內耳，Pendrin表達於內淋巴管、內淋巴囊、橢圓囊、球囊以及Corti's器外溝細胞、根細胞、螺旋突上皮細胞和血管紋梭形細胞等處。內琳巴管和內淋巴囊與內淋巴液代謝有關，Pendrin可能作為氯離子轉運體調節內淋巴液的離子平衡，同時作為碳酸氫根離子轉運體將血管紋內空間的碳酸氫根分泌入內淋巴液，碳酸氫根的堆積將限制保護性穀胱甘肽的產生從而增加自由基壓力，碳酸氫根的移除有助於保護血管紋免受自由基損傷，維持其正常功能。近年來多項研究表明SLC26A4基因突變與Pendred症候群和單純大前庭水管有密切關係。大前庭水管是兒童感音性耳聾中能夠通過影像學手段明確診斷的較為常見的疾病，Valvassori禾卩Clemisl978年在對3700例顳骨連續分層掃描中發現有50例大前庭水管。此病出生時可能聽力正常，或伴有輕度至中重度的聽力損失，患兒早期多有較好的言語能力，聽力逐漸下降。聽力下降的誘發因素多為頭部外傷、顱內壓增高、感冒等，因墮床、兒童玩耍或體育活動中的輕度碰撞可能造成明顯的聽力下降。此類患兒殘餘聽力較好，語言學習能力強於聾啞學生的平均水平，明確的診斷有利於及時採取適當的生活監護措施防止外傷而保護殘餘聽力。據估計，世界範圍內兒童語前聾患者中4-10%由Pendred症候群導致，但在我國Pendred症候群的報導還較少。高解析度顳骨CT掃描發現20%兒童感音神經性聾患者伴有內耳畸形，其中以大前庭水管和Mondini畸形最為常見。Reardon等報導在家族性大前庭水管患者中SLC26A4基因突變檢出率高於散發病例。在大前庭水管或Mondini畸形患者中，82%多發患者家庭和30%單發患者家庭能檢測到SLC26A4基因突變。大前庭水管患者中SLC26A4基因突變檢出率分別為中國人97.9%;日本人78.1%;韓國人92.31%;高加索人40%。由SLC26A4基因突變導致或與其相關的非症候群耳聾患者的比例分別是東亞至少5%的語前聾病人攜帶SLC26A4基因突變；南亞約5%的常染色體隱性遺傳性耳聾病人攜帶SLC26A4基因突變；高加索人約4%;英國3.5%;中國14.54%。SLC26A4基因突變表現出廣泛的等位基因異質性，目前報導的SLC26A4基因突變類型已達160餘種，其中以錯義突變最為常見，還包括無義突變、剪切點突變、移碼突變等形式。不同種族的耳聾人群中SLC26A4基因熱點突變不同。在歐洲，T416P和L236P是Pendred症候群患者最常見的兩種突變類型；在泉亞，IVS7-2A〉G和H723R是韓國人中突變頻率較高的類型，H723R和L676Q分別是日本人和蒙古人中突變頻率較高的類型。綜上所述，目前需要提供一種對各種族SLC26A4基因突變譜和熱點突變的研究方法，該方法能有助於根據不同種族的具體情況制定有針對性的篩査方案、設計專門的檢測方法及其檢測工具。定義在本說明和權利要求中，為了便於引用，本發明的SLC26A4基因突變類型採用下述的命名法如本文中所述的術語IVS，也稱作intraveningsequence,表示剪切序歹U。如本文中所述的術語Intron,表示內含子。如本文中所述的術語ins，表示插入突變。如本文中所述的術語del或A，表示缺失突變。當給定位點的鹼基被其它鹼基取代時，表示為原鹼基位點用於取代的鹼基，例如C68A，表示在SLC26A4基因的編碼區第68位點處發生鹼基A替換C〗當在給定位點插入其它鹼基時，表示為"位點編號ins插入鹼基"。例如1548insC，表示在SLC26A4基因的編碼區第1548位點處插入鹼基C，其相當於承1548C;當缺失給定位點的鹼基時，表示為"位i編號del缺失鹼基"，例如1520delT，表示在SLC26A4基因的編碼區第1520位點處缺失鹼基T，其相當於A1520T;當在多個給定位點取代、插入或缺失1個或多個鹼基時，表示為"多個位點編號突變類型1個或多個突變鹼基"。例如，234—235delC，表示在SLC26A4基因的編碼區第234或235位點缺失1個鹼基C，相當於A234-235C;1181—1183delTCT,表示在SLC26A4基因的編碼區第1181-1183的3個位點缺失3個鹼基TCT，相當於A1181-1183TCT;43-44insG，表示在SLC26A4基因的編碼區第43或44位點插入1個鹼基G，相當於承43-44G。另外，本發明還涉及剪切序列和內含子的各種突變，其中在SLC26A4基因剪切序列或內含子取代突變中，IVS剪切序列所在內含子編號+/-(位點編號X)原鹼基>取代鹼基(其中緊跟剪切序列所在內含子編號後的符號"+"表示從內含子起始端出發，符號"-"表示從內含子末端出發，下同)，表示在該剪切序列所在內含子起始端/末端的第X個鹼基位點處發生取代。例如，IVS4+2T〉C，表示SLC26A4基因第4內含子起始端剪切序列第2個鹼基處位點T被C取代；IVS7-2A>G，則表示SLC26A4基因第7內含子末端剪切序列第2個鹼基處(即距離下一外顯子的第2個鹼基處)位點A被G取代；又例如，Intron4-12T>A，表示SLC26A4基因第4內含子末端第12個鹼基處(即距離第5外顯子第12個鹼基處)位點T被A取代。基於相似原則，在SLC26A4基因內含子缺失突變中，111"011內含子編號+/-(位點編號2)(161缺失鹼基，表示在該內含子起始端/末端第Z個鹼基處缺失所示的鹼基(1個或多個)。例如，Intron7+(44-46)delACA表示SLC26A4基因第7內含子起始端第44-46個鹼基處缺失鹼基ACA。又如Intron9-(28—35)delTTTGTAGG，表示SLC26A4基因第9內含子末端第28-35個鹼基處(即距離第10外顯子第28-35個鹼基處)缺失鹼基TTTGTAGG;基於相似原則，在SLC26A4基因內含子插入突變中，Intron內含子編號+/-(位點編號N)ins插入鹼基，表示在該內含子起始端/末端第N個鹼基位點處插入所示的鹼基(1個或多個)。例如，Intronl2-(7—13)insT，表示SLC26A4基因第12內含子末端第7-13個鹼基處(即距離第13外顯子第7-13個鹼基處)插入一個鹼基T。另外，本發明還涉及非翻譯區UTR的突變例如，2343+69C〉A表示從5'UTR區起始端第69鹼基處(即編碼區最後一個鹼基也即從編碼區第2343鹼基後方緊鄰的鹼基開始計數第69鹼基處)，發生鹼基A取代C。無義突變是指鹼基替換後，編碼的胺基酸的密碼子變為不編碼任何胺基酸的終止密碼子(UAG、UAA、UGA)，造成多肽鏈合成的提前終止，肽鏈長度縮短，成為無活性的多肽片段。移碼突變同樣會導致終止密碼子提前出現，多肽鏈合成的提前終止，肽鏈長度縮短，成為無活性的多肽片段。錯義突變是指鹼基替換後使mRNA的密碼子變成編碼另一個氦基酸的密碼子，改變了胺基酸的序列，影響蛋白質的功能。剪切點突變會導致剪切功能異常從而影響轉錄和翻譯。靜止變異不會造成胺基酸的改變，對蛋白功能一般無影響。但反映人群DNA序列的多態性。UTR區變異不直接造成胺基酸的改變，但可能通過調控作用對蛋白的結構和功能產生影響。內含子變異不直接造成胺基酸的改變，但可以提示人群某一基因的多態改變。
發明內容一.中國人群SLC26A4基因突變類型本發明的第一個發明目的是提供SLC26A4基因的86種突變類型，其中無義突變7種，移碼突變13種，錯義突變48種，剪切點突變5種，UTR區變異1種，靜止變異6種，內含子變異6種(intron7+(44—46)delACA、intron9-(28—35)delTTTGTAGG、intron18-(53—56)delCAAA、intron19-25T〉A、intron4-12T〉A、intron12-(7—13)insT)。在一個具體實施方案中，所述的SLC26A4基因為說明書附屬的序列表中SEQIDNO:l所述的序列，並且該SLC26A4基因序列還具有選自下列突變位點的一個或多個突變43—44insG、C68A、G87C、G109T、C200G、C225G、A230T、234一235delC、G249A、G259T、T279A、C281T、413—414delT、IVS4+2T>C、IVS4+7A>G、Intron4-12T〉A、G589A、G665T、T678C、T754C、A757G、Intron7+44_46de1ACA、916一917insG、IVS7-2A〉G、C941T、1019—1020delT、C1079T、A1124G、C1173A、A1174T、1181—1183de1TCT、C1225T、G1226A、C1229T、A1238G、G1240A、Intron9-(28_35)delTTTGTAGG、C1245A、A1262C、G1327C、1299—1300insC、G1327C、T1334G、C1336T、1339—1340de1A、C1343A、G1409A、T1472C、T1517G、1520delT、1548insC、Intron12"7_13)insT、IVS13+5G〉A、T1586G、A1594C、G1595T、1645_1646insA、A1667G、G1678A、1687—1693insA、IVS15+5G>A、T1790C、1733—1735delATA、T1826G、G1897A、G1905A、G1975C、T1979G、C1983A、G1985A、G1988A、C1991T、A1993G、G2044T、C2162T、C2167G、Intron18-(53—56)delCAAA、A2168G、A2176G、T2205G、A2217G、T2228A、Intronl9隱25T〉A、A2283G、C2326G、非翻譯區2343+69C〉A。其中，在所述86種突變類型中，59種為尚未見報導的類型，其中無義突變5種，移碼突變9種，錯義突變30禾中，剪切點突變2種，UTR區變異1種，靜止變異6種，內含子變異6種(表1)。在上述具體實施方案的基礎上，其中所述的一個或多個突變進一步選自IVS7-2A〉G、A2168G、A1174T、C1229T、T2027A、IVS15+5G>A、G589A、A1238G、T1826G、C281T、G1226A、C1336T、1548insC、G1975C、G259T、T279A、G665T、C1079T、1181_1183delTCT、C1225T、G1595T、1299_1300insC、1339_1340delA、C1343A、1687_1693insA、C2162T、C2167G，其中這些突變的等位基因佔全部突變等位基因的93.04%。在上述具體實施方案的基礎上，其中所述的一個或多個突變進一步選自IVS7-2A>G、A2168G、A1174T、C1229T、T2027A、IVS15+5G〉A、G589A、A1238G、T1826G、C281T、G1226A、C1336T、1548insC，其中這些種突變的等位基因佔全部突變等位基因的88.29%。在上述具體實施方案的基礎上，其中所述的一個或多個突變進一步選自IVS7-2A〉G和A2168G(導致發生H723R胺基酸突變)，其中這2種突變的等位基因佔全部突變等位基因的76.06%。另外，對於上述SLC26A4基因突變類型的研究發現，中國人群SLC26A4基因各種突變/變異形式(不計內含子變異)按種類排序由多到少為錯義突變、移碼突變、無義突變、剪切點突變、靜止變異、UTR區變異。以下具體討論SLC26A4基因的各種突變/變異形式。新發現的編碼區的無義突變和移碼突變新發現的編碼區的無義突變(5種，C68A、G249A、1520delT、G2044T43—44insG，2341019一1020delT，121645_1646insA17331735delATA)、T2228A)和移碼突變(9種，—235delC，413—414delT，99_1300insC，1339—1340de1A，，1687_1693insA，一般會導致蛋白功能明顯異常。新發現錯義變異保守性分析評估一種錯義變異是否為有害突變需要對其編碼的胺基酸進行物種進化保守性比對，如果在不同物種中相應位點的胺基酸高度保守，則說明該胺基酸在進化過程中變化較小，其對蛋白功能的貢獻穩定，那麼基因突變導致的胺基酸改變一般會導致蛋白異常，相對應的基因變異多為有害突變；如果在不同物種中相應位點的胺基酸非高度保守，則說明該胺基酸在進化過程中變化較大，其對蛋白功能的貢獻不穩定，那麼基因突變導致的胺基酸改變對蛋白的影響可能小於高度保守的胺基酸，相對應的基因變異有害突變的可能性減低。在人類、猩猩、大鼠、小鼠、爪蟾等物種中進行Pendrin蛋白的進化保守性比對。編碼區新發現的所有30種、錯義突變中，C200G(對應胺基酸變化T67S)，A1124G(對應胺基酸變化Y375C)，A1993G(對應胺基酸變化I665V),A2283G(對應胺基酸變化T761T)等4種突變對應的胺基酸不保守；T1472C(對應胺基酸變化I491T)，G1595T(對應胺基酸變化S532Y),T1979G(對應胺基酸變化L660R)，G1985A(對應胺基酸變化C662Y)等4種突變對應的胺基酸在人類、猩猩、大鼠、小鼠、爪蟾等物種中的一個不保守；其餘22種突變在上述各物種中高度保守。這意味著如果某一突變位點對應的胺基酸在各物種高度保守，提示這一胺基酸在進化過程中變化少，是各物種中該基因編碼蛋白結構中的重要部分，是維持蛋白功能的重要位點，如果某一突變位點對應的胺基酸在各物種不保守，則提示這一胺基酸在進化過程中變化多，非維持蛋白功能的重要位點。新發現的剪切點變異發生後剪切功能預測為了驗證剪切點變圖變對剪切功能的影響，利用BDGP網站提供的剪切點功能預測工具對2種新發現的剪切點突變進行正常序列和突變後序列的評估比較，當原有剪切點的評分降到小於0.4時，說明該突變可能會影響原剪切點的剪切功能。2種剪切點突變後評分不同程度的下降。IVS4+2T>C和IVS13+5G>A突變使原有剪切點消失而影響蛋白質的正常翻譯過程。同時對3種已有報導的致病性明確的剪切點突變進行突變後剪切功能預測發現IVS4+7A〉G和IVS7-2A〉G突變使原有剪切點消失而影響蛋白質的正常翻譯過程，而IVS15+5G〉A可能導致原有剪切功能改變從而影響蛋白質的翻譯過程。新發現的2種剪切點突變剪切功能預測結果與已知致病性明確的剪切點突變剪切功能預測結果類似，進一步提示新發現剪切點突變為致病突變的可能性(表2)。表2SLC26A4基因剪切點突變功能預測tableseeoriginaldocumentpage14在我們研究中發現的47種剪切區突變和造成編碼區胺基酸改變的突變類型目前尚未見報導，是中國人群特有的突變類型。根據正常對照組和前庭水管擴大病人SLC26A4基因篩查結果總結SLC26A4基因編碼區錯義突變、移碼突變和剪切點突變性質為多態改變的可能性較小，並且80%在物種進化中高度保守，因此認為它們極有可能對表型有所貢獻。新發現的靜止變異和內含子變異新發現的靜止變異(6種，C225G，T678C,G1905A，T2205G，A2217G，A2283G)和內含子變異(6禾中，intron7+(44—46)delACA、intron9-(28—35)delTTTGTAGG、intronl8-(53一56)delCAAA、intronl9-25T〉A、intron4-12T〉A、intron12-(7—13)insT)雖然未直接對蛋白質的結構功能造成影響，但其存在可以協助鑑別突變位於哪條等位基因上。新發現的UTR區變異新發現了1種UTR區變異(2343+69OA)，該變異位於第21號外顯子的非編碼區，功能上屬於SLC26A4基因的5，UTR區，它不直接造成Pendrin胺基酸的改變，但可能通過調控作用對蛋白的結構和功能產生影響，其致病性雖尚不明確，但為進一步研究提供了新的方向。二.中國人群SLC26A4基因突變頻率本發明的第二個發明目的是提供中國人群SLC26A4基因突變頻率。中國民族眾多，不同民族熱點突變也存在差別，我們經過對2352名中國耳聾人群進行SLC26A4基因篩查，發現中國人群SLC26A4基因突變頻率(具體參見實施例1-2和表3)，有效地證實了本發明與中國人群SLC26A4基因突變以及中國人群遺傳學耳聾的顯著相關性。三、本發明的應用本發明第三個目的是根據前述的研究結果，在所得的突變等位基因頻率及各種突變佔全部突變的比例信息的基礎上，提供用於檢測與遺傳性耳聾相關的SLC26A4基因的診斷(篩査)方法和工具(產品)。其中，所述的工具(產品)包括各種常規的診斷(篩査)的製品，例如直接針對突變等位基因頻率及各種突變佔全部突變的比例信息的基因(蛋白)晶片、試劑或試劑盒等。所述的基因晶片又稱晶片，屬於生物晶片的一種。其工作原理是經過標記的待測樣本通過與晶片上特定位置的探針雜交，可根據鹼基互補配對的原則確定靶序列，經雷射共聚集顯微鏡掃描，以計算機系統對螢光信號進行比較和檢測，並迅速得出所需的信息。基因晶片技術比常規方法效率高几十到幾千倍，可在一次試驗中間平行分析成千上萬個基因，是一種進行序列分析及基因表達信息分析的強有力工具。其中，基因晶片根據所用載體材料不同分為玻璃晶片和矽晶片等；根據載體上所固定的種類可分為cDNA和寡核苷酸晶片兩種；根據其用途可分測序晶片、表達譜晶片、診斷晶片等。近年來，已研究開發出以各種結構微陣列晶片，如生物電子晶片、藥物控釋晶片、通道型微陣列晶片、基因擴增晶片、集成晶片、生物傳感器晶片。應當指出，如果根據第二發明目的和實施例以及表3所述的突變頻率，在設計基因晶片中，根據各個突變位點的突變頻率，適當調整突變位點所對應探針在晶片的濃度或量，通過計算機所檢測到信號的顏色(波長)和強弱，從而可檢測出究竟是哪種突變位點，從而更好地為診斷和治療與SLC26A4基因具體突變類型相關的遺傳學耳聾。在一個具體實施方案中，在對耳聾人群進行SLC26A4基因基因晶片初篩時，可以首先選擇篩査IVS7-2A>G和A2168G(導致發生H723R胺基酸改變)兩個位點，通過常規的光蝕刻技術或顯微列印技術，將含有上述兩個位點的DNA探針有序地固定在支持物表面上，然後通過計算機分析晶片與樣品的雜交信號，最終得到診斷或篩查結果。其中，根據實施例1-3和表3的突變頻率(分別是IVS7-2A〉G(64.01"/。)禾卩A2168G(12.05%)，下同)，如果相應調整它們在晶片上的濃度或量，通過其與標準樣品的信號的顏色(波長)和強度相比，從而製備可檢測具體突變位點的基因晶片；,在上述研究的基礎上，如果進行進一步篩査，可設計小規模基因晶片(包含10~15個檢測位點)。即選用IVS7-2A〉G(64.01%)、A2168G(12.05%)、A1174T(2.21%)、C1229T(2.04%)、T2027A(1.53%)、IVS15+5G〉A(1.19%)、G589A(1.02%)、A1238G(1.02%)、T1826G(0.85%)、C281T(0.69%)、G1226A(0.69%)、C1336T(0.51%)、1548insC(0.51%)等13種突變位點，來製備可定性的基因晶片，最終獲得診斷或篩査結果；在上述研究的基礎上，如果還進行進一步篩査，可設計中等規模基因晶片，即選用IVS7-2A〉G(64.01%)、A2168G(12.05%)、A1174T(2.21%)、C1229T(2.04%)、T2027A(1.53%)、IVS15+5G>A(1.19%)、G589A(1.02%)、A1238G(1.02%)、T1826G(0.85%)、C281T(0.69%)、G1226A(0.69%)、C1336T(0.51%)、1548insC(0.51%)、G1975C(0.34%)、G259T(0.34%)、T279A(0.34%)、G665T(0.34%)、C1079T(0.34%)、1181—1183delTCT(0.34%)、C1225T(0.34%)、G1595T(0.34%)、1299_1300insC(0.34%)、C2162T(0.34%)、1339—1340delA(0.34%)、C1343A(0.34%)、1687—1693insA(0.34%)、C2167G(0.34。/。)等27種突變位點，來製備可定性的基因晶片，最終獲得診斷或篩查結果。在所述的試劑或試劑盒中，主要涉及針對單個位點突變的單引物序列和多個突變位點的多重引物序列。應當指出，多重PCR技術是在常規PCR的基礎上發展而來的。因此，其基本原理和常規PCR沒有差別，所不同的是多重PCR技術是在同一個體系中加入多對引物，同時檢測多個目標序列的存在。因此在知曉具體突變位點的前提下，設計針對該位點或多個位點的引物或多重引物序列，對於本領域技術人員而言，屬於本領域的常規技術，因此並不需要特意指明其序列組成。四、有益效果-l.提供了中國人群遺傳性耳聾基因SLC26A4基因的86種突變新類型；2.在上述中國人群遺傳性耳聾基因SLC26A4基因的86種突變新類型中，進一步提供了佔全部突變基因的93.04%的27種突變新類型；'3.在上述中國人群遺傳性耳聾基因SLC26A4基因的86種突變新類型中，更進一步提供了佔全部突變基因的88.29%的13種突變新類型；4.在上述中國人群遺傳性耳聾基因SLC26A4基因的86種突變新類型中，更進一步提供了佔全部突變基因的76.06%的2種突變新類型；5.根據上述突變類型在中國人群中的突變頻率，提供了該突變頻率的新用途，即設計用於診斷與SLC26A4基因突變頻率相關的遺傳學耳聾的各種產品，極大地提高了診斷範圍和診斷效率。具體實施例方式現在僅用參考下面非限制性的實施例的方式進一步描述本發明。但是應當理解，下面的實施例僅僅是作為例證的，不應以任何方式當作對上述本發明總體的限制。除非有其它說明，本發明的實施例使用本領域中的傳統分子生物學、細胞生物學、PCR擴增和突變技術等等。這些技術是技術人員熟知的，並在文獻中有詳細解釋。參見，例如，SambrookandRuss.ell"MolecularCloning:ALaboratoryManual"(2001);Cloning:APracticalApproach,"VolumesIandII(D.N.Glover，ed.，1985)〃；T.ABrown"Genome"BIOSScientificPublishersLimited;SubramanyaRD，LucchesegG,KanducD,etal.ClinicalapplicationsofDNA印icroarrayanalysis[J].JExpTheroOncol,2003,3:297-304.實施例1:本發明人在屈內首先報導對3例散發大前庭水管患者進行SLC26A4基因篩査，發現1例G316X突變雜合子，2例IVS7-2A〉G純合子，隨後又在兩個大前庭水管家系中檢測到SLC26A4基因突變，初步證實了SLC26A4基因與大前庭水管的相關性。在該研究中，根據我們前期在來自35個家庭的38例患大前庭水管的病例研究中發現，SLC26A4基因IVS7-2A>G突變是中國人大前庭水管症候群中的高發突變，佔突變總數的63.5%，在71.9%的大前庭水管患者中可以發現此突變，1%的正常人攜帶此種雜合突變。因此，針對此特定突變，我們設計了一系列的診斷篩査方法及工具，通過該篩査研究，我們快速地發現在攜帶此突變的大前庭水管患者。利用SLC26A4基因IVS7-2A>G篩查策略結合顳骨CT進行的內蒙赤峰地區大前庭水管症候群的流行病學調查顯示，在141例(134例來自不同家庭的耳聾患者加7例同在一個學校的直系兄弟姐妹)聾啞學生中，20例攜帶SLC26A4基因IVS7-2A〉G純合或雜合突變，對其中18例攜帶SLC26A4基因IVS7-2A〉G突變的患者進行顳骨CT檢査，16例均由CT證實為前庭水管擴大，證明上述基因篩査方法和工具可以遴選出帶有常見突變的大前庭水管症候群患者；在內蒙赤峰134例來自不同家庭的耳聾患者中完成SLC26A4基因編碼區全序列篩查後發現熱點突變區域篩查(外顯子7+8，19，10)能診斷出90%的大前庭水管患者。實施例2:為了解SLC26A4基因在中國重度-極重度耳聾人群的突變情況及其與耳聾的關係，在上述研究的基礎上，我們展開了全國範圍的SLC26A4基因熱點突變區域篩査，對其中檢測到的單雜合突變攜帶者進一步行全序列篩査、測序，尋找可能存在的另外的突變，篩選方法包括根據前述的SLC26A4基因的可能的86種突變類型，根據常規方法設計多重PCR引物或其試劑盒，進行PCR或多重PCR檢測或測序。研究對象為雙側重度-極重度耳聾患者，選自北京、上海、黑龍江省牡丹江、吉林省吉林、'山西省大同、河南省安陽、河北省高碑店和涿州、廣東省佛山、廣西壯族自治區柳州、福建省福州、雲南省昆明和臨滄、貴州省貴陽、內蒙古自治區赤峰、甘肅省蘭州、寧夏回族自治區銀川、青海省西寧、陝西省西安、新疆維吾爾族自治區烏魯木齊、庫爾勒和焉耆、江蘇省南通、湖北省武漢、安徽省阜陽、四川省成都、西藏自治區拉薩等27個省市自治區的聾啞學校，共計2352例(不包括同一父母所生的兄弟姐妹)，男1315人，女1038人，年齡分布1.824歲，平均年齡14.17士4.41歲。共涉及22個民族，漢族1903人，藏族119人，回族89人，維吾爾族69人，蒙古族33人，壯族25人，彝族23人，白族14人，佤族12人，滿族12人，苗族12人，布依族9人，土家族7人，拉祜族5人，侗族5人，傣族5人，朝鮮族2人，瑤族2人，撒拉族2人，布朗族2人，木化族1人，哈尼族1人。結果如下我們發現IVS7-2A〉G突變是在中國漢族、回族、蒙古族耳聾人群SLC26A4基因第一高發突變，其等位基因頻率及佔突變等位基因的比例見表3;A2168G突變雖然等位基因頻率較IVS7-2A>G相差較遠，但較其他突變類型仍具明顯優勢，為中國漢族、回族、蒙古族耳聾人群的第二高發突變。IVS7-2A〉G和A2168G兩種突變共佔突變等位基因的76.06%，它們是SLC26A4基因在中國人群的最熱點突變；IVS7-2A>G、A2168G、A1174T、C1229T、T2027A、IVS15+5G〉A、G589A、A1238G、T1826G、C281T、G1226A、C1336T、1548insC等13種突變佔全部突變等位基因的88.29%,這組突變中後11種是SLC26A4基因在中國人群的熱點突變；IVS7-2A>G、A2168G、A1174T、C1229T、T2027A、IVS15+5G>A、G589A、A1238G、T1826G、C281T、G1226A、C1336T、1548insC、G1975C、G259T、T279A、G665T、C1079T、1181—1183delTCT、C1225T、、G1595T、C1343A、1299—1300insC、1339一1340delA、1687一1693insA、C2162T、C2167G等27種突變佔全部突變等位基因的93.04%，這組突變中後14種是SLC26A4基因在中國人群的相對熱點突變。實施例3:根據上述研究結果，我們設計了三組可定性的基因晶片，分別是晶片組A:包含IVS7-2A>G和A2168G兩個突變位點；晶片組B:包含IVS7-2A〉G、A2168G、A1174T、C1229T、T2027A、IVS15+5G〉A、G589A、A1238G、T1826G、C281T、G1226A、C1336T、1548insC等13種突變位點；晶片組C:包含IVS7-2A〉G、A2168G、A1174T、C1229T、T2027A、IVS15+5G〉A、G589A、A1238G、T1826G、C281T、G1226A、C1336T、1548insC、G1975C、G259T、T279A、G665T、C1079T、1181_1183delTCT、C1225T、G1595T、1299—1300insC、C2162T、1339—1340delA、C1343A、16871693insA、C2167G等27種突變位點。在分別用三組基因晶片對58例前庭水管擴大患者進行檢測(測序檢測SLC26A4基因編碼區測序共檢測到95條突變等位基因)，結果如下tableseeoriginaldocumentpage21由此可見，利用上述的晶片組，對於SLC26A4基因突變導致的遺傳性大前庭水管，其突變等位基因檢測(診斷)率分別是76.84%、86.32%、87.37%。這表明使用上述晶片，可以有效檢測SLC26A4常見多發突變。表l新發現的SLC26A4基因突變或變異類型(一)tableseeoriginaldocumentpage23表l新發現的SLC26A4基因突變或變異類型(二)imageseeoriginaldocumentpage24表l新發現的SLC26A4基因突變或變異類型(三)tableseeoriginaldocumentpage25formulaseeoriginaldocumentpage26表3中國重度-極重度耳聾SLC26A4基因突變等位基因統計(Exon7+8,19,10篩査)tableseeoriginaldocumentpage27tableseeoriginaldocumentpage28formulaseeoriginaldocumentpage29〈220>〈221〉exon8(1143)...(1225)〈221〉exon9〈222〉(1225)...(1373)<221〉exon10〈222〉(1374)...(1487)〈220〉〈221〉exonll(1488)...(1565)〈221〉exonl2<222〉(1566)…(1661)〈220〉〈221〉exonl3(1662)...(1768)exonl4〈222〉(1769)...(1838)〈220>〈221>exonl5〈222〉(1839)...(1931)〈220>exonl6〈222〉(1932)….(2027)〈220〉exonl7〈222〉(2028)...(2258)〈220〉〈221〉exonl8〈222〉(2259)...(2313)〈220〉〈221〉exonl9〈222〉(2314)...(2459)〈220〉-〈221>exon20;2〉(2460).(2543)<220〉〈221〉exon21〈222〉(2544)...(4923)〈400〉1CTCAGCCTTCCCGGTTCGGGAAAGGGGAAGAATGCAGGAGGGGTAGGATTTCTTTCCTGA60TAGGATCGGTTGGGAAAGACCGCAGCCTGTGTGTGTCTTTCCCTTCGACCAAGGTGTCTG120TTGCTCCGTATAGTCCGCGGGCAGGTCGGATCTACAGCGATGCGGGAGAGAGACTCTTGTGTGACGTCATCCCTACTAGCCATACTTTATTAATGGTGGGGCAATGGAACTCCTGATTGCTGCAGATTGGCTGCTGCCTTACTACAATGGATACCAATCTAGGAATTAAATGACGATAATGCATTGTTAATCTCGGAGATCAGTAGGAAATTGCCTTTGGCTCTTTCCCGTCTCTGCTGCAGAAGTCGGTGTGACATTCCGTATAGTGTCTGTTGACTGTGCACAGATATAGATTCTTAGTCAAGTCCACGGAAAATACAGTGATGCTGTAACTTGATATTC嵐GTGAACTTTCCTGGATTGATGTGAAGCGGGTTCTTTACTCTATCTTCACTCTCATAAGAACTTGAAGGTCTCTATGACTCAAAACTCTAGGCTTTATTCAGACGATCACAGATTTGTGCTGACCCTCAGTTTTTGTAGTAAATGCTPGATAATAAATTACATATACAGAACCAGGTTCATGGTTTAAAAATATATAATGATCATTGTGCTATTCTTTTATATTTTTGACCACTTAAATAAAACGTCCCACTGCCTGGCATTCCGGGCGGGGCGCGGCCGCCGCAGCTCCCCGAGTGCTCGCTTTCCAGCMCAGCCCTGGCCAAGTGCTGCAGTTGCCCATCTTGGAGTGGCTCCTTCGGGAGTTAGTACTGGGCTGCAGTTCCTGTCGGATATGCTTTGGAACATCAAGACATAATCTGTTGTTCTGAGCATGGTGTATTAAATACTACTATGACAGTGCCCTGACTCTGCTGGATTCATAGTGAGGTACTTGGCCAAGTGCTGGTCTCACAGCAGTTCTCTCTATTATCTATATGCTGATTTCACTGCTGGATTGATCGGTTTAGACACAAAATGCTACTGCCATTTCATATGATCCATCCCAAGGGGGTTTTGCTGGCTGCATCATTTTCCAAGTATATGCCACCAAGTATGGATCAGCMCATCTTCTCAGCACGGCCGTCCAGGAGAGCAGATTGTGATGATCGCCATTCCTTGGCAGCTGTTGTAATTGTCGTCTGTGGAGACAGAATACATCATTCTGGGGCTGGATCGGTCCTGAGAGTTCAGTTTCCTACAAAAGTACCAAGAATTATTTTCCAGTCCTATTTTCTAGTTGGATTTGATGCCATTAGAAACTAATAAAAAGTGGACTTCAACAAATAATGCTTTTGCCCAACCAAGGAAATAGAGACGTTCCCAMGTGCCAATCCCGTTGTTGGAGTGAGATCACTGTGTATTTTGCATCACTTCTGACGACAACATTAGAAAGGACAGAACCAAGTGAAATCTCTCAGGATTGTAAAGATACCCTGTCCAGGATGAGGCTATGCGAGCAAGGAATACAAGACAAACTCATTCTTTTTTCTATTAATTTATAAAATAAACACCTTTTTGGCAGCGTCCAGGGTAAGCTAATAATGTTCACGTGGGAACAGCCTCTGTGGTCAAGCACTGACCTGGATATCCATGATGAAATAAAATGATTAATGCATTGGAGTTTTAAAAATGCAGCCGGAATTGAGGATCTCTTCCAATATATTTTGAAATATTATAAAAATCTTTTTTGATATGACAGATTATTTTGTTTAAAGCATGGAGGCATGTATAGGTGAGTGAAAATTTTTTTGATGTTCTCAAAAATTTTAGCAGTAAAAAAAATCTAAAAATTGATCTGAGAGCGCTATAAAGGCAGCAGAGACAGGTCATGGCAACAGCTGCAGCTACATGGTGACGAGCGGCGCCTGCAGGAGGTTCMGAAAGAGAGCCTTTCCAAATACCGAGTCAAGGAATAGTGGCCACGCTGCAAGGGGTCTCTACTCTGCTTTTTTCTCTCAGTTGGACCTTTTCCACCCCCGACGAACACTTTCTCTAGACACTGCAGCTAGAGATTTGGAATTATACAGTTGATACAGATCCTTTGGTTGGTGGCTAAAGATTGTCCTCAATGTTCGCTGGTTGAGATTTTTCAATGCTCACCATTGTCGTCTGTTCCCAGTCCCTATTCCTATAGAGCCAACCTGGAAAAAAATTGCCTCCTGAACTTCCACCTTCGCTGTGGTGGCTTATGCTATTACACCATCGATGGGMCGATTCTTCTCTTGTTTTGTGCTGGAGGAAAGACACAGGTTTTGCCCTGGGGAAGCTTCTGCCAACCTGAAAGGGATGTTTAGATTGATGCTGTTATCTGGTCGGTTTACTAGCTGGCCTTCTTCTTGGAATGGCCTTGGAACAAAAACATTGAAGAACCTATGGCAATGTCGATGGTTTTGAGTATATAATAAGAGGCTGAATTAAGAGCAACAAAGAATAGCCTGATGAGGATATTGAATTCAAGTGGATTGGAACTCTATAGCCTTGTGCTTGACTGTTGCGGGTGATTGTCAAAGAAAAGATTATGTGATAGAAAAGACACATTCTTTTTGACGGTCAAGAGGGTCAAGGTTCCATTTTGAATTAATAGAAACAGAGGTACACTTGCATCCTGAAAGAACTTCCTCAATGCATTGACAGCCATTGAAAGAGAAGCACATCCCTAACATGGGCAAAATGCTGGTGTTATAATACGCTGCCCTGGCATATCTCTGTTCAGAGTCACGAATGATTAATCAGCTGCACTGATCACCATGTAATTTATCAATAAAAGCCTTTAATTTGCTTAGTATCTAATATGATCCTGGAAATGGTTTACGATGCAGACAAATGAAATAAGATAATAATCATGATCACAAAATGCAGTTTTAATTATCTTATGATCTGTGTAAAATCTGATGCTTACATAACCATGGTGAGTGTAAAGTAAGTAATCTTTACTACCTATAGTAGTCTGTGAGCGGAAGGG180GCGCCAGGCG240TCGCGGCCGG300CGCAAGACGC360GGTGTGCTAA420TGGCTGCTTA480ATGGCATATG540CCTATCCTGA600GTGGTGAGTT660GTATCCAGCA720ACAGCTAGAG780TTTGGTGGCT840TTCACAACAG900TCAACCAAAA960AATATTGGTG1020ATGGCAGTTA1080GAAGTAATTG1140TACAATGCTG1200GTGAGCTTGT1260ATTGCAGTGT1320CAGGAATTCA1380GCCACCACTG1440GCTGGCATCA1500GAACCCTTGC1560ATGCAGCTGT1620GTGTTTACGT1680ATATTTGGAC1740AGCATCCCTA1800CAAGGAGTGA1860AAAAAATGTA1920AAAGCGCTGA1980GGCATCATAA2040GATCTGGAGG2100GAGCTTCCAG2160GGAGCTATAT2220TTCCAAAGAA2280CTGGAGCAAT2340CATGATGCTA2400TTAGAAACGA2460CTGACGGAAG2520TGGGTTCGGG2580TATTTCTTCA2640TAAGACTGCT2700GGCTAGAATT2760CTGATCTACA2820GTTAGAGTGA2880TAAAGAAAAA2940AGGTCACATT3000GAAAATACTT3060ATGAAGTGTT3120CTAAAAGCTA3180TAAAGAGATT3240CTGAGATCAA3300AGTCTATAGA3360CATAAAAACA3420TTAAAATGAG3480AACTGAACTC3540TTTAAAGTGA3600formulaseeoriginaldocumentpage32權利要求1.中國人群遺傳性耳聾相關的SLC26A4基因的突變類型，其特徵在於所述的SLC26A4基因為SEQIDNO1所述的序列，並且該SLC26A4基因序列還具有選自下列突變位點的一個或多個突變(1)取代突變C68A、G87C、109G>T、C200G、C225G、A230T、G249A、G259T、T279A、C281T、G589A、G665T、T678C、T754C、A757G、C941T、C1079T、A1124G、C1173A、A1174T、C1225T、G1226A、C1229T、A1238G、G1240A、C1245A、A1262C、G1327C、G1327C、T1334G、C1336T、T1586G、A1594C、G1595T、A1667G、G1678A、T1790C、C1343A、G1409A、T1472C、T1517G、A2168G、A2176G、T2205G、A2217G、T2228A、A2283G、C2326G、T1826G、G1897A、G1905A、G1975C、T1979G、C1983A、G1985A、G1988A、C1991T、A1993G、G2044T、C2162T、C2167G、IVS4+2T>C、IVS4+7A>G、Intron4-12T>A、IVS7-2A>G、IVS13+5G>A、IVS15+5G>A、Intron19-25T>A、2343+69C>A；(2)缺失突變234_235de1C、413_414delT、1019_1020delT、1339_1340delA、Intron7+44_46delACA、1733_1735delATA、1520delT、1181_1183delTCT、Intron9-(2835)delTTTGTAGG、Intron18-(53_56)delCAAA；(3)插入突變43_44insG、916_917insG、1548insC、1299_1300insC、1645_1646insA、1687_1693insA、Intron12-(7_13)insT。2.權利要求1中所述的基因突變類型，其中所述的一個或多個突變選自IVS7-2A〉G、A2168G、A1174T、C1229T、T2027A、IVS15+5G>A、G589A、A1238G、T1826G、C281T、G1226A、C1336T、1548insC、G1975C、G259T、T279A、G665T、C1079T、1181—1183delTCT、C1225T、G1595T、1299_1300insC、1339一1340delA、C1343A、1687—1693insA、C2162T、C2167G，其中這些突變的等位基因佔全部突變等位基因的93.04%。3.權利要求2所述的基因突變類型，其中所述的一個或多個突變選自IVS7-2A〉G、A2168G、A1174T、C1229T、T2027A、IVS15+5G>A、G589A、A1238G、T1826G、C281T、G1226A、C1336T、1548insC，其中這些種突變的等位基因佔全部突變等位基因的88.29%。4.權利要求3所述的基因突變類型，其中所述的一個或多個突變選自IVS7-2A>G和A2168G(H723R)，其中這2種突變的等位基因佔全部突變等位基因的76.06%。5.權利要求1中所述的基因突變類型，其中所述的一個或多個突變選自43—44insG、C68A、G87C、C200G、C225G、234—235delC、G249A、G259T、T279A、413—414delT、IVS4+2T〉C、Intron4-12T>A、G665T、T678C、A757G、Intron7+44一46delACA、C941T、1019一1020delT、C1079T、A1124G、C1173A、C1225T、A1238G、Intron9-(28一35)delTTTGTAGG、G1240A、C1245A、G1327C、1299—1300insC、1339_1340delA、G1409A、T1472C、T1517G、1520delT、Intron12-(7—13)insT、IVS13+5G〉A、G1595T、1645一1646insA、G1678A、1687—1693insA、1733一1735delATA、G1897A、G1905A、T1979G、C1983A、G1985A、G1988A、C1991T、A1993G、G2044T、Intron18-C53_56)delCAAA、C2167G、A2176G、T2205G、A2217G、T2228A、Intronl9-25T>A、A2283G、C2326G、2343+69C〉A，其中這些基因突變類型是中國人群特有的耳聾相關SLC26A4基因的突變類型。6.權利要求5所述的基因突變類型，其中所述的一個或多個突變選自43一44insG、C68A、G87C、C200G、234一235delC、G249A、G259T、T279A、413—414delT、IVS4+2T〉C、G665T、A757G、C941T、1019—1020de1T、C1079T、A1124G、C1173A、C1225T、A1238G、G1240A、C1245A、G1327C、1299—1300insC、1339—1340delA、G1409A、T1472C、T1517G、1520delT、IVS13+5G〉A、insA、G1678A、1687_1693insA、G1897A、T1979G、C1983A、C1991T、A1993G、G2044T、T2228A、C2326G、非翻譯區2343+69C〉A，其中這些基因突變類型是導致SLC26A4基因編碼蛋白胺基酸發生改變或影響基因轉錄和翻譯的突變類型。7.權利要求6所述的基因突變類型，其中所述的一個或多個突變選自A1238G、G259T、T279A、G665T、C1079T、C1225T、1299_1300insC、1339_1340delA、G1595T、1687—1693insA、C2167G，其中這些基因突變類型是突變發生頻率超過一次的突變類型。8.權利要求6所述的基因突變類型，其中所述的一個或多個突變選自43一44insG、C68A、234—235delC、G249A、413—414delT、1019—1020delT、1299—1300insC、13391340delA、1520delT、16451646insA、Gl595T、1645—16461733—1735delATA、G1985A、G1988A、C2167G、A2176G、、1687_1693insA、1733—1735de1ATA、G2044T、T2228A，其中這些突變類型是導致SLC26A4基因終止密碼子提前出現、使編碼蛋白質發生明顯異常改變的突變類型。9.權利要求1-8任一項所述的基因突變類型，其在製備用於檢測或診斷與SLC26A4基因相關的中國人群遺傳性耳聾的產品中的用途。10.權利要求9所述的用途，是用於檢測上述突變類型的試劑、試劑盒或基因晶片。11.權利要求10所述的用途，其中所述的試劑、試劑盒或基因晶片包含針對突變位點的引物對或多重引物對。12.權利要求11所述的用途，其中所述的基因晶片在其表面上存在用於檢測所述突變位點的特異探針。13.用於檢測權利要求1-8任一項所述基因突變類型的試劑或試劑盒。14.權利要求13所述的試劑或試劑盒，其中所述的試劑或試劑盒包含針對突變位點的引物對或多重引物對。15.用於檢測權利要求1-8任一項所述基因突變類型的基因晶片。16.權利要求15所述的基因晶片，其中所述基因晶片通過檢測任一突變位點的是否存在，來確定樣本是否患有與SLC26A4突變基因相關的中國人群遺傳性耳聾疾病。全文摘要本申請涉及中國人群耳聾相關SLC26A4基因特有突變類型圖譜86種，相對熱點突變類型圖譜及其頻率信息27種，熱點突變類型圖譜及其頻率信息13種，最熱點突變類型及其頻率信息2種；中國人群新發現的SLC26A4基因突變類型59種，其中導致SLC26A4基因編碼蛋白胺基酸改變或影響基因轉錄和翻譯的突變類型47種，導致鹼基改變、胺基酸不改變的突變類型6種，SLC26A4基因內含子突變類型6種。上述發現對研製符合中國耳聾人群遺傳特徵的SLC26A4基因診斷晶片和試劑盒具有重要的實際意義。文檔編號C12N15/12GK101445799SQ20071017815公開日2009年6月3日申請日期2007年11月27日優先權日2007年11月27日發明者樸戴,袁永一,韓東一申請人:韓東一;戴樸