生物標記物-蚯蚓內臟p450含量的測定方法

2023-12-06 08:34:36

專利名稱：：生物標記物-蚯蚓內臟p450含量的測定方法
技術領域：
：本發明涉及細胞色素P450,具體地說是生物標記物-蚯蚓內臟P450含量的測定方法。技術背景細胞色素P450(CYP)是廣泛存在於動物、植物和微生物等不同生物體內的一類具有重要生理功能的代謝酶系，它是由結構相似，性質類似的多種同工酶組成。作為生物體內的第一代謝階段酶系，P450酶系可催化大量親脂性外源物質，承擔大量肝臟藥物的代謝解毒作用(文獻l.沈鈞，徐佩佩，金錫鵬.1997.肝臟中細胞色素P450測定方法的改進。工業衛生與職業病，23(4):236238;文獻2.冷欣夫，邱星輝.2001.細胞色素P450酶系的結構、功能與應用前景.科學出版社.2;文獻3.徐承敏，漲增利，童建.2003.環磷醯胺對小鼠肝細胞色素P450含量的影響.蘇州大學學報(醫學版)，23(2):135^6,141)，因而，在臨床醫學、醫藥學等領域廣泛研究。除此之外，細胞色素P450酶系還有另外一種功能，即可被外源汙染物誘導或抑制而使CYP含量或活性顯著增加或降低，汙染物濃度與CYP含量或活性之間具有顯著相關性。利用生物代謝過程中CYP含量或活性與汙染物毒性之間的響應關係，可將細胞色素P450作為生物標記物，進行環境汙染的早期診斷。對此，很多學者進行了嘗試，但多數研究集中在應用水生生物(如魚類等)肝臟中細胞色素P450含量或活性來指示水體環境的汙染狀況(文獻4.王詠王春霞徐靜波2000.多環芳烴化合物對鯉魚肝微粒體EROD的體外誘導.環境科學學報.20(增刊)176*180;文獻5.SturmA,HansenPD，1999.AlteredCholinesteraseandMonooxygenaseLevelsinDaphniamagnaandChironomusripariusExposedtoEnvironmentalPollutants,五cotox￡""v/raw42:9'a15;文獻6.GalganiF,BocqueneQTruquetPhe/'<a/.,1992.MonitoringofpollutantbiochemicaleffectsonmarineorganismsoftheFrenchcoasts.<9cea"o/og/ca15(4):52在6；文獻7.HaaschML,PrinceR,1993.Cagedandwildfish:inductionofhepaticcytochromeP450asanenvironmentalbiomonitor.￡wv/raw7bx/co/CTew12:885A889;文獻8.FentK,WoodinBR,StegemanJJ,1998.Effectsoftriphenyltinandotherorganotinsonhepaticmonooxygenasesysteminfish.CowpB/oc/論w121(C):277A288;文獻9.AgradiE,BagaR，CilloFa/.,2000,EnvironmentalcontaminantsandbiochemicalresponseineelexposedtoPoriverwater.C%emasp/zere41:1555A1562;文獻10.RazaH,OtaibaA,MontagueW,1995.諸aphtaflavone-induciblecytochromeP4501A1activityinlivermicrosomesofthemarineSafifish(5VgmwsS〖0c/7e附泡r應co/50:1401▲1406;文獻11.CelanderM,LeaverMJ，GeorgeSG"a/"1993.InductionofcytochromeP4501A1andconjugatingenzymesinrainbowtrout(O"cor/^"c/^w，/一liver:atimecoursestudy.Co'wp5/oc/ewP/2w/0/106C:343A349;文^12.Kloepper畫SamsPJ,BentonE,1994.Exposureoffishtobiologicallytreatedbleached-krafteffluent.2.InductionofhepaticcytochromeP4501Ainmountainwhitefish(/V'oso//mww/Z/Zamsow)andotherspecies.￡〃v/ra"7b;c/co/Ozem13:1483▲1496)。(列如應用各類魚種肝臟中P450含量或特異性酶活性(ERQD、PROD、ECOD和AHH等)對水體中多環芳烴(PAHs)、多氯聯苯(PCBs)和二惡英等汙染進行早期診斷研究。有關土壤汙染早期診斷的生物標記物研究也有報導。但多數是從醫學角度，以傳統醫學生物試驗為基礎進行的相關探討。如Roos等人以小鼠口服多環芳烴(PAHs)汙染土壤的方式對其染毒，發現汙染土壤可使鼠肝微粒體P450活性產生7^28倍的高誘導響應，誘導強度與土壤汙染程度相關(文獻13.P.H.Roos，M.VanAfferden，D.Strotkamp，D.Tappe,F.Pfeifer，W.G.1996.LivermicrosomallevelsofcytochromeP450IA1asbiomarkerforexposureandbioavalabilityofsoil-boundpolycyclicaromatichydrocarbons,五w/raw膨齒/Cowto附z77加'ow7bx/co/ogy.30:107*113;文獻14.Peter.H.Roos.2002.DifferentialinductionofCYPlAlinduodenum,liverandkidneyofratsafteroralintakeofsoilcontainingpolycyclicaromatichydrocarbons,fiwv/rawwewf"/Cowtow/w"riowawd7bx/co/ogy.33:127A132)。但以非土壤牛.物小鼠口服的方法只能進行實驗室條件下的高劑量-響應關係研究，對土壤汙染的診斷存在很大局限性(文獻l5.M.O.FoLichecourt,P,Bemy，丄L.Riviere,1998.BioavailabilityofPCBstomalelaboratoryratsmaintainedonlittereofcontaminatedsoilsLPCBsburdenandinductionofalkooxyresorufin-o-Dealkylaseactivitiesinliverandlung,五謂'ra臓ewto/Owtow/腦打'ow7bx/co/ogy.35:680*687)。以土壤動物進行相關實驗，是土壤汙染診斷最直接和有效的方法。蚯蚓(赤子愛勝)是國際標準方法組織推薦的土壤生態毒理供試動物。然而，目前以蚯蚓細胞色素P450為生物標記物進行土壤汙染早期診斷研究要遠遠落後於水體環境的汙染診斷。其主要原因是選用蚯頓作為供試動物增加了P450含量或活性測定試驗的難度。有研究報導選擇蚯躬l體內P450特異性同工酶活性(如EROD、PROD禾nECOD等)來指示土壤環境的汙染3犬7兄(文獻16.R.K.Achazi,C.Flenner,D.R.Livingstone,L.D.Peters,K.SchaubandE.Scheiwe.1998.CytochromeP450anddependentactivitiesinunexposedandPAH-exposedterrestrialannelids.Co'wp.i/oc/ew.P/》'w'o/.C,121,339A350;文獻17.Saint-DenisM,NarbonneJF,ArnaudC"a/.,1999.Biochemicalresponsesoftheearthworm￡7sew'a,紐油exposedtocontaminatedartificialsoil-effectsofbenzo(a)pyrene.Sb//5:o/B/oc/7e附31:1837"846;文獻18BoothL,HeppelthwaiteV，O'HalloranK，2002.DevelopmentofBiomarkersinAporrectodeacaliginosaandLumbricusmbellusforDetectingExposuretoBenzo[a]pyrene.J5b//》3:148*154;文獻19.BrownPJ,LongSM，SpurgeonDJa/.,2004.Toxicologicalandbiochemicalresponsesoftheearthworm丄訓6Wc^rw6e〃m'topyxene,anon-carcinogenicpolycyclicaromatichydrocarbon.C7;emo5p/7ere57:1675^1681)，但由於這些同工酶本身固有的活性較低，且在測定的過程中存在千擾等因素的存在，使得活性測定結果通常為未檢出或活性變化不明顯，因而指示效果很不理想。相比之下，P450含量的測定方法具有簡單、快速和經濟等優點，但是目前應用蚯蚓P450含量作為生物標記物進行土壤汙染診斷研究很少報導，其中最重要的原因是實驗方法上沒有得到突破。具體存在以下難點1)蚯蚓P450含量的測定通常採用整體動物，由此產生的幹擾遠遠大於肝臟組織；2)蚯蚓整體形態、結構組織等的特殊性，導致幹擾物質種類增加，不僅包括血紅蛋白，還包括黃色素，蚯蚓(赤子愛勝)特有的深紅色色素兒丁質層表皮紅色素也嚴重幹擾P450的測定。有研究者試圖實現蚯蚓(赤子愛勝)P450含量的測定，由於缺少有效的去幹擾方法，實驗研究沒有取得成功。例如，Achazi等人16利用差速離心法製得蚯頓微粒體後，經分子篩再經過電泳方法進-^歩分離血紅素，試圖實現幹擾物質與細胞色素P450的分離，但實驗最終失敗。為此，經反覆試驗，在2004年申請人申請了有關《蚯蚓體內(整體)細胞色素P450含量的測定方法》的專利(專利號200410050391.4)。在此基礎上，經反覆研究，又發現了更為簡單、直接和有效的蚯蚓P450含量的測定方法。
發明內容為了推進土壤汙染生態毒理學診斷研究不斷向分子生物學水平發展，在國家自然科學基金(20277041，20337010，20577056)和國家重點基礎研究發展規劃(973)項目(2004CB418503)資助下，申請人開展了土壤汙染診斷生物標記物細胞色素P450研究。根據P450含量測定的方法原理，借鑑2004年專利(專利號200410050391.4)《蚯頓體內細胞色素P450含量的測定方法》，針對蚯蚓(赤子愛勝)整體動物的特點，經過以去除幹擾物質為主要目標的各種實驗摸索，最終建立了蚯頓(赤子愛勝)內臟P450含量的定量測定方法，實現了蚯蚓P450含量更為簡單、直接和有效的測定。為實現上述目的，本發明採用的技術方案為生物標記物-蚯蚓內臟P450含量的測定方法，1)將排淨體內物質後的活體蚯蚓在甘油溶液中浸泡後，迅速解剖取其內臟；將內臟用過量的鹽溶液中清洗至無色為止；2)將洗淨後的內臟轉移到勻漿緩衝液中，而後破碎其細胞；將勻漿物在低溫3。C以1000015000g超速離心2030min，取上清液再次以100000150000g超速離心60卯min，棄掉上清液，保留微粒體沉澱；3)將微粒體在含有體積濃度20%甘油的勻漿緩衝液中混勻，待測P450總量和微粒體懸液蛋白含量。蛋白含量採用考馬斯亮藍法測定(文獻21.BradfordMM.Arapidandsensitivemethodforthequantitationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebinding,j，/.傷oc/論肌，1976,72:248^254);P450參照經典P450含量的測定方法(文獻20.TsuneoOmuraandRyoSato.1964.TheCarbonM.onoxide-bindingPigmentofliverMicrosomes.Jowma/q/'S/o/og/ca/a2em/幼:v，239(7):2370~2378)採用紫外分光光度法，於400500nm處掃描CO差光譜，分別記錄450nm和490nm處的吸光值，根據以下公式計算CYP450的含量(腿ol/mg)=(/\八(450-490)11111*稀釋倍數)/(0.091*蛋白含量)其中0.091為CYP450的消光係數，稀釋倍數指蛋白測定時稀釋的倍數；在進行P450含量測定前，將實驗用活體蚯頓在蒸餾水中洗淨後用濾紙吸千、稱重；於室溫下在溼潤的濾紙中放置2448h，使其排淨體內的物質後待用；將排淨體內物質後的活體蚯蚓在體積濃度為2040%甘油溶液中4"C浸泡2030min後，迅速解剖取出內臟；將內臟放置在過濾裝置中用大量的(U5MKC1溶液清洗，直至清洗液呈無色為止；內臟的勻漿緩衝液組成為250mmol/l蔗糖，50mmo1/1TrispH7.5，lmmoi/lDTT，1mmol/lEDTA。微粒體保存緩衝液為其中含有體積濃度20%甘油的勻漿緩衝液。所述細胞色素P450總量的測定是採用紫外分光光度法，根據掃描的CO差光譜中P450峰值出現的位置來判定CO的通氣量及反應時間，最終準確定量。本發明方法借鑑2004年專利《蚯蚓體內細胞色素P450含量的測定方法》，同時，進行了大量創新和改進，最終實現了蚯蚓內臟P450含量的定性、定量測定；目前國內外尚無選用蚯蚓內臟作為P450含量測定的對象；該方法的主要優點概括為簡單、快速、低耗、準確定性定量。發明點在1)測定對象的選擇選取蚯蚓內臟進行細胞色素P450含量的測定。優點在於可避免或減少由整體測定所帶來的幹擾。試驗的光譜掃描結果表明，蚯蚓內臟中P450含量峰值沒有產生因幹擾物質引發的偏移現象，這為P450含量的準確定量提供了堅實的基礎。另外，內臟是蚯蚓代謝外源汙染物的重要場所，也是生化酶類分布最為集中的區域，選取此部位測定酶活性更為直接和有效。2)解剖預處理方法採用冰冷甘油固定活體蚯蚓後進行解剖。甘油的固定可避免活體解剖時蚯蚓的活動性給解剖帶來的不便，且吸收水分後蚯蚓體表收縮更利於解剖。試驗表明，甘油的最佳固定時間為230min(4°C)，時間增加則會引起蚯蚓體表的凍傷，進而不利於解剖操作的進行;此外，甘油還能有效保護P450活性，儘可能避免其在解剖和後續操作過程中的活性損失。選用整體法測定P450含量時，甘油(固定lh)的作用僅僅是為了保護蚯蚓體內P450酶系活性。3)簡化了P450的測定過程主要體現在兩方面①勻漿處理過程採用整體法時，蚯頓體表的韌性使勻槳處理只能選用電動組織勻漿器，其高速轉動產生的熱量會影響P450酶活性，因而在勻漿的間歇需用冰水的不停的冷卻；而內臟的組織勻漿可採用手動玻璃組織研磨器在冰浴中進行，這樣既可省去了冷卻操作又保證了勻漿過程在低溫下進行，避免P450失活。②省去了物理剝離過程採用整體法時，幹擾物質的存在使差速離心法製得的微粒體沉澱還需要進-一步的物理剝離操作，然後才可進行P450含量的測定；而內臟中P450的測定，可在差速離心後用所得的微粒休沉澱直接進行，使測定過程簡單化，並避免了手工剝離操作可能帶來的人為誤差。4)最佳通氣量的控制和反應結束的判定即根據CO差光譜中P450峰值出現的位置來判定CO的通氣量及反應時間。CO通氣量的不足或過量都會影響P450峰值(形)的出現，而反應時間決定著P450含量最終的準確性。通過對P450峰值(形)的判別來調整測定過程中CO的通氣量和反應時間，使反應進行完全，從而保證P450的準確定量。改變了以往樣品測定過程中P450與CO的定時反應，避免了因反應不完全而導致的P450含量測定不準確。具體實施方式實施例生物標記物-蚯蚓內臟P450含量的測定方法，操作步驟如下1)將排淨體內物質後的活體蚯蚓在冰冷甘油溶液中浸泡後，迅速解剖取其內臟。內臟用大量KC1溶液清洗，直至洗脫液為無色；2)將洗淨後的內臟轉移到勻漿緩衝液中，用玻璃組織研磨器將其細胞破碎，於低溫3"C超速離心機上10000g離心20min，將上清液再次以150000g超速離心90min，棄掉上清液保留微粒體沉澱；3)將微粒體在保存緩衝液中混勻，採用紫外分光光度法測定P450總量，考馬斯亮藍法測定微粒體懸液的蛋白含量。在進行P450含量測定前，將實驗用活體蚯頓在蒸餾水中洗淨後用濾紙吸千、稱重；於室溫下在溼潤的濾紙中放置24h，使其排淨體內的物質後待用；將排淨體內物質後的活體蚯蚓於20%甘油溶液中4。C浸泡2030min後，在解剖盤中迅速將其解剖取其內臟，並用大量的4。C的0.15MKC1溶液衝洗內臟，直至洗脫液為無色。蚯蚓內臟勻漿緩衝液組成為250mmol/l蔗糖，50mmol/lTrispH7.5，lmmol/1DTT，lmmol/1EDTA;微粒體保存緩衝液為含有體積濃度20%甘油的勻漿緩衝溶液。P450總量測定如下微粒體蛋白懸液6ml，加入適量的連二亞硫酸鈉將其還原。混勻後放置12min，將其分裝於兩個比色杯(3ml)中，-個作為樣品杯，另一個作為參比杯。在樣品杯中通入--氧化碳(濃硫酸和甲酸各8ml混合，用熱水浴啟動反應，製備CO氣體)約40個泡後，充分混勻放置3min，然後在紫外一可見雙光束分光光度計上400500nm處掃描光譜。根據P450峰值出現的位置來判定CO通氣量和反應是否完全，及時調整CO通氣量和反應時間，直至P450峰值出現在450nm附近且450和490nm處的吸光度差值不再變化。最後，P450總含量(nmol/mg蛋白)具體結果見f表根據如下公式計算P450含量XA(450-490)nm0.091[:微粒體懸液蛋白濃度樣品OD450nmOD490nm蛋白濃度(mg/ml)P450含量(nmol/mg)樣品10,1470.1260.0812.849樣品20,1380.1180.0782.818t樣品30.1200.1020.0682.909注樣品13為同處理的平行;樣品。對比例l:各步操作如上(實施例)所述，不同之處在於樣p^1採用磷酸鈉緩衝溶液(Na2HPO4-NaH2PO4，0.1mol/L,pH7.8)作為勻漿緩衝液，而樣品2未經20%甘油預處理。具體結果見下表樣品01)450議蛋白濃度(mg/ml)P450含量(nmol/mg)樣品10.1360.1120.1212.18樣品20.1180.1010.0932.009對比例2:生物標記物-蚯蚓體內P450含量的測定方法(專利號200410050391.4)操作均在0-4。C進行1)將排淨體內物質後的活體蚯蚓在冰冷的20%甘油溶液中浸泡lh後，轉移至0.15MKC1溶液中，將整條蚯蚓分割破碎，放置在過濾裝置中用0.15MKC1溶液清洗,直至清洗液呈無色；2)將破碎物轉移到勻漿緩衝液(250mmo1/1蔗糖，50mmo1/1TrispH7.5，lmmo1/1DTT，1mmo1/1EDTA)中，以內切式組織勻槳器以8000轉/分勻槳30秒鐘後，將勻漿物在低溫4。C超速離心機上15000g離心30min，將上清液再次以150000g超速離心90min，棄掉上清液後，將裝微粒體沉澱的離心管放置於冰水中，使沉澱殘留的血紅素進-步與微粒體分離後，將紅色物質剝離3)將微粒體在保存緩衝液(250mmo1/1蔗糖，50mmo1/1TmpH7.5，lmmol/lDTT，lmmol/lEDTA，20%甘油)中混勻，待測P450總量和微粒體懸液蛋白含量。細胞色素P450總量測定採用紫外分光光度法即微粒體蛋白懸液6ml，加入適量的連二亞硫酸鈉將其還原。混勻後，分裝於兩個比色杯中，一個作為樣品杯，另一個作為參比杯。在樣品杯中通入--氧化碳(濃硫酸和甲酸各5ml製備CO氣體)約23min後，放置23min，然後在紫外雙光束分光光度計上400500nm處掃描光譜，分別記錄450nm和490nm處的吸光值。根據以下公式計算P450含量CYP450的含量(nmol/mg)—AA(450-490)nn卄稀釋倍數)/(0.091*蛋白含量)其中0.091為CYP450的消光係數稀釋倍數指蛋白測定時稀釋的倍數蛋白含量測定採用考馬斯亮藍法21具體結果見下表tableseeoriginaldocumentpage9注樣品13為同處理的平行樣品權利要求1.生物標記物-蚯蚓內臟P450含量的測定方法，其特徵在於1)將排淨體內物質後的活體蚯蚓在體積濃度為20～40％甘油溶液中浸後迅速解剖取其內臟；將內臟用過量的KCl溶液清洗直至清洗液呈無色為止；2)將洗淨後的內臟轉移到勻漿緩衝液中，而後破碎其細胞；將勻漿物在低溫3℃以10000～15000g超速離心20～30min，取上清液再次以100000～150000g超速離心60～90min，棄掉上清液，保留微粒體沉澱；3)將微粒體在含有體積濃度20％甘油的勻漿緩衝液中混勻，測P450總量和微粒體懸液蛋白含量。2.按照權利要求1所述的生物標記物-蚯蚓內臟P450含量測定方法，其特徵在於將排淨體內物質後的活體蚯頓在甘油溶液中04t:下浸泡2030min;清洗溶液KC1濃度為0.150.25M。3.按照權利要求1所述的生物標記物-蚯蚓內臟P450含量測定方法，其特徵在於內臟的勻漿緩衝液組成為20030Ommol/L蔗糖，50100mmol/LTrispH7.5，lmmol/LDTT，lmmol/LEDTA。4.按照權利要求1所述的生物標記物-蚯頓內臟P450含量測定方法，其特徵在於在進行P450含量測定前，將實驗用活體蚯躬l在蒸餾水中洗淨後用濾紙吸千、稱重；於室溫下在溼潤的濾紙中放置2448h，使其排淨體內的物質後待用。5.按照權利要求1所述的生物標記物-蚯頓內臟P450含量測定方法，其特徵在於P450總量採用連二亞硫酸鈉還原的CO差光譜法進行定量。全文摘要本發明涉及細胞色素P450，具體地說是生物標記物-蚯蚓內臟P450含量的測定方法1)將活體蚯蚓在甘油溶液中浸泡後，迅速解剖取其內臟；2)將內臟用冰冷的鹽水清洗後轉移到勻漿緩衝液中，用玻璃組織研磨器將其細胞破碎，於低溫3℃超速離心機上10000g離心20min，將上清液再次以150000g超速離心90min，棄掉上清液保留微粒體沉澱；3)將微粒體溶解在保存緩衝液中混勻，待測P450總量和微粒體懸液蛋白含量。P450總量採用連二亞硫酸鈉還原的CO差光譜法進行定量。本發明的主要優點為簡單、快速、低耗、準確定性定量。文檔編號G01N33/48GK101210918SQ20061015586公開日2008年7月2日申請日期2006年12月31日優先權日2006年12月31日發明者淼劉,孫鐵珩,宋玉芳,薇張申請人:中國科學院瀋陽應用生態研究所