一種生產老年性痴呆致病物質澱粉樣變多肽β(Aβ)的方法及其產物的製作方法
2023-12-09 09:13:56 1
專利名稱：一種生產老年性痴呆致病物質澱粉樣變多肽β(Aβ)的方法及其產物的製作方法
技術領域：
本發明一般地涉及治療老年性痴呆所需多肽的表達，更具體地本發明提供了一種能夠治療和預防老年性痴呆的疫苗的核心成份。
背景技術：
老年性痴呆(主要指阿爾茨海默病＜Alzheimer′s Disease，AD＞)發病率隨著社會人口老齡化而呈上升趨勢。在美國二億多總人口中患有不同程度的AD病者就有480萬，約佔總人口的2％，在60歲以上的老人中發病率更高。該病近年來有呈流行病發展之勢，未來的發病率還會更高。在我國也有相近似的發病率。AD病的主要病理特徵是患者大腦中與記憶和認知有關的區域產生神經性病變斑塊，斑塊中主要成分為一種分子量4KD的多肽，β-澱粉樣肽(Aβ)聚合而成的澱粉樣物質和受累於其中的營養不良或變性的神經樹突和軸突，以及一些炎症反應性神經膠質細胞。多數患者斑塊中還產生大量的神經纖維纏結。AD病的發病機理研究顯示，Aβ及其纖維形成的澱粉樣物質是主要的病變，由於大腦病變區大量的澱粉樣物質沉積和炎症反應，使得該處的神經細胞萎縮、變性、功能消失。導致一系列神經功能受損的症狀出現。因此，防治AD病應主要從兩個方面進行即阻止Aβ多肽的大量產生、聚積和形成纖維；以及清除大腦病變區已產生的Aβ多肽、纖維和澱粉樣物質。
目前AD病的藥物開發研究的一個方向是免疫治療。方法之一是使用合成澱粉樣變多肽Aβ作為疫苗刺激機體產生抗Aβ抗體，從而加快腦內免疫細胞將纖維化的Aβ從腦組織中的清除。這種疫苗已在小鼠動物試驗中證明有效(Schenk D 1999；Morgan D 2000；Weiner H2000；Janus C 2000；Lemere C 2001；Poduslo JF 2001)。但是，使用合成多肽作為疫苗成本高，臨床應用受到限制。細菌表達蛋白，肽鏈越短，疏水性越強，表達越困難。Aβ是一個疏水性很強的短肽，直接用細菌表達該短肽有很大困難。鑑於此，為克服疏水短肽表達困難，本發明人設想利用基因工程方法將Aβ多肽基因與易於表達的親水蛋白基因融合後表達，可以提高表達產率。經過細菌大量表達和初步純化，再將融合的蛋白切除，進一步純化目標多肽-Aβ多肽。根據這一思路，本發明人進行了深入的研究，終於完成了本發明。
發明內容
本發明一方面涉及一種融合蛋白，其由Aβ多肽和細菌的Intein蛋白組成，所述Aβ多肽融合於Intein的羧基端和/或氨基端。Aβ多肽胺基酸序列是由人Aβ多肽序列衍生而來，包括40或42個胺基酸的Aβ多肽序列。
本發明的另一方面涉及一種融合基因，其編碼本發明的Aβ融合蛋白。
本發明的再一方面涉及包含所述融合基因的原核載體，以及由該表達載體轉化或轉染的原核宿主細胞。
本發明的又一方面涉及生產Aβ多肽的方法，該方法包括在原核細胞中表達Intein-Aβ的融合蛋白，將Aβ多肽從該融合蛋白水解釋放，純化獲得Aβ多肽。
本發明可通過如下方式實現本發明所述的細菌表達生產的Aβ-Intein融合蛋白有多種方式。一種是在Aβ多肽前加一個蛋氨酸，其羧基端與Intein2蛋白融合；另一種把Intein1蛋白DnaB與Aβ多肽的氨基端融合；第三種使用兩個Intein蛋白與Aβ融合，DnaB融合於Aβ的氨基端融合；Intein2(GyrA或RIR1)與Aβ的羧基端融合。
在Aβ和Intein融合基因的5』端有細菌的表達啟動子的細菌表達載體都可用於實現本發明。本發明所用表達載體是Twin1(New EnglandBiolabs)，如
圖1所示，它帶有T7啟動子，同時攜帶N和C末端融合所需Intein，以便在載體構建時選擇N或/和C末端與Intein蛋白融合。
本發明所構建的Aβ-Intein融合蛋白只含有一個Intein；Intein蛋白的DnaB與Aβ的N末端融合(圖2a)；或Intein蛋白的GyrA與Aβ的C末端融合(圖2b)。
Aβ多肽編碼區具有下述其中之一的胺基酸序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(Aβ42)或DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV(Aβ40)或具有上述任一胺基酸序列中連續5個胺基酸的序列。
採用上述Aβ多肽或其胺基酸序列中連續5個胺基酸的多肽作為免疫抗原疫苗均可以刺激機體免疫系統產生免疫抗體。但是短肽在細菌的表達效率很低。
為獲得上述Aβ多肽，可以選用幾種方案將Aβ多肽與Intein蛋白融合。
(一)Intein1蛋白DnaB與Aβ多肽的氨基端融合將編碼Aβ多肽的DNA直接加在載體編碼Intein1蛋白的DnaB羧基端，去除Twin1載體上的Intein2蛋白GyrA。從而獲得編碼氨基端與Intein蛋白融合的Aβ多肽的DNA構建體。本發明所選用的DnaB-Aβ多肽的結構是MKIEEGKLTNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEPSNVPALWQLQNNGNNGLELRESGAISGDSLISLASTGKRVSIKDLLDEKDFEIWAINEQTMKLESAKVSRVFCTGKKLVYILKTRLGRTIKATANHRFLTIDGWKRLDELSLKEHIALPRKLESSSLQLSPEIEKLSQSDIYWDSIVSITETGVEEVFDLTVPGPHNFVANDIIVHNDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV其中有下線的羧基端為Aβ40多肽。Intein1的酶解位點在Intein1蛋白的羧基端，因此酶解後可將完整Aβ多肽釋放。編碼該融合蛋白的DNA序列結構是CATATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGACAAATCCTGGTGTATCCGCTTGGCAGGTCAACACAGCTTATACTGCGGGACAATTGGTCACATATAACGGCAAGACGTATAAATGTTTGCAGCCCCACACCTCCTTGGCAGGATGGGAACCATCCAACGTTCCTGCCTTGTGGCAGCTTCAAAACAACGGTAACAACGGTCTCGAACTGCGCGAGTCCGGAGCTATCTCTGGCGATAGTCTGATCAGCCTGGCTAGCACAGGAAAAAGAGTTTCTATTAAAGATTTGTTAGATGAAAAAGATTTTGAAATATGGGCAATTAATGAACAGACGATGAAGCTAGAATCAGCTAAAGTTAGTCGTGTATTTTGTACTGGCAAAAAGCTAGTTTATATTCTAAAAACTCGACTAGGTAGAACTATCAAGGCAACAGCAAATCATAGATTTTAACTATTGATGGTTGGAAAAGATTAGATGAGCTATCTTTAAAAGAGCATATTGCTCTACCCCGTAA
ACTAGAAAGCTCCTCTTTACAATTGTCACCAGAAATAGAAAAGTTGTCTCAGAGTGATATTTACTGGGACTCCATCGTTTCTATTACGGAGACTGGAGTCGAAGAGGTTTTTGATTTGACTGTGCCAGGACCACATAACTTTGTCGCGAATGACATCATTGTACACAACGATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGATATGAAGTCCATCATCAAAAATTGGTGTTCTTTGCAGAAGATGTGGGTTCAAACAAAGGTGCAATCATTGGACTCATGGTGGGCGGTGTTGTCTAACTGCAG其中5』端有下線的CATATG序列是內切酶NdeI識別位點，3』端CTGCAG序列是內切酶PstI識別位點。其中克隆所用的SapI內切酶與常見內切酶不同，酶切位點在識別位點之外，導致DNA構建之後SapI位點不復存在。使用SapI內切酶的優點是在融合蛋白的銜接部位不會因保留酶切位點而導入額外的胺基酸序列。此結構的構建方法比較簡單，將Aβ40基因克隆進Twin1表達載體的SapI和PstI酶切位點之間即可。含有DnaB-Aβ40融合蛋白的載體結構請見圖2a。
融合蛋白中的Aβ40分離、純化可以使用Chitin Bead(New EnglandBiolabs)親和層析柱將細菌表達的Intein-Aβ40融合蛋白在鹼性緩衝液中吸附於親和層析柱上，然後將pH值調至中性，在25度室溫Intein蛋白DnaB在融合位點將Aβ40水解釋放。
(二)Aβ多肽前加一個蛋氨酸，其羧基端與Intein2蛋白融合將編碼Aβ40多肽的DNA的羧基端與Intein2蛋白的編碼基因融合，並將載體上的Intein1蛋白DnaB編碼區去除，在Aβ40的編碼序列的氨基端加一個蛋白起始胺基酸-蛋氨酸。本發明所選用的Intein2蛋白是Twin1載體所攜帶的GyrA。Aβ40-GyrA融合蛋白的多肽序列結構是MDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVCITGDALVALPEGESVRIADIVPGARPNSDNAIDLKVLDRHGNPVLADRLFHSGEHPVYTVRTVEGLRVTGTANHPLLCLVDVAGVPTLLWKLIDEIKPGDYAVIQRSAFSVDCAGFARGKPEFAPTTYTVGVPGLVRFLEAHHRDPDAQAIADELTDGRFYYAKVASVTDAGVQPVYSLRVDTADHAFITNGFVSHATGLTGLNSGLTTNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEPSNVPALWQLQ其中有下線的氨基端序列為Aβ40多肽。Intein2的酶解位點在Intein2蛋白的氨基端，因此酶解後可釋放帶有額外蛋氨酸的Aβ多肽。編碼該融合蛋白的DNA序列結構是
CATATGGATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGATATGAAGTCCATCATCAAAAATTGGTGTTCTTTGCAGAAGATGTGGGTTCAAACAAAGGTGCAATCATTGGACTCATGGTGGGCGGTGTTGTCTGCATCACGGGAGATGCACTAGTTGCCCTACCCGAGGGCGAGTCGGTACGCATCGCCGACATCGTGCCGGGTGCGCGGCCCAACAGTGACAACGCCATCGACCTGAAAGTCCTTGACCGGCATGGCAATCCCGTGCTCGCCGACCGGCTGTTCCACTCCGGCGAGCATCCGGTGTACACGGTGCGTACGGTCGAAGGTCTGCGTGTGACGGGCACCGCGAACCACCCGTTGTTGTGTTTGGTCGACGTCGCCGGGGTGCCGACCCTGCTGTGGAAGCTGATCGACGAAATCAAGCCGGGCGATTACGCGGTGATTCAACGCAGCGCATTCAGCGTCGACTGTGCAGGTTTTGCCCGCGGAAAACCCGAATTTGCGCCCACAACCTACACAGTCGGCGTCCCTGGACTGGTGCGTTTCTTGGAAGCACACCACCGAGACCCGGACGCCCAAGCTATCGCCGACGAGCTGACCGACGGGCGGTTCTACTACGCGAAAGTCGCCAGTGTCACCGACGCCGGCGTGCAGCCGGTGTATAGCCTTCGTGTCGACACGGCAGACCACGCGTTTATCACGAACGGGTTCGTCAGCCACGCTACTGGCCTCACCGGTCTGAACTCAGGCCTCACGACAAATCCTGGTGTATCCGCTTGGCAGGTCAACACAGCTTATACTGCGGGACAATTGGTCACATATAACGGCAAGACGTATAAATGTTTGCAGCCCCACACCTCCTTGGCAGGATGGGAACCATCCAACGTTCCTGCCTTGTGGCAGCTTCAATGACTGCAG其中5』端有下線的CATATG序列是內切酶NdeI識別位點，3』端CTGCAG序列是內切酶PstI識別位點。與前述氨基端融合方法相似，其SapI酶切位點在DNA構建過程中消失。此結構的構建方法比較簡單，將Aβ40基因克隆進Twin1表達載體的NdeI和SapI酶切位點之間即可。含有Aβ40-GyrA融合蛋白的載體結構請見圖2b。
融合蛋白中的Aβ40分離、純化同樣使用Chitin親和層析柱將細菌表達的Intein-Aβ40融合蛋白吸附於親和層析柱上，然後使用還原劑，例如DTT，誘導Intein2蛋白GyrA在融合位點將Aβ40水解釋放。
(三)兩個Intein蛋白與Aβ融合將Aβ40多肽與兩個Intein蛋白融合；將Aβ40羧基端與Intein2蛋白融合，將Aβ40氨基端與Intein1蛋白DnaB融合。融合方法和融合蛋白的細菌表達及純化方法與上述方法相似。水解釋放Aβ40的方法需要結合使用還原劑和調整pH及溫度的方法。
構建Aβ42-Intein融合蛋白的方法與上述Aβ40-Intein相似。不同之處是用Aβ42多肽序列取代Aβ40構建融合蛋白表達載體。Aβ42-Intein融合蛋白的表達，純化，和水解釋放則與Aβ40-Intein融合蛋白完全相同。
當然，其它已知的Intein蛋白序列，或其它細菌蛋白也可以作為融合對象。這裡所列舉的DNA序列，其中至少有三分之一是可以改變而不影響所表達融合蛋白的多肽序列和蛋白結構。
有益效果本發明通過將Aβ多肽基因與易於表達的親水蛋白基因融合後表達，提高了表達產率。經過細菌大量表達和初步純化，再將融合的蛋白切除，進一步純化目標多肽-Aβ多肽。
附圖簡述圖1是TWIN-1載體結構示意圖。
圖2a.是以TWIN-1為基礎將Aβ40多肽N末端DNA與InteinDNA融合後構建的載體示意圖。
圖2b.是以TWIN-1為基礎將在Aβ40多肽C末端DNA與InteinDNA融合後構建的載體示意圖。
圖3a.TWIN1-N-Aβ40在菌株中誘導表達的電泳圖。1為分子量標準(kD)；2未誘導的菌株；3經過IPTG誘導後的表達菌株；4誘導菌株經超聲波破菌後的上清液；5、7均為誘導菌株經超聲波破菌後的包涵體；6為洗滌後的包涵體。
圖3b.TWIN1-N-Aβ40表達產物經純化後的電泳圖。1、2、3均為包涵體經ChitinBeads親和層析純化後的Aβ40表達產物；4為分子量標準(kD)。
具體實施例方式
的描述實施例1Aβ40氨基端融合Intein1的融合蛋白的細菌表達一、構建編碼Intein1-Aβ40融合蛋白的DNA使用PCR方法從人澱粉樣變前體蛋白(Amyloid precursorprotein(APP))選擇性擴增Aβ40多肽基因。選用ROCHE公司的EXPEND HIGH FIDELITY PCR KIT。PCR反應包括38ul去離子水，5ul試劑盒提供的10X緩衝液，3ul DMSO，1uldNTP(10mM dATP，10mM dCTP，10mM dGTP，10mM dTTP)，1ul試劑盒提供的混合DNA聚合酶，1ul 10ng/ml含人APP的DNA質粒作為模板。1ul 10pM正向引物和1ul 10pM配對反向引物。
選用含Sap1內切酶位點的正向引物Aβ-N-SapFGATCTCAGCTCTTCTAACGATGCAGAATTCCGACATG；選用含Pst1內切酶位點的反向引物Aβ40-N-Pst-RGTGCATTGGTTCTGCAGTTAGACAACACCGCCCACCATG Aβ40多肽)或者Aβ42-N-pst-RCACTATGCTGCAGCTACGCTATGACAACACCGCC(Aβ42多肽)。PCR反應的引物配對組合綜述如下Aβ40Aβ-N-SapF+Aβ40-N-Pst-RAβ42Aβ-N-SapF+Aβ42-N-pst-RPCR反應使用94℃，30秒 54℃，30秒 72℃，1分鐘；共30循環周期。提取2ul PCR產物加3ul去離子水和1ul電泳溶液(SigmaG2526)，經1％瓊脂電泳分離證實PCR產物含有目標基因大小的DNA後，將其餘PCR產物使用QIAGEN公司的QIAQUIK PCRPURIFICATION KIT純化一份PCR反應產物與五份試劑盒所提供的PB緩衝液混合，然後裝入試劑盒所提供的小型離心柱離心；再使用0.5ml PB緩衝液離心洗柱一次；再用50ul試劑盒所提供的EB緩衝液裝柱離心洗脫。經DNA濃度測定，吸取1ug純化的PCR產物，加2ul 10X緩衝液，1ul SapI內切酶和1ul PstI內切酶(New EnglandBiolabs)，再加去離子水至最終體積20ul，37℃保溫2小時。1ugTwin1(New England Biolabs)載體DNA加5ul 10X緩衝液，1ul SapI內切酶和1ul PstI內切酶(New England Biolab)，再加去離子水至最終體積48ul，37℃保溫1小時，然後再加1ul SapI內切酶和1ul PstI內切酶，再37℃保溫1小時，然後再加1ul CIP(Calf IntestinalPhosphatase，New England Biolab公司)37℃保溫20分鐘。酶切後的PCR產物和載體經1％瓊脂電泳分離，切出150bp大小含Aβ的DNA帶和6.6kb的載體帶，再使用QIAGEN的AGROSE GEL EXTRACTIONKIT將酶切後的目的基因和載體純化稱出含有目的DNA的瓊脂重量，加入3倍體積試劑盒提供的QG緩衝液，在50℃水浴保溫10分鐘以使瓊脂溶化，再加入1倍於瓊脂體積的異丙醇後過MiniElute親和柱。使用Eppendorff離心機離心一分鐘後，目的DNA會滯留在親和柱上。使用500ul試劑盒提供的QG緩衝液，而後750ul試劑盒提供的PE溶液離心清洗MiniElute親和柱各一次，然後用20ul 10mMpH8.5 Tris-Cl緩衝液洗脫目的DNA。得到內切酶處理和純化過的融合抗體DNA和載體後，使用ROCHE公司的RAPID DNA LIGATIONKIT將它們連接在一起3ul上述純化過的融合抗體DNA加1ul載體，再加入1ul試劑盒提供的5X DNA混合溶液，混合好兩種DNA後再加入5ul試劑盒提供的2X連接緩衝液和0.5ul試劑盒提供的連接酶(ligase)23-25℃室溫保溫5-10分鐘即可。使用2ul上述連接好DNA加20-40ul感受態DH5α細菌細胞，4℃冰上保溫20分鐘，42℃水浴熱休克1分鐘，4℃冷卻2分鐘，加入SOC培養液(Invitrogen公司)200ul，37℃搖床培養45分鐘，然後塗含有氨苄青黴素的LB瓊脂平板。選陽性菌落小量擴增提取DNA(QIAGEN公司QIASPINPLASMID MINI KIT)，經SapI和PstI酶切，DNA序列分析驗證表達質粒構建的正確性後，進行DNA大量擴增(QIAGENQ公司QIAFILTER PLASMID MAXI KIT)。圖2a為以此方法構建的含有融合基因的載體的示意圖。
二、大腸桿菌表達融合蛋白和Aβ分離純化用構建好的含克隆靶基因的質粒表達載體Twin1-N-Aβ40，轉化進E.coli BL21(DE3)體系中進行誘導表達和純化，具體操作步驟如下(一)融合蛋白的誘導表達將克隆載體用氯化鈣法轉化進E.coli BL21(DE3)(Novagen公司)，在含有氨苄青黴素(100ug/ml)的1.5％瓊脂板中，37℃過夜培養。次日挑單克隆在含有氨苄青黴素(100ug/ml)的TP(Tryptone 0.2％，酵母提取物1.5％，Na2HPO40.2％，KH2PO40.1％，NaCl 0.8％，用前加入20％葡萄糖，使終濃度為0.2％)培養基中，37℃振蕩培養過夜。將過夜培養物按1/100接種於1L新鮮培養基中，37℃繼續培養，待OD600達到0.5-0.7之間進行誘導表達，誘導劑IPTG濃度為0.8mM，37℃誘導5小時。然後離心6000rpm，15分鐘收穫菌體，可置-20℃保存。
(二)包涵體的洗滌、溶解、復性將菌體重懸於Buffer A(50mM Tris pH8.5，50mM NaCl，5mMEDTA，0.1mM PMSF)中(10ml/g)，超聲波破菌(400W，工作30秒，間隔60秒，20分鐘)。離心15000rpm，20分鐘，棄掉上清，將沉澱重懸於Buffer B(50mM Tris pH8.5，50mM NaCl，5mMEDTA，0.3％SDS，5％Tritonx-100，Glycerin10％)中(10ml/g)，置室溫3小時或4℃過夜。然後用Buffer B洗一次，Buffer A洗兩次。洗滌後的包涵體用BufferC(4M urea，20mM Tris pH8.5，50mM NaCl，1mM EDTA，)溶解。溶解後的包涵體遞次用含2M、1M、0.5M、0M urea的BufferC於4℃透析復性(8～12h/次)。離心12000rpm，15分鐘收集上清，置4℃準備層析分離。提取少量樣品加SDS上樣緩衝液進行SDS-PAGE分離和染色分析(圖3a)。
(三)目的Aβ40多肽的分離、純化用10個柱床體積Buffer B1(20mM Tris PH8.5，50mM NaCl，1mM EDTA)平衡Chitin Bead層析柱。緩慢上樣(流速不超過0.5-1.0ml/min)，然後15個柱床體積Buffer B1衝洗層析柱，(流速2ml/min)。使用3個柱床體積Buffer B2(20mM Tris PH7.0，50mM NaCl，1mM EDTA)快速通過替換Buffer B1，於室溫(25℃)裂解過夜。次日，用Buffer B2洗脫樣品，按2ml/管收集。然後用3個柱床體積含1％SDS的BufferB1室溫清洗層析柱。
(四)樣品的冷凍乾燥將收集的樣品置於分子排阻量為2000的透析袋中，用PEG8000吸附濃縮至0.5mg/ml。濃縮後樣品用NH4AC(20mM，pH7.5)，4℃透析，-80℃冷凍。進行真空冷凍乾燥。SDS-PAGE電泳初步分析分子量和純度(圖3b)。
實施例2Aβ40羧基端融合Intein 1的融合蛋白的細菌表達一、構建編碼Aβ-Intein1融合蛋白的DNA使用PCR方法從人澱粉樣變前體蛋白(APP)選擇性擴增Aβ40多肽基因。選用ROCHE公司的EXPEND HIGH FIDELITY PCR KIT。PCR反應包括38ul去離子水，5ul試劑盒提供的10X緩衝液，3ulDMSO，1ul dNTP(10mM dATP，10mM dCTP，10mM dGTP，10mMdTTP)，1ul試劑盒提供的混合DNA聚合酶，1ul 10ng/ml含人APP的DNA質粒作為模板。1ul 10pM正向引物和1ul 10pM配對反向引物。選用含Nde1內切酶位點的正向引物Ab-C-Nde-FGGAATTCCATATGGATGCAGAATTCCGA；選用含Sap1內切酶位點的反向引物Aβ40-C-Sap-RGTGCATTGCTCTTCTGCATTAGACAACACCGCCCACCATG(Aβ40多肽)或者Aβ42-C-Sap-RCCAGTCTAGCTCTTCTGCACTACGCTATGACAACACCGCC(Aβ42多肽)。
PCR反應的引物配對組合綜述如下Aβ40Aβ-C-Nde-F+Aβ40-C-Sap-RAβ42Aβ-C-Nde-F+Aβ42-C-Sap-RPCR反應使用94℃，30秒；54℃，30秒；72℃，1分鐘；共30循環周期。提取2ul PCR產物加3ul去離子水和1ul電泳溶液(SigmaG2526)，經1％瓊脂電泳分離證實PCR產物含有目標基因大小的DNA後，將其餘PCR產物使用QIAGEN公司的QIAQUIK PCRPURIFICATION KIT純化一份PCR反應產物與五份試劑盒提供的PB緩衝液混合，然後裝入試劑盒所提供的小型離心柱離心；再使用0.5ml PB緩衝液離心洗柱一次；再用50ul試劑盒所提供的EB緩衝液裝柱離心洗脫。經DNA濃度測定，吸取1ug純化的PCR產物，加2ul 10X緩衝液，1ul SapI內切酶和1ul NdeI內切酶(New EnglandBiolabs)，再加去離子水至最終體積20ul，37℃保溫2小時。1ugTwin1(New England Biolabs)載體DNA加5ul 10X緩衝液，1ul SapI內切酶和1ul NdeI內切酶(New England Biolab)，再加去離子水至最終體積48ul，37℃保溫1小時，然後再加1ul SapI內切酶和1ul NdeI內切酶，再37℃保溫1小時，然後再加1ul CIP(Calf IntestinalPhosphatase，New England Biolab公司)37℃保溫20分鐘。酶切後的PCR產物和載體經1％瓊脂電泳分離，切出150bp大小含Aβ的DNA帶和6.6kb的載體帶，再使用QIAGEN的AGROSE GEL EXTRACTIONKIT將酶切後的目的基因和載體純化稱出含有目的DNA的瓊脂重量，加入3倍體積的試劑盒提供的QG緩衝液，在50℃水浴保溫10分鐘以使瓊脂溶化，再加入1倍於瓊脂體積的異丙醇後過MiniElute親和柱。使用Eppendorff離心機離心一分鐘後，目的DNA會滯留在親和柱上。使用500ul試劑盒提供的QG緩衝液，而後750ul試劑盒提供的PE溶液離心清洗MiniElute親和柱各一次，然後用20ul 10mMpH8.5 Tris-Cl緩衝液洗脫目的DNA。得到內切酶處理和純化過的融合抗體DNA和載體後，使用ROCHE公司的RAPID DNA LIGATIONKIT將它們連接在一起3ul上述純化過的融合抗體DNA加1ul載體，再加入1ul試劑盒提供的5X DNA混合溶液，混合好兩種DNA後再加入5ul試劑盒提供的2X連接緩衝液和0.5ul試劑盒提供的連接酶(ligase)，混合後在23-25℃室溫保溫5-10分鐘即可。使用2ul上述連接好DNA加20-40ul感受態大腸桿菌DH5α細菌細胞，4℃冰上保溫20分鐘，42℃水浴熱休克1分鐘，4℃冷卻2分鐘，加入SOC培養液(Invitrogen公司)200ul，37℃搖床培養45分鐘，然後塗含有氨苄青黴素的LB瓊脂平板。選陽性菌落小量擴增提取DNA(QIAGEN公司QIASPIN PLASMID MINI KIT)，經SapI和NdeI酶切，DNA序列分析驗證表達質粒構建的正確性後，進行DNA大量擴增(QIAGENQ公司QIAFILTER PLASMID MAXI KIT)。圖2b為以此方法構建的含有融合基因的載體的示意圖。
二、大腸桿菌表達融合蛋白和Aβ分離純化用構建好的含克隆靶基因的質粒表達載體Aβ40-C-Twin1轉化進E.coli BL21(DE3)體系中進行誘導表達和純化。具體操作步驟如下融合蛋白的誘導表達，包涵體的洗滌、溶解、復性，均與上述Aβ氨基端融合Intein的細菌表達完全相同。
目的Aβ多肽的分離、純化用10個柱床體積Buffer B1(20mM Tris PH8.5，50mM NaCl，1mMEDTA)平衡Chitin Bead層析柱。緩慢上樣(流速不超過0.5-1.0ml/min)，然後15個柱床體積Buffer B1衝洗層析柱，(流速2ml/min)。
使用3個柱床體積Buffer B3(20mM Tris PH8.5，500mM NaCl，1mM EDTA，40mM DTT)快速通過替換Buffer B1，於4℃裂解過夜。次日，用Buffer B3洗脫樣品，按2ml/管收集。然後用3個柱床體積含1％SDS的BufferB1室溫清洗層析柱。
樣品的冷凍乾燥程序也與上述Aβ氨基端融合Intein蛋白的裂解純化相同。
參考文獻Bard F等，Nature Medicine 6916-919.
Janus C等，Nature 408979-982；Lemere C等，DNA Cell Biol.20705-711Levy E等，Science2481124-1126.
Morgan D等，Nature408915-916.
Poduslo JF等，Neuroreport 123197-3200Schenk D等，Nature400116-117.
Weiner H等，Annals Neurology 48567-579
權利要求
1.一種生產老年性痴呆致病物質澱粉樣變多肽β(Aβ)的方法，該方法包括(1)將所述的Aβ多肽編碼區與在細菌中容易表達的蛋白基因融合；(2)將融合基因置於細菌表達載體中；(3)轉染細菌宿主，表達融合產物；(4)純化融合蛋白，從融合蛋白中分離Aβ多肽。
2.根據權利要求1所述的方法，其中步驟(1)所述的融合是指在細菌中容易表達的蛋白基因融合到Aβ多肽的氨基端或羧基端。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中步驟(2)所述的細菌表達載體含有細菌的表達啟動子。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述的細菌表達載體是Twin1。
5.根據權利要求1-4任一項所述的方法，其中細菌宿主是大腸桿菌。
6.根據權利要求5所述的方法，其中細菌宿主是大腸桿菌BL21(DE3)。
7.根據權利要求1-6任一項所述的方法，其中Aβ多肽是人Aβ多肽序列衍生的。
8.根據權利要求7所述的方法，其中Aβ多肽具有下列胺基酸序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(Aβ42)或DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV(Aβ40)或具有上述任一胺基酸序列中連續5個胺基酸的序列。
9.根據權利要求1-8任一項所述的方法，其中所述的融合蛋白具有在一定條件下將與之融合的多肽在融合位點切斷或酶解的功能。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述的融合蛋白是下列蛋白之一Intein，GST，Lac Z，或其它在蛋白與多肽融合區具有酶解或水解位點的細菌蛋白或人工合成蛋白。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所說的Intein融合蛋白具有以下蛋白序列MKIEEGKLTNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEPSNVPALWQLQNNGNNGLELRESGAISGDSLISLASTGKRVSIKDLLDEKDFEIWAINEQTMKLESAKVSRVFCTGKKLVYILKTRLGRTIKATANHRFLTIDGWKRLDELSLKEHIALPRKLESSSLQLSPEIEKLSQSDIYWDSIVSITETGVEEVFDLTVPGPHNFVANDIIVHN或/和CITGDALVALPEGESVRIADIVPGARPNSDNAIDLKVLDRHGNPVLADRLFHSGEHPVYTVRTVEGLRVTGTANHPLLCLVDVAGVPTLLWKLIDEIKPGDYAVIQRSAFSVDCAGFARGKPEFAPTTYTVGVPGLVRFLEAHHRDPDAQAIADELTDGRFYYAKVASVTDAGVQPVYSLRVDTADHAFITNGFVSHATGLTGLNSGLTTNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEPSNVPALWQLQ
12.一種Aβ融合蛋白，具有如下胺基酸序列MKIEEGKLTNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEPSNVPALWQLQNNGNNGLELRESGAISGDSLISLASTGKRVSIKDLLDEKDFEIWAINEQTMKLESAKVSRVFCTGKKLVYILKTRLGRTIKATANHRFLTIDGWKRLDELSLKEHIALPRKLESSSLQLSPEIEKLSQSDIYWDSIVSITETGVEEVFDLTVPGPHNFVANDIIVHNDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV或MDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVCITGDALVALPEGESVRIADIVPGARPNSDNAIDLKVLDRHGNPVLADRLFHSGEHPVYTVRTVEGLRVTGTANHPLLCLVDVAGVPTLLWKLIDEIKPGDYAVIQRSAFSVDCAGFARGKPEFAPTTYTVGVPGLVRFLEAHHRDPDAQAIADELTDGRFYYAKVASVTDAGVQPVYSLRVDTADHAFITNGFVSHATGLTGLNSGLTTNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEPSNVPALWQLQ
13.一種Aβ多肽，具有下列胺基酸序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(Aβ42)或DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV(Aβ40)或具有上述任一胺基酸序列中連續5個胺基酸的序列。
14.權利要求13所述的Aβ多肽在製備用於治療和預防老年性痴呆的藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種能夠大量生產老年性痴呆致病物質Aβ多肽的方法，所述方法將細菌Intein融合於Aβ多肽的氨基端或羧基端，從而使在細菌中較難表達的短肽能夠大量地在細菌中表達。本發明還涉及融合Intein－Aβ蛋白的融合基因，包含該基因的原核細胞表達載體。本發明還涉及融合Intein－Aβ蛋白的細菌表達和純化，以及Aβ多肽從該融合蛋白的水解釋放和純化方法。
文檔編號C12N15/70GK1635119SQ200310123998
公開日2005年7月6日 申請日期2003年12月25日 優先權日2003年12月25日
發明者張小如, 張冀民 申請人:張小如, 張冀民