基於ITS2序列鑑別大花龍膽與混偽品的引物、鑑別方法與流程

2023-12-08 15:29:42 3

本發明屬於中藥材鑑定技術領域，具體涉及一種基於ITS2序列鑑別大花龍膽與混偽品的引物、鑑別方法。

背景技術：

大花龍膽G.szechenyii，具有清溼熱，瀉肝膽實火，鎮咳，利喉，健胃等功效，主治肺熱咳嗽，目赤咽痛，陰部溼疹，天花等病症，藥用部位為其乾燥花枝。目前，大花龍膽被歸類為白花龍膽的一種，除了大花龍膽，白花龍膽還包括高山龍膽和岷縣龍膽。

由於大花龍膽主要來自野生，而且功效有其特殊之處，市場需求量逐年攀升，市場價格遠遠超過比其他白花龍膽類藥材，經濟價值高。但是，由於外形相似、分類混亂、鑑定者知識的局限性等原因，目前大花龍膽與其他白花龍膽以及秦艽等龍膽屬藥材難以區分，導致對大花龍膽的認識存在同物異名、同名異物、品種之間誤用混用等問題，嚴重影響了用藥的準確性和安全性。

目前，有關大花龍膽的研究只見零星報導，對大花龍膽的鑑別仍然主要依靠傳統的形態分類學鑑定，鑑定工作難度很大。隨著分子生物學的發展，分子鑑定方法也越來越多的應用到中藥材的鑑定上，但目前還未見使用分子技術對大花龍膽進行鑑別的報導。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供一種基於ITS2序列鑑別大花龍膽與混偽品的引物、鑑別方法。

本發明提供了一種鑑別大花龍膽與混偽品的引物對，它是SEQ ID NO:1-2所示的引物對，用於擴增ITS2序列。

本發明還提供了一種鑑別大花龍膽與混偽品的方法，它包括如下步驟：

a、提取待檢樣本的DNA；

b、基因擴增：採用SEQ ID NO:1-2所示的引物對，對待檢樣本中的DNA進行PCR，得到PCR產物；

c、結果分析：對步驟b)擴增得到的產物進行測序；對測序結果進行分析即可。

其中，步驟b中，所述PCR的條件為：94℃下變性5min；然後在94℃變性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，進行35個循環；72℃延伸10min。

其中，步驟c中，所述對測序結果進行分析的方法為：分析測序結果是否含有SEQ ID NO:3所示的序列；

或者利用遺傳分析軟體，分析比較待檢樣本ITS2序列與大花龍膽的ITS2序列差異，判定待檢樣本是否為大花龍膽。

進一步地，所述遺傳分析軟體為Mega軟體。

本發明還提供了SEQ ID NO:1-2所示的引物對在鑑別大花龍膽與混偽品中的用途。

其中，所述大花龍膽混偽品為高山龍膽、岷縣龍膽、高冷龍膽、滇龍膽草、秦艽和/或麻花艽。

大花龍膽混偽品：包括大花龍膽的易混淆品及偽品。

本發明研究發現，大花龍膽的ITS2序列，可以用於鑑別大花龍膽及其混偽品，如岷縣龍膽、高山龍膽、高冷龍膽、滇龍膽等，本發明利用ITS2序列鑑別大花龍膽的方法操作簡便、準確可靠，為大花龍膽的資源保護、物種多樣性研究提供依據，也為規範藥材市場提供了保障。

顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於以下的實例。凡基於本發明上述內容所實現的技術均屬於本發明的範圍。

附圖說明

圖1為大花龍膽四個居群的地理坐標圖

圖2為大花龍膽原植物圖片圖

圖3為大花龍膽生境圖

圖4為高山龍膽與岷縣龍膽五個居群的地理坐標圖

圖5為居群GSW中高山龍膽原植物圖

圖6為居群GSY中高山龍膽原植物圖

圖7為居群MXH中岷縣龍膽原植物圖

圖8為居群MXR中岷縣龍膽原植物圖

圖9為居群MXB中岷縣龍膽原植物圖

圖10為岷縣龍膽DNA(左)、高山龍膽DNA(中)及大花龍膽DNA(右)圖

圖11為不同退火溫度下樣品DHL1、MXR1的PCR產物擴增結果圖

圖12為居群MXB 15樣品的ITS2-PCR產物的擴增結果圖

圖13為基於ITS2序列構建的58份大花龍膽樣品的NJ系統聚類樹圖

圖14為基於ITS2序列構建的高山龍膽與岷縣龍膽NJ系統聚類樹圖

圖15為基於ITS2序列構建的大花龍膽及其混偽品的NJ聚類樹圖

圖16為基於ITS2序列構建的大花龍膽及其混偽品的UPGMA聚類樹圖

具體實施方式

下面以實施例作進一步說明，但本發明不局限於這些實施例。

實施例1本發明鑑別大花龍膽與混偽品的方法

1、材料來源、儀器與試劑

1.1材料來源

大花龍膽四個居群的植物形態外觀一致，均為「高5～7cm，蓮座叢葉發達，花多單生枝頂，花冠上部具藍灰色或棕灰色條紋和斑點」。各居群命名方式主要依據採樣地點而定。具體見表1。大花龍膽四個居群的地理坐標見圖1。大花龍膽植物形態見圖2，生存環境見圖3。

本研究參考《中國高等植物》有關兩物種記載，結合野外調查結果，將「株高15～30cm，花1～8朵，花梗長達4cm」的植物定種為岷縣龍膽，「株高3～10cm，花1～6朵，無花梗或具短花梗」的植物定種為高山龍膽。高山龍膽兩個居群命名方式依據植物形態特徵而定，岷縣龍膽三個居群依據採樣地點命名。具體見表1。高山龍膽與岷縣龍膽五個居群的地理坐標見圖4。各居群中原植物形態見圖5～9。

1.2儀器與試劑

Tissuelyser-48全自動樣品快速研磨儀(上海淨信科技)、單道移液器(Eppendorf，德國)、DK-8D型電熱恆溫水槽(上海一恆科技有限公司)、5424R離心機(Eppendorf，德國)、微量分光光度計(Healthcare Bio-Sciences AB)、JY300HE電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)、JY300HE電泳槽(北京君意東方電泳設備有限公司)、T100TMPCR儀(BIO-RAD，新加坡)、721BR08817凝膠成像系統(BIO-RAD，美國)。

DP305植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)、瓊脂糖(SIGMA-ALDRICH)、2×Es TaqMasterMix(北京康為世紀生物科技有限公司)、D2000DNA Maker(天根生化科技有限公司)。

2、實驗方法

2.1DNA提取及質量檢測

取樣品葉片，提取DNA：葉片為高原上採集的新鮮葉片，用矽膠快速乾燥後，放入-70℃低溫箱中保存後，備用。

提取樣品葉片DNA時採用全自動樣品快速研磨儀代替人工研磨，使葉片細胞壁破碎完全，以釋放細胞內含物。其餘步驟按試劑盒要求進行。

DNA質量檢測：

①取2μL DNA樣品用微量分光光度計測定其在260nm和280nm處的OD值及DNA濃度。

②取5μLDNA樣品與1μL 6×Loading Buffer混合均勻，在1％瓊脂糖凝膠上於120V 220MA條件下電泳20min檢測DNA質量。

2.2引物設計

設計正向引物ITS2F(SEQ ID NO:1)：

5』-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3』

反向引物ITS3R(SEQ ID NO:2)：

5』-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3』，

均由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成。

2.3PCR反應體系及擴增程序

反應體系設定為：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，正向和反向引物(2.5μmol/L)各1.0μL，根據模板濃度不同DNA用量在1.0～3.0μL之間，其餘用無菌雙蒸水補足體系至25μL。

PCR擴增程序：94℃，變性5min；94℃，變性30s，最佳退火溫度下退火30s，72℃延伸1min，35個循環；72℃延伸10min。

擴增產物保存於-20℃冰箱。

2.4引物最佳退火溫度的考察

調整退火溫度，將退火溫度設定在48℃～58℃之間，PCR儀自動生成A＝58℃、B＝57.2℃、C＝56℃、D＝54.1℃、E＝51.7℃、F＝49.9℃、G＝48.7℃、H＝48℃共8個溫度梯度，根據不同溫度下PCR產物的電泳圖譜，挑選出ITS2引物的最優退火溫度。

2.5PCR產物的檢測

取PCR擴增產物5μL，採用最佳瓊脂糖濃度2.0％，電泳45min，凝膠中含4％的Goldview核酸染料，電極緩衝液為1×TAE，電壓不超過5V/cm，以D2000DNA Maker作為相對分子質量，待電泳結束、衝洗乾淨後在美國BIO-RAD生產的721BR08817凝膠成像系統上觀察記錄，保存圖像。

2.6PCR擴增產物DNA片段測序及數據分析

PCR擴增產物的DNA片段由成都擎科梓熙生物技術有限公司測序完成並應用Contig Express軟體對序列進行校對拼接，獲得ITS2序列。

使用Clustal W(Version2.1)軟體對實驗所得序列進行同源性比對。利用MEGA(Version5.05)軟體尋找SNP位點，運用K2P(Kimura 2-Parameter)模型計算各樣本之間的種內遺傳距離，採用鄰接法(Neighbor Joining，NJ)構建系統聚類樹。

3、結果分析

3.1DNA質量檢測

微量分光光度計檢測樣品DNA純度結果顯示，樣品中提取的DNA在260nm和280nm下光密度比值均在1.7～1.9之間，純度較高。

微量分光光度計檢測所有樣品DNA濃度均在18.5ng/μL～78.5ng/μL之間，用TE緩衝液稀釋DNA濃度至20ng/μL，放於-20℃冰箱中備用。

採用1％瓊脂糖凝膠檢測DNA質量，結果如圖10。

可見，所有樣品的DNA條帶完整、明亮、清晰、整齊、無明顯的拖尾現象、基本沒有降解，所提DNA質量符合分子生物學實驗要求。3.2最佳退火溫度的考察

採用樣品DHL1、MXR1對PCR反應的最佳退火溫度進行考察，PCR產物電泳檢測結果如圖11，A＝58℃、B＝57.2℃、C＝56℃、D＝54.1℃、E＝51.7℃、F＝49.9℃、G＝48.7℃、H＝48℃，樣品DHL1在B、C、D溫度下，條帶更為明亮。樣品MXR1在F退火溫度下無擴增條帶，在A、B、D、H退火溫度下擴增的條帶清晰明亮度不濟在C、H退火溫度下擴增的條帶清晰。綜合樣品DHL1和MXR1的PCR產物電泳檢測結果，將C＝56℃作為ITS2分子標記的最佳退火溫度。

3.3PCR擴增產物的檢測

在2.0％的瓊脂糖凝膠濃度下，檢測PCR產物，結果以居群MXB中15個樣品的ITS2擴增圖譜為例說明，具體見圖12。居群MXB中15個樣品擴增的ITS2片段大小約500bp，擴增條帶特整齊、清晰、明亮、特異性單一，符合ITS2分子標記實驗要求。

3.4ITS2序列測定結果

3.4.1大花龍膽居群內的ITS2序列結果

對大花龍膽四個居群58個樣品的PCR產物進行直接測序，應用Contig Express軟體對序列進行校對拼接，獲得ITS2序列。

對ITS2序列進行同源性比對，結果顯示其相似性達99.99％。ITS2序列長度為464～477bp，平均長度為468.4bp，個體間存在長度多態性；序列GC量為55.8％～56.0％，平均達55.9％，基本無差異。

所有大花龍膽樣品的ITS2中均包含下述序列：(SEQ ID NO:3)

ATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCC

CGAAGCCATTAGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCACGCATCGCGTC

GCCCCCCCAACACCGTGCATGAATTCATGCCGGTCGTCGGAGGGGCGGAT

ATTGGCTTCCCGTGCTTCGGTGCGGCTGGCCTAAATTCAAGTCCCTTGCG

ACGGACACGACGACAAGTGGTGGTTGAATTACTCAACTAAGGTGCTGTCG

CGCGTTGACCCGTCGGATGAGGAGACTTCTTTGACCCTAACGCATGTGTC

GTCACGACGTATGCCACGACCGCGACCCCAGGTCAGGCGGGATTACCCGC

TGAGTTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACAAGGATTCC

CCTAGTAACGGCGAGCGAACCGGGAACAGCCCAAGCTTAAAATCAGTCGA

CTTCGTCGTCTGAATT

採用鄰接法(Neighbor Joining，NJ)對所有大花龍膽樣品構建系統聚類樹，結果顯示所有樣品聚成一類(圖13)。

結果表明，本發明SEQ ID NO:1-2所示的引物對，擴增的大花龍膽ITS2序列高度一致，對不同環境、地理分布的大花龍膽居群均能擴增出同樣的SEQ ID NO:3所示序列。

3.4.2高山龍膽與岷縣龍膽的ITS2序列

對高山龍膽2個居群共27個樣品的PCR產物進行直接測序，應用Contig Express軟體對序列進行校對拼接，獲得ITS2序列。通過MEGA(Version6.06)中Clustal W程序對序列進行同源性匹配，並尋找序列中的SNP位點。ITS2片段長度為376bp，其中保守位點121處，變異位點277處，信息位點255處，GC含量基本無差異，在59.2％～59.4％之間，平均為59.3％。採用DNAsp5.10.01軟體對遺傳多樣性進行測定，結果發現，GSW居群內的遺傳多樣性為0.3528，GSY居群內的遺傳多樣性為0.2839，兩個居群間的核苷酸多態性為0.3738。

對岷縣龍膽3個居群45個樣品的ITS2序列進行同源比對，結果顯示岷縣龍膽45個個體的ITS2序列長度為339bp，保守位點92個，變異位點261個，信息位點247個，GC含量為57.7％～58.3％，平均為57.9％。DNAsp5.10.01分析顯示，MXB居群內的核苷酸多態性最低，為0.0023，MXR居群內的核苷酸多態性最高，為0.2993，MXH居群內的核苷酸多樣性為0.2314，3個居群間的核苷酸多態性為0.3068。

運用MEGA(Version6.06)軟體中的K2P(Kimura 2-Parameter)模型計算高山龍膽與岷縣龍膽72份樣本ITS2序列之間的遺傳距離。結果顯示高山龍膽與岷縣龍膽種間及同種不同居群間遺傳距離均為0.0000～0.9984。

採用鄰接法(Neighbor Joining，NJ)對高山龍膽與岷縣龍膽72份樣品的ITS2序列構建系統聚類樹，見圖14。

結果顯示，NJ樹主要分為兩支，而每支上均有高山龍膽、岷縣龍膽(GSW、GSY、MXH、MXR四個居群)的不同個體，僅有MXB居群的15個個體只在一個分支上。

說明高山龍膽、岷縣龍膽二者存在不同居群間個體的交叉，通過本發明的IST2序列無法區分高山龍膽與岷縣龍膽。

3.4.3大花龍膽與其混偽品之間親緣關係的ITS2分析

大花龍膽五個居群所有樣品的ITS2序列相同，故大花龍膽的ITS2序列命名為G.szechenyii。

由於高山龍膽與岷縣龍膽的ITS2序列分別有兩種排列形式，故將高山龍膽與岷縣龍膽的兩種ITS2序列，分別命名為G.algida-Ⅰ、G.algida-Ⅱ、G.purdomii-Ⅰ、G.purdomii-Ⅱ。

粗根龍膽Gentianacallistantha Diels et Gilg：《中國高等植物》(第九卷)已經依據植物形態將其正名為大花龍膽，即將粗根龍膽與大花龍膽兩品種合併為一個種。

3.4.3.1遺傳距離分析

從GenBANK資料庫中下載已有高山龍膽G.algida Pall.的ITS2序列及大花龍膽常見混偽品高冷龍膽Gentiana frigidHaenke、滇龍膽草GentianarigescensFranch.exHemsl.、秦艽Gentianamacrophylla Pall.、麻花艽Gentianastraminea Maxim.的ITS2序列，物種信息見表2。

表2從GenBANK資料庫中下載物種的信息表

將測定所得的大花龍膽、高山龍膽、岷縣龍膽的ITS2序列與從GenBank資料庫中調取的大花龍膽易混品種的ITS2序列一起，通過MEGA6.06構建系統發育樹。選取龍膽科大鐘花屬大鐘花Megacodonstylophorus(C.B.Clarke))H.Smith，龍膽科花錨屬橢圓葉花錨HaleniaellipticaD.Don作為外類群。

通過MEGA(Version6.06)對所有序列進行同源比對，同源序列中總序列長度為221bp，保守序列143處，簡約信息位點43處，單變異位點32處，變異位點共75處，變異位點佔總位點的33.9％。GC含量在56.6％～63.2％之間，平均為59.3％。在K2P(Kimura2-Parameter)模型下建立遺傳距離矩陣，結果見表3。

由表3可見，大花龍膽與其它品種的遺傳距離為0.0094～0.2608，種間變異明顯，而大花龍膽居群之間序列穩定。

而高山龍膽-Ⅰ與岷縣龍膽-Ⅰ兩種間的遺傳距離；高山龍膽-Ⅱ、岷縣龍膽-Ⅱ與高冷龍膽三者的遺傳距離最小，均為0，無法進行區分。

因此，基於IST2序列的遺傳距離分析法可以用於鑑別大花龍膽與其它易混品。

3.4.3.2聚類分析：

採用鄰接法(Neighbor joining，NJ)及非加權組平均法(Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)對所有物種構建系統發育樹，聚類時以Bootstrap做1000次可信度分析，結果見圖15、16。

通過NJ法、UPGMA法對大花龍膽及易混品種構建的系統發育樹可以發現，聚類主要分為五支，第一支由龍膽屬高山龍膽組的高山龍膽-Ⅰ、高山龍膽-Ⅱ、岷縣龍膽-Ⅰ、岷縣龍膽-Ⅱ、高山龍膽、高冷龍膽組成。第二支由龍膽屬多枝組滇龍膽草自成一支。第三支由龍膽屬多枝組大花龍膽與粗根龍膽組成，大花龍膽與粗根龍膽的遺傳距離較近，為0.0094，這與《中國高等植物》依據植物形態將大花龍膽與粗根龍膽兩品種合併為一個種的結果相一致。第四支由龍膽屬秦艽組中的秦艽和麻花艽組成。第五支由龍膽科大鐘花屬大鐘花和花錨屬橢圓葉花錨組成，所有龍膽屬品種與花錨屬橢圓葉花錨均距離較遠。

NJ與UPGMA聚類結果基本一致，與傳統經典分類中的品種親緣關係呈現一致性，本發明的IST2序列，可以區分物種是否為大花龍膽，但無法將高山龍膽、岷縣龍膽與高冷龍膽三者區分開。

因此，SEQ ID NO:1-2所示的引物對擴增的IST2序列，可以區分大花龍膽及其混偽品。

綜上，本發明SEQ ID NO:1-2所示的引物對，可以準確鑑別大花龍膽真偽，且操作簡單、準確可靠，為規範藥材市場提供了保障，應用前景良好。