一種同時檢測樣品中11種違禁化合物的高效毛細管電泳方法

2023-12-08 20:37:11

專利名稱：一種同時檢測樣品中11種違禁化合物的高效毛細管電泳方法
技術領域：
本發明屬於化學品檢測領域，具體涉及一種同時檢測樣品中11種違禁化合物的高效毛細管電泳方法。
背景技術：
呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因、硝呋索爾、氯黴素、環丙沙星屬於廣譜類抗菌藥，這些藥物不僅低廉高效，而且對多種細菌均有殺滅作用，因此常常被養殖戶用於水產品等食用動物養殖，用來預防和治療腹瀉、霍亂等常見傳染病。這些抗菌藥的部分殘留對人體健康危害極大，甚至有致畸、致癌的毒副作用。事實上，硝基呋喃類藥物在動物體內的半衰期很短，主要是其代謝產物3-氨基-2-唑烷基酮(AOZ)、5_甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)、氨基脲(SEM)、1-氨基乙內醯脲(AHD)能跟組織蛋白牢牢的結合，而且即使蒸、煮、炒、微波爐加熱也不能使代謝物的蛋白結合體大量降解。人們食用該動物產品後，在胃酸的作用下，這些蛋白結合態的代謝物會從蛋白質中釋放而被人體吸收，從而對人體產生毒副作用。鑑於此，1993年歐盟獸藥委員會(CVMP)將呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林列為禁用藥物，1995年又將呋喃唑酮列為禁用藥物，並規定了畜禽產品中硝基呋喃類最高殘餘限量，2002年美國也制定了相應的法規，在我國，2002年硝基呋喃被列為禁用獸藥，2003年硝基呋喃被列為水產品殘留監控對象，2004年農業部規定硝基呋喃類化合物禁用於所有食用動物。檢測硝基呋喃等藥物及代謝物方法很多，主要有高效液相色譜法，液質聯用法，酶聯免疫法等。液相色譜法具有高效、快速和專屬性強的特點，特別是質譜檢測的聯合使用，不僅可以實現樣品的高效分離和靈敏檢測，同時又能給出成分的結構信息，是較好的殘留確證方法；但所用儀器昂貴，樣品前處理繁瑣，耗時較長，進樣量大，有毒有機溶劑使用量大，色譜柱易於汙染而報廢，分析時間較長，分析成本高，對分析人員專業技能水平要求較高，難以實現普及使用。酶聯免疫法適合大量樣品初篩，操作簡單，儀器便宜。但對於硝基呋喃類藥物的代謝物只能測定AOZ和AMOZ兩種，陽性樣品需要確證。故仍需建立新的分析方法以實現相關殘留分析，以進一步提高檢測的靈敏度，加快分析速度，合理控制分析成本，增加方法的可操作性。

發明內容
本發明的目的在於針對現有檢測硝基呋喃類藥物及其代謝物方法的不足，提供一種分離度高，重現性好，分析成本低，可同時檢測樣品中氯黴素、環丙沙星、硝基呋喃類藥物及其代謝物共11種違禁化合物殘留的分析方法。本發明所採取的技術方案是:
一種同時檢測樣品中11種違禁化合物的高效毛細管電泳方法，包括如下步驟:
(I)在均質的樣品提取液中加入2-硝基苯甲醛(2-NBA)，混勻，在65 75 1:水浴中衍生 40 80 min ； (2)調節衍生液pH值至7.0 8.0，然後進樣至含有脫氧膽酸鈉(SDC)和甲醇(CH3OH)的NaH2PO4-Na2HPO4緩衝液的毛細管上電泳分離和測定；
所述11中違禁化合物包括:呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因、硝呋索爾、呋喃唑酮代謝物(AOZ )、呋喃它酮代謝物(AMOZ )、呋喃西林代謝物(SEM )、呋喃妥因代謝物(AHD)、氯黴素和環丙沙星。步驟(I)所述的衍生是在酸性條件下進行。所述酸性條件是指衍生液中鹽酸的終濃度為1.0 10 mol/L。步驟(I)衍生液中2-硝基苯甲醛的終濃度為0.0001 1.0 mmol/L。作為進一步的優選方案，步驟(I)樣品在70 °C水浴中衍生60 min。NaH2PO4-Na2HPO4 緩衝液濃度為 18 22 mmol/L，含有的 SDC 為 70 90 mmol/L,含有的 CH3OH 為 8 12 % (V/V), pH 8.0 10.0。作為進一步的優選方案，NaH2PO4-Na2HPO4緩衝液濃度為20 mmol/L,含有的SDC為80 mmol/L，含有的 CH3OH 為 10 % (V/V), pH 9.0。毛細管電泳的條件參數為:毛細管有效柱長為50 cm,內徑為75 μ m,電壓為20kV,溫度為25 °C,檢測波長275 nm,壓力進樣0.5 psi,8 sec。樣品提取液由以下方法製備:
(1)取已均質的樣品，置於容器中，加入無水乙醇提取，離心，取上清；
(2)上清濃縮至近幹，用乙腈溶液溶解，加入正己烷，萃取分離，棄去正己烷層；
(3)乙腈層濃縮至近幹，加入無水乙醇溶解，45 55°C下氮氣吹乾，用乙腈-水混合溶劑溶解，備用。作為進一步的優選方案，所述乙腈-水混合溶劑中，乙腈和水體積比為30:70。本發明的有益效果是:
本方法採用2-硝基苯甲醛(2-NBA)對代謝物進行紫外衍生，通過建立11種標準品對照電泳譜圖，進而採用高效毛細管電泳法同時對樣品中呋喃唑酮等11種違禁化合物殘留進行分離和檢測，本方法不僅靈敏度高，分離度和重現性好，樣品預處理方法也比較簡單，避免大量有機溶劑使用，與傳統的高效液相色譜方法和液質聯用方法相比，分析成本低，具體表現在:
(I)樣品用量少:按照上述毛細管分離條件，每次進樣所需樣品只有幾nL，這樣可以節約資源。(2)分離度高:利用上述電泳參數，可以同時檢測呋喃唑酮等11種違禁化合物，各組分達到完全分離。(3)衍生反應條件簡單:衍生反應在65 75 °C，只需40 80 min即可完成衍生，操作非常簡單，且節約時間。(4)自動化程度高:只要在毛細管電泳儀上輸入好設定的衝洗程序，進樣及分離程序，電泳儀可以自動操作，無需人員操作。


圖1是呋喃唑酮等11種違禁化合物的高效毛細管電泳圖(1.呋喃唑酮，2.呋喃它酮，3.2-ΝΒΑ，4.呋喃西林，5.ΑΜ0Ζ，6.氯黴素，7.Α0Ζ，8.呋喃妥因，9.AHD，10.SEM，11.環丙沙星，12.硝呋索爾)；
圖2黃骨魚空白樣品中的高效毛細管電泳圖(1.2-NBA)；
圖3是黃骨魚模擬樣品中11種違禁化合物的高效毛細管電泳圖(1.呋喃唑酮，2.呋喃它酮，3.2-ΝΒΑ，4.呋喃西林，5.ΑΜ0Ζ，6.氯黴素，7.Α0Ζ，8.呋喃妥因，9.AHD，10.SEM，11.環丙沙星，12.硝呋索爾)；
圖4是蝦空白樣品中的高效毛細管電泳圖(1.2-ΝΒΑ)；
圖5是蝦模擬樣品中11種違禁化合物的高效毛細管電泳圖(1.呋喃唑酮，2.呋喃它酮，3.2-ΝΒΑ，4.呋喃西林，5.ΑΜΟΖ，6.氯黴素，7.ΑΟΖ，8.呋喃妥因，9.AHD，10.SEM，11.環丙沙星，12.硝呋索爾)。
具體實施例方式一種同時檢測樣品中11種違禁化合物的高效毛細管電泳方法,包括如下步驟: (I)在均質的樣品提取液中加入2-硝基苯甲醛，混勻，在65 75 °C水浴中衍生40
80 min。(2)調節衍生液pH值至7.0 8.0,使衍生液的pH值接近電泳緩衝液的pH值，保證分離效果。然後進樣至含有脫氧膽酸鈉(SDC)和甲醇(CH3OH)的NaH2PO4-Na2HPO4緩衝液的毛細管上電泳分離和測定。所述11種違禁化合物包括:呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因、硝呋索爾、呋喃唑酮代謝物(AOZ )、呋喃它酮代謝物(AMOZ )、呋喃西林代謝物(SEM)、呋喃妥因代謝物(AHD)、氯黴素和環丙沙星。步驟(I)所述的衍生是在酸性條件下進行，所述酸性條件是指衍生液中鹽酸的終濃度為1.0 10 mol/L。NaH2PO4-Na2HPO4 緩衝液濃度為 18 22 mmol/L，含有的 SDC 為 70 90 mmol/L,含有的 CH3OH 為 8 12 % (V/V), pH 8.0 10.0。毛細管電泳的條件參數為:毛細管有效柱長為50 cm,內徑為75 μπι,電壓為20kV,溫度為25 °C,檢測波長275 nm,壓力進樣0.5 psi,8 sec。樣品提取液由以下方法製備:
(1)取已均質的樣品，置於容器中，加入無水乙醇提取，離心，取上清；
(2)上清濃縮至近幹，用乙腈溶液溶解，加入正己烷，萃取分離，棄去正己烷層；
(3)乙腈層濃縮至近幹，加入無水乙醇溶解，45 55°C下氮氣吹乾，用乙腈-水混合溶劑溶解，備用。下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但並不局限於此。以下實施例所用毛細管電泳儀的毛細管總長為57 cm,有效柱長為50 cm,內徑為75 μπι。電泳條件參數:電壓為20 kV，溫度為25 °C，檢測波長275 nm，壓力進樣0.5 psi,8 sec。電泳緩衝液:NaH2PO4-Na2HPO4緩衝液濃度為20 mmol/L，含有的SDC為80 mmol/L,含有的 CH3OH 為 10 % (V/V), pH 9.0。為了能夠連續檢測樣品和保證檢測結果的重現性，所述的進行毛細管電泳時，要對毛細管進行衝洗壓力為20 psi衝洗，按照衝洗目的的需要，衝洗的程序為:
A、進樣前對毛細管的衝洗:0.1 mol/L HCl5 min,
H2O5 min,
0.1 mol/L NaOH5 min,
H2O5 min,
緩衝液5 min。B、檢測結束後對毛細管的衝洗:
H2O5 min ο溶液進樣前均需用0.22 μπι膜過濾。實施例1
1、呋喃唑酮等11種違禁化合物標準品對照電泳譜圖的建立 (O首先配製11種違禁化合物標準品儲備液I mg/mL備用；
(2)分別取AOZ、AMOZ, SEM、AHD 儲備液 150 μ L, 50 mmol/L2_NBA 150 μ L, 12 mol/L鹽酸0.9 mL，超純水定容至10 mL,於70 °C條件下衍生I h ；
(3)用5mol/L氫氧化鈉調節衍生液pH至7.4 ;
(4)加入呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因、硝呋索爾、氯黴素及環丙沙星儲備液各300 UL ；`
(5)在上述電泳條件下進樣即得呋喃唑酮等11種違禁化合物標準品對照電泳譜圖(見圖1)。2、呋喃唑酮等11種違禁化合物的檢出限和檢出濃度(表I)
檢出限:S/N=3時檢測的濃度；
計算公式:
Dp Γ
W
式中-.C——樣品中禁用化合物的檢出濃度，yg/kg; m——樣品取樣量，kg ；
P——代入回歸方程計算得到的待測樣液中禁用物質的質量濃度，Ug/mL;
V-定容體積，mL ；
D —稀釋倍數(不稀釋則為I)。
權利要求
1.一種同時檢測樣品中11種違禁化合物的高效毛細管電泳方法，包括如下步驟: (1)在均質的樣品提取液中加入2-硝基苯甲醛，混勻，在65 75°C水浴中衍生40 80 min ； (2)調節衍生液pH值至7.0 8.0，然後進樣至含有脫氧膽酸鈉(SDC)和甲醇(CH3OH)的NaH2PO4-Na2HPO4緩衝液的毛細管上電泳分離和測定； 所述11種違禁化合物包括:呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因、硝呋索爾、呋喃唑酮代謝物(AOZ )、呋喃它酮代謝物(AMOZ )、呋喃西林代謝物(SEM )、呋喃妥因代謝物(AHD)、氯黴素和環丙沙星。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(I)所述的衍生是在酸性條件下進行。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述酸性條件是指衍生液中鹽酸的終濃度為 1.0 10 mol/L。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(I)衍生液中2-硝基苯甲醛的終濃度為 0.0001 1.0 mmol/Lo
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(I)樣品在70°C水浴中衍生60 min。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，NaH2PO4-Na2HPO4緩衝液濃度為18 22mmol/L，含有的 SDC 為 70 90 mmol/L，含有的 CH3OH 為 8 12 % (V/V),pH 8.0 10.0。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，NaH2PO4-Na2HPO4緩衝液濃度為20mmol/L，含有的 SDC 為 80 mmol/L，含有的 CH3OH 為 10 % (V/V), pH 9.0。
8.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，毛細管電泳的條件參數為:毛細管有效柱長為50 cm，內徑為75 μ m，電壓為20 kV，溫度為25 °C，檢測波長275 nm，壓力進樣0.5psi，8 sec。
9.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述樣品提取液由以下方法製備: (1)取已均質的樣品，置於容器中，加入無水乙醇提取，離心，取上清液； (2)上清液濃縮至近幹，用乙腈溶液溶解，加入正己烷，萃取分離，棄去正己烷層； (3)乙腈層濃縮至近幹，加入無水乙醇溶解，45 55°C下氮氣吹乾，用乙腈-水混合溶劑溶解，備用。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述乙腈-水混合溶劑中，乙腈和水體積比為30:70。
全文摘要
本發明公開了一種同時檢測樣品中11種違禁化合物的高效毛細管電泳方法。本方法採用2-硝基苯甲醛(2-NBA)對代謝物進行紫外衍生後，採用高效毛細管電泳法同時對食用動物樣品中11種違禁化合物殘留進行檢測，本方法不僅靈敏度高，分離度和重現性好，樣品預處理方法也比較簡單，避免大量有機溶劑使用、分析成本低、適宜所有食用動物樣品中相關違禁化合物殘留的微量分析。
文檔編號G01N1/28GK103115953SQ20131003213
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月28日 優先權日2013年1月28日
發明者潘育方, 翟海雲, 張蘭春 申請人:廣東藥學院