一種增強抗菌肽在植物體內表達的豐度和穩定性的方法

2023-12-01 01:37:41

專利名稱：一種增強抗菌肽在植物體內表達的豐度和穩定性的方法
技術領域：
本發明涉及一種在植物體串連融合表達抗菌肽以提高抗菌肽表達豐度和穩 定性的技術，用於增強農作物抗病性。
背景技術：
抗菌肽是生物體防禦系統中產生的一類對外源病菌具有高效殺滅活性的肽類物質，特別是一些動物來源的抗菌肽，如天蠶素(Cecropins)、蜂毒素 (Melittins)、蛙皮素(Magainins)等，對細菌、真菌、病毒、螺旋體等多種病 原菌甚至癌細胞都有一定的殺滅活性，而且長期使用不會使病原菌產生耐藥性， 也不存在殘留汙染問題，是抗生素和化學殺菌劑的理想替代品。由於抗菌肽具有高效、環保、不使病源菌產生耐藥性等優點，近年來，已成 為植物抗病基因工程、養殖飼料添加劑、新興醫藥等領域的研究熱點。特別是 在植物抗病基因工程領域，抗菌肽基因資源成為最有潛力和應用價值的資源之 一。然而，動物源抗菌肽基因轉入植物後所遇到的主要問題就是抗菌肽表達豐 度偏低，限制了抗菌肽功效的發揮。雖然基因的轉錄後表達很複雜，與多種因 素有關，但這種動物源抗菌肽在植物細胞表達偏低的現象普遍認為主要是外源 抗菌肽在植物細胞不夠穩定，容易被細胞內的蛋白酶降解的原因。1997年，Tailor等發現鳳仙花(Impatiens balsamina L.)種子天然抗菌肽的 前體蛋白是由引導肽和連續6個長度為20個胺基酸的成熟肽單元串聯融合組 成，各成熟肽單元之間由保守的蛋白酶剪切位點隔開，前體蛋白翻譯後可在胞 間溶膠中自動剪切為各成熟抗菌肽單元。為了驗證該剪切位點是否可以應用於 其它植物和其它抗菌肽，Francois等將由該剪切位點隔開的大麗花抗菌肽和蘿蔔 抗菌肽在擬南芥中融合表達，結果證明該鳳仙花抗菌肽剪切位點完全可以在擬 南芥中發揮作用，大麗花抗菌肽和蘿蔔抗菌肽的融合蛋白被徹底切割為有功能活性的2個抗菌肽。與其它類型的蛋白質剪切位點相比，識別該位點的內肽酶 天然存在於植細胞胞間溶膠，前體蛋白切割完全，切割後成熟肽兩端殘留的剪 切位點的胺基酸少，對成熟肽的功能影響小。本發明利用了該內肽酶識別位點， 以Thanatin抗菌肽為例，設計了可自動剪切的抗菌肽基因多拷貝串聯融合表達 技術，並結合其它外源蛋白增強表達技術，以增強抗菌肽在植物體內的表達豐 度和穩定性，提高作物抗病效果。發明內容本發明提供了一種增強抗菌肽在植物體內表達的豐度和穩定性的方法，解 決了異源抗菌肽在植物體內表達豐度偏低，易被植物內源蛋白酶降解的問題。本發明的具體技術方案如下 一種通過多拷貝串聯融合表達的原理來增強 抗菌肽在植物體內的表達豐度和穩定性的方法，包含以下步驟A)以特徵序列為MASERQALMLILLTTFFFTIKPSQA的大豆幾定質酶信號肽為引導肽，引 導目標蛋白定向積累於細胞壁和細胞間隙；B )以特徵序列為 SNAADEVATPEDVEPG的多肽為連接肽，連接多個抗菌肽串聯融合表達，表達 後於S丄NAADEVATPE丄DVEPG位點剪切為多個抗菌肽單元；C)根據目標植 物密碼子使用頻率對編碼序列進行優化；D)將引導肽、抗菌肽、連接肽組合 成引導肽+抗菌肽+(連接肽+抗菌肽"N的結構形式將抗菌肽串聯融合表達，提 高抗菌肽表達效率和穩定性，N為任意拷貝數。上述的多拷貝抗菌肽融合表達載體構建方法，包含以下步驟A)在引導 肽+抗菌肽的融合基因末端設計BglII+終止密碼+Xbal或其它切點，克隆構建 Destination Vector, B)在連接肽+抗菌肽的融合基因頭部加BamH I切點，尾部 加BglII+終止密碼+Xba I或其它切點(同A步驟的末端設計)，克隆構建Entry Vector; C)將Entry Vector的目標序列用BamH I和Xba I切下，連接於Destination Vector用BglII和Xba I酶切產生的載體臂，以所得新的載體為 Destination Vector將Entry Vector目標片段反覆連接進入Destination Vector,直至獲得所需抗菌肽基因拷貝數。以下，對本發明的技術方案做出解釋首先，根據目標植物密碼子偏愛性設 計引導肽、抗菌肽和連接肽的密碼子，再按引導肽+抗菌肽+(連接肽+抗菌肽^N 的方法設計多拷貝抗菌肽融合表達載體，然後利用分子克隆的方法構建含引導肽+抗菌肽單元的Destination Vector和含連接肽+抗菌肽單元的Entry Vector,將 Entry Vector中的目標片段切下反覆連接進入Destination Vector即可獲得多拷貝 抗菌肽融合表達載體，N次連接可獲得N+1拷貝數抗菌肽基因融合表達載體。 利用該載體轉化植物即可增強抗菌肽在目標植物內表達的豐度和穩定性，提高 植物抗病效果。這裡引導肽來源於大豆幾丁質酶信號肽，可以引導目標蛋白分 泌到細胞間隙和細胞壁周圍，使抗菌肽在細胞外圍高豐度積累以增強抗病效果。 連接肽來源於鳳仙花抗菌肽前體肽剪切位點，可在植物體內將多拷貝融合表達 的抗菌肽剪切為多個抗菌肽單元。多拷貝抗菌肽融合表達載體構建方法，酶切 位點，及抗菌肽、引導肽、連接肽的胺基酸序列和編碼序列詳見附圖1，其中， 抗菌肽序列為Thanatin所示部分，引導肽序列為SP所示部分，連接肽序列為 LP所示部分，對應的DNA編碼序列是根據油菜密碼子使用頻率優化得來。本 發明的方法可應用於油菜、水稻、玉米、大豆、小麥等各種可轉換植物的轉基 因改良，提高其抗病能力。


圖1~圖3為可自剪切多拷貝Thanatin抗菌肽融合表達載體設計與構 建示意圖；其中圖1: Thanatin 1 5拷貝融合表達載體構建過程及最終載體結構； 圖2: SP-Thanatin序列結構及分段合成示意圖；圖3: LP-Thanatin序列結構及 分段合成示意圖。AFPV1 AFPV5為不同拷貝數抗菌肽融合表達的植物表達載 體。SP:大豆幾丁質酶信號肽；LP:連接肽，來源於鳳仙花，可被植物體內的
內肽酶識別，識別序列為S氺NAADEVATPE丄DVEPG; TMAS:甘露鹼合成酶基 因的終止子；BAR:抗除草劑basta基因；PMAS:甘露鹼合成酶啟動子；P2X35S: 組成型表達強啟動子；Q: TMV omega翻譯增強序列；Toes:章魚鹼合成酶基 因的終止子；① (D:分段合成的基因片斷01igo1 6。
具體實施方式
以抗菌肽Thanatin為例構建可剪切多拷貝抗菌肽融合表達載體。設計要點以鳳仙花抗菌肽剪切位點為間隔序列，其胺基酸序列及剪切方式 為S丄NAADEVATPE;DVEPG，以大豆幾丁質酶信號肽為引導序列，其序列特 徵為MASERQALMLILL TTFF FTIKPSQA，將多拷貝抗菌肽融合表達產物導入 細胞間隙和細胞壁周圍高豐度積累，再剪切為單個有活性的抗菌肽單元。該大 豆幾丁質酶信號肽與GFP蛋白融合表達研究表明該信號肽可將目標蛋白特異性 導入細胞間隙和細胞壁。按附圖1設計抗菌肽融合表達載體結構。融合表達的抗菌肽由一個引導肽， 5個Thanatin抗菌肽，和4個剪切肽組成，剪切肽分別位於5個抗菌肽之間， 使融合抗菌肽表達後得以剪切。融合表達載體由Destination Vector和Entry Vector兩個載體經多次反覆連接而來。前者克隆了引導肽和第一個抗菌肽基因。 後者克隆了剪切肽和後續抗菌肽基因。DestinationVector末端設計了 BamH I切 點，Entry Vector前端設計了BglII切點，兩者為同尾酶，酶切後反覆連接，即 可獲得任意拷貝數的抗菌肽融合表達載體。融合表達載體結構設計好後，將胺基酸序列按油菜等雙子葉植物密碼子傾向 轉換為適合油菜等雙子葉植物表達的基因序列。並根據該序列分段合成基因片 段① ⑥。① ctgcagccatggcttctgagagacaggctcttatgcttatccttcttactactttcttct② acaggcttcttagatccagcctgagaaggcttgatagtgaagaagaaagtagtaaga
③ ggatctaagaagcctgttcctatcatctactgtaacagaagaactggaaagtgtcagaga④ gaattctctagactaagatctcattctctgacactttccag⑤ ggatccaacgctgctgatgaggttgctactcctgaggatgtt⑥ ggaacaggcttcttagatccaggctcaacatcctcaggagtag構建Destination Vector:將Oligo① ④用雙蒸水稀釋到10 |aM，分別 取Oligo① ④5 |iL、 0.2 uL、 0.2 fiL、 5 (iL， 25 mM Mg2+ 8 (iL， 10 mM dNTP 1.6 iaL， 10 x PCR buffer 10 pL， Taq 5 U,加水到100 pL，進行PCR。PCR循環為94°C 5，， (94°C 30", 58°C 30", 72°C 30") x 10, (94°C 30"， 50°C 30", 72°C 30") x 20, 72°C 10，， 4°C~。 PCR產物於MicroconYM30過柱，濃縮於30 (iL，力B10UPstl、 10 U EcoR I 、 5 10 x Reaction Buffer於50 體系酶切3 h，再次用Microcon YM30過柱，濃縮於15 |iL。同時pUC18質粒用Pst I 、 EcoR I雙酶切，上樣於 1%的瓊脂糖凝膠，電泳後回收目標帶，取l pL載體與4 目標DNA連接後 轉化大腸桿菌。構建Entry Vector:將Oligo③ ⑥用雙蒸水稀釋到10 pM，分別取Oligo ③ ⑥0.2nL、 5|aL、 5 4、 0.2 pL， 25 mM Mg2+8 (iL， 10 mM dNTP 1.6 |iL, 10 xPCRbufferl0pL，Taq5U，力口水至Ul00iLiL,按上述同樣方法進行PCR，產物 於1.5%的瓊脂糖凝膠電泳後回收目標帶，克隆於pMD18-T載體。挑取Destination Vector和Entry Vector克隆測序確認目標片段完全正確。 將Destination Vector用Bgl II和Xba I雙酶切，Entry Vector用BamH I和 Xbal雙酶切，0.8%凝膠電泳後回收目標片段連接。所得新載體反覆如此酶切 連接，即可獲得任意拷貝數抗菌肽基因融合表達的載體。將多拷貝抗菌肽融合表達的Destination Vector用Nco I和Xba I雙酶切切 下目標片段，連接於植物表達載體，例如pFGC5941,即可獲得可剪切多拷貝抗 菌肽融合表達載體。利用該載體轉化植物，如擬南芥、油菜等，可顯著提高抗 菌肽的表達豐度和體內存在的半衰期，提高植物抗病效果。如轉化擬南芥後，擬南芥對菌核病的抗性大大提高，沒有轉化的擬南芥野生型ColO接種核盤菌 48h後葉片全部枯死，轉基因擬南芥接種48h後只有約一半葉片枯死，這說明 經轉化後的擬南芥對菌核病抗菌性能得到了大大的提高。採用本發明的方法轉 化油菜後，油菜葉片接種菌核病菌絲塊後病。
權利要求
1. 一種增強抗菌肽在植物體內表達的豐度和穩定性的方法，包含以下步驟A)以特徵序列為MASERQALMLILLTTFFFTIKPSQA的大豆幾丁質酶信號肽為引導肽，引導目標蛋白定向積累於細胞壁和細胞間隙；B)以特徵序列為SNAADEVATPEDVEPG的多肽為連接肽，連接多個抗菌肽串聯融合表達，表達後於S↓NAADEVATPE↓DVEPG位點剪切為多個抗菌肽單元；C)根據目標植物密碼子使用頻率對編碼序列進行優化；D)將引導肽、抗菌肽、連接肽組合成引導肽+抗菌肽+(連接肽+抗菌肽)*N的結構形式將抗菌肽串聯融合表達，提高抗菌肽表達效率和穩定性，N為任意拷貝數。
2. 根據權利要求1所述的增強抗菌肽在植物體內表達的豐度和穩定性的方 法，其特徵在於所述的多拷貝抗菌肽融合表達包含以下步驟A)在引導肽+抗 菌肽的融合基因末端設計BglII +終止密碼+Xbal或其它切點，克隆構建 Destination Vector, B)在連接肽+抗菌肽的融合基因頭部加BamH I切點，尾部 加BglII+終止密碼+Xba I或其它切點(同A步驟的末端設計)，克隆構建Entry Vector; C)將Entry Vector的目標序列用BamH I和Xba I切下，連接於 Destination Vector用BglII和Xba I酶切產生的載體臂，以所得新的載體為 Destination Vector將Entry Vector目標片段反覆連接進入Destination Vector,直 至獲得所需抗菌肽基因拷貝數。
全文摘要
本發明涉及一種增強抗菌肽在植物體內表達的豐度和穩定性的方法，屬於生物技術領域，它通過設計了一種在植物體內可自動剪切的多拷貝抗菌肽串聯融合表達技術，使多拷貝融合表達的抗菌肽在植物體內可自動剪切為有功能活性的單個抗菌肽單元，以增加抗菌肽表達豐度和抗菌肽的穩定性。
文檔編號C12N15/62GK101397559SQ20071007159
公開日2009年4月1日 申請日期2007年9月30日 優先權日2007年9月30日
發明者劉仁虎, 劉智宏, 汪小福, 王伏林, 郎春秀, 陳笑芸, 陳錦清 申請人:浙江省農業科學院