一步法病原體核酸螢光定量pcr檢測方法
2023-11-10 23:17:37 1
專利名稱：：一步法病原體核酸螢光定量pcr檢測方法
技術領域：
：本發明涉及一種核酸螢光定量PCR檢測方法，尤其是涉及一種一步法病原體核酸螢光定量PCR檢測方法。
背景技術：
：血清中病毒核酸的提取，目前主要有四種方法(l)直接煮沸法向血清中加入核酸裂解液，直接煮沸，高速離心，上清即為模板；其優點是易於操作；缺點是不能有效去除血清中抑制PCR的因素，弱陽性經常無擴增；(2)煮沸法先將血清濃縮，再加裂解液，煮沸，高速離心，上清為模板，是目前國內臨床通用的方法；這種方法能部分去除撝苯又蠓蟹〃中無法去除的抑制性因素，缺點在於濃縮這一步，不同廠家的濃縮效果不一樣，有的可以看到沉澱，有的無法看到，看得到沉澱的是因為將病毒與蛋白都濃縮了，這樣，導致後面加入裂解液時很難充分混勻；無法看到沉澱，使操作者無法確定吸棄上清時會不會吹打到病毒核酸；(3)柱提取法血清通過裂解，過柱後核酸吸附到膜上，通過兩次洗滌，最後洗脫下來的為模板；這種方法相對前兩種提取方法而言，提取的核酸純度大大提高，不但可用於下遊PCR實驗，還可用來做其他分子生物學實驗，缺點是手工操作過多，效率低，且無法自動化；(4)磁分離方法磁分離是利用功能化磁性納米顆粒的表面配體(或受體)與受體(或配體)之間特異性相互作用來實現對靶向生物目標的快速分離；目前，磁分離方法已廣泛應用於核酸(DNA和RNA)、蛋白質、酶、細胞等多種生物物質的分離與純化；磁分離方法提取核酸可稱得上是提取核酸的終極方法，因為此方法具備上述所有方法的優點，並且能輕而易舉實現自動化。不過，所用試劑基本上為國外所壟斷，價格非常昂貴，從而限制了其在我國的廣泛應用。
發明內容本發明的目的在於提供一種操作簡單快速，抗汙染，幹擾能力強，提取的核酸無損失，快速準確，所用試劑製造成本低的一步法病原體核酸螢光定量PCR檢測方法。本發明的技術方案是針對待測病原體核酸選取保守基因序列，設計特異性引物探針，採用一種核酸快速釋放試劑提取病原體核酸，直接加入相應的PCR反應液，實現PCR螢光定量檢測。所述核酸快速釋放試劑由0.010.5mM/L(與KC1水溶液的質量體積比)的表面活性肽溶解於50200mM/L的KC1水溶液，0.01%2%(與無菌水的質量體積比)的SDS(十二烷基磺酸鈉)、LLS(Lithiumlaurylsulfate,十二烷基硫酸鋰)或Chelex-lOO(Chelex樹脂)，以及O.05%1%(體積)的乙醇組成。所述核酸快速釋放試劑配製方法以無菌水、KC1配製50200mM/L的KC1溶液，加入表面活性肽，使表面活性肽濃度達到0.010.5mM/L，加入0.01%2%(與無菌水的質量體積比))的SDS、LLS或Chelex-100，加入0.05X1%(體積)的乙醇，即配成本發明之核酸釋放試劑。所述百分比以無菌水體積為計算基準(下同)。本發明結果判斷理想的標準品擴增曲線基線平整，NTC無模板，不產生引物二聚體，一直是水平線；指數區較明顯，斜率大且固定；平臺區匯於一起，線性範圍廣。理想的標準曲線斜率接近於_3.322，一致性係數接近1.000，理想的重複性，同一樣本CT值變異係數<10%，濃度變異係數<50%。本發明優點整個樣本處理和檢驗過程在一個PCR反應管中即可完成，無需離心、振蕩、更換離心管等一系列繁瑣操作，不但簡化了操作步驟，節省了耗材成本，而且無需加熱，開/關管蓋，移液等可能導致核酸丟失與汙染的操作，抗汙染能力強，實驗結果的重複性大大提高，對操作人員的技術要求較低；還節省了時間成本，可以讓臨床醫生及患者及早得到診斷結果，避免等待試驗結果的焦慮。總之，本發明一步法實現PCR螢光定量檢測，操作簡單快速，抗汙染抗幹擾能力強，提取的核酸無損失，所用試劑製造成本低。圖1(a)為本發明方法檢測HBVDNA標準品的螢光定量PCR擴增曲線；圖1(b)為本發明方法檢測HBVDNA標準品所作標準曲線；圖2(a)為對照方法(離心柱法)提取HCVRNA並進行螢光定量PCR檢測擴增曲線；圖2(b)為本發明方法重複性檢測HCVRNA陽性樣本的螢光定量PCR擴增曲線；圖3為本發明方法檢測沙眼衣原體(CT)陽性樣本的螢光定量PCR擴增曲線。具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步說明。實施例1用於HBVDNA的螢光定量PCR檢測用帶濾芯吸嘴吸取5微升核酸釋放試劑，5微升待測樣本(標準品、陰性、陽性對照，未知濃度的HBVDNA陽性的血清或血漿)，加入PCR反應管中，移液槍頭吸打5-10次混勻，靜置約5min後，用帶濾芯吸嘴吸取40微升已配好的PCR反應液，於StratageneMx3000P或ABI7300/7500系列PCR儀上進行實時螢光定量PCR擴增。PCR反應各成分濃度及比例如下tableseeoriginaldocumentpage4tableseeoriginaldocumentpage5結果分析如附圖1(a)、(b)中檢測了HBVDNA標準品A、B、C、D，濃度分別為4X107IU/ml、4X106IU/ml、4X105IU/ml、4X104IU/ml，以此標準品濃度做標準曲線，分析斜率為3.31，一致性係數為0.9995。實施例2用於HCVRNA的螢光定量PCR檢測用帶濾芯吸嘴吸取5微升核酸釋放試劑，5微升待測樣本(標準品、陰陽性對照，已知HCVRNA陽性的血清或血漿)，加入PCR反應管中，移液槍頭吸打混勻，靜置約5min後，用帶濾芯吸嘴吸取40y1已配好的PCR反應液，於StratageneMx3000P或ABI7300/7500系列PCR儀上進行實時螢光定量PCR擴增。HCVPCR反應液由引物、探針、dNTPs、5XPCRbuffer、滅菌純化水、ROX溶液、酶等組34成。每人份HCVPCR反應液40y1，單人份用量配方如下tableseeoriginaldocumentpage5tableseeoriginaldocumentpage6對照例採用離心柱方法提取HCVRNA並進行螢光定量PCR擴增。如附圖2(a)，提取了HCVRNA的4個標準品並擴增，濃度分別為5X107IU/ml、5X106IU/ml、5X105IU/ml、5X104IU/ml，從擴增曲線上看，離心柱法提取檢測的擴增曲線指數區較不明顯，沒有明顯的平臺區。結果分析如附圖2(b)，採用了本發明的方法6次重複性檢測濃度為1X104IU/ml陽性樣本，從擴增曲線看，基線平整，一直是水平線；指數區較明顯，平臺區匯於一起，同一個樣本6次檢測ct值的變異係數<2%，濃度值變異係數<50%。實施例3用於性病系列病原體DNA的螢光定量PCR檢測用棉試子擦淨尿道口，再用另一棉試子插入尿道內輕輕轉動後取出，將試子置含0.5ml生理鹽水的EP管攪拌、擠幹後，棄拭子，用帶濾芯吸嘴吸取上述含含分泌物的樣本5iU，加入到核酸釋放試劑中(可按實施例1中比例配好核酸釋放試劑，與水以2:3的比例將核酸釋放試劑進行稀釋後使用)，移液槍頭吸打混勻，靜置約5min後，用帶濾芯吸嘴吸取40ill已配好的PCR反應液，於StratageneMx3000P或ABI7300PCR儀上進行實時螢光定量PCR擴增。針對沙眼衣原體(CT)、解脲脲原體(UU)、淋球菌(NGH)和單純皰疹病毒2型(HSV2)設計相應的引物探針序列，PCR反應各成分濃度及比例如下tableseeoriginaldocumentpage7PCR反應程序為tableseeoriginaldocumentpage7結果分析如附圖3，應用本發明的方法對沙眼衣原體DNA進行檢測，原液濃度為5X108IU/ml，以生理鹽水10倍梯度稀釋至5X103IU/ml，同時以生理鹽水做陰性對照，從擴增的曲線上看，基線平整，陰性對照(NTC)無模板，不產生引物二聚體，一直是水平線；指數區較明顯，斜率大且固定；平臺區匯於一起，線性範圍廣。權利要求一種一步法病原體核酸螢光定量PCR檢測方法，包括針對待測病原體核酸選取保守基因序列，設計特異性引物探針步驟，其特徵在於，採用一種核酸快速釋放試劑提取病原體核酸，直接加入相應的PCR反應液，實現PCR螢光定量檢測；所述核酸快速釋放試劑由0.01～0.5mM/L(與KCl水溶液的質量體積比)的表面活性肽溶解於50～200mM/L的KCl水溶液，0.01％～2％(與無菌水的質量體積比)的SDS、LLS或Chelex-100，以及0.05％～1％(體積)的乙醇組成。所述百分比以無菌水體積為計算基準。全文摘要一步法病原體核酸螢光定量PCR檢測方法，該方法是針對待測病原體核酸選取保守基因序列，設計特異性引物探針，採用一種核酸快速釋放試劑提取病原體核酸，直接加入相應的PCR反應液，實現PCR螢光定量檢測。本發明操作簡單快速，抗汙染抗幹擾能力強，提取的核酸無損失，快速準確，所用試劑製造成本低。文檔編號G01N21/64GK101713002SQ200910309980公開日2010年5月26日申請日期2009年11月19日優先權日2009年11月19日發明者戴立忠,熊曉燕申請人:戴立忠